2015생태독성시험운영_실무지침_개정판(최종_인쇄용_151124)_최종.hwp

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1 발간등록번호 NIER-GP 생태독성시험방법및운영지침 ( 개정판 ) i -

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3 제목차례 Ⅰ. 개요 1 1. 제도도입배경 1 2. 생태독성관리제도 5 3. 물벼룩에대하여 5 4. 시험생물종 ( 물벼룩 ) 분양 7 Ⅱ. 물벼룩배양 필요장비및기구 배양액제조 군집 계대배양을통한연속배양방법 배양액교체 21 Ⅲ. 물벼룩먹이의제조 먹이공급방법 물벼룩먹이종류 녹조류배양방법 YCT 제조방법 26 Ⅳ. 생태독성시험과정 생태독성분석흐름도 시험방법 생태독성에영향을미치는요인 실험시주요참고사항 32 - iii -

4 Ⅴ. 결과의통계처리 Probit Method Trimmed Spearman Karber(TSK) Method 계산식에의한결과산출 Graphical Method (EPA) 39 Ⅵ. 생태독성시험정도관리 환경시험검사기관정도관리운영규정 숙련도시험 (Proficiency Testing) 현장평가 (On-site Assessment) 표준독성시험 70 Ⅶ. 참고문헌 72 부록 73 - iv -

5 표차례 < 표 1> 시험생물종 ( 물벼룩 ) 분양실적 9 < 표 2> 생태독성분석기관현황 9 < 표 3> 필요장비및기구 11 < 표 4> 배양액제조에첨가되는시약및첨가량 14 < 표 5> 물벼룩배양조건 18 < 표 6> 먹이공급량 23 < 표 7> 조류배양액제조방법 26 < 표 8> 각통계분석방법의적용범위 34 < 표 9> Probit method 적용가능사례 35 < 표 10> TSK method 적용가능사례 36 < 표 11> 재시험시통계프로그램의입력농도 38 < 표 12> Graphical method 적용가능사례 40 < 표 13> 수질분야숙련도시험평가항목 ( 발췌 ) 42 < 표 14> 2015 년도숙련도시험항목 44 < 표 15> 대상기관별물벼룩에의한숙련도시험용시료독성값및 robust z-score 산출결과 46 - v -

6 그림차례 < 그림 1> 생태독성제도도입배경 2 < 그림 2> 생태독성제도운영체계 3 < 그림 3> 물벼룩기관의구조와기능 5 < 그림 4> 물벼룩의단위생식및수정생식과정 7 < 그림 5> 물벼룩분양신청서서식 8 < 그림 6> 배양액제조방법 16 < 그림 7> 군집배양및계대배양방법 19 < 그림 8> 곰팡이, 박테리아, 산소부족에따른물벼룩 성체의색깔 20 < 그림 9> 내구란과정상란의구분 20 < 그림 10> 물벼룩암컷과수컷의차이 21 < 그림 11> 물벼룩이동방법 22 < 그림 12> 물벼룩먹이로사용되는녹조류종류 24 < 그림 13> 생태독성분석흐름도 28 < 그림 14> 시료의희석및반복구 30 < 그림 15> 분석결과및 EC50값산정방법 ( 예시 ) 31 < 그림 16> Chi-square test 불만족시경고문구 35 < 그림 17> 재시험시통계프로그램 (TSK) 결과값산출창 39 < 그림 18> Graphical method를이용한결과산출예시 40 < 그림 19> 숙련도시험진행과정 43 < 그림 20> 각숙련도시료별실험실간 Robust z-score 분포 49 < 그림 21> 기관별숙련도시험평가결과 51 < 그림 22> 현장평가업무진행과정 52 < 그림 23> 현장평가순서 53 - vi -

7 < 그림 24> 내부정도관리차트작성예시 71 - vii -

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9 Ⅰ. 개요 1. 제도도입배경수환경오염물질에대한과거의규제방안은 BOD, COD 등과같은일반수질항목과개별화학물질의농도에대한이화학적측정및분석을통하여수질의오염도를평가하는것이다. 그러나매년약 246,000여종의화학물질이유통되고 400여종의신규화학물질이등록되고있는현상황에서유해물질의개별적관리로수환경을건강하게유지관리한다는것은거의불가능한일이라고할수있다. 이미, 미국, 유럽등선진국에서는수질및수생태계관리에있어서기존의화학적분석에의한농도평가에서생태독성평가에의한관리체제로전환하고있으며우리나라도생물검정위주의생태독성평가체제를도입, 운영중에있으나완전하게정착되기위해서는제도적인보완은물론체계적인조사, 연구에의한뒷받침이필요하다. 환경부에서는생태적으로건강한하천과유해물질로부터안전한물환경조성을목표로 2007년 수질환경보전법 을 수질및수생태계보전에관한법률 로개정하고유해물질로부터안전한물환경조성을위한 생태독성통합관리제도 (Whole Effluent Toxicity : WET) 를 2011년 1월 1일부터시행하고있다. 생태독성평가와관련된제도시행과정은다음과같이 3가지로요약된다. ㅇ물환경관리기본계획수립 (2006 ~) : 유해화학물질통합관리체계구축및 2010년까지생태독성배출허용기준마련등포함ㅇ수생태법시행규칙개정 ( ) : 수질오염물질및방류수수질기준, 배출허용기준에 " 생태독성 (TU)" 추가ㅇ생태독성제도정착을위한종합계획수립 (2008 ~ 2012) : 행정체계및제도정비, 조사연구추진및기술지원사업시행, 교육, 홍보및관련산업육성 - 1 -

10 < 그림 1> 생태독성제도도입배경 생태독성제도와관련된규정은 수질및수생태계보전에관한법률 시행규칙에포함되어있으며, 아울러국립환경과학원에서는생태독성원인이일반적으로인식되는유해물질이아닌단순염성분에의한경우이를증명하는절차등을명시한 염에의한생태독성증명에관한규정 을운영하고있다. 각규정의주요내용은다음과같다

11 ㅇ 수질및수생태계보전에관한법률 시행규칙 - 수질오염물질및방류수수질기준, 배출허용기준에 생태독성 항목추가 (2007) - 배출허용기준초과원인이염인경우행정처분제외 ( 증명절차, 방법등은국립환경과학원장고시로제정, 2010) - 폐수종말처리시설및공공하수처리시설을염증명고시적용대상시설에포함 (2013) ㅇ 염에의한생태독성증명에관한규정 ( 과학원고시 ) - 염증명신청절차및방법등규정제정 (2010) - 적용대상시설에폐수종말처리시설추가, 염증명유효기간연장규정신설등규정개정 (2014) - 적용대상시설에공공하수처리시설추가, 신청서류 ( 종합평가보고서 ) 내용간소화등규정개정 (2015) < 그림 2> 생태독성제도운영체계 - 3 -

12 그러나생물을이용한시험방법은이화학분석과달리정량분석이불가능하며, 시험생물의건강상태및시험자의숙련도에따라평가결과가달라질수있다. 더욱이생태독성배출허용기준이나방류수수질기준초과시시설에대한개선명령등법적규제를동반하고있어, 시험결과에대한신뢰성확보가매우중요하다. 본지침은시험생물종의배양, 먹이의질 (Quality), 생태독성에영향을미치는요인, 통계기법을이용한결과산출, 정도관리체계등생태독성측정시실무적으로접할수있는내용에대하여보다구체적인내용을수록하여실제분석업무담당자의편의를도모하고궁극적으로는시험결과의신뢰성을향상시키는데기여할수있도록하고자하였다

13 2. 생태독성관리제도생태독성관리제도는산업폐수방류수에소형갑각류인물벼룩을넣고생태독성여부를측정하여하 폐수를통해배출되는미지의유해물질을통합관리하기위한제도이다. 물벼룩을시험종으로선택한이유는물벼룩이수생태계 1차영양단계대표생물종으로, 크기약 0.3 mm ~ 6 mm 정도로작고다산및짧은생활사를갖는특징이있으며무엇보다도독성물질에민감하고독성시험의재현성이높기때문이다. 3. 물벼룩에대하여가. 물벼룩의구조와특징물벼룩은전세계적으로 11과 52속 450여종이그리고이들중한국산물벼룩은 9과 29속 55종으로알려져있다. < 그림 3> 물벼룩기관의구조와기능 - 5 -

14 대부분담수종 ( 약 95 %) 이며유속이빠르지않은하천, 호수, 연못등에주로서식하고, 적정서식온도는평균 15 ~ 25 정도이다. 먹이는단세포의녹조류와같은식물성플랑크톤또는원생동물, 박테리아등의미생물을섭취하며먹이종류보다는입자크기에민감하고가슴다리와다리에부착되어있는여과용다리털을이용하여먹이를섭취한다. 물벼룩기관의구조와기능은 < 그림 3> 과같다. 나. 물벼룩의생식방법물벼룩의생식은크게단위생식과수정생식을통해이루어진다. 이는환경상태에따라좌우되는데, 환경이좋으면암컷에서암컷이생산되는단위생식을하나, 이상환경 ( 온도, 경도, ph, 조도, 독성물질유입등 ) 에접촉하게되면수정생식을통해암컷에서수컷이부화 1) 하게된다. 물벼룩수정란의명칭은검은알 (black egg), 내구란 (ephippia), 휴면란 (resting egg) 등으로불린다. 영양상태가좋은환경에서, 어린개체 (neonate) 를 1주일배양하면암컷의경우알을가지기시작하며, 새끼를낳는다. 그러나활동범위가크고, 크기도작으며, 붉은색을띠는경우수컷일확률이높다. 현미경으로보았을때암컷은배가둥근반면, 수컷은배가직각모양을띠면서가슴갈퀴가암컷에비해크며가슴에잔털을가지는특징을보인다. 다. 물벼룩의수명및생활사물벼룩의수명및생활사 (life cycle) 는물벼룩의종, 온도, 먹이양등에따라달라진다. 의경우, 평균수명은 40일 (25 ) ~ 56일 (20 ) 이며, 형태적으로 egg, juvenile( 알을갖고있지않은형태 ), adolescent( 처음알을갖게되는형태 ), adult의과정을거친 1) 수컷이생성되는이유는자연환경중극한상태에서개체존속의필요성을느낄때로서온도가적정온도아래로내려갈경우 (15 ), 주위환경이건조하여수량이감소하는경우, 광량이적어지는경우, 그리고섭취할먹이양이감소하고물벼룩의밀도가증가하는경우등이다

15 다. 20 조건에서하루보통 6 ~ 10개의알을가지며 50일동안 57개정도의알을낳는다. 그러나온도가상승하게되면유충부화량은증가하며성충의생존기간은짧아진다. 반대로온도가낮아지면유충부화량은감소하며성충의생존기간은길어진다. < 그림 4> 물벼룩의단위생식및수정생식과정 4. 시험생물종 ( 물벼룩 ) 분양시험생물종 ( ) 의연속배양및시험결과의신뢰성확보를위해출처가명확하고건강한물벼룩을사용하여야한다. 따라서반드시국립환경과학원에서분양받는시험생물종을사용토록규정되 - 7 -

16 어있으며, 생태독성시험용물벼룩은국립환경과학원에서무상으로분양하고있다. 분양하는물벼룩은어린개체를최대 200개체정도분양하며, 분양받은어린개체는 2세대이상계대배양후실험에사용하여야한다. 물벼룩분양을받으려면분양신청서 ( 서식그림 5) 를첨부하여국립환경과학원에문서로신청하여야하며, 신청전에분양시기등의조정을위해과학원담당자와미리협의하여야한다. 생태독성분석기관은 2015년 2월현재법정및공공기관 24개소, 민간분석기관 43개소로총 67기관이운영중이다. < 그림 5> 물벼룩분양신청서서식 - 8 -

17 < 표 1> 시험생물종 ( 물벼룩 ) 분양실적 (2012 ~ 현재 ) 구분 기관수 비고 계 90 법정기관 18 관할사업장이없는대구, 광주제외 민간기관 55 학 계 17 대학등연구용 < 표 2> 생태독성분석기관현황 ( 현재 ) 구분기관명기관수 계 67 법정분석기관 환경부소속기관 시도보건환경연구원 유역환경청 : 한강, 낙동강, 금강, 영산강지방환경청 : 원주, 대구, 새만금 서울, 부산, 대전, 인천, 울산, 경기, 경기북부, 강원, 충북, 충남, 전북, 전남, 경북, 경남, 제주 ( 대구, 광주제외 ) 7 15 민간분석기관 한국화학융합시험연구원 ( 재 )FITI 시험연구원 ( 오창분원 ) 그린텍 네오엔비즈 녹색기술연구소 대현환경 동부그린환경 동진생명연구원 두현이엔씨 산업공해연구소 상록엔바이로 세진이티엘 신라엔텍

18 구분기관명기관수 알렉스분석시험소 에스제이엔테크 영동환경 원일화학엔환경 원일환경 유성환경 이앤디환경기술연구소 이화환경지점 일신종합환경 정우엔텍연구소 지엔피 청룡환경 켐토피아 코비 푸른환경 하이텍환경 한국산업공해연구소 한국종합공해시험연구소 혜성환경그린파이너스 금강엔지니어링 아이케이사이언스 영진환경산업 이엔아이자연환경알앤디 주흥환경 코오롱워터앤에너지 태림인더스트리 환경컨설팅 에버그린탑 한솔환경산업 기타한국환경공단 2 개소

19 Ⅱ. 물벼룩배양 1. 필요장비및기구물벼룩배양및급성독성시험을위한장비및기구등은 < 표 3> 과같다. < 표 3> 필요장비및기구용도장비및기구권장사항 물벼룩배양및독성시험시노출 배양액및희석수제조 물벼룩먹이제조 ( 녹조류배양 ) 배양기또는항온수조 정제수제조장치 배양기 배양실내별도의온도조절장치구비 배양기는배양실과시료노출실의구분이가능한제품권장 ( 예 : 양문형 ) 배양공간의공기질이깨끗하지않다면이를정화할수있는여과설비구비 증류수생산용량 10 L/h 이상인장비 ( 물벼룩성체약 700 마리배양시가정 ) 온도및조도조절이가능하고폭기또는교반이가능한것 고압증기멸균기 - 클린벤치 - 독성시험 라이트 (Light) 박스 물벼룩의치사및유영저해는육안으로확인이가능하나, 색도가있는시료또는미약한유영저해판정시에는라이트박스를이용하는것이효과적임 5 0 m L 유리비커독성시험시시험용기로사용 노출 Rack 시료노출시사용

20 용도장비및기구권장사항 물벼룩포집 (grab) ( 배양액교체및독성시험 ) 배양용기 배양액제조및저장 스포이드또는피펫 1 L 유리비커등 증류수통 교반기및마그네틱바 스포이드, 피펫입구의직경은최소 5 mm 가되도록절단하여사용 유리피펫을절단하여사용할경우절단면이날카롭지않도록마무리함 ( 가열처리등 ) 물벼룩배양시악영향을주지않는재질의용기사용 (PP, PE 재질도배양용기로사용가능하나물벼룩의영향여부를확인후사용 ) 수량은배양하고자하는물벼룩개체수를고려하여여유롭게준비 황산칼슘이수화물 (CaSO 4 2H 2 O) 용해시사용 배양액폭기 에어펌프 펌프내에함유된유분 ( 그리스 ) 으로인해발생된증기 (fume) 가배양액내로유입될경우, 물벼룩에게악영향을줄수있으므로유분등을함유하지않는펌프를사용하거나활성탄필터를이용하여증기유입을방지토록함 배양액제조및표준독성시험 배양액제조 물벼룩 / 조류배양환경점검 산기석 (air stone) 전자저울 배양액제조시약 조도측정기및온도계 증류수통바닥으로충분히가라앉을수있어야함 소수점셋째자리까지정량할수있는것 물벼룩배양액 (< 표 4> 참조 ) 조류배양액 (< 표 7> 참조 ) - 배양액및시료잔류염소측정기

21 용도 장비및기구 권장사항 측정 암모니아측정기 - 경도측정기 - ph meter - DO meter - 온도계 - 물벼룩먹이의상태확인 ( 녹조류 ) YCT * ( 물벼룩먹이 ) 제조 염도및전기전도도측정기 현미경 믹서기 2 L 분별깔때기 거름망 - 물벼룩의먹이는사용전현미경을통해조류세포밀도, 응집 ( 오염 ) 정도등을관찰하여물벼룩먹이로써적합한지확인해야함 YCT 제조시각재료를분쇄 Trout chow 나 Flake food 의발효액제조시유분배제 구멍직경 110 μm가되는것을사용 조류및 YCT 보관 냉장고 - 냉동고 YCT 제조후약한달간냉동보관가능 * YCT : Yeast, Cerophyll, Trout chow 을혼합하여제조 ( 상용화된제품 구매사용가능 )

22 2. 배양액제조 배양액은증류수에 < 표 4> 에제시된시약을첨가하여제조하며, 배양 액제조순서는아래와같다 (20 L 제조기준 ). < 표 4> 배양액제조에첨가되는시약및첨가량 시약명 증류수량에따른시약첨가량 (mg) 20 L 1 L 40 L 염화칼륨 (KCl) 황산마그네슘 (MgSO 4 ) 2, ,800 황산칼슘이수화물 (CaSO 4 2H 2 O) 2, ,800 탄산수소나트륨 (NaHCO 3 ) 3, ,680 (1) 증류수 18 L 준비 (2) 준비된증류수에염화칼륨 (KCl) 160 mg, 황산마그네슘 (MgSO 4 ) 2,400 mg, 탄산수소나트륨 (NaHCO 3 ) 3,840 mg 를첨가하고 12 시간 정도폭기한다. 폭기는관상어용에어펌프를사용하며, 호스끝부분에산기석 (air stone) 을부착하여증류수통하단부터폭기가이루어질수있도록함 ( 첨가된시약을충분히용해시키고, 용존산소농도를높임 ). 펌프내에함유된유분 ( 그리스 ) 으로인해발생된증기 (fume) 가배양액에유입될경우, 물벼룩에게악영향을줄수있으므로유분등을함유하지않는펌프 (Oil free) 를사용하거나활성탄필터를이용하여증기유입을방지토록함. (3) 별도로 2 L 증류수에황산칼슘 이수화물 (CaSO 4 2H 2 O) 2,400 mg 을넣고교반기와마그네틱바를이용하여충분히용해시킨다. (4) 위 (2) 항과 (3) 항용액을혼합하고 12시간정도폭기를중단한후 배양액으로사용한다 (< 그림 6> 참조 ). 폭기중인배양액을바로사용할경우수중의미세기포가물벼룩몸에

23 부착되어유영저해를야기할수있음 제조된배양액의조성은용존산소 3.0 mg/l 이상, ph , 경도 ( ) CaCO 3 mg/l, 알칼리도 ( ) CaCO 3 mg/l 을나타내야하며, 위항목들을최소주 1 회이상확인함 배양액은배양중인물벼룩개체수를고려하여배양액교체에소요되는배양액량을산출하고사용 1 일전미리제조토록함 ( 예 : 1 L 비커에성체 10 마리씩넣어총 700 마리를배양한다고가정할때배양액교체일에소요되는배양액량은약 70 L)

24 증류수 18 L 에황산마그네슘 2,400 mg, 염화칼륨 160 mg, 탄산수소나트륨 3,840 mg 을넣고 12 시간폭기 별도의증류수 2 L 에황산칼슘이수화물 2,400 mg 을넣고교반기와마그네틱바로충분히용해 1+2 를혼합하여 12 시간정도방치후배양액으로사용 < 그림 6> 배양액제조방법

25 3. 군집 계대배양을통한연속배양방법 (1) 국립환경과학원에서새로분양받은어린개체 (neonate) 약 100 마 리를 2 L 비커에넣고군집배양한다. (2) 군집배양한어린개체가성장하여첫알을가지기시작한성체 ( 군집배양시작일로부터약 5 7 일후, 육안으로확인가능 ) 를 1 L 비커에 8 ~ 10 마리정도옮겨계대배양한다. 성체를 1 L 비커에 10 마리이상배양할경우, 개체과밀도로성체의생존율과어린개체생산율이저하되고, 내구란과수컷의발생을유발할수있음. 특히, 성체는연령이 3 주차 ~ 5 주차동안어린개체를가장많이생산하므로, 성체수를조절하여생산된어린개체로인한개체과밀도가발생하지않도록주의필요. (3) 계대배양중인성체에서생산된어린개체를골라내어 2 L 비커 에약 100 마리씩넣고군집배양한다. 어린개체골라낼때에는몸체의윤곽이뚜렷하고, 개체크기가크며활동성이좋은개체위주로선별. (4) 위 (1) 항 (3) 항까지의과정을반복하여물벼룩을연속배양한다 (< 그림 7> 참조 ). (5) 시험을실시할때는계대배양 ( 여러세대를거쳐배양 ) 한생후 2주이상의물벼룩에서생후 24시간미만의어린개체를사용한다. 물벼룩은배양상태가좋을때 7 일 ~ 10 일사이에첫새끼를부화하게되는데이때부화된새끼는시험에사용하지않고, 같은어미에서약 4 번째부화한새끼부터시험에사용. 군집배양의경우, 부화횟수를정확히아는것이어렵기때문에생후약 2 주이상의어미에서생산된새끼를시험에사용. (6) 새로분양받은어린개체는최소 2 세대이상순화과정 2) 을거친

26 후, 이들어린개체가 2 주이상성장하여생산한어린개체를급성 독성시험에사용한다. 배양환경 3) 이불량할경우, < 그림 9> 및 < 그림 10> 과같은수컷또는내구란이발생될수있음. 이경우, 수컷 4), 내구란 (Ephippia) 5) 이발생된배양용기내의물벼룩은전량폐기해야함 (7) 물벼룩은곰팡이, 박테리아등에의해오염될수있는데, 이경우성체의생존율및어린개체의생산율이크게저하되고다른개체로전염될수있으므로배양용기내모든개체는폐기한다. 곰팡이에오염된경우몸체색깔은흰색을띠며박테리아에오염되었을경우에는붉은색또는검은색을띤다. 또한, 비커내모든물벼룩이붉은색일경우에는배양액내산소부족을의심할수있으므로, 배양액내용존산소농도를확인한다 (< 그림 8> 참조 ). < 표 5> 물벼룩배양조건 항목 조건 온도 20 ± 2 광도 500 Lux 1,000 Lux 광주기 ( 명 : 암 ) 16 : 8 2) < 그림 7> 의 1 3 과정을두번이상거친성체에서생산되는어린개체 3) 배양환경이란시험자숙련도, 먹이질및공급량, 배양온도, 배양액성상, 배양실공기질등물벼룩에배양에영향을줄수있는모든인자 4) 수컷은암컷에비해활동성이크고, 몸크기가작으며, 붉은색을나타낸다. 또한, 현미경관찰시암컷은배가둥근반면, 수컷은배가직각모양을하고있다 5) 수컷과의교미를통해수정이이뤄진암컷은검정색의알 ( 내구란 ) 을형성하게된다. 이알 ( 내구란 ) 은탈피를통해수체밑바닥으로가라앉게되며, 환경이좋아지면부화되어암컷이증가하고, 단위생식을하게된다

27 < 그림 7> 군집배양및계대배양방법

28 곰팡이에의한영향 등 박테리아에의한영향 산소부족에의한영향 헤모글로빈상승 < 그림 8> 곰팡이, 박테리아, 산소부족에따른물벼룩성체의색깔 6) < 내구란 > < 정상란 > < 그림 9> 내구란과정상란의구분 7) 6) Source : National Center for Biotechnology Information(US), ) Source :

29 < 암컷 > < 수컷 > < 그림 10> 물벼룩암컷과수컷의차이 8) 4. 배양액교체배양액교체주기는 1주일에 3회 ( 예 : 월, 수, 금 ) 정도가적당하며, 물벼룩은스포이드나피펫등을이용하여포집 (Grab) 하고조심스럽게새로운배양액으로옮긴다. 물벼룩포집시사용하는스포이드또는피펫의입구직경은최소 5 mm 이상이되어야한다 ( 스포이드또는피펫입구에물벼룩이걸리는것과같은물리적스트레스최소화 ). 물벼룩을새로운배양액으로옮길때에는 < 그림 11> 과같이스포이드나피펫이배양액에충분히잠기게한후물벼룩을내보내야물벼룩의껍질 (carapace) 에공기가부착되어수면위로떠오르는것을방지할수있다. 8) Source :

30 < 올바르지않은이동방법 > < 올바른이동방법 > < 그림 11> 물벼룩이동방법

31 Ⅲ. 물벼룩먹이의제조 1. 먹이공급방법먹이는배양액교체일 ( 예 : 월, 수, 금 ) 에는조류와 YCT를공급하며배양액미교체일 ( 예 : 화, 목 ) 에는조류만공급한다. 특히, 금요일에는주말에섭식하는량을고려하여조류를추가적으로더공급한다. 먹이공급량은 < 표 6> 을참고한다. 먹이를공급하고약 12시간후확인하여물벼룩몸체에조류가붙어있으면치사또는유영저해를유발할수있으므로조류공급량을줄인다. 신규배양혹은상용화제품을처음공급하는경우먹이의오염여부판단을위해비커에어린개체 20여마리를별도로준비하여시험적으로먹이를공급한다. 1 ~ 2일정도지난후에도물벼룩에이상이없으면전체물벼룩에공급한다. < 표 6> 먹이공급량 (1 L 비커에성체 8 ~ 10 마리배양시기준 ) 9) 구분 배양액교체일 ( 월, 수, 금 ) 배양액미교체일 ( 화, 목 ) 비고 조류 ( cells/ml) 약 1 ml 약 1 ml 이내금요일에약 1 ml 추가 YCT (Yeast, Cerophyll, Trout chow) 약 1 ml - 조류의세포수 ( cells/ml) 를계수하지아니할경우대략배양액의색이연한연두색이된상태를기준으로할수있으나각실험실별로경험에의한최적의먹이양을판단토록함 9) Source : Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms Fifth Edition October

32 2. 물벼룩먹이종류물벼룩먹이는 < 그림 12> 와같이 ( 이전학명 : ) 등과같은단세포녹조류와 Yeast, Cerophyll, Trout chow를혼합한 YCT를사용한다. YCT는보조먹이로줄수있으며, 2010년국립환경과학원자체실험결과 YCT의공급이없을경우, 성체의생존율과어린개체생산율이저하된사례가있으므로참고한다. < 그림 12> 물벼룩먹이로사용되는녹조류종류 10) 3. 녹조류배양방법 (1) 각각의표준원액 (stock solution) 은 < 표 7> 에제시된방법에따라제조한후고압증기멸균기를이용하여 121, 15분간멸균한다 ( 표준원액은밀봉후 4 에서한달간보관가능 ). 10) Source : National Bioresource Project, Algae Resource Database,

33 (2) 조류배양액은 < 표 7> 에제시된제조방법에따라부피플라스크 (1 L 용량 ) 에각각의표준원액첨가량을넣고증류수로전량이 1 L 가되도록한다. FeSO 4 7H 2 O 경우침전물이생기므로사용전흔들어사용하며, 각각의표준원액은섞이지않도록주의해야한다. (3) 제조된배양액은삼각플라스크에옮긴후 121, 15 분간멸균한다. 이때배양액을삼각플라스크목부분까지너무과하게채우면멸균시배양액이넘칠수있으므로삼각플라스크의 2/3 ~ 1/2 만채우도록한다. 조제한배양액은하루냉장또는상온에서완전히식힌후조류를접종한다 ( 오염방지를위해클린벤치내에서접종 ). 최초배양에사용되는녹조류는한국생명공학연구원에서분양 ( 유상 ) 받거나상용화된물벼룩먹이용녹조류를구매하여사용할수있음 (4) 조류는 25, 명조건인큐베이터 (8,000 Lux 이상 ) 에서필터처 리한공기로폭기하면서 5 6 일정도배양한다. (5) 배양된조류를현미경으로검경하여과다응집된경우폭기를강 하게하거나교반강도를올려준다. (6) 배양이종료된조류는 4 에서 3 4 일간침전시킨후상층액 은 2/3 정도버린후현미경으로조류세포농도와배양상태 ( 응집, 오 염여부 ) 를확인후사용한다 ( 먹이로사용되는조류세포농도는 ( ) cells/ml 가적당함 ). 조류배양시외부공기를통한오염 ( 곰팡이, 박테리아등 ) 이빈번하기때문에수시로오염여부확인필요

34 < 표 7> 조류배양액제조방법 표준용액 11) 제조 조류배양액제조 구분 시약명 첨가량 (g) 증류수 (ml) 증류수 1 L 당첨가되는표준용액양 (ml) 1 NaNO CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 7H 2 O K 2 HPO KH 2 PO NaCl Na 2 EDTA+KOH FeSO 4 7H 2 O H 3 BO ZnSO 4 7H 2 O 0.88 MnCl 2 4H 2 O MoO CuSO 4 5H 2 O Co(NO 3 ) 2 6H 2 O YCT (Yeast, Cerophyll, Trout chow) 제조방법 YCT는 Yeast, Cerophyll, Trout chow를아래의 (1) ~ (3) 까지의과정을통해제조후혼합하여사용한다. 필요시바로제조하여사용하며, 제조된 YCT는 1달간냉동보관가능하다. 냉동된 YCT는사용 1시간전에해동하고, 해동된시점부터일주일간만사용한다. (1) Trout chow나 Flake food의발효액제조 Trout chow나 Flake food 5 g을초순수 1 L에넣어분쇄기로잘섞는다. 잘섞어진혼합액은 2 L 분별깔때기에부어통과시킨후 ( 상 11) 표준용액 (stock solution) 은밀봉후 4 에서한달간보관가능

35 등액배제 ) 혼합액을실온에서일주일간폭기 ( 용기바닥에서 ) 한다. 발 효과정에서증발로인해생길수있는초순수의손실은발효가완료 될때까지계속하여채워줘야한다. 이과정은일주일이소요되며, 악 취를발생시킬수있으므로, 흄 (Fume) 후드, 환기가능한곳, 격리 등이필요할수있다. 발효가완료되면, 냉장보관하여최소 1 시간 침전시키고, 상등액을여과 ( 구멍직경이 110 μm정도인거름망이용 ) 하여최종액량을 100 ml 로하고사용전까지냉동한다. (2) Yeast 혼합액제조 활성건조효모 5 g 을초순수 1 L 에넣는다. 활성건조효모가잘 풀어지도록교반기에서마그네틱바를이용하여교반또는손으로세 차게흔들거나, 믹서기로약하게혼합하여 100 ml 로만든다. (1) 과 정을통해제조된 Trout chow 나 Flake food 의발효액 100 ml 와 혼합한다 ( 혼합후남는여액은폐기한다 ). (3) Cerophyll 혼합액제조 ( 건조, 입상, 곡물잎 ) 건조하여, 입상으로만든알파파잎 5 g 을초순수 1 L 에넣는다. 분 쇄기로 5 분간강하게섞거나, 교반기에서마그네틱바로 24 시간교반 ( 중간속도 ) 하여준다. 분쇄기를이용하여교반후부유물질이생겼을 경우, 냉장고에서 2 ~ 4 시간정치하여침전시키고침전이완료된액 의상등액을취하여 100 ml 로한다. YCT [(1) + (2) + (3) 혼합 ] 는약 300 ml 가되도록하고, 50 ml ~ 100 ml 의밀봉이가능한 ( 예 : screw-cap) 플라스틱용기에나누어담아냉동시킴. 제조된 YCT 의고형물함량은약 (1.7 ~ 1.9) solids/l 가적당함

36 Ⅳ. 생태독성시험과정 1. 생태독성분석흐름도 < 그림 13> 생태독성분석흐름도 2. 시험방법 (1) 시료원수를 100 %, 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 % 로단계적으 로희석하고각농도군당 4 개의반복구를둔다. 시험용액의양은 50 ml 로한다. 시료의온도가 20 를벗어나는경우물벼룩에영향을줄수있으므로 20 ±2 로맞추어시험토록한다

37 (2) 아래주의사항을참조하여각농도군및반복구별로시험용물벼룩을 5마리씩투입하고온도 (20 ± 2), 명암주기는 16 : 8로하여 24시간동안노출시킨다. - 시험하기 2 시간전에먹이를충분히공급하여시험기간중에먹이부족으로인한영향을최소화시킨다. - 시험기간중에는물교환, 먹이공급, 폭기등을하지않는다. - 시험용물벼룩의투입은낮은농도에서높은농도순서로수행한다. - 시료간교차오염방지를위하여스포이드 ( 또는피펫 ) 는시료건별로사용후교체한다 ( 적어도시료 1건당 1개이상사용 ). - 물벼룩투입시스포이드 ( 또는피펫 ) 내배양액의양은가능한한적은양으로유지토록함으로써각시험용기내희석농도변화를최소화시킨다. - 물벼룩을투입할때표면에물벼룩이뜨는경우해당물벼룩을제거하고다른물벼룩을재투입한다. 단, 시료특성 ( 독성함유등 ) 에의한것으로판단되는경우는예외로한다. - 시료간교차오염으로인하여물벼룩에미치는영향을최소화시키기위해시료 1건당약 150마리정도의물벼룩을별도비커에옮겨담아사용하고, 사용후남은물벼룩은폐기한다. - 시험시작시간과종료시간을반드시기록토록하여 24시간노출여부를확인할수있도록한다

38 물벼룩 5 마리 씩 투입 è (1) (2) < 그림 14> 시료의희석및반복구 (3) 24시간후각농도군당물벼룩의치사및유영저해개체수를확인한다. < 그림 15> 에서보면각농도군당물벼룩의치사및유영저해개체수는 100 % 에서 20마리, 50 % 에서 17마리, 25 % 에서 10마리, 12.5 % 에서 5마리, 6.25 % 에서 2마리, 대조군에서 0마리가된다. 대조군에서 10 % 이상이치사한경우에는재시험실시. (4) 각농도군당물벼룩의치사및유영저해개체수를바탕으로 Probit, TSK(Trimmed Spearman Karber) 등통계프로그램이나산출식을이용하여 EC 50 값을산출한다. 위그림에서 EC 50 값은 25가되며, 독성값 (TU : Toxic Unit) 은 4가된다 (TU = 100/EC 50 )

39 è (3) (4) < 그림 15> 분석결과및 EC 50 값산정방법 ( 예시 ) (5) 사용된물벼룩을폐기할때망으로걸러살아있는상태로하수구 에유입되지않도록주의해야한다. 3. 생태독성에영향을미치는요인 (1) 부유물질부유물질은입경 2 mm 의물에용해되지않는물질로시료내에다량의부유물질이포함되어있는경우생태독성시험시물벼룩 유영저해및치사여부에대한관찰이어려울수있다. (2) 시료보관방법시료의보관및취급하는방법에따라생태독성분석결과는큰영향을미치는데일반적으로시료내함유되어있는독성은생분해, 가수분해, 흡착등과같은방법으로저장기간이길어질수록감소한다. 이를최소화하기위해 US EPA Guideline에서는실험시작뿐아니라보관과수송시냉장보관토록하고있다

40 (3) 시험생물종의먹이시험생물종이영양소품질과먹이크기 ( 조류등 ) 가일정하지않은조건에서배양되어왔다면시료를동일한조건에서분석한다하더라도생태독성분석결과가달리나올수있다. EPA Guideline에서는부화 24 시간미만의바다새우유충을대상으로실험을수행하는경우먹이의품질과먹이크기를유지하여유충에게공급하도록제시하고있다. 먹이의제조, 구입등으로기존공급하던먹이와다른먹이를공급할때는먹이의불량및오염등으로물벼룩이영향을받지않도록일부물벼룩으로사전점검 ( 약 2일간사전먹이주입 ) 을한이후전체물벼룩에먹이를공급하도록한다. 이는먹이의불량등으로인한물벼룩의영향을미리방지하기위함이다. (4) 희석수의조성희석수의조성 ( 경도, 염도, 전도도, 탁도, DO, ph 등 ) 이부적절한경우방류수에포함되어있는독성에영향을미칠수있다. 따라서희석수조제시주기적인성분분석을통해일정한희석수조성을유지하여야한다. (5) 시험생물종의이력시험생물종의건강성을평가하기위해시험생물종의수집, 배양, 환경순화, 실험실에서의취급등에대한숙지가필요하다. 실험에사용되는물벼룩은국립환경과학원에서분양받은생물종으로만분석을실시하여야하며, 분양후순화과정을거친 2세대이후의물벼룩으로분석을실시하여야한다. 4. 실험시주요참고사항아래내용은물벼룩독성실험시일어날수있는상황에대한대처방안혹은기본지식에대하여서술한것이다. (1) 실험전먹이 ( 조류및 YCT) 를충분히준후실험을수행한다

41 (2) 기생충이발생하면성체의생존율및어린개체생산율을크게저하시키고다른개체로전염될수있으므로, 배양용기내의모든개체는폐기한다. (3) 계대및군집배양에서물벼룩이송에사용되는스포이드는정해진그룹별로다른것을사용하여야교차오염을방지할수있다. (4) 방류수에는물벼룩의영양공급원인미네랄과입자들이존재하기때문에방류수에서대조군보다성장이좋은경우도발생할수있다. (5) 방류수와희석수의경도차이및부유 / 용존입자차이에의해독성물질의존재형태및분포가변화하여독성이 50% 에서높게나타나는경우도있다. (6) 태어난지 7일이내의물벼룩은군집배양이성장에효과적이나, 성체들을높은밀도로군집배양하는경우스트레스에의해성장둔화및새끼의수가감소한다. (7) Yeast는건조효모 (dried yeast), 활성건조효모 (active dried yeast), 추출효모 (yeast extracted) 가있는데이들중활성건조효모 (active dried yeast) 를사용한다. (8) 초순수제조기의염소소독후에는초순수제조기내의잔류염소가모두제거된이후배양액제조에사용한다 ( 증류수내잔류염소측정 ). (9) 시료는시험전실험온도 (20 ± 2) 에맞춘다. (10) 배양액을폭기후물벼룩배양에바로사용하면과포화된용존산소로인하여물벼룩의몸에미세기포가부착되어물벼룩의활동성에영향을줄수있으므로배양액은폭기후 12 시간이지난이후에사용한다

42 Ⅴ. 결과의통계처리 물벼룩을이용한독성시험결과는통계학적분석방법을이용하여 EC 50 값을구하고이를다시독성값 (TU) 로나타낸다. 따라서 EC 50 값을산출하는데사용된통계프로그램도최종결과와함께표기한다. 수질오염공정시험기준에서는통계학적분석방법으로 Probit Method, Trimmed Spearman Karber(TSK) Method, 계산식에의한결과도출을제시하고있다. 아래 < 표 8> 은각각의통계기법에대한특징을나타낸것이다. < 표 8> 각통계분석방법의적용범위 통계프로그램 방법 Probit Method Trimmed Spearman Karber(TSK) Method 계산식에의한 결과도출 Graphical Method 적용범위 - 원수 100 % 농도에서유영저해물벼룩이 11 ~ 20 마리일경우적용하며 EC 50 값에대한 95 % 신뢰도구간을한정하여준다. - 원수 100 % 농도에서유영저해물벼룩이 3 ~ 9 마리일경우적용하며 EC 50 값에대한신뢰도구간을알수없다. - EPA 에서제시한방법으로물벼룩이모두생존, 모두사망한데이터만존재할경우사용 1. Probit Method 통계분석프로그램은원수 100 % 농도에노출시킨물벼룩의치사및유영저해개체가 11마리이상, 20마리일때사용한다. 그중 Probit Method는원수 100 % 이외의농도에서부분치사 ( 치사및유영저해를보이는개체수가 1 ~ 19마리 ) 를보이는농도가 2개이상일경우사용하는방법이다

43 즉아래 < 표 9> 의 25 %, 50 % 농도와같이독성에대한부분치사 (2 마리, 7 마리 ) 를보이는농도의데이터가 2 개이상있을때권장한다. 단, Probit Method 를이용하여결과산출시 < 그림 16> 과같이 Chi-square test 를만족하지못할경우, 경고문구가나오게되고 95 % 신뢰구간이산정되지않는다. 따라서이경우에는 Trimmed Spearman Karber(TSK) Method 를이용하여결과를산출한다. < 표 9> Probit method 적용가능사례 시료농도 (%) 노출개체수 치사및유영저해개체수 치사율 (%) 비고 % 치사데이터 % 치사데이터 부분치사데이터 부분치사데이터 % 치사데이터 < 그림 16> Chi-square test 불만족시경고문구

44 2. Trimmed Spearman Karber(TSK) Method 원수 100 % 농도에노출시킨물벼룩의치사및유영저해개체수조건 은 TSK Method 역시동일하다. 하지만 TSK Method 는원수 100 % 이외의농도에서부분치사 ( 치사및유영저해를보이는개체수가 1 ~ 19 마리 ) 를보이는농도가 1 개또는없을경우사용하는방법이다. 즉, 아 래 < 표 10> 의 50 % 농도와같이독성에대한부분치사 (7 마리 ) 를보 이는농도의데이터가 1 개있을때사용한다. 부분치사율이없을경우 Graphical Method 사용이가능하나국 내시험법에는포함되어있지않아연구목적인경우에만사용한다. < 표 10> TSK method 적용가능사례 시료농도 (%) 노출개체수 치사및유영저해개체수 치사율 (%) 비고 % 치사데이터 % 치사데이터 % 치사데이터 부분치사데이터 % 치사데이터 3. 계산식에의한결과산출원수 100 % 에서노출시킨물벼룩의치사및유영저해개체수가 3마리이상 9마리이며, 그외농도에서는치사및유영저해가확인되지않았을경우, 아래의수식을이용하여독성값 (TU : Toxic Unit) 을산출한다. 계산식 : TU = 0.02 ( 치사및유영저해 (%))

45 ( 예시 ) 원수 100 % 에노출시킨물벼룩 20 마리중 5 마리가치사 및유영저해를나타냈으며, 그외농도에서는치사및유영저해가 나타나지않았을경우 ; = TU 0.5 또한다음과같은경우들은별도의계산을통하지않고 TU 값을표기 할수있다. (1) 원수 100 % 에서노출시킨물벼룩의치사및유영저해를보이는 개체수가 0 ~ 2 마리이며, 그외농도에서는치사및유영저해가나타 나지않았을경우, TU = 0 으로표기한다. (2) 원수 100 % 에서노출시킨물벼룩의치사및유영저해를보이는 개체수가 10 마리이며, 그외농도에서는치사및유영저해가나타나 지않았을경우, TU = 1 로표기한다. EC 50 (Effective Concentration of 50 %) 값의정의는시료에노출시킨시험생물종의반수가영향을받는농도이며, 독성값은 100에서 EC 50 값을나눈값을말한다. 따라서이와같은경우 EC 50 값은 100 % 가되며, TU = 100/100으로 1이된다. 비슷한경우로원수 100 % 에노출시킨물벼룩이모두치사및유영저해를나타내고, 원수 50 % 에노출시킨물벼룩의치사및유영저해를보이는개체가 10마리일때 EC 50 값은 50 % 가되며 TU는 2가된다. (3) 원수 100 % 에서노출시킨물벼룩의치사및유영저해개체수가 11 ~ 19마리이며, 그외농도에서는치사및유영저해가나타나지않은경우 1 < TU < 2 로표기한다. 통계프로그램을이용하여산출한 TU값을사용할수도있다. 위예시에서정확한독성값 (TU) 산출을원할경우, 원수 100 % 와원수 50 % 사이에농도를추가하여 ( 예 : 75 %) 재시험하여야한다

46 재시험시시료의최대보관시간을고려한다. 수질오염공정시험기준에서생태독성시료의최대보관시간은시료성상의변화를고려하여 36시간이내로규정하고있으므로, 재시험시시료의최대보관시간을고려해야한다. (4) 원수 100 % ~ 12.5 % 에노출시킨물벼룩의치사및유영저해를보이는개체수가 20마리이며, 6.25 % 에서 11마리이상의물벼룩이치사및유영저해를나타낸경우, 표 11과같이 6.25 % 로더희석하여재시험한다. 통계프로그램을이용하여결과값을산출할때재시험시희석한농도를입력하여결과값을산출한다. 즉, < 표 11> 과같이통계프로그램을이용할때농도 12.5 %, 6.25 %, 3.13 %, 1.56 %, 1.78 % 를입력한다. 이때치사및유영저해가 20마리 (< 표 11> 의희석농도 12.5 %) 인농도를한개포함시켜서결과값을산출한다.) < 표 11> 재시험시통계프로그램의입력농도 시료농도 (%) 노출개체수 치사및유영저해개체수 치사율 (%) 비고 통계프로그램에입력하는 시료농도

47 < 그림 17> 재시험시통계프로그램 (TSK) 결과값산출창 4. Graphical Method (EPA) 본방법은국내시험법에포함되지않으므로연구목적일경우만사용한다. Graphical Method는시험결과가물벼룩이모두생존한농도 (0 % 치사 ) 와모두죽은농도 (100 % 치사 ) 의데이터만존재할경우에사용한다 < 표 12>. 이는그래프에서 0과 100의끝점만존재하기때문에 95 % 신뢰구간이산정되지않고오직 EC 50 값만을계산하는방법이다. Graphical Method는 < 그림 18> 과같이 X축을치사및유영저해율 (%), Y축을 Log 10 ( 시료희석율 ) 으로하여시험결과를 plotting 하고 50 % 치사및유영저해율에대응하는 Y값을구한다. 최종적인 EC 50 값은 Y값의 Log 10 을소거하여산출하며 < 그림 18> 에서산출된 EC 50 값은 % 가된다

48 < 표 12> Graphical method 적용가능사례 시료농도 (%) 노출개체수 치사및유영저해개체수 치사율 (%) 비고 % 치사데이터 % 치사데이터 % 치사데이터 % 치사데이터 % 치사데이터 < 그림 18> Graphical method 를이용한결과산출예시

49 Ⅵ. 생태독성시험정도관리 1. 환경시험검사기관정도관리운영규정가. 목적및대상기관의의무 환경시험검사기관정도관리운영등에관한규정 ( 과학원고시제 호, 정도관리고시 라고함 ) 은정도관리시행을위하여숙련도시험및현장평가등에필요한세부적인사항을규정하고있으며, 대상기관은본정도관리고시 ( 별표 1) 에명시된 시험 검사기관에대한요구사항 에따라기관의운영방침, 목표그리고업무절차등을체계적으로문서화한정도관리시스템을확립, 실행하고, 위사항의주기적인검증및평가를위해과학원장이실시하는정도관리를받아야한다. 나. 정도관리평가분야및방법정도관리평가분야는 (1) 대기, (2) 수질, (3) 먹는물, (4) 폐기물, (5) 토양, (6) 실내공기질, (7) 악취, (8) 잔류성유기오염물질분야등 8개분야이며, 수질분야정도관리대상기관중생태독성항목을수행하는기관의경우수질분야에포함하여수행된다. 숙련도시험은생태독성을수질분야에포함하여시행하며생태독성은 BOD, COD 등과같은평가항목의하나로간주하여평가가진행된다. 그러나생태독성만을분석하는기관은생태독성 1항목으로만숙련도를평가하게된다. 현장평가시에도생태독성은수질분야타항목 (BOD, COD 등 ) 과함께별도의평가표로평가한다. < 표 13> 은환경시험검사기관정도관리운영등에관한규정 ( 별표 4) 에기술된 정도관리평가분야및항목 중수질분야만발췌한것이다. 현재이들항목중예산, 시험방법등의난이성등을고려하여일부항목에대해서만시행중에있다

50 < 표 13> 수질분야숙련도시험평가항목 ( 발췌 ) 중분류 소분류 일반항목 BOD, COD, TOC, 부유물질 (SS), 노말헥산추출물질, 시안 페놀류, 음이온계면활성제, 색도, ph, 온도, DO, 잔류염소, 전기전도도, 클로로필 -a, 탁도, 투명도, 용존유기탄소등 이온류불소화합물, 브롬이온, 암모니아성질소, 염소이온, 퍼클로레이트, 황산이온 영양염류용존총인, 용존총질소, 인산염인, 질산성질소, 총인, 총질소, 아질산성질소 금속류구리, 납, 니켈, 망간, 바륨, 비소, 셀레늄, 수은, 아연, 안티몬, 주석, 철, 카드뮴, 크롬, 6 가크롬, 알킬수은 유기물질다이에틸헥실프탈레이트, 석유계총탄화수소용매추출, 유기인, 폴리클로리네이티드비페닐 휘발성유기화합물 미생물 생태독성 퇴적물 1,4- 다이옥산, 염화비닐, 아크릴로니트릴, 브로모포름, 휘발성유기화합물 (THMs, BTEX 등 ) 총대장균군, 분원성대장균군, 대장균, 식물성플랑크톤 급성독성 함수율, 완전연소가능량, 입도, COD, TOC, 총질소, 총인, 수용성인, 구리, 납, 니켈, 비소, 수은, 아연, 카드뮴, 크롬, 리튬, 알루미늄 2. 숙련도시험 (Proficiency Testing) 가. 숙련도시험구분및진행과정숙련도시험은정기및수시숙련도시험그리고기타의 3가지로구분된다. 정기숙련도시험은전체정도관리대상기관에대하여시행되며이중에는일정규모이상의폐 하수처리시설, 보건소및정수장등도포함된다

51 < 그림 19> 숙련도시험진행과정수시숙련도시험은측정대행업을새로등록하려는경우또는부적합등의사유로정도관리검증서를발급받지못해정도관리를다시받고자한경우수행된다. 그외자율적으로정도관리를받고자하는경우도가능한데이경우전년도 12월말까지과학원정도관리담당부서에신청하여야하며, 일정규모의폐 하수처리시설및정수장은자체숙련도시험 ( 농도가표기된시료배부 ) 으로갈음한다. 연단위로시행되는숙련도시험진행과정은 < 그림 19> 와같다. 생태독성분야숙련도시험은 2015년의경우정규항목 1항목, 예비항목 3항목등총 4개항목으로평가한다. 예비항목으로진행되는 3개숙련도시료에대한분석도정도관리용시료와같이송부된방법에따라정규항목의경우와동일하게분석하고모든분석결과는정도관리홈페이지에입력한다. 생태독성만을분석하는기관의경우정규항목 1건만을가지고숙련도결과를평가하게된다. < 표 14> 는 2015년도숙련도시험을수행하는전분야에대한대상항목등을나타낸것이다

52 < 표 14> 2015 년도숙련도시험항목 분야대상기관대상항목 대기 (2) 수질 (23) 먹는물 (20) 폐기물 (13) 토양 (13) 악취 (3) 실내공기질 (8) 잔 류 성 유 기 오 염 물 질 ( 1 ) 환경유해인자 (7) 대기오염도측정기관 수질오염도측정기관 폐 하수종말처리시설 생태독성시험기관 먹는물수질검사기관 보건소 굴뚝 ( 먼지 ) 시료채취, 대기연속자동측정기운영능력 BOD, COD, SS, 총질소, 총인, Cd, Pb, Hg, As, Cu, Cr, Mn, 시안, 페놀류, 노말헥산추출물질 ( 법정 ), 총대장균군 ( 법정 ), TOC, 클로로폼, 벤젠 BOD, COD, 총질소, 총인 생태독성물질 4 개항목 NH 3 -N, F, NO 3 -N, Cl -, SO 4 2-, Pb, Hg, As, Cd, Cr, 파라티온, 다이아지논, 분원성연쇄상구군, 살모넬라, 쉬겔라, 벤젠, 클로로폼, 시안, 페놀 NH 3 -N, 총대장균군 정수장 NH 3 -N, NO 3 -N, Cl -, 법정기관 분석전문기관 일반 PCBs 고형연료제품 토양오염도검사기관 토양누출검사기관 악취검사기관 실내공기질검사기관 잔류성유기오염물질측정기관 어린이용품 어린이활동공간 Pb, Cr, Cu, Cd, 트라이클로로에틸렌 (TCE), 테트라클로로에틸렌 (PCE) Pb, Cr, Cu, Cd, 혼합유기용제 ( 클로로벤젠, 1,2- 다이클로로에탄, 2- 클로로페놀 ), 혼합유기인 ( 파라티온, 다이아지논, 이피엔 ) 절연유 PCBs 표준시료의확보에따라확정 Cd, Zn, Cu, Pb, TPH, 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 자일렌, 벤조 (a) 피렌, 비소, 니켈 (Ni) 누출검사숙련도 아세트알데하이드, 뷰틸알데하이드, 복합악취 벤젠, 톨루엔, 에틸벤젠, 자일렌, 스타일렌, TVOCs, 석면, 폼알데하이드 다이옥신 표준시료의확보에따라확정 모래중의납, 카드뮴, 비소, 페인트중납, 합성고무중크롬, 카드뮴, 납

53 나. 생태독성분야숙련도시험 실험실간비교에의한숙련도시험은각실험실의수행능력을판단하 기위한것으로이는실험실의편의 (bias), 안정성 (stability) 그리고 반복성 (repeatability) 에대한평가를수행하여판단한다. 이중, 실험 실의편의는표준물질에의한시험으로측정하거나실험실간비교에 의한숙련도시험이실험실편의에대한정보를얻는가장일반적인 방법으로알려져있다 (KATS, 2009). 이숙련도시험은각대상실험 실에서분석하여제출한시험결과를이용, 변동성등을계산하고 z-score 를산출하여평가한다. 그러나생물을이용한실험결과는화 학물질에대한분석과는달리시험생물종의건강상태에많이의존되 므로일관성있는결과도출이쉽지않다. 이런이유로현재생태독 성항목에대한숙련도시험은수년간예비시험으로진행되어왔으며 2015 년에는총 4 개시험용시료중 1 개시료만정규항목으로수행되 고있다. (1) 숙련도시험평가방법 < 예시 > 58 개기관을대상으로실험실간숙련도시험을수행하고그과정및결과를예시하였다. 각실험실에서의생태독성측정은총 3 종의숙련도시험용미지시료에대하여함께배포된분석지침에따라희석토록하고이를 100 % 농도로간주하여수질공정시험기준 ES a ( 물벼룩을이용한급성독성시험법, NIER 2014) 에따라 EC 50 값 (%) 과최종생태독성값 (TU: Toxic Unit) 값을산출토록하였다. 숙련도시험결과를처리하는데일반적으로사용되는통계적방법은 ISO 13528:2005 에기술되어있으며, ILAC_G13:07/2007 Appendix A 에보면 ISO 표준 (standard) 및 IUPAC 권고사항에극한치 (outlier) 들이포함된결과의처리등을위한통계처리방법으로 robust 통계처리 (robust 평균및 robust 표준편차등 ) 를허용하고있다. 이 robust 통계방법은숙련도시험결과중극한치가평균혹은표준편차에미치는영향을최소화시키므로참여실험실들의변동성을측정할때이런극한값들을미리제외시킬필요가없다

54 각시료별로제시한 TU 값을토대로 TU 값에대한 robust 평균및 robust 표준편차를산출하였고, 환경분야시험검사등에관한법률 시행규칙별표 (11 의 2) 정도관리판정기준 에따라 robust z-score 를아래식에따라계산하여판정기준에따라 만족 또는 불만족 으로평가하였다. : robust z-score : 숙련도참여기관의측정값 : 기준값 (robust 평균 ) : 측정값의분산정도 (robust 표준편차 ) 판정기준 : : 만족, : 불만족 (2) 숙련도시험결과평가 각실험실별로계산된 robust 평균 ( ) 및 Robust 표준편차 ( ) 를이용하여산출된 robust z-score 산출결과는 < 표 15> 와같다. 여기에서보면 만족 으로평가된실험실은총 58 개소중 50 ~ 51 개소 (86.2 % ~ 87.9 %) 이었으며, 시험용시료별로볼때 만족 으로평가된총개수는유사하였으나실험실별로는차이를나타냈다. < 표 15> 대상기관별물벼룩에의한숙련도시험용시료독성값및 robust z-score 산출결과 Participants Sample A Sample B Sample C TU z-score TU z-score TU z-score Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_

55 Participants Sample A Sample B Sample C TU z-score TU z-score TU z-score Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_

56 Participants Sample A Sample B Sample C TU z-score TU z-score TU z-score Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ Lab_ robust average robust SD* CV**(%) * SD(standard deviation) ** CV(coefficient of variation) < 그림 20> 은시험용시료 3 종에대하여각실험실에서분석된 TU 값으로산출한 robust z-score 값을해당실험실별로도시한것이다. 3 종의시험용시료에대한각실험실의분석결과를보면 2 종이상의시료에서 를나타내는실험실이다수관찰되었다 (lab-2, lab-23, lab-26, lab-30, lab-46, lab-54, lab-55). 특히 lab-46 은 3 종의시료모두다 를나타냈다. 변동계수 (CV: Coefficient of Variation) 도시료별로 24 % ~ 40 % 정도의범위를보여실험실간편차는비교적큰것으로나타났다. 시험용시료들의 TU 중간값이 3.9 ~ 6.0 수준임을감안할때이렇게실험실간편차가큰이유는 ; 첫째, 시험생물종 ( 물벼룩 ) 의건강성유지에필요한동일한환경에서의지속적인배양과정이부적절한경우이다

57 < 그림 20> 각숙련도시료별실험실간 Robust z-score 분포 생물을이용하여평가를하는경우시험종의건강성에따라결과에대한편차가크게나타날수있으며, 숙련되지않은실험요원의경우물벼룩의상태확인 ( 수컷과암컷의구분, 내구란의생성등 ) 이쉽지않으므로시험생물종의적절한관리가신뢰성있는독성데이터생산에중대한역할을수행한다. 또한주기적인배양액의교체가요구되는데보통일주일단위로볼때월, 수, 금요일에배양액을교체하는것이일반적이나주기적인배양액의교체가원활하게이루어지지않는경우물벼룩의밀도증가또는먹이부족등으로내구란이생성되거나사망에이르는경우도발생될수있다. 주입되는먹이의양도중요한데먹이가너무많은경우조류등이물벼룩몸체에부착되어유영저해를일으킬수있으며적은경우아사하거나부적절한생육환경에따른내구란의생성등이야기될수있다

58 두번째로, 시험과정에서시험생물종 ( 물벼룩 ) 의움직임에대한판단의오류이다. 시험생물종 ( 물벼룩 ) 에미치는독성영향에대한판단은최종적으로물벼룩의움직임을관찰하여영향여부를판정하게되므로오랜경험을가진숙련자의역할이매우중요하다. 현재개정중에있는수질오염공정시험기준의 물벼룩을이용한급성독성시험법 에는 치사 (death) 에대한판단을 일정희석비율로준비된시료에물벼룩을투입하고 24 시간경과후시험용기를손으로살짝두드려주고, 15 초후관찰하였을때독성물질에의해영향을받아움직임이명백하게없는상태 로규정하고있으며, 유영저해 (immobilization) 는 독성물질에의해영향을받아움직임이없을경우로이때, 촉수를움직인다하더라도유영을하지못하는상태 로규정하고있는데실제로관찰해보면무엇보다도어린개체가너무작아육안으로미세한움직임까지관찰하기가쉽지않다는점이며, 움직임에대한판단도실험자에따라다르게평가되기쉬우므로신규실험자는많은경험을가질실험자와일정기간같이관찰하도록하는등오류의최소화를위한조치가필요하다. 생태독성분석기관에대한종합평가 ( 기관평가 ) 는 robust z-score 결과로평가한항목별 ( 숙련도시료 3 종 ) 평가결과를 만족 5 점, 불만족 0 점으로하여총점을 100 점으로아래와같은식에의해환산점수를산출하였다. 적합 으로판정받으려면 2014 년이전까지는 80 점이상, 2015 년이후부터는 90 점이상이어야한다. 총점 환산점수 항목수 3 개숙련도시료모두정규항목으로가정하고위결과를토대로각기관별환산점수를산출하면 2015 년부터적용되는숙련도시험 적합 판정기준점수인 90 점이상인기관수는 44 개기관이고나머지 14 개기관은 부적합 으로평가된다 < 그림 21>

59 < 그림 21> 기관별숙련도시험평가결과 3. 현장평가 (On-site Assessment) 가. 현장평가방법, 기준및결과판정현장평가는정도관리평가위원이대상기관을직접방문하여시험검사기관의시설, 장비및운영실태를평가하는것으로정도관리고시별지 8호및 9호서식에따른 운영및기술점검표 와 시험분야별분석능력점검표 에의해평가한다. 또한대상기관이정기숙련도시험시시행되지않는항목을분석하는기관이거나검증서를발급받은이후영업또는업무실적이저조하여정도관리검증기관의능력유지가어렵다고판단되는경우해당분야또는항목표준물질등에대한실험을수행토록하는방법으로현장평가를수행할수도있다. 이경우해당평가위원은국립환경과학원담당자와사전에협의하여평가방법등을정하여야한다. 정도관리결과에대한최종판정은 정도관리심의회 의심의결과에따르며숙련도시험결과적합으로판정되고현장평가결과가 70 점이상이라할지라도, 현장평가시지적된미흡사항에대한보완조

60 치가제대로이행되지않는경우부적합으로판정될수있다. 현장평 가적합여부의판단방법은다음과같다. 정도관리부적합 판정을받은기관은그판정을통보받은날로부터해당시험 검사등을할수없으며위반시 1년징역또는 500 만원벌금에처해질수있다. 현장평가업무진행과정은 < 그림 22> 와같다. < 그림 22> 현장평가업무진행과정

61 나. 현장평가절차현장평가당일평가과정은 < 그림 23> 과같은순서로진행되며각단계별세부내용은다음과같다. (1) 시작회의시작회의에는현장평가팀과대상기관의대표자및관련업무담당자 ( 품질책임자및기술책임자등 ) 이참석하여현장평가가원활히수행될수있도록한다. 구분 현장평가팀 ( 팀장 ) 대상기관 ( 대표자 ) 역할 ㅇ현장평가의목적, 대상, 방법등설명ㅇ종료회의날짜와개략적인시간을공지 ㅇ대상기관참석자의담당업무및업무추진현황등설명ㅇ시험실순회, 문서평가및시험분야별평가를담당하는직원지정ㅇ현장평가에필요한문서를제출하고, 평가위원들이컴퓨터, 프린터, 회의실등을사용할수있도록조치 < 그림 23> 현장평가순서

62 (2) 실험실순회 평가위원은각시험분야별담당자와함께시료접수창구, 시료보관 실, 자료보관실, 시험실, 저울실, 증류수공급시설및가스저장시설 등대상기관의시험관련환경을순회하면서, 전반적인미흡사항들을 점검한다. 평가팀장은중대한미흡사항 * 의를개최하여, 평가지속여부를협의할수있다. * 중대한미흡사항 (1) 품질문서가없거나, 상당히미흡하여도저히현장평가를진행할수없는경우. (2) 현장평가를시작하는날로부터 1 년이내에중대한미흡사항에해당되는사유로개별법에따라영업정지 1 개월또는업무정지 1 개월이상의행정처분을받은경우. (3) 인력의허위기재 ( 자격증만대여한경우포함 ) (4) 기술능력, 시설및장비가등록 지정 인정기준에미달된경우 (5) 정도관리검증서를발급받은이후정당한사유없이 1 년이상영업또는업무실적이없는경우 ( 용역사업참여실적은인정 ) (6) 숙련도시험에서의아래부정행위가발견된경우 - 3 년간숙련도시험평가결과가보관되어있지않음 - 제출한분석결과에대한원자료 ( 분석결과지, 계산과정등 ) 가보관되어있지않음 - 제출한분석결과와원자료가상호일치하지않음 - 숙련도시험표준시료분석을타기관등에위탁등 (7) 고의또는중대한과실로측정결과를거짓으로산출한경우 - 산출근거가부정확하거나자료검증을위한근거자료가불충분한경우 - 시험성적서의거짓기재및발급등 발견등필요한경우중간회 (3) 문서평가 평가팀장은 운영및기술점검표 에따라조직도 ( 인력현황포함 ), 업

63 무분장서, 시험방법목록, 장비관리기록, 표준용액및시약목록, 시료관리기록, 시험결과보고서등과같은대상기관의정도관리문서및기록물을검토하여적절성여부를평가한다. 아울러평가위원은숙련도시험의부정행위, 시험성적서거짓기재와허위발급여부등을확인한다. (4) 시험분야별평가평가위원은 시험분야별분석능력점검표 에따라실험실환경, 시험방법및관련작업지시서의적절성, 표준용액및시약의관리현황, 분석수행기록, 장비의교정및유지관리기록, 보관중인시험결과및관리기록, 숙련도시험기록등을평가하고필요시현장입회시험이나분석담당자와의질의응답또는품질책임자및기술책임자와의면담을통해평가결과를확인한다. (5) 각분야별점검표작성각점검표내평가항목이대상기관과관련이없는경우평가하지않으며, 각점검표의평가내용중 평점 0 을받은내용은별도양식인 미흡사항보고서 에지적사유를구체적으로기록한다. 다른업무와연관되어재확인이필요한사항은다른평가위원의평가기록과대조하거나별도의방법으로확인토록하고쉽게시정가능한경미한미흡사항은 현지시정조치 라고기재한다 ( 보완조치결과보고불필요 ). 대상기관에서는미흡사항에대한 보완조치결과보고서 를현장평가종료일로부터 30일이내에국립환경과학원으로제출하여야한다. (6) 평가보고서작성평가팀장은각분야별점검표를취합, 검토하고각평가결과를상호대조하여현장평가적합여부를결정한다 ( 최종결과는정도관리심의회에서확정 ). 발견된모든미흡사항은대상기관의의견을포함하여확인절차를밟게되며, 평가위원은지적된미흡사항을수집된정보와근거 ( 관련문서및기준 ) 을바탕으로미흡내용을구체적이고제3자가잘알아볼수있도록명료하게작성한다

64 (7) 종료회의평가팀장은종료회의에서대상기관의대표자, 기술및품질책임자에게현장평가중발견된사항들을설명한다. 대상기관과의견이불일치된평가결과에대해서는종료일로부터 7일이내에이의신청이가능함을공지하고미흡사항에대하여대상기관대표자 ( 혹은위임된자 ) 의확인서명을받는다. 아울러평가팀장은대상기관의참석자에게현장평가이후의보완조치이행및정도관리최종평가결과의통보에대한대략적인일정을설명한다. 평가팀은평가시알게된모든사항에대한기밀을누설하지않을것을약속한다. 다. 현장평가시주로지적되는미흡사항검토 (1) 운영및기술분야 ➀ 자체숙련도시험계획의효율성 ➁ 인력, 장비및시설변경시시험방법운영능력확인의적절성 ➂ 모든직원의품질시스템이해 실행효율성 ➃ 직원교육계획의적절성및교육기록의명확성 ➄ 업무와품질시스템의부합정도 ➅ 직원들의업무분장서및대리자지명의명확성 ➆ 표준물질취급, 보관, 사용절차의적절성 ➇ 시험장비의교정계획및기록, 장비관리에대한적절성 ➈ 기존내용과변경내용식별의효용성 (2) 수질분야 ➀ 인력, 장비교체시, 또는내부정도관리주기에따라검출한계, 정밀도및정확도를측정하고있는지 ➁ 시약과시료를분리하여보관하는지 ➂ 부피측정유리기구에대한교정여부 ➃ 저울은평편하고흔들림이없는곳에위치하고있는지 ➄ 표준물질또는표준용액등보관, 사용시제조일자, 유효기간, 폐기등에관한기록여부 ➅ 측정결과에대한원자료의기록및관리의적절성

65 ➆ 정제수제조장치관리의적절성 ➇ 성적서에담당자및확인자의서명등관리가적절한지 ➈ 시료채취에대한관리및기록이적절한지 ➉ 유지보수에대한기록등장비관리는적절한지 (3) 생태독성분야 ➀ 국립환경과학원에서분양받은물벼룩을배양하고있는지 ➁ 내부정도관리차트를작성하고있는지 ( 표준독성시험월1회이상실시여부 ) ➂ 시료채취용기의적합성 ➃ 시료채취에대한기록및관리가적절한지 ( 시료채취와함께측정하여야할항목의측정여부포함 ) ➄ 성적서에담당자및확인자의서명등관리가적절한지 ➅ 실험실 ( 특히배양실이별도로있는경우배양실포함 ) 의오염예방을위해적절히대처하고있는지 라. 생태독성분야현장평가분석능력점검표 ( 수질 -8) 내용검토 평가표점검내용 1. 시료채취 1-1. 시료채취장비및물품보유여부 시료채취장비및물품보유 ( 관리대장또는구매대장확인 ) 시료채취용기의적합성 ( 수질오염공정시험기준 ES 참고 ) 1-2. 조사목적에적합한지점및위치선정의정확성 산업폐수, 하수, 하천수등수질공정시험기준에안내된용수로 Grab 채수여부 하수및폐수의시료채취 검토및점검사항 물벼룩급성독성시험을위한시료채취용기는물벼룩에영향을주지않는유리제품을사용하도록규정 일부외국에서는독성이나타나지않는다고확인된경우해당플라스틱제품의사용도가능 ( 재사용은금지 ) [ 하천수 ] 에서의시료채취는물오염상태및용수의목적에따라채수지점을선정하며하천본류와하천지류가합류하는경우에는합류이전의각지점과합류이후충분히혼합된지점에서각각채수한다

66 평가표점검내용 지점의적합성 검토및점검사항 하천에서의혼합시료는하천의단면에서수심이가장깊은수면의지점과그지점을중심으로하여좌우로수면폭을 2 등분한각각의지점의수면으로부터수심 2 m 미만일때에는수심의 ⅓ 에서, 수심이 2 m 이상일때에는수심의 ⅓ 및 ⅔ 에서각각채수한다. [ 폐수 ] 는최종방류구에서채취하되최종방류구가여러개인경우는아래그림과같이각방류구에서모두채취한다. 배출허용기준적합여부판정을위하여채취하는시료는시료의성상, 유량, 유속등의시간에따른변화

67 평가표점검내용 1-3. 시료운송방법과보관의적절성 시료운송의적절성 (4 에서냉장보관하여운송 ) 시료별운반시간준수 (24 시간이내도착 ) 저온냉장보관 1-4. 시료채취와함께측정하여야하는항목의측정 ( 채취시간, 수온, ph, DO, 전기전도도, 염분, 잔류염소, 암모니아, 경도등의기록여부 ) 검토및점검사항 를고려하여현장물의성질을대표할수있도록채취하여야하며, 복수채취를원칙으로한다. 복수시료채취방법에는수동으로하는방법과자동으로하는방법이있으며, 수동으로시료를채취할경우에는 30 분이상간격으로 2 회이상채취 (composite sample) 하여일정량의단일시료로한다. 단, 부득이한사유로 6 시간이상간격으로채취한시료는각각측정분석한후산술평균하여측정분석값을산출한다 (2 개이상의시료를각각측정분석한후산술평균한결과배출허용기준을초과한경우의위반일적용은최초배출허용기준이초과된시료의채취일을기준으로한다 ). 자동시료채취기로시료를채취할경우에는 6시간이내에 30분이상간격으로 2회이상채취 (composite sample) 하여일정량의단일시료로한다. ES 에따라시료는시험실에도착할때까지조성의변화가일어나지않도록하여야한다. 시료를채취후즉시시험할수없을때는따로규정이없는한 4 에서운송및보존하되최대 36 시간을초과하지않아야한다. 일부항목은현장에서측정하지않으면그값이변하므로이런항목은반드시현장에서측정하고시료채취기록부에기록하여야한다. 시료채취기록부에기록하여야할사항은지점명, 시료채취시간, 수온, 기온, 유량, 수심, ph, 용존산소, 전기전도도를비롯하여기타관측사항

68 2. 물벼룩배양 평가표점검내용 2-1. 국립환경과학원에서분양받은물벼룩을배양하고있는지에대한여부 ( 분양확인증, 분양요청공문등확인 ) 2-2. 배양액의적절성 정제수제조장치관리의적절성 ( 정제수관리를위한필터의주기적교체에대한기록등 ) 배양액제조에필요한시약보유및보관의적절성 수질오염공정시험기준에따른제조방법적용여부 제조된배양액조성의적절성 ( 제조된배양액조성 (ph 검토및점검사항 으로수질에영향을줄만한시설의상태나환경현황등이며, 산업폐수를채취하는경우는조업시간, 조업내용및생산물품과생산량을비롯하여폐수처리장가동시간과폐수처리방법등이추가되어진다. 특히시료채취지점이염소소독이전인지또는이후인지를명확히기록하며, 현장또는시험실에서염분농도, 암모니아농도및경도를측정하여기록한다. 물벼룩은반드시국립환경과학원에서분양받아사용토록한다 ( 수질오염공정시험기준명시 ). 물벼룩을이용한급성독성시험에사용되는시험생물은 종으로우리나라에서식하지않으며 5.6 mm ~ 6 mm 에달한다. 생태독성시험에주로사용되는시험용물벼룩은 와 등으로알려져있으며, 는우리나라에서서식하는것으로보고되고있다. 크기는약 3.5 mm 정도로 보다작다. 물벼룩을배양하기위한물은오염되지않은것이면어느것이나가능하나시험에서는동질의시험생물을계대배양하여야하므로증류수에필요한시약을첨가하여배양액으로사용한다. 사용하기전 24시간정도폭기 (aeration) 시킨다

69 평가표점검내용 7.6 ~ 8.0, 경도 (160 ~ 180) mg CaCO 3 /L, 알칼리도 (110 ~ 120) mg CaCO 3 /L, 용존산소 3.0 mg/l 이상 ) 에대한주기적인확인여부 ) 검토및점검사항 시약 첨가량 (mg/l) 염화칼륨 (KCl) 8 황산마그네슘 (MgSO 4 ) 120 황산칼슘이수화물 (CaSO 4 2H 2 O) 120 탄산수소나트륨 (NaHCO 3 ) 먹이공급의적합성 ( 등과같은단세포녹조류 (3.0 ~ cells/ml) 및 YCT(yeast, cerophyll, trout chow) 사용여부 ) 2-4. 배양하고있는물벼룩의건강상태 ( 내구란, 수컷, 유영저해, 치사발생여부 ) ES ( 물벼룩을이용한급성독성시험법 ) 에규정된배양액은 EPA배양액 (reconstituted hard water) 과동일한조성을갖는다. ES 에따르면물벼룩의먹이는 등과같은단세포녹조류를사용하고보조먹이로 YCT(yeast, cerophyll, trout chow) 를첨가하여사용할수있다. 보조먹이를사용하는것은 ES 에따른배양액에는장기간배양에서부족할수있는양이온, 음이온등의미량성분이부족하기때문이다. 그러므로단일먹이를사용하는경우는장기간배양에문제가발생할수있으나단세포녹조류를배양할때비타민을투입하면장기간배양에문제가거의발생하지않는다. 물벼룩의건강을온전히확인하기는어려우나배양용기내에서배양하고있는물벼룩의 10 % 이상이죽는다면어떤문제가있는것으로보며, 그배양용기내의물벼룩은일체시험에사용하지않는다. 일반적으로동일한수온, 조도및동일한배양액에충분한양의먹이를공급한다면건강한상태를유지할수있다. 그러나배양중에내구란 (black

70 평가표점검내용 2-5. 실험실청결상태및오염예방에대한적절한대처 3. 장비및물품의관리 검토및점검사항 egg) 이발생하거나수컷이보이면배양용기내에너무많은물벼룩을배양하고있거나먹이부족또는배양온도가저하된것으로판단할수있다. 물벼룩급성독성을시험하기위한시료용기와배양용기는자주사용하는경우내벽에석회성분이침적되므로주기적으로묽은염산용액에담가제거한후세척하여사용하고, 농약, 휘발성유기화합물, 기름성분이시험수에포함된경우에는시험후시험용기세척시 뜨거운비눗물세척 - 헹굼 - 아세톤세척 - 헹굼 과정을추가한다. 시험수의유해성이금속성분에기인한다고판단되는경우, 시험후시험용기세척시 묽은염산 (10 %) 세척혹은질산용액세척 - 헹굼 과정을추가한다 정제수제조장치보유여부물벼룩배양액의제조및시험용기의세척을위한정제수제조장치가있어야한다 항온장치 ( 인큐베이터, 항온수조등 ) 보유여부 3-3. 항온장치의올바른작동여부 - 온도 : 20 ±2 - 조도 : 500 Lux ~ 1,000 Lux - 조명 : 명 : 암 = 16 : 8 물벼룩의배양및시험을위하여일정온도로유지할수있는인큐베이터또는항온수조가있어야한다. 물벼룩배양과시험을별도의독립된공간에서항온항습기등을통하여일정온도를유지한상태에서진행한다면인큐베이터나항온수조가없어도된다. 물벼룩의배양및시험을인큐베이터에서수행한다면온도 (20 ±2 ) 와조도 (500 Lux ~ 1000 Lux) 및조명을규정된바에따라조절할수있으나,

71 평가표점검내용 3-4. 시험및배양에사용되는기기및기구보유여부 ( 배양용기, 시험용기, 스포이드등의보유 ) 3-5. 저울의안정성확인 저울의수평여부 저울내부의흡습제비치여부 저울설치장소의적절성 ( 평편하고흔들림이없는곳 ) 저울내 외부의청결상태유지 검토및점검사항 항온수조와항온항습기를이용하는경우는조도와조명이규정된바를준수할수있는지를확인하여야한다. 물벼룩을얼마나많이배양하느냐에따라수량은달라질수있지만일반적으로시험과배양에필요한기본적인기구는배양용기 (1 L 또는 2 L 비커 ), 시험용기 (50 ml 비커 ), 스포이드또는홀피펫 (25 ml 또는 50 ml) 등이필요하다. 저울은민감한기기이므로별도의저울실을운영하는것이바람직하다. - 이상적인측정환경은실내온도 20 ±2, 상대습도 (45 ~ 60) % 이다. 별도의저울실이있어이러한환경조건을유지하지못하는경우는각저울내부에습기의영향을배제하기위하여정상적인기능을갖고있는흡습제를비치한다. - 저울이설치된장소는먼지가적어야하며, 저울내부도청결하여이전에사용하였던화학물질이남아있지않아야한다. - 저울은진동에매우민감하므로견고한받침대를사용해야하며, 필요시에는석재와같은받침대를사용하여평형을유지한다. - 에어컨, 환풍기와같이진동을유발하는장비는저울가까이에설치하지않는다. - 직사광선이닿지않도록설치한다. - 자기를띠는기계를저울가까운곳에설치하지않도록한다. - 저울발판을돌려수평기의물방울이수평기가운데오도록설치한

72 4. 시험방법 평가표점검내용 4-1. 시료보존기간내시험실시여부 ( 시료채취후 36 시간내시험실시여부 ) 4-2. 시험에사용되는물벼룩의적절성 (2 회이상계대배양이이뤄진어미개체에서생산된 24 시간미만의어린물벼룩을시험에사용하고있는지에대한여부 ) 4-3. 적합한희석수사용및적절한희석배율적용여부확인 ( 수질오염공정시험기준에따른희석수, 희석배율적용여부확인 ) 다. 검토및점검사항 - 저울을사용하기전에는반드시 1 시간이상안정화하여사용하며, 사용후 AC 어댑터를접속한채로대기 ( 스텐바이 ) 상태로놓아둔다. - 처음사용하거나또는사용장소를이동할경우반드시정밀한분동을이용하여검정하여사용한다 ( 주기적인정도검사필수 ). ES 에따라시료채취후즉시시험할수없을때는따로규정이없는한 4 에서운송및보존하되최대 36시간을초과하지않아야한다. ES 에따라시험을실시할때는계대배양 ( 여러세대를거쳐배양 ) 한생후 2주이상의물벼룩암컷성체를시험전날에새롭게준비한용기에옮기고, 그다음날까지생산된생후 24 시간미만의어린개체를사용한다. 물벼룩은배양상태가좋을때 7 일 10 일사이에첫새끼를부화하게되는데이때부화된새끼는시험에사용하지않고같은어미가약네번째부화한새끼부터시험에사용하여야한다. 군집배양의경우, 부화횟수를정확히아는것이어렵기때문에생후약 2주이상의어미에서생산된새끼를시험에사용한다. 독성값이높을것으로예상되는시료는시험하기전에미리배양액을사용하여희석을한다. 또한희석된시료를사용하여산출된독성값에희석배수를곱하여실제시료의독

73 평가표점검내용 4-4. 노출시간의준수 ( 시료에물벼룩을노출하고 24 시간후결과를산출하고있는가?) 4-5. 유영저해및치사판단숙지정도 4-6. 시험방법에따른계산과정의정확성 ( 수질오염공정시험기준에따른생태독성값산출여부 ) 검토및점검사항 성값으로환산한다. ES 에따라시험시간은 24 시간을준수하여야한다. 국가 ( 또는시험방법 ) 에따라서는 48시간후결과산출시험시간 (24시간) 이경과한후시험용기를살며시움직여주고, 15초후관찰했을때아무반응이없는경우를 치사 (death) 라판정하며, 거의치사상태에서촉수정도만움직인다면이를 ' 유영저해 (immobilization)' 라한다. ES 결과보고 에따라독성값을산출한다. (1) 통계적방법을통한 EC 50 을구할수있는경우 : 생태독성값 (TU)= 100/EC 50 (2) 통계적방법을통한 EC 50 을구할수없는경우 : ➀ 100 % 시료에서투입물벼룩의 0 % 10 % 에영향이있는경우 ( 예 : 원수인 100 % 시료에투입물벼룩 20 마리중 0 마리 2 마리가유영저해및치사를보일때 ) 에는 TU 를 0 으로한다. ➁ 원수 100 % 시료에서투입물벼룩의 10 % 49 % 에영향이있는경우에는 0.02 ( 유영저해율또는치사율 ) 로 TU 를계산한다. [ 주 ] 원수인 100 % 시료에투입물벼룩 20 마리중 5 마리가유영저해및치사가관찰되었을때, = 0.5 TU 가된다. ➂ 원수 100 % 시료에서투입물벼룩의 51 % 99 % 에영향이있는경우, 1 < TU < 2 로표시하

74 평가표점검내용 4-7. 결과표현의적절성 ( 적절한단위여부등 ) 5. 정도관리 (QA/QC) 5-1. 표준물질용액제조방법숙지정도 ( 다이크롬산칼륨을이용하여 24시간 -EC 50 값이 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l 범위가되도록제조하였는지에대한여부 ) 검토및점검사항 거나, 필요에따라 100 %, 75 %, 35 %, 12.5 % 로시험수의농도를조절하여다시시험한다. ES 결과보고 를참조하라. 즉, 결과는독성값 TU로표현하며정수단위로표기한다. 물벼룩을이용한급성독성시험에서표준물질은다이크롬산포타슘 (K 2 Cr 2 O 7 ) 이다. ES 정도보증 / 정도관리 에따라표준독성물질시험은배양액에 24 시간 -EC 50 값이 0.9 mg/l 2.1 mg/l 범위가되도록다이크롬산포타슘을제조하여야한다. 다이크롬산포타슘을첨가한표준독성물질용액을이용하여 7.0 분석절차 와동일하게시험하여 - 24 시간 -EC 50 값이 0.9 mg/l 2.1 mg/l 범위를벗어났다면재시험하고, 5-2. 내부정도관리의적절성 내부정도관리차트작성여부 ( 다이크롬산칼륨을이용한표준독성시험월 1 회이상실시여부 ) 시간 -EC 50 값범위의적절성 (EC 50 : 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l) - 재시험결과에서도 24시간-EC 50 값이 0.9 mg/l 2.1 mg/l 범위를벗어났다면원인파악등의조치가필요하며원인을알수없는경우현재의물벼룩을전량폐기하고재분양받는등조치가필요하다. '5-1. 표준물질용액제조방법숙지정도 ' 참조. 표준독성물질시험은월 1 회이상수행하여야하며, 이를내부정도관리차트 (control chart) 로써작성하여야한다

75 평가표점검내용 시간 -EC 50 값이정상범위를벗어났을경우대처방법숙지정도 6. 기록및관리 6-1. 시료채취에대한기록및관리의적절성 6-2. 측정결과에대한원자료의기록및관리의적절성 6-3. 성적서의기록및관리의적절성 ( 담당자, 확인자의서명등 ) 6-4. 모든기록에대한접근의용이성 ( 과거기록을쉽게찾아볼수있어야함 ) 6-5. 모든기록의수정 변경에대한적절한보안조치 7. 실험실폐액처리 검토및점검사항 시험결과에대한근거자료로사용되는시료채취기록부와기기분석의원자료등을명확히보관하고있어야하며, 이들자료가훼손되지않도록관리하여야한다. 시료채취기록부와시험기록부및시험성적서등은담당자와기술책임자의서명이있어야하며, 품질책임자의확인하에보관되거나고객에게송부되어야한다. 생산된모든자료는담당자뿐만아니라제 3 자도쉽게찾아볼수있도록파일링하는것이좋으며, 가능한한성적서와함께모든근거자료를함께파일링하는것을권장한다. 시험 검사기관에서생산되는기록에는품질문서를비롯하여시료채취일지, 시험일지, 시험원자료 (raw data), 계약서, 시험성적서와직원의신원에관한기록까지모두포함된다. 기록의수정은잘못된부분을알수있도록통상두줄로긋되수정된부분은수정한자가누구인지를확인할수있도록서명한다. 시험 검사기관에서생산되는각종기록물은관련규정에따라다를수있으나통상 3 년간보관한다 ( 환경분야시험 검사등에관한법률 또는 환경분야시험 검사업무처리규정 등참조 )

76 평가표점검내용 검토및점검사항 7-1. 실험실폐액처리의적절성시험실에서발생하는폐유기용제등은폐기물관리법에의한지정폐기물이므로이를보관할때는 폐기물관리법시행규칙 제 14 조별표 5 에따라다음과같이관리하여야한다. ㅇ보관창고에보관표지 ( 노란바탕, 검은글씨 ) 를잘보이는곳에부착하여보관 ㅇ보관용기를사용하여보관하는경우, 용기별로폐기물의종류, 양및배출업소등을적은보관표지를붙임 ㅇ지정폐기물외의폐기물과구분하여보관 ㅇ폐유기용제는휘발되지아니하도록밀폐하여보관하되폐유기용제에부식되지않는재질의용기에보관 ㅇ폐산, 폐알칼리, 폐유기용제등은보관이시작된날로부터 45 일, 그밖의지정폐기물은 60 일을초과하여보관하면안됨. 다만, 1 년간배출하는지정폐기물의총량이 3 톤 (2013 년 12 월 31 일까지는 4 톤 ) 미만인사업장의경우에는 1 년의기간내에서보관 지정폐기물의보관창고에는보관중인지정폐기물의종류, 보관가능용량, 취급시주의사항및관리책임자등을적어넣은표지판을다음과같이설치하여야한다. 다만, 드럼등보관용기를사용하여보관하는경우에는용기별로폐기물의종류 / 양및배출업소등을, 지정폐기물의종류가같은용기가여러개있는경우에는폐기물의종류별로폐기물의종류 양및배출업소

77 평가표점검내용 검토및점검사항 등을각각알수있도록표지판에적어넣어야한다. ㅇ보관창고에는표지판을사람이쉽게볼수있는위치에설치하여야한다. ㅇ표지의규격 : 가로 60 센티미터이상 x 세로 40 센티미터이상 ( 드럼등소형용기에붙이는경우에는가로 15 센티미터이상 x 세로 10 센티미터이상 ) ㅇ표지의색깔 : 노란색바탕에검은색선및검은색글자 ㅇ표지판의보기 1 폐기물의종류 : 3 관리책임자 : 5 취급시주의사항 - 보관시 : - 운반시 : - 처리시 : 지정폐기물보관표지 6 운반 ( 처리 ) 예정장소 : 2 보관가능용량 : 톤 4 보관기간 : ~ ( 일간 ) 7-2. 물벼룩의적절한폐기조치 ( 시험에사용된물벼룩을살아있는상태로하수구에유입되지않도록하고있는지에대한여부 ) 물벼룩을폐기할경우에는망으로걸러서건조시키거나물고기의먹이로제공하는등살아있는상태로하수구에유입되지않도록주의해야한다

78 4. 표준독성시험표준독성시험은독성물질에대한물벼룩의민감도와시험결과의신뢰성을확인하기위해월 1회시행한다. 표준독성시험에사용되는표준독성물질은다이크롬산포타슘 (K 2 Cr 2 O 7, 분자량 : ) 으로하며, 표준독성시험은아래와같은절차로수행한다. (1) 표준독성물질조제다이크롬산포타슘 1 g을정확히달아 1 L 부피플라스크에넣고증류수로표선까지정확히채운후표준용액 (stock solution) 으로사용한다. (2) 표준시료조제표준용액 4 ml를정확히취하여 1 L 부피플라스크에넣고배양액으로표선까지정확히채워원수 100 % 시료 ( 다이크롬산포타슘농도 4 mg/l) 로한다. 표준독성시험시원수 100 % 시료의제조농도는내부정도관리를만족하기위한다이크롬산포타슘 EC 50 값정상범위인 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l 와실험자의편의를고려하여원수 100 % 시료의농도를 2 mg/l ~ 5 mg/l 가되도록제조하고사용한다. (3) 생태독성실험원수 100 % 시료를 50 %, 25 %, 12.5 %, 6.25 % 로단계적으로희석하고각농도당 4개의반복구를두고물벼룩 5마리씩을넣어노출시킨다. (4) 결과확인 24시간경과후물벼룩치사및유영저해를확인하여 EC 50 값 (mg/l) 을산출하며, 내부정도관리만족을위한 EC 50 값의정상범위는 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l 이다. < 그림 24> 와같이내부정도관리차트를작성하여월별내부정도관리

79 만족여부를확인한다. 최종결과에서 EC 50 값이정상범위를벗어나는경우, 배양액조성, 배양온도, 먹이상태, 먹이공급량, 외부오염원의유입여부, 시험자의숙련도등을점검해야한다. < 그림 24> 내부정도관리차트 (Control chart) 작성예시

80 Ⅶ. 참고문헌 1. 국립환경과학원. 2012, 산업폐수 염 독성관리방안및공공처리시설 염 고시적용방안연구 2. 국립환경과학원. 2011, 생태독성통합관리제도조기정착을위한과학적기반구축 (IV) 3. 국립환경과학원. 2010, 산업폐수방류수평가를위한물벼룩을이용한급성독성시험에관한실험서 4. 국립환경과학원 생태독성분석기관기술교육자료집. 5. 국립환경과학원 정도관리현장평가내용해설. p 김종민, 신기식, 유순주, 김명옥, 최성헌 국내생태독성분석기관에대한숙련도실험결과평가. 한국물환경학회지 7. Canada. EC, 2000, Biological Test Method : Reference Method for Determining Acute Lethality of Effluents to 8. National Center for Biotechnology Information(US). 2005, Some Parasites of 9. OECD. 2004, sp., Acute Immobilisation Test 10. US. EPA, 2002, Methods for Measuring the Acute Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater and Marine Organisms Fifth Edition 11. UK. EA, 2007, The Direct Toxicity Assessment of Aqueous Environmental Samples Using the Juvenile Immobilisation Test 12. National Bioresource Project, Algae Resource Database, Marinco Bioassay Laboratory website,

81 부록 A. 생태독성측정결과통계프로그램이용방법해설 B. 생태독성정도관리현장평가점검표 C. 폐수종말처리시설의방류수수질기준 D. 수질오염물질의배출허용기준 E. 공공하수처리시설의방류수수질기준

82 A. 생태독성측정결과통계프로그램이용방법해설 1. Probit Method

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87 2. Trimmed Spearman Karber(TSK) Method

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89 3. Graphical Method 를이용한 EC 50 값산출방법 (Excel 이용 )

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91 B. 생태독성분야정도관리현장평가점검표 ( 환경시험 검사기관정도관리운영등에관한규정 별지제 8 호서식 ) 점검표번호 : 수질 -8( 생태독성 : 급성독성 ) 평가기준 평가결과 평가내용 적합 부적합 해당사항없음 평점 1. 시료채취 1-1. 시료채취장비및물품보유여부 시료채취장비및물품보유 ( 관리대장또는구매대장확인 ) 시료채취용기의적합성 ( 수질오염공정시험기준 ES 참고 ) 1-2. 조사목적에적합한지점및위치선정의정확성 산업폐수, 하수, 하천수등수질공정시험기준에안내된용수로 Grab 채수여부 하수및폐수의시료채취지점의적합성 시료운송방법과보관의적절성 시료운송의적절성 (4 에서냉장보관하여운송 ) 시료별운반시간준수 (24 시간이내도착 ) 저온냉장보관 시료채취와함께측정하여야하는항목의측정 ( 채취시간, 수온, ph, DO, 전기전도도, 염분, 잔류염소, 암모니아, 경도등의기록여부 ) 2. 물벼룩배양 국립환경과학원에서분양받은물벼룩을배양하고있는지에대한여부 ( 분양확인증, 분양요청공문등확인 ) 배양액의적절성 정제수제조장치관리의적절성 ( 정제수관리를위한필터의주기적교체에대한기록등 )

92 점검표번호 : 수질 -8( 생태독성 : 급성독성 ) 평가기준 평가결과 평가내용 적합 부적합 해당사항없음 평점 배양액제조에필요한시약보유및보관의적절성 수질오염공정시험기준에따른제조방법적용여부 제조된배양액조성의적절성 ( 제조된배양액조성 (ph 7.6 ~ 8.0, 경도 160 ~ 180 mg CaCO 3 /L, 알칼리도 110 ~ 120 mg CaCO 3 /L, 용존산소 3.0 mg/l 이상 ) 에대한주기적인확인여부 ) 2-3. 먹이공급의적합성 ( 등과같은단세포녹조류 (3.0 ~ cells/ml) 및 YCT(yeast, cerophyll, trout chow) 사용여부 배양하고있는물벼룩의건강상태 ( 내구란, 수컷, 유영저해, 치사발생여부 ) 실험실청결상태및오염예방에대한적절한대처 장비및물품의관리 3-1. 정제수제조장치보유여부 항온장치 ( 인큐베이터, 항온수조등 ) 보유여부 항온장치의올바른작동여부 ( 온도 (20 ±2), 조도 (500 Lux ~ 1,000 Lux), 조명 ( 명 : 암 =16:8)) 3-4. 시험및배양에사용되는기기및기구보유여부 ( 배양용기, 시험용기, 스포이드등의보유 ) 저울의안정성확인 저울의수평여부 저울내부의흡습제비치여부 저울설치장소의적절성 ( 평편하고흔들림이없는곳 ) 저울내 외부의청결상태유지 시험방법

93 점검표번호 : 수질 -8( 생태독성 : 급성독성 ) 평가기준 평가결과 평가내용 적합 부적합 해당사항없음 평점 4-1. 시료보존기간내시험실시여부 ( 시료채취후 36 시간내시험실시여부 ) 4-2. 시험에사용되는물벼룩의적절성 (2 회이상계대배양이이뤄진어미개체에서생산된 24 시간미만의어린물벼룩을시험에사용하고있는지에대한여부 ) 4-3. 적합한희석수사용및적절한희석배율적용여부확인 ( 수질오염공정시험기준에따른희석수, 희석배율적용여부확인 ) 4-4. 노출시간의준수 ( 시료에물벼룩을노출하고 24 시간후결과를산출하고있는가?) 유영저해및치사판단숙지정도 시험방법에따른계산과정의정확성 ( 수질오염공정시험기준에따른생태독성값산출여부 ) 결과표현의적절성 ( 적절한단위여부등 ) 정도관리 (QA/QC) 5-1. 표준물질용액제조방법숙지정도 ( 다이크롬산포타슘을이용하여 24 시간 -EC 50 값이 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l 범위가되도록제조하였는지에대한여부 ) 5-2. 내부정도관리의적절성 내부정도관리차트작성여부 ( 다이크롬산포타슘을이용한표준독성시험월 1 회이상실시여부 ) 시간-EC 50 값범위의적절성 (EC 50 : 0.9 mg/l ~ 2.1 mg/l) 시간-EC 50 값이정상범위를벗어났을경우대처방법숙지정도 6. 기록및관리 시료채취에대한기록및관리의적절성 측정결과에대한원자료의기록및관리의적절성

94 점검표번호 : 수질 -8( 생태독성 : 급성독성 ) 평가기준 평가결과 평가내용 6-3. 성적서의기록및관리의적절성 ( 담당자, 확인자의서명등 ) 6-4. 모든기록에대한접근의용이성 ( 과거기록을쉽게찾아볼수있어야함 ) 적합 부적합 모든기록의수정 변경에대한적절한보안조치 실험실폐액처리 7-1. 실험실폐액처리의적절성 물벼룩의적절한폐기조치 ( 시험에사용된물벼룩을망등을이용하여살아있는상태로하수구에유입되지않도록하고있는지에대한여부 ) < 환산점수계산 > - 평점총점 : 평점기준의적합점수합계 - 평점제외점수 : 해당사항없는항에대한평가기준의적합점수합계 해당사항이없는항은그항의평가기준이적합인점수를기록 - 평점합 : 평가결과의평점합계 평점합환산점수 평점총점 평점제외점수 1 0 해당사항없음 평점

95 C. 폐수종말처리시설의방류수수질기준 ( 수질및수생태보전에관한법률시행규칙제 26 조 [ 별표 10] < 개정 >) 1. 방류수수질기준 적용기간및수질기준 구분 생 물 화 학 적 산 소 요 구 량 ( B O D ) ( m g / L ) 화 학 적 산 소 요 구 량 ( C O D ) ( m g / L ) 부 유 물 질 ( S S ) ( m g / L ) 총 질 소 ( T - N ) ( m g / L ) 총 인 ( T - P ) ( m g / L ) 총 대 장 균 군 수 ( 개 / m L ) 생 태 독 성 ( T U ) 까지 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 4 ( 8 ) 부터 까지 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 4 ( 8 ) 부터 까지 이후 Ⅰ 지역 Ⅱ 지역 Ⅲ 지역 Ⅳ 지역 Ⅰ 지역 Ⅱ 지역 Ⅲ 지역 Ⅳ 지역 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 0. 2 ( 0. 2 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 0. 3 ( 0. 3 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 0. 5 ( 0. 5 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 2 0 ( 3 0 ) 4 0 ( 6 0 ) 4 ( 8 ) 3, , , , , , ( 1 ) 1 ( 1 ) 1 ( 1 ) 1 ( 1 ) 1 ( 1 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 4 0 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 2 0 ) 0. 2 ( 0. 2 ) 3, ( 3, ) 1 ( 1 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 4 0 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 2 0 ) 0. 3 ( 0. 3 ) 3, ( 3, ) 1 ( 1 ) 1 0 ( 1 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 2 0 ) 0. 5 ( 0. 5 ) 3, ( 3, ) 1 ( 1 ) 1 0 ( 1 0 ) 4 0 ( 4 0 ) 1 0 ( 1 0 ) 2 0 ( 2 0 ) 2 ( 2 ) 3, ( 3, ) 1 ( 1 ) ( 비고 ) 1. 산업단지및농공단지폐수종말처리시설의페놀류등수질오염물질의방류수수질기준은위표에도불구하고해당처리시설에서처리할수있는수질오염물질항목으로한정하여 ( 별표 13) 제 2 호나목의표중특례지

96 역에적용되는배출허용기준의범위에서해당처리시설설치사업시행자의요청에따라환경부장관이정하여고시한다. 2. 적용기간에따른수질기준란의 ( ) 는농공단지폐수종말처리시설의방류수수질기준을말한다. 3. 생태독성항목의방류수수질기준은물벼룩에대한급성독성시험기준을말한다. 4. 생태독성방류수수질기준초과의경우그원인이오직염 ( 산의음이온과염기의양이온에의해만들어지는화합물을말한다. 같다 ) 성분때문이라고증명된때에는그방류수를법제 2 조제 9 호의공공수역중항만또는연안해역에방류하는경우에한정하여생태독성방류수수질기준을초과하지아니하는것으로본다. 5. 제 4 호에따른생태독성방류수수질기준초과원인이오직염성분때문이라는증명에필요한구비서류, 절차ㆍ방법등에관하여필요한사항은국립환경과학원장이정하여고시한다. 2. 적용대상지역 구분범위 Ⅰ 지역 가. 수도법 제 7 조에따라지정ㆍ공고된상수원보호구역 나. 환경정책기본법 제 22 조제 1 항에따라지정ㆍ고시된특별대책지역중수질보전특별대책지역으로지정ㆍ고시된지역 다. 한강수계상수원수질개선및주민지원등에관한법률 제 4 조제 1 항, 낙동강수계물관리및주민지원등에관한법률 제 4 조제 1 항, 금강수계물관리및주민지원등에관한법률 제 4 조제 1 항및 영산강ㆍ섬진강수계물관리및주민지원등에관한법률 제 4 조제 1 항에따라각각지정ㆍ고시된수변구역 라. 새만금사업촉진을위한특별법 제 2 조제 1 호에따른새만금사업지역으로유입되는하천이있는지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역

97 구분범위 Ⅱ 지역법제 22 조제 2 항에따라고시된중권역중화학적산소요구량 (COD) 또는총인 (T-P) 의수치가법제 24 조제 2 항제 1 호에따른목표기준을초과하였거나초과할우려가현저한지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역 Ⅲ 지역법제 22 조제 2 항에따라고시된중권역중한강ㆍ금강ㆍ낙동강ㆍ영산강ㆍ섬진강수계에포함되는지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역 (Ⅰ 지역및 Ⅱ 지역을제외한다 ) Ⅳ 지역 Ⅰ 지역, Ⅱ 지역및 Ⅲ 지역을제외한지역

98 D. 수질오염물질의배출허용기준 ( 수질및수생태보전에관한법률시행규칙제 34 조 [ 별표 13] ) 1. 지역구분적용에대한공통기준가. 제2호각목및비고의지역구분란의청정지역, 가지역, 나지역및특례지역은다음과같다. 1) 청정지역 : 환경정책기본법시행령 ( 별표 1) 제3호에따른수질및수생태계환경기준 ( " 수질및수생태계환경기준 " 이라한다 ) 매우좋음 (Ⅰa) 등급정도의수질을보전하여야한다고인정되는수역의수질에영향을미치는지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역 2) 가지역 : 수질및수생태계환경기준좋음 (Ⅰb), 약간좋음 (Ⅱ) 등급정도의수질을보전하여야한다고인정되는수역의수질에영향을미치는지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역 3) 나지역 : 수질및수생태계환경기준보통 (Ⅲ), 약간나쁨 (Ⅳ), 나쁨 (Ⅴ) 등급정도의수질을보전하여야한다고인정되는수역의수질에영향을미치는지역으로서환경부장관이정하여고시하는지역 4) 특례지역 : 환경부장관이법제49조제3항에따른공동처리구역으로지정하는지역및시장 군수가 산업입지및개발에관한법률 제8조에따라지정하는농공단지나. 자연공원법 제2조제1호에따른자연공원의공원구역및 수도법 제7조에따라지정 공고된상수원보호구역은제2호에따른항목별배출허용기준을적용할때에는청정지역으로본다. 다. 정상가동중인공공하수처리시설에배수설비를연결하여처리하고있는폐수배출시설에제2호에따른항목별배출허용기준 ( 같은호나목의항목은해당공공하수처리시설에서처리하는수질오염물질항목만해당한다 ) 을적용할때에는나지역의기준을적용한다

99 2. 항목별배출허용기준 가. 생물화학적산소요구량 화학적산소요구량 부유물질량 대상규모 1일폐수배출량 2천세제곱미터이상 1일폐수배출량 2천세제곱미터미만 항목 지역구분 생물화학적산소요구량 ( mg /L) 화학적산소요구량 ( mg /L) 부유물질량 ( mg /L) 생물화학적산소요구량 ( mg /L) 화학적산소요구량 ( mg /L) 부유물질량 ( mg /L) 청정지역 가지역 나지역 특례지역 ( 비고 ) 1. 하수처리구역에서 하수도법 제28조에따라공공하수도관리청의허가를받아폐수를공공하수도에유입시키지아니하고공공수역으로배출하는폐수배출시설및 하수도법 제27조제1항을위반하여배수설비를설치하지아니하고폐수를공공수역으로배출하는사업장에대한배출허용기준은공공하수처리시설의방류수수질기준을적용한다. 2. 국토의계획및이용에관한법률 제6조제2호에따른관리지역에서의같은법시행령 ( 별표 20) 제1호차목및 ( 별표 27) 제2호타목 (( 별표 20) 제1호차목에따른공장만해당한다 ) 에따른공장에대한배출허용기준은특례지역의기준을적용한다. 나. 페놀류등수질오염물질 1) 삭제 < >, 2)~4), 6): 생략

100 5) 2014 년 1 월 1 일부터 2015 년 12 월 31 일까지적용되는기준 항목 지역구분 청정지역 가지역 나지역 특례지역 수온이온농도 5.8~ ~ ~ ~8.6 노말헥산추출물질함유량 광유류 ( mg /L) 동식물유지류 ( mg /L) 페놀류함유량 ( mg /L) 시안함유량 ( mg /L) 크롬함유량 ( mg /L) 용해성철함유량 ( mg /L) 아연함유량 ( mg /L) 구리 ( 동 ) 함유량 ( mg /L) 카드뮴함유량 ( mg /L) 수은함유량 ( mg /L) 유기인함유량 ( mg /L) 비소함유량 ( mg /L) 납함유량 ( mg /L) 가크롬함유량 ( mg /L) 용해성망간함유량 ( mg /L) 플로오르 ( 불소 ) 함유량 ( mg /L) PCB 함유량 ( mg /L) 불검출 총대장균군 ( 群 ) ( 총대장균군수 ) ( ml ) 100 3,000 3,000 3,000 색도 ( 도 ) 온도 ( ) 총질소 ( mg /L) 총인 ( mg /L) 트리클로로에틸렌 ( mg /L) 테트라클로로에틸렌 ( mg /L) 음이온계면활성제 ( mg /L) 벤젠 ( mg /L) 디클로로메탄 ( mg /L) 생태독성 (TU) 셀레늄함유량 ( mg /L) 사염화탄소 ( mg /L) ,1- 디클로로에틸렌 ( mg /L)

101 항목 지역구분 청정지역 가지역 나지역 특례지역 1,2- 디클로로에탄 ( mg /L) 클로로포름 ( mg /L) 니켈 ( mg /L) 바륨 ( mg /L) ,4- 다이옥산 ( mg /L) 디에틸헥실프탈레이트 ( D E H P ) ( mg / L ) 염화비닐 ( mg /L) 아크릴로니트릴 ( mg /L) 브로모포름 ( mg /L) ( 비고 ) 1. 색도항목의배출허용기준은 ( 별표 4) 제 2 호 18) 의섬유염색및가공시설, 같은호 19) 의기타섬유제품제조시설및같은호 23) 의펄프ㆍ종이및종이제품 ( 색소첨가제품만해당한다 ) 제조시설에만적용한다. 2. 생태독성배출허용기준은물벼룩에대한급성독성시험을기준으로하며, ( 별표 4) 제 2 호의 3), 12), 14), 17) 부터 20) 까지, 23), 26), 27), 30), 31), 33) 부터 40) 까지, 46), 48) 부터 50) 까지, 54), 55), 57) 부터 60) 까지, 63), 67), 74), 75) 및 80) 에해당되는폐수배출시설에만적용한다. 다만, 해당사업장에서배출되는폐수를모두폐수종말처리시설또는 하수도법 제 2 조제 9 호에따른공공하수처리시설에유입시키는폐수배출시설에는적용하지아니한다. 3. 청정지역에설치된영 ( 별표 13) 에따른제 3 종부터제 5 종까지의사업장에적용하는생태독성배출허용기준은 TU 2 를적용하되, 2016 년 1 월 1 일부터는 TU 1 을적용한다. 4. 가지역, 나지역, 특례지역에적용하는생태독성배출허용기준의경우별표 4 제 2 호의 18), 48) 및 80) 에해당하는폐수배출시설은 TU 4 를적용하고, 같은호의 31) 및 33) 에해당하는폐수배출시설은 TU 8 을적용하되, 2016 년 1 월 1 일부터는모두 TU 2 를적용한다. 5. 삭제 < > 6. 생태독성 (TU) 배출허용기준초과원인이염 ( 산의음이온과염기의양이온에의해만들어지는화합물을말한다. 같다 ) 으로증명된경우로서