48(6)-08(김준석).fm

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1 , pp 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 김경섭 김준석 경기대학교화학공학과 수원시영통구이의동산 94-6 (2010 년 6 월 1 일접수, 2010 년 7 월 8 일채택 ) Optimization of Ammonia Percolation Process for Ethanol Production from Miscanthus Sinensis Kyoung-Seob Kim and Jun Seok Kim Department of Chemical Engineering, Kyonggi University, 94-6, Yiui-dong, Yeongtong-gu, Suwon-si, Gyeonggi , Korea (Received 1 June 2010; accepted 8 July 2010) 요 약 당질계및전분질계바이오매스 (1 세대바이오매스 ) 의단점은식량고갈의문제로인한원료수급이불안정하여원료비상승과함께원료확보라는문제에당면해있다. 이를해결하기위한다양한대책이모색되었고그대책으로목질계바이오매스 (2 세대바이오매스 ) 에대한연구가이루어져왔다. 그러나목질계바이오매스는매우복잡하고어려운 Lignin 제거문제에직면하게되었다. 그리하여현재는기존의바이오매스의단점을극복할새로운바이오매스인비식용작물의관심이증가하고있다. 비식용작물바이오매스는당질계및전분질계바이오매스와달리식량문제로인한원료비의상승이나원료확보면에서안전하며또한기존목질계바이오매스에비해보다쉽게 Lignin 을제거할수있는장점이있다. 본논문에서는이러한비식용작물중 Cellulose 함량이높고 Lignin 함량이상대적으로낮은억새를이용하여암모니아공정전처리의최적화조건을연구하였다. 공정변수로는암모니아농도, 반응시간, 반응온도를선정하였으며전처리후각반응물의 Cellulose 함유율, Lignin 함유율, 잔류고체량및가수분해도를반응표면분석법을이용하여최적전처리조건을확립하였다. 최적조건탐색결과는암모니아반응농도 ; 11.27%, 반응온도 ; o C, 반응시간 ; min 으로최적반응조건을결정할수있었으며최적조건으로전처리후억새의상대적인 Cellulose 함유율 ; 39.98%, Lignin 함유율 ; 8.01%, 가수분해도 ; 85.89% 의결과를얻어, 억새가기존목질계바이오매스들보다전처리및당화발효에있어유리한기질이라고결론지을수있다. Abstract Lignocellulose(2 nd generation) is difficult to hydrolyze due to the presence of lignin and the technology developed for cellulose fermentation to ethanol is not yet economically viable. However, recent advances in the extremely new field of biotechnology for the ethanol production are making it possible to use of agriculture residuals and nonedible crops biomass, e.q., rice straw and miscanthus sinensis, because of their several superior aspects as agriculture residual and nonedible crops biomass; low lignin, high contents of carbohydrates. In this article, as the basic study of AP(Ammonia Percolation), the properties and the optium conditions of process were established, and then the overall efficiency of AP was investigated. The important independent variables for AP process were selected as ammonia concentration, reaction temperature, and reaction time. The percolation condition for maximizing the content of cellulose, the enzymatic digestibility, and the lignin removal was optimized using RSM(Response Surface Methodology). The determined optimum condition is ammonia concentration; 11.27%, reaction temperature; o C, and reaction time; min. The satisfying results were obtained under this optimized condition, that is, the results are as follows: cellulose content(relative); 39.98%, lignin content(relative); 8.01%, and enzymatic digestibility; 85.89%. Key words: Biomass Pretreatment, Ammonia Percolation, Enzymatic Hydrolysis, Bio Ethanol 1. 서론 최근화석연료사용에따른고유가와지구온난화문제로인한대체에너지개발이활발히진행되고있는가운데, 세계각국에서는차 To whom correspondence should be addressed. jskim84@kyonggi.ac.kr 세대연료로서바이오에탄올의보급이급속하게진행되고있다. 대기중의 CO 2 농도는초기산업화이래거의 25% 가증가되었으며, 과거 30년동안 CO 2 농도의증가율은훨씬더크다. 이에미국은 2017 년까지석유소비를 20% 줄이는대신바이오에탄올등의대체에너지이용을확대하고 (20 in 10) 2025년까지는에너지의 25%(25 25 VISION) 까지확대하며, 2030년에는자동차가솔린의 30% 를 704

2 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 705 (30 30 VISION, 2004년기준 ) 바이오에탄올로공급한다는계획을수립하였다. 또한유럽, 일본, 중국도바이오에탄올생산확대정책을추진중에있다. 이처럼세계적으로화석연료의의존도를낮추기위한대체에너지개발과정책에전력을다하고있다 [1-3]. 이러한대체에너지중바이오연료로통용되는바이오에탄올은그중심에있다. 바이오에탄올이란일반적으로식물을원료물질로하여생산되는에탄올을말한다. 바이오에탄올은크게사탕수수와옥수수등으로부터 ( 제 1세대바이오매스 ) 생산되는당분질, 전분질계에탄올과나무와같은바이오매스 ( 제 2세대바이오매스 ) 를원료로하여생산되는섬유질계에탄올로구분될수있다. 이들바이오매스의일반적인바이오에탄올생산공정은맥주생산공정과비슷하여탄수화물을 Glucose( 포도당 ) 로전환하고, 생성된 Glucose를이용하여발효하는공정인생물공정에의해생산된다. 이렇듯바이오에탄올은재생가능한원료로부터얻어지며오염물질을거의배출하지않아환경친화적인연료이고, 온실가스의양을줄일수있다는특성을갖고있다 [4-7]. 현재세계에공급되는대부분의에탄올은설탕과옥수수로부터생산되는당분질계혹은전분질계에탄올이다. 그러나기존바이오에탄올의주된원료가되어온제 1세대바이오매스와그대체원료인제2세대바이오매스는각각그들이가지고있는문제점에당면해있다. 제 1세대바이오매스는식량고갈문제로인한장기적인관점에서의원료수급의불안정으로인한원료비상승과원료확보의문제점이나타났으며궁극적으로이들바이오매스로부터생산되는에탄올로전세계가필요로하는에탄올수요량을충족시킬수없다는것이다. 그리고이러한문제점의대안인제 2세대바이오매스중목질계바이오매스의문제점은 Lignin 제거과정인전처리공정으로인한생산비용의상승과함께, 낮은생산성의문제로이어져제1세대바이오매스와비교하였을때경제성이낮아여러가지로개선해야할부분이존재한다 [8,9]. 그러나본논문에서다루고자하는억새와같은비식용작물바이오매스는식량고갈의문제를극복할수있는동시에목질계바이오매스와는달리 Lignin의함량이낮고 Lignin 제거방법에있어서도수월하다는장점을가지고있어목질계바이오매스의문제또한극복할수있기때문에차세대바이오매스로서각광받고있다. 따라서본논문에서는억새를이용하여기존 Lignin 제거에가장효과가좋은암모니아전처리방법중암모니아침출공정의최적화조건을설정하기위해반응표면분석법을이용하여최적화조건을설정하는연구를수행하였다 [10-13]. Fig. 1. Schematic diagram of experimental setup of batch process. 보관하여사용하였다 전처리장치최적조건설정을위해설계된실험조건에따라각각의암모니아반응농도, 반응시간, 반응온도로고액비율 1:10(1 g : 10 ml) 으로억새를단일반응기를이용하여전처리하였다. 암모니아침출공정 (AP) 의최적조건을설정하기위한단일반응기는 Fig. 1에나타내었다. 실험장치는 Preheating oil bath, Main oil bath, 각각의온도조절장치로이루어져있으며반응기는길이가 180 mm 내경이 9mm의 Tube 형태이며암모니아의부식을방지하기위해 SUS재질로제작되었다. 암모니아침출반응은단일반응기에의해결정된최적조건으로 20 g의기질을 200 ml의암모니아용액 (1:10) 으로반응시켰으며이를반응표면분석법으로결정된최적조건의결과와비교하였다. 암모니아침출반응기는 Fig. 2에나타내었다. 액체저장고, 펌프, 오븐, 침 2. 실험재료및방법 2-1. 재료본실험에사용된바이오매스는비식용작물계열의억새를창해에탄올연구소로부터공급받아사용하였다. 기질은 40 mesh를통과한균일한크기를사용하였으며 45 o C에서건조하여수분이제거된기질을사용하였다. 사용된효소는한국에너지기술연구소 (KIER; Korea Institute of Energy Research) 로부터공급받은 Celluclast (Cellulase, Novo Co., Denmark) 와 Novozyme-188(β-glucosidase, Novo Co., Denmark) 를사용하였다. 평균비활성도는 Filter paper activity가 65FPU/ml, b-glucosidase activity는 48CBU/ml로측정되었다. 에탄올을생산하기위한균주로는 Saccharomyces cerevisiae를인큐베이터에서 30 o C로 24시간동안종균배지로 YPD(Yeast extract, Peptone, Dextrose)Broth를사용하여종균배양한후 4 o C에서냉동 Fig. 2. Schematic diagram of experimental setup of ammonia percolation process.

3 706 김경섭 김준석 출반응기, 유출액체저장고로구성되었으며침출반응기의길이는 190 mm 내경이 30 mm의 Tube 형태이고 SUS 재질로제작되었다. 반응기의부피는 cm 3 이다. 질소봄베와연결하여압력을조절하여고온에서의액체증기화를방지하였고용액의흐름은펌프미터와압력게이지에의해조절하였다. 전처리된억새는증류수를사용하여잔류암모니아를세척하고 45 o C oven에서건조하여수분을제거하였다 [12,14,15] 효소당화및가수분해도결정당화실험은기존 Cellulose 계열의최적당화조건인 50 o C, ph 4.8 로 72시간동안진행하였다. 삼각플라스크에 sodium citrate buffer (0.5 M, ph4.8) 와전처리된억새를기질농도 5%(w/v) 로혼합하여 Autoclave에서 121 o C로 15분동안멸균한후상온으로냉각시켜효소를 60FPU/ml의양으로접종하였고 50 o C의 Shaking incubator 안에서 180 RPM의속도로교반을시키며당화를진행하였다 [16]. 효소는 Celluclast와 Novozyme-188을 Cocktail(3:1) 하여접종하였다. 이후일정시간단위로시료를채취하여 HPLC를통해분석하였다. 분석에사용된 Column과 Detector는 Aminex HPX-87-H column과 Waters 410 RI detector이다. 이동상은 M의 H 2 SO 4 용액, 유속은 0.6 ml/min, Column과 Detector의온도는 50 o C로운전하였다 [22]. 가수분해도는다음과같이정의된다. Enzymatic digestibility = The amount of glucose released(g) 0.9 Total initial glucan (g) 2-4. 발효발효실험은 4 o C로냉장보관되었던 Sachharomyces cerevisiae 균주를사용하여 YPD media에 Activation시키고당화액은 121 o C에서 15분동안멸균한후상온으로냉각시켰다. Activation된균주를당화액의 10%(v/v) 양을취하여이를멸균된당화액에혼합한후 38 o C의 Shaking incubator 안에서 180 RPM의속도로교반을시키며발효를진행하였다 [16,17]. 에탄올수율은다음과같이정의된다. [EtOH]f - [EtOH]O Ethanol yield = 100% f[biomass] 2-5. 분석방법전처리전후의억새의성분분석은미국신재생에너지연구소 (NREL) 로부터제공된 Chemical Analysis and Testing Standard Procedure LAP-002 와 LAP-003을따라당및 Lignin 성분등으로분석하였다 [22]. 여러당성분의분석에는 HPLC(Waters Co.,USA) 를사용하였으며, Aminex HPX-87-P column과 Waters 410 RI detector로분석하였다. 이동상은증류수, 유속은 0.6 ml/min, Column과 Detector의온도는 85 o C로맞추어분석을실시하였다 [22]. 전처리최적공정을찾기위해서는반응표면분석법을이용하였다. 반응온도, 반응시간, 암모니아반응농도를공정변수로설정하였으며반응후고체잔존류, Glucose 함유율, Lignin 함유율, 당화율및 Ethanol 수율등을고려하여최적반응조건을설정하였다 [11,18-21]. 실험은 Central composite 방법으로설계되었으며다음표과같다. 반응표면분석은 Design Expert 7.1 Software를사용하였다. 3. 결과및고찰 3-1. 전처리전, 후의성분분석억새의전처리전, 후의성분을미국신재생에너지연구소 (NREL) 의분석방법에따라분석하였으며전처리전억새의구성성분을 Table Table 1. Composition of various biomass Miscanthus E.F.B Bagasse sinensis Cassava stem Rigida Glucose (%) Xylose (%) Lignin (%) Ash (%) Others (%) Fig. 3. The effect of ammonia concentration of AP process on the composition of glucose and lignin.

4 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 707 1에나타냈다. 억새의전처리전성분은대표적인목질계바이오매스인리기다와기타대표적인바이오매스들과비교하였을때 Cellulose 및 Hemi-cellulose의성분이높으며당화저해를일으키는 Lignin의성분은적은것으로나타났다. 이는기존목질계바이오매스를전처리할때필요한에너지보다작은에너지로전처리를할수있을것으로예상할수있다 암모니아반응농도에따른영향설계된실험을수행후그결과를이용해반응온도는 o C, 반응시간을 20 min으로고정시키고 5% 에서 15% 까지의암모니아반응농도변화에따른기질의상대적인 Glucose 함유율과 Lignin 함유율변화에대해조사해보았다. Fig. 3에서나타나듯이반응농도가증가함에따라 Glucose 함유율의변화는암모니아반응농도가 5% 일때약 39% 이고암모니아반응농도가15% 일때약 38% 로 Glucose 함유율손실이거의없다는결론을얻었다. Fig. 3에서보이듯이 Lignin 함유율변화에대해서는암모니아반응농도가 5% 일때 Lignin 함유율이약 10% 인데반해암모니아반응농도가 15% 일때는 Lignin 함유율이약 8% 로 Lignin 함유율이낮아지는결과를얻었다. 이는암모니아반응농도는 Glucose 함유율변화보다 Lignin 함유율변화에더밀접한관계를가지고있음을알수있다 반응온도에따른영향암모니아농도는 11.27%(wt/wt), 반응시간을 20 min으로고정시키고 140 o C에서 190 o C까지의반응온도변화에따른기질의상대적인 Glucose 함유율과 Lignin 함유율변화에대해조사해보았다. Fig. 4. 에서보이듯이 140 o C 온도에서는 Glucose 함유율이 38.7% 로손실이거의없지만 190 o C에서는 Glucose 함유율이 36.8% 로약 2% 의손실이일어나반응온도가증가함에따라 Glucose 함유율이감소됨을알수있다. 반면반응온도에따른 Lignin 함유율의변화는 Fig. 4에나타나듯 140 o C에서약 9% 정도의 Lignin 함유율을나타냈고 190 o C 에서는약 8% 의함유율을나타내어온도가증가함에따라 Lignin의함유율이다소감소하기는하지만커다란변화는없는것으로나타났다. 이는반응온도가 Glucose 함유율변화에더밀접한관계가있음을알수있다 반응시간에따른영향암모니아반응농도는 11.27%(wt/wt), 반응온도를 o C로고정시키고 10 min에서 60 min까지의반응시간변화에따른기질의상대적인 Glucose 함유율과 Lignin 함유율변화에대해조사해보았다. Fig. 5에서나타나듯이반응시간이증가함에따라 Glucose 함유율의변화는반응시간이 10 min일때약 39% 이고반응시간이 50 min일때약 35% 로반응시간이길어질수록 Glucose 함유율이감소한다는결과를얻었다. 또한 Fig. 5에서보이듯이 Lignin 함유율변화에대해서도반응시간이 10 min일때 Lignin 함유율이약 8.5% 인데반해반응시간이 60 min일때 Lignin 함유율이약 6.8% 로 Lignin 함유율이낮아지는결과를얻었다. 이는반응시간이 Glucose 함유율변화와 Lignin 함유율변화둘모두와밀접한관계를가지고있음알수있다 RSM분석에의한암모니아침출공정의최적조건 공정변수설정암모니아침출공정의최적조건을설정하기위해서반응표면분석법 (Response Surface Methodology) 을사용하였다. 주요변수로는암모니아농도, 반응온도, 반응시간을선정하였으며이외다른변수들이영향을미칠수있지만다른변수들은암모니아반응농도나반응시간등과상관관계를가지므로위세가지조건에대해최적화가이루어지면나머지변수들도최적화가이루어진것으로간주될수있다. 반응표면분석법은둘이상의공정변수가존재할때공정변수가미치는반응계의영향을반응표면으로가시화시켜다양한공정변수들의고유한기여뿐만아니라변수들간의상호작용을이해하여공 Fig. 4. The effect of temperature of AP process on the composition of glucose and lignin.

5 708 김경섭 김준석 Fig. 5. The effect of time of AP process on the composition of glucose and lignin. Table 2. The central composite design for the response surface methodolog Level Ammonia concentration (%) Reaction temperature ( o C) Reaction time (min) Run X(1) a X(2) b X(3) c X(1)a : Coded value of ammonia concentration. X(2)b : Coded value of reaction temperature. X(3)c : Coded value of reaction time. 정변수를최적화하는데유용하게이용된다 [20] 실험계획 Table 2에서보여지는것처럼 Central composite 설계에따라반복실험을통해독립변수의변화에따라 17가지조건에서실험을수행 Table 3. The result of batch reaction under varuous conditions Run Result Glucose content (%) Lignin content (%) 하여통계적으로분석되어종속변수 (Glucose 함유율, Lignin 함유율 ) 에대한회귀방정식을얻어반응조건에대한상호영향및최적반응조건을구하였다 [20] 공정변수에대한영향위실험계획에따른 17가지조건에서실험을수행한각기질의 Glucose 함유율과 Lignin 함유율에대한결과를 Table 3에나타내었다. Glucose 함유율은최대 39.25%, 최저 33.37% 를얻었으며 Lignin 의함유율은최대 10.60%, 최저 5.54% 를얻었다. 각독립변수에따른 Glucose 함유율은 Fig. 3-5에보여지듯이반응시간에따른영향이매우크다는것을알수있으며, 반면암모니아반응농도와반응온도에있어서는큰영향을받지않음을알수있다. Fig. 6은독립변수들의상호관계에의한 Glucose 함유율변화를

6 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 709 Fig. 6. The effect of AP conditions on the composition of glucose. 나타낸것이고반응시간을 20 min으로고정하였을때는반응온도가암모니아반응농도보다영향이더큰것으로나타났으며 (Fig. 6(a), (d) 암모니아반응농도를 11.27% 로일정하게유지하였을때는반응온도에대한영향보다는반응시간에대한영향이더욱큰것으로나타났다 (Fig. 6(c),(f)). 마지막으로반응온도를 o C로유지하였을때역시암모니아반응농도보다는반응시간에대한영향이더큰것을알수있다 (Fig. 6(b),(e)). 이로서 Glucose의손실을최소화하기위해서는반응시간을짧게가지고가는것이유리하다는결론을얻을수있다. Lignin 함유율의각독립변수에따른영향은 Fig. 3-5를비교해보았을때암모니아반응농도와반응시간에따른영향이크다는것을알수있다. Fig. 7은독립변수들의상호관계에의한 Lignin 함유율변화를나타낸것이며반응시간을 20 min으로고정하였을때는암모니아반응농도가반응온도보다영향이더큰것으로나타났으며 (Fig. 7(a),(d)) 암모니아반응농도를 11.27% 로일정하게유지하였을때는반응온도에대한영향보다는반응시간에대한영향이더욱큰것으로나타났다 (Fig. 7(c),(f)). 마지막으로반응온도를 o C로유지하였을때역시암모니아반응농도보다반응시간에대한영향이더큰것을알수있다 (Fig. 7(b),(e)). 이로서 Lignin의추출을최대화하기위해서는암모니아반응농도를높이고반응시간을길게가지고 가는것이유리하다는결론을얻을수있다. 이와같은결과는암모니아가흡착반응을통해 Lignin을제거하는것을간접적으로알수있으며또한 Linin 제거에있어서암모니아의농도가매우중요함을알수있다. 이들의결과를다중회귀분석을통해종속변수에대한반응표면방정식을얻어내었다. 반응표면방정식은각각다음과같이나타났다. Glucose = * Conc * Temp * Time * 10 3 * Conc. * Temp * 10 3 * Conc. * Time * 10 3 * Temp. * Time * 10 3 * Conc * 10 3 * Temp * 10 3 * Time 2 Lignin = * Conc * Temp.

7 710 김경섭 김준석 Fig. 7. The effect of AP conditions on the composition of lignin * Time * 10 3 * Conc. * Temp * 10 3 * Conc. * Time * 10 4 * Temp. * Time * 10 3 * Conc * 10 3 * Temp * 10 4 * Time2 로 설정하고 Lignin 함유율은 최소로 설정하여 Glucose의 손실을 최 소화하고 Lignin의 제거는 최대화할 수 있는 조건을 Table 4에 나타 내었다. 위와 같은 조건으로 암모니아 침출 공정을 수행하여 최적조 건에서의 설정된 결과와 비교해 보았다. 비교 결과 Glucose 함유량 은 39.98%, Lignin 함유량은 8.01%로 다소 만족할 만한 결과를 얻 Glucose 함유율에 대한 회귀계수 값은 0.92이며 Lignin 함유율에 대한 회귀계수 값은 0.96으로 둘 다 잘 일치함을 알 수 있다 최적조건 설정 위의 결과를 종합하여 암모니아 침출 공정의 최적공정조건을 반 응표면분석법을 이용하여 확립할 수 있었다. Glucose 함유율은 최대 Table 4. The effect of AP treatment on the composition and enzymatic digestibility of biomass with the optimized condition Glucose Lignin Enzymatic Ethanol content (%) content (%) digestibility (%) yield (%) Untreatment biomass AP treated biomass AP condition; Ammonia concetration : 11% Reaction Temperature: 157 oc Reaction Time: 10 min Fig. 8. The enzymatic digestibility of pretreated biomass and by saccharification.

8 억새를이용한바이오에탄올생산을위한암모니아침출공정최적화 711 Table 5. The enzymatic digestibility of pretreated biomass and the production of ethanol by saccharification and fermentation Whatman paper. Untreated biomass 었다. 이후전처리된기질을 ph 4.8의 sodium citrate buffer에기질농도 5 wt/vol% 로맞추고효소를 65 FPU/ml를첨가하여 72시간동안당화하였을때 Fig. 8에서보여지듯이당농도는 g/l였으며이는당전환율 85.9% 로매우높은결과를얻을수있었다. 이후 Saccharomyces cerevisiae 효모를사용하여 48시간동안의발효실험을통해 Table 5에서보여지듯이 13.4 g/l의에탄올농도를얻었으며이는이론수율의 90.24% 로매우높은수준의에탄올수율을얻었다. 이러한결과를토대로억새가기존의목질계바이오매스에비해전처리에사용되는에너지소모가적으며높은수준의에탄올을얻어낼수있어바이오매스로서의충분한가치를가지고있다는결론을지을수있다. 4. 결론 단일반응기를이용하여억새에대한암모니아침출공정의최적조건최적화에대하여조사하였다. 반응표면분석을이용하여탐색되어진공정조건은암모니아반응농도 ; 11.27%, 반응온도 ; o C, 반응시간 ; min으로결정되었다. 최적조건으로암모니아공정을수행한결과 Glucose 함유율은 44.27% 에서 39.98% 로 Glucose의손실을최소화하였으며반면 Lignin 함유율은 20.62% 에서 8.01% 로 61.15% 감소하여암모니아침출공정을이용한억새의전처리가기존의목질계바이오매스의전처리보다에너지손실이적고효소가수분해도또한 85.89% 로전처리되지않은억새와비교했을때 81.79% 증가하였고에탄올발효에있어서도 g/l로이론수율의 90.24% 을얻어당화와발효과정에있어도기존목질계바이오매스보다유리한기질로작용할수있다는결론을내릴수있다. 참고문헌 Pretreated biomass by ARP Glucose (g/l) Ethanol (g/l) Lee, J. K. and Bransby, D., Biofule Industry and Recent Research in USA. J. Kor. Grass. Forage Sci., 28(2), (2008). 2. Hahn-Hagerdal, B., Galbe, M., Gorwa-Grauclund, M. 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