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시완 빈
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1 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(4): (2014) ISSN / eissn 연구논문 전자선조사를이용한볏짚의친환경전처리공정 이병민 1, 이진영 1, 김두영 1, 홍성권 2, 강필현 1, 전준표 1 * Environmentally-Friendly Pretreatment of Rice Straw by an Electron Beam Irradiation Byoung-Min Lee 1, Jin-Young Lee 1, Du-Yeong Kim 1, Sung-Kwon Hong 2, Phil-Hyun Kang 1, and Joon-Pyo Jeun 1 * 접수 : 2014 년 4 월 3 일 / 게재승인 : 2014 년 8 월 18 일 2014 The Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Abstract: The autoclaving assisted by an irradiation pretreatment method was developed without toxic chemicals to produce fermentable sugars for their conversion to bioethanol. In the first step, electron beam irradiation (EBI) of rice straw was performed at various doses. The electron beam-irradiated rice straw was then autoclaved with DI water at 120 o C for 1 h. A total sugar yield of 81% was obtained from 300 kgy electron beam-irradiated rice straw after 72 h of enzymatic hydrolysis by Cellulase 1.5L (70 FPU/mL) and Novozyme-188 (40 CbU/mL). Also, the removal of hemicellulose and lignin was 32.0% and 32.5%, respectively. This result indicates that the environmentally-friendly pretreatment method of rice straw by an electron beam irradiation could be applied for bioethanol production in plant. Keywords: Rice straw, Biomass, Pretreatment, Bioethanol, Electron beam 1. INTRODUCTION 바이오매스 (biomass) 는원재료를직접사용하거나전환공정 1 한국원자력연구원공업환경연구부 1 Research Division for Industry & Environment, Korea Atomic Energy Research Institute, Jeongeup , Korea Tel: , Fax: jpjeun@kaeri.re.kr 2 충남대학교공과대학고분자공학과 2 Department of Polymer Science and Engineering, Chungnam National University, Daejeon , Korea 을거쳐에너지원으로사용할수있는모든생물자원으로정의된다 [1]. 바이오매스중지구상에서가장풍부한목질계바이오매스로부터연료와화학물질이생산되어왔으며현재는옥수수등전분질계바이오매스가에탄올생산의주가되고있다. 바이오매스는재료별 1 세대, 2 세대, 3 세대바이오매스로구분되며이중 1 세대바이오매스는식량자원문제와직결되어있는만큼원료확보의어려움과원료비의상승을이유로세계적으로바이오에탄올수요량을충족시킬수없다. 1 세대바이오매스의대체라고할수있는 2 세대바이오매스중섬유소계리그노셀룰로오스 (lignocellulose) 바이오매스는볏짚 (rice straw), 보릿짚 (wheat straw), 옥수수짚 (corn straw), 사탕수수찌꺼기 (sugarcane bagasse) 등이있으며양이풍부하고가격이낮은장점을지니고있다. 리그노셀룰로오스 (lignocellulose) 의주요성분은셀룰로오스 (cellulose), 헤미셀룰로오스 (hemi-cellulose), 리그닌 (lignin) 세가지의고분자이다. 셀룰로오스는글루코스 (glucose) 가 β-1,4- 글루코시딕결합 (β-1,4-glucosidic bond) 으로반복되어이루어져있으며결정성 (semi-crystallinity) 을띈다 [2]. 그리고헤미셀룰로오스는펜토오스 (pentoses), 헥소오스 (hexoses), 아세틸화당 (acetylated sugar) 으로이루어져있는무정형고분자 (amorphous polymer) 이며 [3] 리그닌은페닐프로펜단위들 (phenyl propane units: p-coumaryl, coniferyl and sinapyl alcohol) 이 C-C, C-O-C 결합으로이루어진무정형고분자이다. 이러한세가지고분자가주요성분인리그노셀룰로오스는구조상글루코스, 자일로스등의당으로전환될수있는탄수화물고분자 ( 셀룰로오스와헤미셀룰로오스 ) 가물리화학적결합에의하여리그닌에둘러싸여있으며이는당전환시효소와미생물의접근성을저해한다. 그러므로이들의효율적인당전환을위하여셀룰로오스, 헤미셀룰로오스를리

2 298 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(4): (2014) 그닌과의분리를위한전처리가필수적이다 [4]. 바이오매스전처리의목적은여러가지전처리방법에따라다음과같이서술하였다. 전처리의방법으로는대표적으로물리적방법, 화학적방법, 생물학적방법등이있다. 물리적방법으로는바이오매스의입자크기를줄이고셀룰로오스의결정화도를낮추기위한분쇄법 (comminution: ball, colloid, hammer, compressioin) [5], 바이오매스입자의기공크기와표면적증가, 결정화도의감소를목적으로하는조사법 (irradiation: electron beam, gamma-ray, microwave) [6], 헤미셀룰로오스의선택적인가수분해를목적으로하는증기폭쇄법 (steam explosion) [7] 등이있다. 화학적방법으로는헤미셀룰로오스의선택적인제거를목적으로하는산에의한가수분해법 (acid hydrolysis) [8], 리그닌의선택적인제거를목적으로하는염기에의한가수분해법 (alkaline hydrolysis) [9], 암모니아섬유폭쇄법 (ammonia fiber explosion) [10] 등이있다. 또한, 생물학적방법으로는리그닌의제거를위한미생물법 (microbe) [11] 이있다. 더불어, 최근에는각각의전처리법의단점을보완하기위하여여러가지방법을결합시킨복합전처리방법이많이발표되고있다 [12]. 여러가지전처리방법중에서가장널리쓰이는방법은산과염기를이용한가수분해법이다. 산가수분해법은바이오매스를주로황산을이용하여산의농도에따라고온또는저온에서처리하는방법으로헤미셀룰로오스의선택적인제거로인한셀룰로오스의표면적증가에는효과적이나헤미셀룰로오스의손실로인하여자일로스의수율이현저히감소함과동시에반응중간생성물이당화억제제로작용하여결과적으로전처리효율을저해시키는단점을갖고있다 [13]. 또한, 염기처리는주로고농도의수산화나트륨을이용하여고온고압으로처리하는방법으로리그닌의제거에는효과적이나고농도의염기를사용함으로전처리후슬러리의중화등이요구된다 [14]. 볏짚은세계적으로연간생산량이약 7~8 억톤으로밀짚 (wheat straw), 옥수수짚과함께가장많은농업폐기물이고목질계바이오매스보다상대적으로리그닌의함량이낮고결합구조가약하여바이오에탄올생산을위한원재료로서잠재력이높은후보군이라할수있다 [15-17]. 본연구에서는볏짚을전자선조사 (electron beam irradiation) 와물찜 (autoclaving) 의두단계로친환경적인전처리를하였으며전자선조사량에따른볏짚의구성성분변화, 당수율, 그리고물리화학적물성변화를분석하여글루코스, 자일로스등의추출과산업현장에서의적용가능성을검토하였다. 2. MATERIALS AND METHOD 2.1. 재료본연구에사용된바이오매스는한국원자력연구원첨단방사선연구소시험농장에서 2013 년에재배한볏짚을사용하였다. 효소당화를위한기질로서볏짚을그라인더 (grinder) 를이용하여분쇄한후 35 mesh 체를이용하여 500 µm 이하의볏짚 을얻어낸후 40 o C 의진공오븐에서 24 시간건조하였다. 건조된볏짚은전자선조사를위하여알루미늄팩에 5 mm 두께로밀봉하였다. 효소당화에사용된 Celluclast 1.5 L (Cellulase 1.5 L, Novo Co., Denmark) 와 Novozyme-188 (β-glucosidase, Novo Co., Denmark) 은 Sigma-Aldrich 社에서구입하였다. 구연산나트륨 (sodium citrate buffer, 0.1 M, ph 4.8) 을제조하여효소당화시완충용액으로사용하였다. 또한, high performance liquid chromatography (HPLC) 분석시초순수증류수 (B&J HPLC certified solvent, SK Chemical) 를이동상 (mobile phase) 으로사용하였다 전자선조사및물찜전처리건조된볏짚의전자선조사는 2.5 MeV 의빔에너지를갖는 ELV-8 type 선형전자빔가속기 (EB Tech. Co., Korea) 를사용하여 25 kgy/scan 의조사강도로조사하였으며이때, 전류세기는 25 ma, 카트속도는 10 m/min 이었다. 전자선조사량은각각 50, 100, 200, 300, 500 kgy 이었으며각각의조사량에따라볏짚은이하 E50, E100, E200, E300, E500 으로명명하였다. 조사된볏짚 15 g 을증류수 285 g 에첨가하고오토클레이브에서 120 도에서 1 시간동안물찜을하였으며물찜이끝난후냉각된증류수로반응을종료시킨후종이필터 (Whatman No.1) 를이용하여증류수로수차례에걸쳐세척한뒤효소당화에앞서 40 o C 의진공건조오븐에서 24 시간건조하였다 효소당화효소당화의기질로서건조된볏짚은기존리그노셀룰로오스바이오매스의최적당화조건을적용하여효소당화를수행하였다 [18]. 볏짚농도 5% (w/v) 로구연산나트륨 (0.1 M, ph 4.8) 완충용액에첨가한후 70 filter paper units (FPU)/mL, 40 cellobiase units (CbU)/mL 의평균활성도를갖는 Celluclast 1.5 L 과 Novozyme-188 효소를각각첨가하였다. 그리고 50 o C 의진탕배양기 (shaking incubator) 에서 150 rpm 으로교반하면서 24, 48, 72 시간동안수행하였다 볏짚의당수율분석전처리조건에따른당수율분석은효소당화액의상층을채취하여 0.2 µm 주사기필터로여과된당화액을 HPLC (Shimazu Co., Japan) 에서수행하였다. HPLC 분석은 column 에이동상으로초순수증류수를 0.6 ml/min 의유속으로흘려주며 Aminex HPX-87P column (Bio-Rad, USA) 을이용하여분리하고 RI detector (410 refractive index detector, Waters, USA) 로검출하는절차로수행하였다. 이때, column 과 detector 의온도는모두 65 o C 이었다 볏짚의성분분석전처리조건에따른볏짚의구성성분의변화는미국신재생에너지연구소 (National Renewable Energy Laboratory, NREL) 의보고서 [19,20] 와미국펄프제지학회 (Technical association of the pulp and paper industry) 의 TAPPI standard and suggested

3 전자선조사를이용한볏짚의친환경전처리공정 299 methods [21] 에따라수행하였다. 성분분석의방법은리그노셀룰로오스의펄핑 (pulping) 과정과유사하며성분분석을마친후건조된무게로구성성분의함량비를나타내었다. 리그닌의함량은볏짚과 72% (w/w) 의황산을 30 o C 에서 1 시간동안교반한볏짚 / 황산혼탁액에냉각된증류수를첨가하여황산의농도가 4% 에도달할때까지희석하고 120 o C 에서 1 시간동안찜 (autoclaving) 을한후세척, 건조된무게를측정함으로서얻을수있다. 셀룰로오스의함량은볏짚을 NaClO/glacial acetic acid/di water 용액과 75 o C 에서 1 시간의교반과정을 5 회반복하고역시이를세척, 건조된무게를측정하였다 적외선분광분석전처리전후의볏짚의화학구조변화는 ATR-FTIR (Bruker Vertex 70 spectrometer, Germany) 을이용하여 4,000~500 cm -1 의파장범위에서 4cm -1 의해상도로 64 번스캔하여흡광도를분석하였다 X- 선회절분석전처리전후의볏짚의결정지수 (crystalliniy index, CrI) 를 X- 선회절기 (X'pert Powder, PANalytical, Netherlands) 를이용하여 40 kv, 30 ma, Cu Kα (λ=1.54 Å) 조건에서 5~50 o 의 2θ 범위에서분석하였다. 3. RESULTS AND DISCUSSION 3.1. 볏짚의성분과무게변화전처리전볏짚의구성성분은약 41.1% 의셀룰로오스, 약 25.3% 의헤미셀룰로오스, 약 19.8% 의리그닌외약 13.8% 의이물질이었으며전처리조건에따라셀룰로오스와헤미셀룰로오스의상대적인함량변화를 Table 1 에나타내었다. 일반적인리그노셀룰로오스의구조는 Fig. 1 과같으며서론에서언급한바와같이효소당화의대상인셀룰로오스와헤미셀룰로오스가리그닌에의하여둘러싸여있으므로리그닌이효소의접근을방해한다. 그러므로리그닌을효과적으로제거하거나리그닌과의물리화학적결합력을약화시킴으로써효소당화대상의표면적을증가하는것이전처리의목적이다. 전처리된볏짚에서셀룰로오스의상대적인함량은전자선조사량에따라증가하여 500 kgy 를조사하고물찜과정을거쳐전처리전의 41.1% 에서 52.8% 로약 11.1% 증가하였고헤미셀룰로오스와리그닌의제거율은각각약 32%, 32.5% Fig. 1. Structure of cellulose-hemicellulose-lignin complex linkage. 이었다. 이러한결과들은서론에서언급한바와같이리그노셀룰로오스의표면적증가를목적으로하는물리적방법의하나인전자선조사전처리를수행하고물찜을통하여셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌간의화학적결합을유연하게하여리그닌과이물질이제거된결과이다. 볏짚의경우이물질의함유량이다른바이오매스에비하여높으며특히증기폭쇄전처리법에서이물질의제거율이높다고알려져있으나 [22,23] 증기폭쇄법은리그닌과당으로전환이가능한탄수화물간의분리에효과적이지못하다 [24]. 볏짚의전자선조사후증기폭쇄법과유사한물찜과정을수행하여이물질의약 76.5% 를제거하였다 당수율분석당수율의경우기존의연구들은바이오매스의이론적당량대비실제당화된양으로계산하였으나본연구에서는당화전바이오매스의총량대비실제당화된양으로다음과같은공식으로계산하였다. 당수율 (%) = 추출된당의무게전처리된볏짚의무게 100 Fig. 2 에서알수있듯이전처리전의볏짚의당수율은 72 시간효소당화를기준으로약 49.4% 를보였다. 그러나전처리후볏짚의당수율은전자선조사량에비례하여증가하는경향을보였으며전자선조사량이 200, 300 kgy 일때각각약 72.5%, 81.0% 이었다. 그러나 300 kgy 이상의전자선조사시당수율은약 82% 정도에서수렴하였고결과적으로당수율 80% 를얻기위하여필요한전자선조사량은 300 kgy 이었다. Table 1. Composition and Mass Balance of Rice Straw Samples Samples (g) Cellulose % (g) Hemicellulose % (g) Lignin % (g) Ash % (g) Raw (15.0) 41.1 (6.16) 25.3 (3.79) 19.8 (2.97) 13.8 (2.07) E50 (13.6) 44.8 (6.09) 25.1 (3.43) 19.8 (2.71) 10.3 (1.41) E100 (12.6) 47.9 (6.03) 24.6 (3.14) 19.7 (2.42) 7.8 (0.99) E200 (12.3) 48.5 (5.96) 24.5 (3.11) 19.5 (2.27) 7.5 (0.95) E300 (11.3) 50.7 (5.72) 24.3 (2.74) 19.0 (2.09) 6.0 (0.72) E500 (10.7) 52.8 (5.64) 24.0 (2.58) 19.0 (2.00) 4.2 (0.48)

300 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(4): 297-302 (2014) Fig. 2. Sugar yields obtained using different pretreatment conditions. Fig. 3.

4 300 Korean Society for Biotechnology and Bioengineering Journal 29(4): (2014) Fig. 2. Sugar yields obtained using different pretreatment conditions. Fig. 3. Variations in the sugar yields based on the hydrolysis time (24, 48, and 72 h). 전처리의효율적인측면에서판단해볼때 72 시간효소당화수행을기준으로글루코스의경우전처리전볏짚대비 70% 이상향상된당수율을보였고자일로스는전처리전볏짚에서는효소당화에의하여추출되지않았으나전처리를한시료에서당화하기시작하여전자선조사량에비례하여당수율이증가하였다. 이는전처리공정후헤미셀룰로오스의표면적증가로인하여효소접근성이증가된결과로판단된다. 더불어 72 시간의효소당화를거쳐추출된당의종류와당수율을전자선조사량에따라 Table 2 에자세히표기하였다. 서론에서언급된대표적인전처리공정인산처리법과증기폭쇄법은약 70~80% 정도의높은당수율을얻을수있는장점이있다. 그러나산전처리시필연적으로생성되는반응중간생성물인푸르푸랄 (furfural), 하이드록시메틸푸르푸랄 (HMF) 등이발생하여바이오매스의다당류가단당류로전환될때당화억제제로작용함과동시에이로인한환경오염을초래하며 [25] 증기폭쇄전처리는약 160~200 o C 의고온에서진행되어에너지소비가큰것으로알려져있다 [26]. 그러나전자선조사를이용한전처리법은부가생성물이거의생성되지않는것으로알려져있으므로 [27] 전자선조사와증기폭쇄법에비하여낮은온도조건에서의물찜을이용한전처리공정을이용하여유해한화학물질을사용하지않고에너지소비의절감을통하여친환경적이고높은당수율을얻을수있었다. Fig. 3 에나타낸바와같이당수율은효소당화시간과전자선조사량에비례하여증가하였다. 더불어, 500 kgy 조사시효소당화 24 시간만에약 70% 의당수율을얻을수있었다. 이는전자선조사로인하여효소에의하여당화되는셀 룰로오스와헤미셀룰로오스의표면적이증가하였고물찜과정을거치면서이물질의제거와동시에셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 리그닌의세가지구성성분간결합력이약화됨으로인한효소접근성의향상에이유가있다. 이를통하여전자선조사 [28] 와물찜 [29] 단일공정과비교시각각 50%, 45% 에서 30~35% 증가된약 80% 의당수율을얻음으로써전자선조사와물찜의시너지효과를확인하였다 물리화학적특성변화전처리전과후의볏짚의물리화학적특성변화는적외선분광분석과 X- 선회절분석을통하여알아보았다. Fig. 4 에서알수있듯이전처리전후의주요피크들은 1,000~1,200 cm -1 의파장범위내의셀룰로오스와헤미셀룰로오스피크들과 1,300 ~1,800 cm -1 의파장범위내의리그닌관련피크들이다. 3,303 cm -1 부근의피크는셀룰로오스내부의수소결합에의한 O-H 스트레칭으로인하여나타난다 [30]. 2,917 cm -1 부근의피크는셀룰로오스내메틸렌그룹의 C-H 스트레칭으로인하여나타나며전처리후피크의강도가약간증가하는것으로알려져있다 [31]. 1,733 cm -1 부근의피크는헤미셀룰로오스와리그닌간의에스터결합관련피크혹은헤미셀룰로오스내아세틸 (acetyl) 그룹의피크로알려져있으며이피크강도의감소는리그닌과헤미셀룰로오스의결합력의감소를의미한다 [32]. 896, 1,155 cm -1 부근의피크는 β-1,4- 글루코시딕결합 (β-1,4-glycosidic bond) 으로나타나며전처리후피크강도가증가하였으며이는셀룰로오스의상대적함량이증가한것을의미한다. 전처리에의한볏짚의구조분석을위한 Table 2. Sugar Yields (%) of Untreated and Pretreated Rice Straw after 72 h of Enzymatic Hydrolysis Samples Glucose Xylose Mannose Galactose Arabinose Total Raw E E E E E

5 전자선조사를이용한볏짚의친환경전처리공정 301 Fig. 4. FT-IR spectra indicating changes in the chemical structures of untreated and pretreated samples. Table 3. Characteristics of Absorption Band in FTIR Spectra of Pretreated Rice Straw Absorbance band (cm -1 ) Assignment Functional groups 3,303 Cellulose O-H stretching (hydrogen bond) 2,917 Cellulose C-H stretching (methylene group) 1,733 Hemicellulose C=O ester linkage (acetyl group) 1,155 Cellulose C-O-C stretching (glycosidic bond) 896 Cellulose C-O-C (β-(1,4)-glycosidic bond) 오스와리그닌과같은무정형영역을제거하여결정성을높이는전처리의효율성을나타내는인자이다. 결정지수의증가는볏짚의결정영역인셀룰로오스의상대적인함량의증가가원인이며 Fig. 5 에서알수있듯이결정지수가증가할수록당수율또한증가한다. 전처리전의볏짚의결정지수는 46.5% 에서 500 kgy 조사시 55.1% 로약 8% 이상증가하여전자선조사량에따라결정지수가비례하여증가함으로써결과적으로당수율에영향을미침을확인할수있었다. 셀룰로오스에의한볏짚의결정성은당수율에큰영향을미치는요인으로볏짚의결정지수증가의원인은앞서언급한바와같이전처리후볏짚의무정형영역인헤미셀룰로오스와리그닌이각각약 32%, 32.5% 제거된결과로해석할수있다. 4. CONCLUSION 2 세대바이오매스볏짚을이용하여전자선조사후물찜전처리공정을수행하고이를분석하였다. 볏짚은전자선 300 kgy 이상조사후물찜처리를한볏짚에서효소당화를거쳐약 65% 의글루코스와자일로스를포함하는약 81% 정도의당수율을얻을수있었다. 이전처리공정은유해한화학물질을사용하지않아친환경적이며전자선조사량에따라당수율의조절이용이한장점들을지니고있다. 따라서이전처리법을통하여생산된당들은발효과정을거쳐바이오에탄올생산등의산업현장에의적용가능성이높다는것을알수있었다. Acknowledgements 본연구는한국원자력연구원기본연구사업연구비지원에의하여수행되었으며이에감사드립니다. REFERENCES Fig. 5. Crystallinity index measured by XRD for the different pretreatment conditions. 주요피크들의자세한정보를 Table 3 에나타내었다. 전처리조건에따른결정지수의변화는다음과같은공식으로계산하였다. CrI (%) I cry I am I cry = I cry 는 2θ=22.4 o 에서결정형영역의피크강도이고 I am 는 2θ= 18.4 o 에서무정형영역의피크강도이다. 결정지수는전처리로인하여리그노셀룰로오스의주요구성성분인헤미셀룰로 1. Standard Terminology Relating to Biotechnology, ASTM E Li, M. F., Y. M. Fan, F. Xu, R. C. Sun, and X. L. Zhang (2010) Cold sodium hydroxide/urea based pretreatment of bamboo for bioethanol production: Characterization of the cellulose rich fraction. Ind. Crop. Prod. 32: Girio, F. M., C. Fonseca, F. Carvalheiro, L. C. Duarte, S. Marques, and R. Bogel-Lukasik (2010) Hemicelluloses for fuel ethanol: A review. Bioresource Technol. 101: Demirbas, A. (2008) Heavy metal adsorption onto agro-based waste materials: A review. J. Hazard. Mater. 157: Hideno, A., H. Inoue, T. Yanagida, K. Tsukahara, T. Endo, and S. Sawayama (2012) Combination of hot compressed water treatment and wet disk milling for high sugar recovery yield in enzymatic hydrolysis of rice straw. Bioresource Technol. 104:

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