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1 KAERI/CM-1230/2009

2 제출문 한국원자력연구원양성자기반공학기술개발사업단장귀하 이보고서를 " 양성자빔을이용한바이오매스전처리와당화효소고생성균주개발 " 과제 ( 세부과제 : " 이용자프로그램개발및운영 ") 의보고서로제출합니다 주관연구기관명 : 고려대학교산학협력단주관연구책임자 : 김승욱연구원 : 이진영 " : 송윤석 " : 이상준 " : 신현용 " : 김성봉협동연구기관명 : 협동연구책임자 : - 1 -

3 보고서요약서 과제고유번호 B-3-1 해당단계연구기간 ~ 단계구분 (2 단계 )/ (3 단계 ) 연구사업명 양성자기반공학기술개발사업 연구과제명 세부과제명이용자프로그램개발및운영 위탁과제명 연구책임자김승욱 연구기관명및소속부서명 고려대학교화공생명공학과 양성자빔을이용한바이오매스전처리와당화효소고생성균주개발해당단계총 : 4 명정부 : 25,000천원해당단계참여내부 : 4 명기업 : 천원연구비연구원수외부 : 명계 : 25,000천원 총연구기간참여연구원수 총 : 8 명내부 : 8 명외부 : 명 참여기업명 총연구비 정부 : 50,000천원기업 : 천원계 : 50,000천원 국제공동연구상대국명 : 상대국연구기관명 : 위탁연구연구기관명 : 연구책임자 : 요약 ( 연구결과를중심으로개조식 500 자이내 ) 보고서면수 56 양성자빔은바이오매스의물리적전처리에탁월한효과를보임. 암모니아전처리된볏짚이일반볏짚보다최종수율이 90% 증가되었으며, 당화초기반응속도도약 7배향상됨. 양성자빔조사후 Crystallinity index를통해결정질부분의표면적증가를확인하였으며, 당화결과효소의접근성이향상됨을알수있었음. Cellulase와 hemicellulase 고활성균주를선별함. 양성자빔, 바이오매스, 전처리, 당화, 셀룰라제, 한글색인어헤미셀룰라제 ( 각 5개이상 ) Proton beam, Biomass, Pretreatment, Saccharification, 영어 Cellulase, Hemicellulase - 2 -

4 요약문 Ⅰ. 제목 양성자빔을이용한바이오매스전처리와당화효소고생성균주개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 본연구개발의목적은바이오매스로부터발효성당을생산하는효소적당화에있어기존의바이오매스전처리기술을친환경적으로대체할수있고, 당화효소고생산성균주를육종함으로서바이오매스효소적당화공정을개발함. 최근에식량문제가대두됨에따라, 당질및전분질계원료를이용하는공정에서목질계및해조류유래바이오매스를이용한바이오에탄올생산공정으로전환이이루어지고있으며이에관한연구가활발히진행중임. 기존의바이오매스전처리기술인 mechanical milling, acid 또는 alkali 전처리그리고증기폭쇄등은전처리능력이떨어지거나알코올발효저해제인부산물생성등의문제점등을가지고있으므로환경친화적인전처리기술개발이요구됨. 바이오매스에함유된 cellulase 와 hemicellulase 를분해할수있는고활성균주가필요함. Ⅲ. 연구개발의내용및범위 양성자가속기이용바이오매스전처리 양성자빔조사량에따른바이오매스변화분석 양성자빔으로전처리된바이오매스의효소적당화 양성자가속기이용당화효소 (cellulase와 hemicellulase) 고생산성균주선별 양성자빔조사량에따른돌연변이유발 당화효소고생산성균주선별 육종균주의특성분석 - 3 -

5 Ⅳ. 연구개발결과 볏짚당화를위한양성자빔최적조사량은일반볏짚은 15 kgy 그리고암모니아로전처리된 (SAA) 볏짚은 3 KGy로밝혀졌고 X-ray diffractometry 분석결과 crystallinity index가일반볏짚은 33.38% 에서 35.72% 로약간높아졌고 SAA 전처리볏짚은 61.11% 에서 65.58% 로약간낮아졌다. 이결과는중요한의미를가지고있다. 당회수율에서는일반볏짚이 70% 까지높아졌고 SAA 전처리볏짚은 90% 까지높아졌으며, ininitial reaction rate는최적조사량에서일반볏짚 ( g l -1 s -1 ) 보다 SAA전처리된볏짚이 g l -1 s -1 로높아졌다. SEM 촬영을통한분석에서도양성자전처리샘플의거칠어진표면변화가확인이되었었다. Trichodema reesei KCTC 6950를사용하여 cellulase 고생산성변이주의선별은탄소원으로 carboxymethylcellulose (CMC) 와 phosphoric acid-swollen cellulose를각각포함한 Mandels mineral salts solution 배지를사용하였다. 또한 Apergillus niger KK2를사용하여 hemicellulase 고생산성변이주의선별은탄소원으로 birchwood xylan을포함한선별배지를이용하였다. 그결과다양한효소활성을갖는돌연변이주가 1차선별되었으며, 이들균주를액체배양하여효소활성이높은균주를선별하였다. Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 양성자빔을이용한미생물균주육종기반기술을제시함으로서생물산업분야에파급효과가있음. 바이오에너지를생산하는유사업종으로의적용확대가가능함. 해당산업의해외시장을파악하여기술이전에적극활용할수있는기반을마련함

6 SUMMARY Biomass pretreatment is very important research field of bioenergy and biotechnology, which is based on lignocellulosic biomass called second generation biomass. A number of researchers have investigated about the effect of irradiation energies on biomass and their results show that irradiation pretreatment of biomass affects enzyme digestibility directly. Thus we expected proton beam irradiation could be efficient for pretreatment of biomass. The bioconversion of lignocellulosic biomass to ethanol has been used industrially. When lignocellulosic biomass converts to ethanol, enzyme takes lots of part of whole cost. Therefore, cellulase production is one of the important processes for the successful enzymatic conversion of cellulosic biomass to ethanol. Among cellulolytic enzymes, cellulase is multi-complex enzyme containing endo-glucanase, exo-glucanase and ß-glucosidase. Cellulolyticfungi, Trichodema reesei is well known to produce the highest yields of cellulase. Especially, suitable cellulase composition was important for the effective saccharification of lignocellulosic biomass and strain having high level production of cellulase should be developed for hydrolysis. For efficient ethanol production, hemicellullase of Aspergillus also develop to use xylose generated from saccharification of biomass. In this study, pretreatment process of rice straw using proton beam irradiation (PBI) was carried out for enhancement of enzyme digestibility at different proton beam doses. Also, PBI pretreatment on ammonia soaking treated (SAA, Soaking aqueous ammonia) rice straw was conducted to solve the problem that is micro-structural inhibition of rice straw. Optimal dosages of proton beam on rice straw and SAA treated rice straw for efficient recovery of sugar were 15 KGy and 3 KGy, respectively. Enzymatic saccharification of PBI treated rice straw and SAA rice straw was conducted for the guidance of NREL standard procedure. Analysis using X-ray diffractometry (XRD) for crystallinity index was carried out and CrI found to be 33.38% of control and 35.72% of 15 KGy. Also, CrI was determined to be 67.11% of control and approximately 65.58% of 3 kgy dose in PBI pretreatment on SAA treated rice straw. The result of sugar recovery of both was approximately 70 % and 91 % of theoretical glucose contents, respectively. The initial reaction rate was increased from g l -1 s -1 of 15 KGy (PBI pretreated rice straw) to g l -1 s -1 (3 KGy PBI pretreated SAA rice straw). The selection of cellulase over-producing mutant was performed on agar plate of Mandels mineral salts solution including carbon source such as carboxymethylcellulose (CMC) and phosphoric acid-swollen cellulose. Selected three mutants were tested for the - 5 -

7 production of cellulase in liquid culture. In the case of FPase, all strains had maximum enzyme activities in 4 day and 5 day culturing. In that time, mutant strain 1 and 4 had 13% and 30% higher enzyme activities than that of parent strain. Also, In the case of CMCase, mutant strains had maximum enzyme activities in 2 day and 3 day culturing but parent strain had maximum enzyme activity in 4 day and 5 day. Mutant strain 10 and 16 had 30% higher enzyme activities than that of parent strain. In the case of β-glucosidase, enzyme activities of mutant strains was superior at initial phase of culturing but enzyme activities of parent strain was looked similar or high at 5 day of culturing. For xylanase, β -glucosidase and β-xylosidase of Aspergillus niger KK2, the selection of hemicellulase over-producing mutant was performed on agar plate including carbon source such as birchwood xylam. Selected mutants were tested for the production of cellulase in liquid culture and some mutants having higher enzyme activities than that of KK2 were selected

8 CONTENTS Chapter 1. Introduction Section 1. Purpose of research Section 1. Extents of research Final goal of research Annual contents and scope of research Section 1. Importance of research Chapter 2. Current situation in domestic and foreign technology Section 1. Current situation in technology Foreign technology Domestic technology Section 2. Technology level Chapter 3. Research contents and results Section 1. Biomass pretreatment using proton beam Reserach content Materials and methods Results 가. Cellulose pretreatment using proton beam 나. Red algae pretreatment using proton beam 다. Rice straw pretreatment using proton beam 라. Ammonia treated rice straw (SAA) pretreatment using proton beam 마. Analysis of XRD Section 2. Selection of saccharification enzyme over-producing mutant using proton beam Development of cellulase over-producing mutant 가. Reserach content 나. Materials and methods 다. Results (1) Growth curve of Trichodema reesei KCTC (2) Lethal rate by proton beam (3) Mutant selection and liquid culture Development of hemicellulase over-producing mutant

9 가. Reserach content 나. Materials and methods 다. Results (1) Lethal rate by proton beam (2) Mutant selection and liquid culture Characteristic of selected mutant Chapter 4. Accomplishment and contribution Section 1. Attainment of research goal Section 2. Contribution to related fields Chapter 5. Application scheme of research Chapter 6. Information of foreign technology obtained from research Chapter 7. References

10 목차 제1장연구개발과제의개요 제1절연구개발의목적 제2절연구개발의범의 최종목표 차년도연구개발범위 제3절연구개발의필요성 제2장국내외기술개발현황 제1절기술개발현황 외국의경우 국내의경우 제2절기술수준 제3장연구개발수행내용및결과 제1절양성자가속기이용바이오매스전처리 연구내용 실험적방법 연구결과 가. 양성자가속기이용셀룰로오스의전처리 나. 양성자가속기이용홍조류의전처리 다. 양성자가속기이용볏짚의전처리 라. 양성자가속기이용암모니아전처리된볏짚 (SAA) 의전처리 마. 볏짚과암모니아전처리된볏짚 (SAA) 의 XRD 분석 제2절양성자가속기이용당화효소고생산성균주선별 양성자가속기이용 Cellulase 고생산성균주육종 가. 연구내용 나. 실험적방법 다. 연구결과 (1) 모균주 (Trichodema reesei KCTC 6950) 의성장곡선 (2) 양성자빔조사에따른사멸율 (3) 선별배지에서변이균주선별과액체배양 양성자가속기이용 Hemicellulase 고생산성균주육종 가. 연구내용

11 나. 실험적방법 다. 연구결과 (1) 양성자빔조사에따른사멸율 (2) 선별배지에서변이균주선별과액체배양 육종된균주의특성분석 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연구개발목표의달성도 제 2 절관련분야기여도 제 5 장연구개발결과의활용계획 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 제 7 장참고문헌

12 제 1 장연구개발과제의개요 제 1 절연구개발의목적 본연구개발의목적은바이오매스로부터발효성당을생산하는효소적당화에있어기존의바이오매스전처리기술을친환경적으로대체할수있고, 당화효소고생산성균주를육종함으로서바이오매스효소적당화공정을개발하는데있어, 1 양성자빔조사량에따른바이오매스전처리에서물리화학적변화를분석하고, 2 바이오매스효소적당화공정을위하여양성자빔조사량에따른당화효소고생산성균주를육종함으로서, 3 전처리된바이오매스와육종된균주로부터생산된당화효소를이용하여바이오매스효소적당화공정기술을개발하는것이다. 제 2 절연구개발범위 1. 최종목표 바이오매스로부터발효성당을생산하는효소적당화에있어기존의바이오매스전처리기술을친환경적으로대체할수있고, 당화효소고생산성균주를육종하여당화효소를생산함으로서바이오매스효소적당화공정을개발하는데있다. 2. 차년도연구개발범위 1 차년도 양성자가속기이용바이오매스전처리와분석방법확립 가. 양성자가속기이용리그노셀룰로스전처리방법확립 양성자빔조사량에따른리그노셀룰로스의셀룰로스와헤미셀룰로스의화학적변화분석 전자현미경을이용하여물리적변화를분석하고결정성변화를측정 양성자빔으로전처리된리그노셀룰로스의효소적당화공정에서특성조사

13 나. 양성자가속기이용홍조류전처리방법확립 양성자빔조사량에따른홍조류의셀룰로스와갈락탄의화학적변화를분석 전자현미경을이용하여물리적변화를분석 양성자빔으로전처리된홍조류의효소적당화공정에서특성조사 다. 전처리조건최적화와전처리바이오매스의분석방법확립 바이오매스물리화학적특성과효소적당화공정을통한전처리조건최적화 바이오매스물리화학적변화를조사할수있는분석방법확립 효소적당화후바이오매스의변화를조사할수있는분석방법확립 2 차년도 양성자가속기이용당화효소고생산성균주선별 가. 양성자가속기이용 Cellulase 고생산성균주육종 양성자빔조사량에따른고생산성돌연변이유발방법확립 양성자빔조사량에따른균주의감수성조사 고생산성균주선별방법확립 양성자빔의최적조사에따른당화효소고생산성균주선별 나. 양성자가속기이용 Hemicellulase 고생산성균주육종 양성자빔조사량에따른고생산성돌연변이유발방법확립 양성자빔조사량에따른균주의감수성조사 고생산성균주선별방법확립 양성자빔의최적조사에따른당화효소고생산성균주선별 다. 육종된균주의특성분석 최종적으로선별된당화효소고생산성균주의배양학적특성규명 제 3 절연구개발의필요성 방사선은 20 세기초부터초파리및보리와옥수수같은농작물돌연변이유발을시작으 로연구되어왔으며, 지금까지주로 gamma-ray 와 X- 선이주를이루어왔다. 본연구책 임자는 UV 와 gamma-ray (Co 60 ) 를이용하여 cellulase 와 hemicellulase 고생산성균주개

14 발을수행하여여러편의논문을발표하였으며균주특허도획득하였다 [1~5]. 최근새로운방사선으로등장한이온빔은기존의방사선보다국부적으로큰에너지를 줄수있는특징이있어, 생물산업에서주로작물과화훼, 당화그리고미생물육종산 업에접목이시도되고있다 [6-8]. 최근에식량문제가대두됨에따라, 당질및전분질계원료를이용하는공정에서목질 계및해조류유래바이오매스를이용한바이오에탄올생산공정으로전환이이루어지고있으며이에관한연구가활발히진행중임. 기존의바이오매스전처리기술인 mechanical milling, acid 또는 alkali 전처리그리고증기폭쇄등은전처리능력이떨어지거나알코올발효저해제인부산물생성등의문제점등을가지고있으므로환경친화적인전처리기술개발이요구된다 [9-16]. 양성자빔의새로운응용분야개척의일환으로바이오매스를전처리하여거대분자의수소결합을절단시켜바이오매스의물성을변화시켜효소적당화에적용하여새로운환경친화적바이오매스전처리기술을개발한다. 양성자빔을이용한바이오매스전처리공정은본연구에서최초로시도되는바, 바이오매스전처리과정에서여러변수들 ( 샘플량, 샘플상태, 샘플농도, 양성자빔조사량, 샘플의 particle size 등 ) 에대한기초실험이이루어진후에경제성확보를위해필요한정량적기준을제시한다. 바이오매스전처리를위한양성자빔의선량은약 1 KGy ~ 30 kgy 정도이며, 고생상성균주개발을위한양성자빔의선량은약 0.05 KGy ~ 1 kgy 정도이다. 따라서본연구개발은양성자빔을이용하여바이오매스전처리와당화효소고생산성균주육종을최초로시도하여친환경적인바이오매스당화공정을개발하는것이다

15 제 2 장국내외기술개발현황 제 1 절기술개발현황 1. 외국의경우 최근에세계각국은고유가시대대비와온실가스저감화를위해환경친화적인바이오 에너지개발에대한심혈을기울이고있으며, 연료용바이오에너지의생산필요성이증 가로인해다음과같은세부단위로기술의융합이진행중임. 저비용 / 친환경재배적응형바이오매스원료확보를위한작물육종및생산체계확립. 고역가효소, 내열성및내에탄올성, 그리고바이오매스기질적응효모균주개발및배지최적화. 바이오에너지대량생산을위한바이오매스전처리, 연속발효공정개발및전공정의경제성검토. 산화안정성, 저온유동성등품질향상을위한반응공정최적화및첨가제등의개발. 최근에식량문제가대두됨에따라, 당질및전분질계원료를이용하는공정에서목질계및해조류유래바이오매스를이용한바이오에탄올생산공정으로전환이이루어지고있으며이에관한연구가활발히진행중임. 바이오매스전처리기술은목질계를이용하여에탄올생산에필요한당을회수하는공정이주를이루고있으며염기를이용한리그닌제거공정과약산을이용한공정이주를이루고있으며, 전처리산물로에탄올발효에저해를나타내는부산물의생산량을감소시키는방향으로진행중임. 약산및염기처리를대체할공정을개발, 공정을단순화하여에탄올생산단가를줄이는방향으로연구중임. 또한, 에탄올생산능이떨어지는헤미셀룰로오즈를선택적으로분리할수있는공정을개발하여에탄올생산성을증가시키는방향으로진행중임. γ-ray 및이온성액체를이용하여셀롤로오즈와헤미셀룰로오즈의수소결합을분해하여당화공정의효율을높이는방향으로연구가진행중임. 특히, γ-ray의경우미국을중심으로진행중에있으나그진행정도가미비하며양성자빔을이용한연구사례는아직전무한상황임

16 2. 국내의경우 국내의바이오에탄올생산산업은총생산량의 93% 가음료용에탄올생산에집중되고있고, 쌀, 보리, 옥수수, 고구마, 타피오카등의전분질원료를전처리공정, 당화와발효공정및증류공정을통하여생산하고있어품질은우수하나생산성이떨어지는공정으로구성되어있음. 즉, 음료용에탄올에대한오랜제조경험을바탕으로하여높은생산수율과고품질의에탄올을생산하고있으나회분식발효공정으로인한생산성이선진국의연속식에비해낮음. 국내에는 10개의에탄올제조회사가있으며, 2004년도에에탄올제조량은총 300천kl로이중 93% 가음료용으로사용되고 7% 만이산업용으로사용되고있음. 바이오매스전처리기술은과거일부연구원에서주도적으로진행되었으나, 현재는연구진행이미진하며기술개발및적용이시급히필요한상태임. 기질의선정그리고기질에대한적절한효소및효모의선정과함께바이오에탄올의고농도생산을위하여여러형태의생물반응시스템을시험하고확립. 약산및염기처리를이용한전처리공정이주류를이루고있으며, 염기처리의경우암모니아의분리가어려워공정비용이상당히고가인상황임. 이에공정을단순화시킬수있는연구가활발히진행하고있으나, 그에따른성과가미비하여추가적인연구가필요한상황임. 국내에서도 γ-ray 및이온성액체를이용하여셀롤로오즈와헤미셀룰로오즈의수소결합을분해하여당화공정의효율을높이는방향으로연구가시도되었으나진행정도가미비하며양성자빔을이용한연구사례는균주와식물체및아직전무한상황임. 제 2 절기술수준 국내에서는원료의가격경쟁력측면때문에연료용바이오에탄올은현재생산을하지않고있으며, 특히, 목질계및해조류유래바이오매스를이용한바이오에탄올생산공정은또한, 대량생산을위한산업화기술은선진국과많은차이를보이고있음

17 개발기술명 < 기술평가 : 본연구관련국내외기술수준비교 > 약산전처리공정및 바이오전처리공정 관련기술최고보유국 현재기술수준 우리나라 연구신청팀 미국 80% 80% 곰팡이셀룰라제미국 90% 90% 기술개발목표수준 바이오전처리공정의선진국화고효율셀룰라제의분리 비고 1) 개발기술명은본연구과제최종연구개발목표기술을의미 2) 현재기술수준은선진국 100% 대비우리나라및신청한연구팀의기술수준표시

18 제 3 장연구개발수행내용및결과 제 1 절양성자가속기이용바이오매스전처리 1. 연구내용 두가지바이오매스 (Cellulosic 바이오매스와홍조류 ) 의양성자전처리에의한당화수율개선에대해서실험을진행하였다. 2세대바이오에탄올의가장기대를받고있는목질계바이오매스의주요성분인셀룰로오스는잘알려진글루코스의베타1,4결합에의한중합체와그중합체간의수소결합으로이루어진견고한섬유조직이다 [17-19]. 그러므로효과적인당화를위해서는적절한전처리가필요함으로, 본과제에서는양성자빔을이용한전처리과정에서셀룰로오스당화에개선효과와 FTIR을이용하여수소결합의양상을확인하였으며, SEM과 XRD 분석으로화학적, 물리적변화를조사하였다. 2. 실험적방법 가. 바이오매스 셀룰로오스는본실험실에서보유한것을사용하였으며, 리그노셀룰로오스 [ 볏짚, 암모니 아전처리볏짚 (SAA)] 와홍조류는각각경기대리서치센터와 ( 주 ) 페가서스에서공급받아사용 하였다. 보관은상대습도 60% 이하의실내온도에서시약장에보관하였다. 나. 바이오매스성분분석 바이오매스의성분분석은미국의 NREL에서공개한 NREL standard procedure에의한바이오매스성분분석을수행하였다. 간략한절차로는정확히 72% 산으로바이오매스를상온에서 1차가수분해하고 5% 이하의약산으로 120 에서 2차가수분해를수행한후중화를시켜소 HPLC로분석을하는방법이다. 다. 바이오매스효소적당화 사용된효소는 Novozyme 사의 Celluclast 를 cellulase 로, Novozyme 188 을 β-glucosidase 로이용했다. 효소의활성도측정및당화방법또한미국의 NREL standard procedure 를참 고하여수행했다. 활성도는 FPase unit 계산법에의해실험을통해측정하였고, 당화는시험관

19 에서정확히 20 g/l 의기질농도, 5 ml 의 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 에희석된효소, 희석 용증류수를합쳐총 10 ml 부피의환경에서반응하였다. 당화반응조건은 50, 150 rpm 의 water bath 에서반응하였다. 라. 분석 (1) HPLC 성분분석및당화물분석에는시마쯔사의 HPLC 세트에 Bio Rad의 HPX-97H 컬럼을이용하였다. HPLC 조건은 N의황산이동상을사용하였고유속은 0.8 ml/min이었으며, 컬럼및 RI detector온도는 50 에서분석하였다. (2) X-ray diffractometry (XRD) PANanalytical의 X'pert Pro 세트를이용하였고분석은 θ-2θ법을사용하였고, Crystallinity index 계산은 Segal et al. 의방법을이용하였다 [20]. XRD분석은 45 kv, 30 ma 의조건에서 10도에서 90도까지약 0.167도의스텝사이즈로스캔하였고 K-α값은 1.544A 의파장을이용하였다. (3) Scanning electron microscopy (SEM) Hitachi사의 S-4300 모델을이용하여수행하였다. 시료는 70 드라이오븐에서 24시간동안건조시킨다음얇은전도체물질 (Pt) 로코팅하여분석하였다. 분석조건은 15 kv, 1.5 nm 의 resolving power로 300에서 700배율로조정해가며진행하였다. 3. 연구결과 가. 양성자가속기이용셀룰로오스의전처리 (1) 양성자빔조사후당화셀룰로오스의당화를위한기초당화실험에서는여러가지입자크기의바이오매스를이용해서가장당화에적합한 mesh사이즈를찾는것이다. Cellulosic 바이오매스의당화는공통적으로사용되는효소인 Celluclast R (10 U/mL) 와 Novozyme188 R (40 U/mL) 을 5:1 비율로사용하였다. 완충용액으로는 citric-phosphate buffer (ph 4.8) 를사용하였으며, 기질의농도는 4 g/l이었다. 또한반응은최적온도 50 에서 48시간전후까지반응을진행시켰다. 실험결과입자크기에따른당화수율은큰차이를보이지는않았지만 mesh사이즈의입자크기의셀룰로오스가비교적당화에적합한크기라는결과를얻을수있었다 ( 그림 1-B). 일반적으로더작은사이즈의셀룰로오스입자가더욱당화가잘될것이라고기대했지만실험결과와는차이

20 를보였으며, 셀룰로오스의경우분쇄중에섬유소가파괴가될가능성도있기에너무작은파우더와같은입자크기는오히려당화가잘안될수도있다는것을확인할수있었다. 양성자빔으로전처리한셀룰로오스의당화실험의경우는 10~20 KGy 범위에서전처리한바이오매스의경우가장당화율이높은것으로나타났다 ( 그림 1-A). 전처리를 30 KGy까지했지만 FT-IR의결과에서도짐작이가듯 20 KGy에서가장수소결합이많이끊어졌음을알수있고그것을당화실험에서도입증할수있었다. 그러나셀룰로오스에더많은노출시간 ( 양성자조사량 ) 이더많은수소결합파괴로이어질것이라예상했지만실험결과 25~30 KGy에서는오히려수소결합파괴가적었으며, 당화율도낮게측정되었다. 25~30 KGy라는양성자에너지가바이오매스를때릴때수소결합뿐아니라바이오메스의기본조직까지파괴하여당화결과가나오지않은것으로생각된다 Concentration(g/L) Control 10kGy 20kGy Concentration(g/L) mesh mesh mesh mesh under 400mesh (A) Time(h) 0 (B) Time(h) 그림 1. 양성자처리된셀룰로오스의당화 (A) 와전처리하지않은셀룰로오스당화 (B). (2) 양성자처리된셀룰로오스분석앞서언급했듯리그노셀룰로오스계바이오매스는글루코스의중합체로이루어져있고그중합체들이각각수소결합으로구성되어아주견고한골격을갖추고있는것때문에전처리없이당화를할경우, 높은수율을얻지못하게된다. 따라서일반적인당화과정전에적절한전처리가필요하며, 전처리된바이오매스의전자현미경 (SEM) 사진을비교한결과양성자가처리된바이오매스의경우처리하지않은샘플에비해비교적표면이거칠게변화된것을확인할수있었다 ( 그림 2). 또한 FT-IR의결과양성자의조사량을 0, 5, 10, 15, 20, 25, 30 kgy 로하였을때 2900cm -1 파장에서수소결합의파괴로흡광도가증가한것을확인하였다 ( 그림 3)

21 (A) (B) 그림 2. 전처리를하지않은셀룰로오스샘플 (A) 과양성자전처리샘플 (B) 의 SEM 사진비교. 정량적으로확인은불가능하지만대략표면이거칠어져서수소결합이파괴된것을볼수있다. 그림 3. 양성자조사량에따른셀룰로오스의 FT-IR 결과 ( 조사량 : 0, 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30 kgy)

22 나. 양성자가속기이용홍조류의전처리홍조류의전처리와당화의경우효소적당화자체를한선례를찾기가힘들었다. 홍조류에대해서양성자전처리및당화를수행한결과건조된홍조류의경우분쇄의어려움이있어당화결과에특별히눈에띄는결과를얻지못했다. 홍조류의경우셀룰로오즈가 galactan에의해보호되고있고유연하고견고한구조를가지고있어효소의접근성이매우낮았다. 그러므로다른전처리로 galactan을제거하는연구가필요하다. 전처리하지않은홍조류보다전처리한홍조류에서 initial reaction rate가작은범위에서높았다 ( 그림 4). 그림 4. 양성자처리된홍조류의당화. 다. 양성자가속기이용볏짚의전처리 (1) 당화에서볏짚입자크기의영향볏짚을잘라파쇄한후작은입자크기를만들기위해분쇄하였다. 그리고 35-45, 40-70, , , 그리고 400 mesh 이상의입자크기를분리하여당화의최적입자조건을찾았다. 당화반응에서 FPase의효소활성은 60 unit이었고 50 에서반응을실시하였다. 실험결과 mesh 사이즈의입자크기가가장최적의당화를위한입자크기인것으로밝혀졌다 ( 그림 5)

23 그림 5. 볏짚입자크기에따른당화. (2) 양성자빔조사량에따른전처리양성자빔조사량에대한최적조건탐색을위해여러범위에걸쳐실험이수행되었으며, 결과는그림 6에나타내엇다. 우선전처리하지않은볏짚 (control) 의경우효소가목표로하는결정질부분, 즉셀룰로오스가헤미셀룰로스리그닌에둘러쌓여효소의접근을방해하는것으로보여전환수율이매우낮은 20% 근방으로나타나있다. 양성자빔의조사를받은샘플들의경우기본적으로 Control보다높은전환수율을보였으며최적의조사량은 15 KGy로결정되었다. 이는양성자의물리적인효과가볏짚입자의표면에변화를주었고, 이변화는구체적으로땅에곡괭이질을해서구멍을내는것과같은효과로그변화부위에의해서효소가더깊은곳까지접근을가능케하는요인으로생각된다. 결론적으로양성자빔전처리는반응표면적증가의효과를보여주는것으로생각된다. 그러나 15 KGy 보다더높은조사량을적용하면오히려전환수율이낮아지는현상을보이는데, 이는앞서 Kamakura and Kaetsu (1978) 가밝힌바와같이더최적조건이상의방사선에너지는바이오매스를 over-decomposition시키는현상을야기하는것으로보여진다 [21]. 그래서회수해야할글루코스의기본구조마저파괴시키는현상이생긴것으로생각된다. 또한볏짚에조사된양성자빔의양별로 initial reaction rate를비교했을때, 2시간대에서 15 KGy 샘플의초기반응속도가 g l -1 s -1 로 Control보다향상되었다

24 그림 6. 볏짚에대한양성자빔조사량의영향. 라. 양성자가속기이용암모니아전처리된볏짚 (SAA) 의전처리볏짚에함유된자연계에가장난분해성물질중하나인리그닌은암모니아로전처리하여제거한후양성자빔영향을조사하였다. 암모니아는 15% 용액을사용하였고 60 에서 250 rpm으로 24시간동안반응시켰다. 그결과고체무게의약 25% 가감소하였고고체분석결과글루코스와자일로스및기타당들의비율이높아졌다. 최적의조사량은 3 KGy인것으로나타났으며그샘플의초기반응속도는 g l -1 s -1 으로볏짚보다 7배높은속도를나타냈다 ( 그림 7). 볏짚에 15kGy 조사량의경우리그닌의물리적변화를일으키는데쓴것으로생각되는반면리그닌의극소량있는암모니아전처리샘플은그만큼의에너지가필요없고, 앞서언급한것과같이최적값이상으로조사량이늘어날수록수율이낮아지는현상도동시에관찰되었다. 그림 7. 암모니아전처리볏짚에대한방사능조사의효과

25 마. 볏짚과암모니아전처리된볏짚 (SAA) 의 XRD 분석볏짚과암모니아전처리된볏짚 (SAA) 을양성자빔으로조사한후 XRD 분석으로결정도 (crystallinity index, CrI) 를계산하였다. 볏짚의경우표면적증가를가늠해볼수있는 33.8% 에서 35.72% 로약소한 CrI값을보였는데, 암모니아전처리샘플의경우는 67.11% 에서 65.58% 로약간의하락을보였으며방사능에너지도볏짚에서만큼강한에너지를필요로하지않았다 ( 그림 8). 이는노출된결정질부분이방사능에너지에의해결합이끊어졌을것으로생각되며이는표면적증가및효소접근성향상의결과를야기한것으로보인다. 그림 8. 볏짚과암모니아전처리된볏짚 (SAA) 을양성자빔으로조사한후 XRD 분석

26 제 2 절양성자가속기이용당화효소고생산성균주선별 1. 양성자가속기이용 Cellulase 고생산성균주육종 가. 연구내용 에탄올을생산하기위한리그노셀룰로오스계바이오매스 (lignocellulosic biomass) 의바이오전환은바이오에너지분야에서널리연구되어왔다. 리그노셀룰로오스계바이오매스 (lignocellulosic biomass) 를에탄올로전환할때, 효소가격이전체공정의많은부분을차지한다. 따라서, 셀룰라아제 (cellulase) 생산은에탄올생산을위한셀룰로오스계바이오매스의성공적인효소전환을위한중요한공정중하나이다. 셀룰라아제 (cellulase) 는크게세가지효소 [1,4-β-D-glucose 4-glucano-hydrolase (=exo-glucanase), 4-β-D-glucan cellobiohydrolase (=endo-glucanase), β-glucosidase (=cellobiase)] 로구성된복합체이며, cellulose를최종적으로포도당 (glucose) 으로분해된다. 셀룰라아제 (cellulase) 의생산은 Trichodema reesei에의해주로연구되었다. 또한, 적합한셀룰라아제 (cellulase) 조성은리그노셀룰로오스계바이오매스 (lignocellulosic biomass) 의효율적인당화를위해중요하고, 균주개발을함으로써셀룰라아제 (cellulase) 의생산성을높일수있다 [22, 23]. 이에본연구에서는, 양성자빔을조사하여균주의변이를유도함으로인해 cellulase 활성이높은균주를개발하는것이다. 나. 실험적방법 (1) 균주모균주는 Trichodema reesei QM 6a에서유도된변이주 Trichodema reesei KCTC 6950을사용하였다. (2) 배지모균주와변이주는 Potato Dextrose Agar (PDA) 사면배지에서 7일간 30 에서배양한후 4 에서보관유지하였다. 양성자빔처리후의생존균주선정은 mandels mineral salts solution에 0.2% CMC, 0.1% Triton X-100, 0.4% L-sorbose, 1.7% agar를첨가한배지가사용되었으며, cellulose 분해능이큰변이주의선별용으로도같은배지를사용하였다 [24, 25]. 액체배지로는 mandels mineral salts solution에탄소원으로 1% cellulose를사용하였으며, agar는제외시켰다. (3) 돌연변이및선별배지에서변이주선별 Trichodema reesei KCTC 6950을사면배지에 7일간 30 에서균체형성시킨후이를다시

27 PDA slant에계대배양하여같은조건으로포자형성을촉진시켰다. 0.2% Tween 80 (30ml) 을 slant에주입하여포자를회수한후이를멸균된 PCR튜브에담아양성자빔을조사하였다. 양성자빔조사가완료된후멸균된증류수로희석하여, 0.2% CMC, 0.1% Triton X-100, 0.4% L-sorbose, 1.7% agar를첨가한 mandels mineral salts solution 배지에도말시켰다. 5~7일후양성자빔처리된포자의생존율을계산하였고, 이를근거로같은배지에약 10개 colony가나타나도록도말하였다. 30 에서 5~7일간배양으로 colony주위에형성된투명환의크기를 Gram, s iodine solution으로염색한후 colony를선별, 이를 PDA에분리배양하였다 [26, 27]. (4) 액체배양에서변이주선별선별배지에서선별된변이균주를 PDA 평판배지에 7일간 30 에서배양한후 5개의 agar 절편을 250 ml 삼각플라스크에 1.0% cellulose를탄소원으로하는 mandels mineral salts solution 100 ml에접종한후, 30 shaking incubator에서 200rpm의교반속도로 7일간배양한후상등액을회수하여효소활성을측정하였다. (5) 효소활성분석 [29] ( 가 ) Filter paper activity (FPase), 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 1.0 ml에 filter paper strip (1x6 cm) 을넣은후 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 로희석된효소용액 1.0 ml을잘혼합한후 50 에서 60 분간반응시켰다. 반응후 3 ml의 DNS 시약을첨가하여끓인후식혀서 575 nm에서흡광도를측정하였다 [29]. ( 나 ) Carboxymethyl cellulase(cmcase) 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 로희석된효소용액 0.5 ml과 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 에녹인 1.0% (w/v) CMC 1.0 ml을잘혼합한후 50 에서 30 분간반응시켰다. 반응후 3 ml의 DNS 시약을첨가하여끓인후식혀서 575 nm에서흡광도를측정하였다. ( 다 ) β-glucosidase 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 로희석된효소용액 0.1 ml과 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 에녹인 1.0 mm PNPG 0.9 ml을잘혼합한후 50 에서 20 분간반응시켰다. 반응후 1M Na2CO3 1.0 ml을첨가하여반응을중지시킨후 400 nm에서흡광도를측정하였다

28 다. 연구결과 (1) 모균주 (Trichodema reesei KCTC 6950) 의성장곡선균주는모균주 Trichodema reesei QM 6a에서유도된변이주 Trichodema reesei KCTC 6950을사용하였고, 탄소원으로 1.0% cellulose를함유한 mandels mineral salts solution 배지에서 30, 200 rpm 조건으로 7일간배양한후, ph 변화와함께효소활성분석 [Filter paper activity (Fpase), Carboxymethyl cellulase (CMCase), β-glucosidase] 을한결과를그림 9에나타내었다. Cellulase 복합체인 exo-glucanase (FPase), endo-glucanase (CMCase), 그리고 β -glucosidase가적합한비율로구성되어있어야효율적인당화가가능하지만모균주인 Trichodema reesei KCTC 6950의효소활성분석결과, FPase와 CMCase 의생산량에비해 β -glucosidase의생산량이현저히낮은것을확인할수있었다. FPase와 CMCase 역가는발효 5 일에각각 0.3 IU/mL과 1.5 IU/mL이었다. 그림 9. Trichodema reesei KCTC 6950 의효소활성분석에따른성장곡선. (2) 양성자빔조사에따른사멸율포자사멸율을조사하기위하여 T. reesei KCTC 6950 포자현탁액에다양한세기의양성자빔 (0.4~2.4 KGy) 을조사하고, 조사된포자액을멸균수에적절히희석한후, 0.2% CMC, 0.1% Triton X-100, 0.4% L-sorbose, 1.7% agar가첨가된 mandels mineral salts solution 선별

29 배지에도말하여배양한후성장한 colony 를계산하여사멸율을구하였다. 1.2 KGy 로조사했 을때사멸율 99.9% 이상으로돌연변이조건에적합하였다 ( 그림 10). 그림 10. 양성자빔조사에따른 T. reesei KCTC 6950 포자사멸율. (3) 선별배지에서변이균주선별과액체배양양성자빔조사로부터변이유도된 T. reesei KCTC 6950 포자사멸율을바탕으로, 양성자빔이조사된포자용액을적절히희석하여선별배지에약 10개정도의 colony가성장하도록도말하여 30 에서 5일간배양하였다. 선별배지는 phosphoric acid-swollen cellulose 또는 carboxymethylcellulose (CMC) 를탄소원으로하는 mandels mineral salts solution 배지를사용하였다. 배양후 phosphoric acid-swollen cellulose를탄소원으로포함한배지는육안으로 halo 크기를비교하였으며, carboxymethylcellulose (CMC) 를탄소원으로포함한배지는 Gram, s iodine solution으로염색하여각각 clear zone 크기를비교하여 halo와 clear zone 크기가큰것만을선별하여변이주를확보하였다. 선별배지에서선별된변이주들의효소활성을비교하기위하여액체배양을수행하였다. 탄소원으로 1.0% cellulose를함유하는 mandels mineral salts solution 액체배지에변이주들이성장한고체배지를한천절편으로각각의균주를접종하여 5일간배양한후효소역가를비교하였다 ( 표 1~2). 효소역가비교결과, cellulose 선별배지에서선별된변이주들이 CMC 선별배지에서선별된변이주보다효소활성이낮은것을알수있었다. 또한모균주인 T. reesei KCTC 6950보다효소활성이높은변이주들을선별할수있었다. 액체배양결과로부터모균주보다효소활성이높은변이주들을선별하여 2차액체배양하여변이주를다시선별하였다 ( 표 3)

30 표 1. CMC 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strains FPase (IU/mL) CMCase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) 비고 모균주

31 표 2. Cellulose 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strains FPase (IU/mL) CMCase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) 비고 모균주

32 표 3. 변이주들을재선별하여액체배양한후효소역가비교 Strains FPase (IU/mL) CMCase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) 비고 모균주 (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21)

33 2. 양성자가속기이용 Hemicellulase 고생산성균주육종 가. 연구내용 리그노셀룰로오스계바이오매스 (lignocellulosic biomass) 로부터에탄올을생산할때당화후 cellulose와 hemicellulose로부터생성된육탄당 (glucose) 과오탄당 ( 주로 xylose) 을모두다이용하여에탄올을생산하는것이수율을높일수있는공정이다. 현재주로 cellulose로부터생성된 glucose를이용하여에탄올을생산하고있지만, xyloe를이용할수있는균주개발이이루어지고있으므로 xylose를만드는 hemicellulase의개발이절실하고, 헤미셀룰라아제 (hemicellulase) 생산은에탄올생산을위한셀룰로오스계바이오매스의성공적인효소전환을위한중요한공정중하나이다. 헤미셀룰라아제 (hemicellulase) 는크게두가지효소 (xylanase, β-xylosidaseidase) 로구성되며, hemicellulose를최종적으로 xylose로분해된다. 헤미셀룰라아제 (hemicellulase) 의생산은주로 Aspergillus에의해주로연구되엇다. 이에본연구에서는, 양성자빔을조사하여 Aspergillus niger 균주의변이를유도함으로인해 hemicellulase 활성이높은균주를개발하는것이다. 나. 실험적방법 (1) 균주 Aspergillus niger KK2는본실험실에서균주개량하여보유하고있는균주이다. (2) 배지 Aspergillus niger KK2와변이주는 Potato Dextrose Agar (PDA) 사면배지에서 7일간 28 에서배양한후 4 에서보관유지하였다. 양성자빔처리후의생존균주선정은선별배지 (1.0% Birchwood xylan, 0.1% Triton X-100, 0.5% bacto-peptone, 0.05% yeast extract, 0.5% KH 2 PO 4, 0.01% CoSO 4, 0.05% CuSO 4, 1.7% agar) 에서 xylan 분해능이큰변이주의선별용으로사용하였다. 액체배지조성은 2% rice straw, 1.0% wheat bran, 1.0% CSL, 0.1% yeast extract, 0.5% KH 2 PO 4, 0.01% CoSO 4, 0.05% CuSO 4 이다. (3) 돌연변이및선별배지에서변이주선별 Aspergillus niger KK2를사면배지에 7일간 28 에서균체형성시킨후이를다시 PDA slant에계대배양하여같은조건으로포자형성을촉진시켰다. 0.2% Tween 80 (30ml) 을 slant에주입하여포자를회수한후이를멸균된 PCR튜브에담아양성자빔을조사하였다. 양성자빔조사가완료된후멸균된증류수로희석하여, 1.0% Birchwood xylan이함유된선별배지에도말시켰다. 3~5일후양성자빔처리된포자의생존율을계산하였고, 이를근거로같은배지에

34 약 10 개 colony 가나타나도록도말하였다 에서 3~5 일간배양으로 colony 주위에형성된 투명환의크기를토대로 colony 를선별, 이를 PDA 에분리배양하였다. (4) 액체배양에서변이주선별선별배지에서선별된변이균주를 PDA 평판배지에 7일간 28 에서배양한후 5개의 agar 절편을 250 ml 삼각플라스크에액체배지 100 ml에접종한후, 28 shaking incubator에서 200rpm의교반속도로 5일간배양한후상등액을회수하여효소활성을측정하였다. (5) 효소활성분석 ( 가 ) Xylanse 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 로희석된효소용액 0.5 ml과 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 에녹인 2.0% (w/v) birchwood xylan 1.0 ml을잘혼합한후 50 에서 20 분간반응시켰다. 반응후 3 ml의 DNS 시약을첨가하여끓인후식혀서 575 nm에서흡광도를측정하였다. ( 나 ) β-xylosidase 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 로희석된효소용액 0.1 ml과 0.05 M citrate buffer (ph 4.8) 에녹인 10 mm PNPX 0.9 ml을잘혼합한후 50 에서 20 분간반응시켰다. 반응후 1M Na2CO3 1.0 ml을첨가하여반응을중지시킨후 400 nm에서흡광도를측정하였다. 다. 연구결과 (1) 양성자빔조사에따른사멸율포자사멸율을조사하기위하여 Aspergillus niger KK2 포자현탁액에다양한세기의양성자빔 (0.3~2.4 KGy) 을조사하고, 조사된포자액을멸균수에적절히희석하여선별배지 (1.0% Birchwood xylan, 0.1% Triton X-100, 0.5% bacto-peptone, 0.05% yeast extract, 0.5% KH 2 PO 4, 0.01% CoSO 4, 0.05% CuSO 4, 1.7% agar) 에도말하여배양한후성장한 colony를계산하여사멸율을구하였다. 1.2 KGy로조사했을때사멸율 99.9% 이상으로돌연변이조건에적합하였다 ( 그림 11)

35 그림 11. 양성자빔조사에따른 Aspergillus niger KK2 포자사멸율. (2) 선별배지에서변이균주선별과액체배양양성자빔조사로부터변이유도된 Aspergillus niger KK2 포자사멸율을바탕으로, 양성자빔이조사된포자용액을적절히희석하여선별배지에약 10개정도의 colony가성장하도록도말하여 30 에서 3일간배양하였다. 배양후탄소원으로 xylan이포함된선별배지에서육안으로 halo 크기가큰것만을선별하여변이주를확보하였다. 선별배지에서선별된변이주들의효소활성을비교하기위하여액체배양을수행하였다. 선별된변이주들은기본액체배지 (2% rice straw, 1.0% wheat bran, 1.0% CSL, 0.1% yeast extract, 0.5% KH 2 PO 4, 0.01% CoSO 4, 0.05% CuSO 4 ) 에변이주들이성장한고체배지를한천절편으로각각의균주를접종하여 5일간배양한후효소역가를비교하였다 ( 표 4~7). 효소역가비교결과, 모균주인 Aspergillus niger KK2 보다효소활성이높은변이주들을선별할수있었다

36 표 4. Xylan 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strain Xylanase (IU/mL) β-xylosidase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB KK

37 표 5. Xylan 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strain Xylanase β-xylosidase β-glucosidase (IU/mL) (IU/mL) (IU/mL) Final ph PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB KK

38 표 6. Xylan 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strain Xylanase (IU/mL) β-xylosidase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB PB KK

39 표 7. Xylan 선별배지에서선별된변이주의액체배양후효소역가비교 Strain Xylanase (IU/mL) β-xylosidase (IU/mL) β-glucosidase (IU/mL) R R R R R R R R R R R R R R KK

40 3. 육종된균주의특성분석선별된 3개변이주들을 1.0% cellulose를탄소원으로하는 mandels mineral salts solution 액체배지에각각포자로접종하여 5일동안배양한후효소역가를비교하였다 ( 그림 12). FPase 경우는모든균주가배양 4일과 5일에최대효소활성을보였으며, 이때변이주 1과변이주 10의효소활성은모군주보다각각약 13% 와 30% 높았다. 또한 CMCase 경우변이주들은배양 2일과 3일에효소활성이최대였지만모균주는배양 4일과 5일에최대활성을보였다. 변이주 10과 16은배양 3일에모균주보다효소활성이약 30% 높았다. 한편 β -glucosidase의경우는배양초기에는변이주의효소활성이높았지만후반에는모균주의효소활성이비슷하거나높았다. 그림 12. 모균주와변이주들의액체배양후효소역가비교결과

41 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 제 1 절연구개발목표의달성도 년도연구목표평가착안점달성도 (%) 1 차년도 리그노셀룰로오스전처리방법확립당화분석결과제시 100 홍조류전처리방법확립당화분석결과제시 100 바이오매스의분석방법확립분석방법제시 100 Cellulase 고생산성균주육종선별결과제시 차년도 Hemicellulase 고생산성균주육종선별결과제시 100 육종된균주특성분석특성분석결과제시 100 제 2 절관련분야기여도 산업폐기물등의바이오매스를이용함으로써환경개선및이산화탄소절감효과등으로삶의질향상기대되며, 에너지보유국으로서의국가안보및국가적위상향상. 바이오에너지생산에관련된연구는기존의화학산업이나전통적인생물산업과비교하여기술적인측면에서대사공학, 효소공학, 바이오플랫폼기술과함께통합공정구성으로산업 BT의활성화. 산업BT와나노기술의융합이본격적으로시도되지않은시점임을고려할때관련분양의핵심기술및기반기술의선점이가능. 전통적으로강점기술인효소분해및발효공정등은바이오에너지생산에필수적인기술로이를기반으로핵심기술확보가능성이비교적높으며, 청정에너지개발을위한융복합기술선점으로원천기술확보. 또한우리나라고유의생물종발굴및생물자원확보기술을통한에너지경쟁력확보. 현재국제적으로온실가스감축에대한구체적인방안이논의되고있는상황임. 조만간국내에서도에너지의효율적이용및대체에너지개발을위한국가차원의계획이수립

42 될것이라판단됨. 따라서가채잠재량이상대적으로높은바이오매스자원의실용화사업은더욱용이하게추진될수있다고보이며, 또한열화학적에너지전환기술을통해폐기물을이용하는경우소각을통해발생하는오염가능성이줄어들수있을것으로기대됨. 목질계바이오매스는재생가능에너지중하나로서, 목재, 건축폐기물등을원료로할수있으며, 특히목질계바이오매스는다른바이오매스보다이산화탄소의고정량이크므로볏짚이나하수진흙등을원료로하는바이오매스보다연소에의해배출되는이산화탄소의양이적으므로온실가스감축에대한대안이될수있다고판단됨. 바이오매스를이용하므로자원의공급이무한정하며재생가능한산업시스템을형성및농업경영인에게새로운비즈니스와고용기회창출. 효소 / 발효공정모델링및최적화기술, 공정설계및경제성분석기술등은바이오에탄올생산공정뿐만아니라여타의바이오 biorefinery 기술에광범위하게적용가능하여생물산업에파급효과

43 제 5 장연구개발결과의활용계획 기술적측면 바이오매스효소적당화공정개발을위한바이오매스전처리최적화와발효균주육종을통한친환경적당화공정기술을확보함. 본과제의수행을통하여얻어지게될당화공정개발은 21세기바이오에너지분야를주도할기술로서국가경쟁력을강화할것임. 본사업수행을통해개발된바이오매스전처리기술과당화공정기술은공통핵심기술로타바이오에너지생산에적용가능함. 자원순환형바이오매스로부터궁극적인바이오에너지생산기술은탈석유화를촉진하고석유의존도감소및환경오염방지를추구함. 경제, 산업적측면 국내대체에너지생산기술확보를통한에너지안보력강화에기여함. 친환경바이오에탄올생산기술개발로국내에탄올산업경쟁력강화에기여함. 산업적측면에서는바이오에너지기술에기반을둔산업의창출을통해새로운일자리창출이예상됨. 바이오매스사용에따른온실가스 (CO 2 ) 배출저감효과. 활용방안 양성자빔을이용한미생물균주육종기반기술을제시함으로서생물산업분야에파급효과가있음. 바이오에너지를생산하는유사업종으로의적용확대가가능함. 해당산업의해외시장을파악하여기술이전에적극활용할수있는기반을마련함. 국내기업화현황 국내에는 10개의에탄올제조회사가있으며 2004년도에에탄올제조량은총 3000천 kl 로이중 93% 가주류용으로사용되고 7% 가산업용으로사용되고있음. 이는해외에탄올의총생산량의 13% 만이주류용으로사용되고산업용으로 21%, 연료용으로 66% 가사용되고있는것에비하면국내는비주류용에탄올의생산비중이극히낮다고할수있

44 음. 이와같이국내에탄올산업의규모및그이용도가주류용으로국한되고있는것은 LG화학, SK, CJ 등을포함한생물화학및발효산업분야에는대기업을필두로, 정밀화학회사를비롯하여, 다수의효소및발효공학기반바이오벤처기업들이산업 BT 기술을활용하여아미노산, 핵산및재조합단백질관련제품개발에많은관심을기울이고있으나상대적으로바이오에탄올관련발효산업은국내의 10개주정회사에의해독자적으로기술개발진행하고있어그산업규모의성장이정체된상태임. < 표. 국내바이오에탄올 ( 주정 ) 시장규모 > ( 단위 : 천달러 ) 연도수입수출수입수출수입수출수입수출수입수출규모 38,032-40,229-38,154-37,198-56,038 - 자료출처 : 주류공업협회 ( 주정 ) 전분질바이오매스의당화과정에많이소모되는 α-amylase 등산업용효소의경우세계적효소생산회사인 Novozymes나 Genencor International 등의제품경쟁력에비해상당한열세에있으나향후수송용에탄올을포함하는바이오에너지시대를대비하여국내의산업계에서도수송용연료생산에본격적인관심을표명하기시작함. 창해에탄올은 2005년 2월파푸아뉴기니아정부와협의하여 40년동안서울시의 3분의 1 에해당하는면적을무상으로임대하고전분질원료인카사바를재배하여에탄올을생산하는사업에투자할계획으로비주류용에탄올생산기반을설립하고있고, 씨에스엠은인도네시아랑풍주정부와카사바경작지무상사용에관한양해각서체결 ( ). 연간 20만 kl의바이오에탄올을생산할계획. 엘비엘코프는돼지감자등의바이오매스에서바이오에탄올을생산하는기술을개발하여동남아국가에관련기술을수출하고국내의공장시설부지및경작지역을확보하기위해경남, 전북, 전남의지자체와 MOU를체결

45 표. 국내바이오에탄올 ( 주정 ) 주요생산업체 업체명주요생산품목과특징생산량 ( kl / 년 ) ( 주 ) 두산백화 주정, 주정박, 탄산가스생산반연속식발효설비 ; 감압식증류설비 22,589 ( 주 ) 무학주정 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 감압식증류설비 28,257 서안주정 ( 주 ) 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 가압식증류설비 19,412 서영주정 ( 주 ) 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 가압식증류설비 30,809 일산실업 ( 주 ) 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 감압식증류설비 32,721 ( 주 ) 진로발효 주정, 주정박, 탄산가스생산살균소독제생산 49,691 회분식발효설비 ; 감압식증류설비 ( 주 ) 창해에탄올 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 감압식증류설비 43,009 풍국주정 ( 주 ) 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 감압식증류설비 28,881 하이트주정 ( 주 ) 주정, 주정박, 탄산가스생산회분식발효설비 ; 가압식증류설비 16,772 한국알콜산업 ( 주 ) 정제주정, 합성주정, 무수주정생산가압식증류설비 ; 공비증류공정 27,855 출처 : 바이오에너지분과기술개발에관한기획조사보고서, 2006, 산업자원부신재생에너지센터 바이오에너지기술연구회

46 제 6 장연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 < 국외제품생산및시장현황 > 브라질 전세계적으로 2005 년부터에탄올판매량이강세를보이고있으며, 최근에탄올국제무 역이급증하는추세를보여서이에힘입어브라질은 25 억리터로국제에탄올무역량의 50% 이상을수출하면서이러한국제무역을주도하고있음. 브라질에서는최초로 1931 년에에탄올사용을증진하는공공정책이최초로수립되어정 부차량에 10% 에탄올혼합가솔린이사용되었고, 공공차량에최소 5% 의에탄올혼합 가솔린이사용함. 이후석유위기와낮은설탕가격에따라서, 1975 년도에 PROALCOOL 을제정하여 1977 년 부터는가솔린에정규적으로에탄올을혼합사용할수있도록법제화하고 1979 년에는 순수에탄올차량판매시작하여현재에는약 5 백만대의에탄올자동차가운행중임. 2001년이후, 에탄올생산량에따라혼합율을 20-25% 로변경할수있도록법제화되었고 2003년에는에탄올과가솔린의함량이변화해도운행이가능한 FFV (Flex Fuel Vehicle) 이판매되기시작하여, 2005년현재총승용차판매대수의약 50% 를차지하고있음. 사탕수수를원료로년간 1,540 만kl의에탄올을생산하여세계시장의 40% 를차지하고 있으며 320 개공장에서사탕수수 3.89 억톤을처리하여설탕을 2,740 만톤을만들고, 나 머지 50% 를바이오에탄올 1,540 만kl를생산하고있음. 미국 미국에서는현재바이오에탄올생산에사용되는원료의약 95% 가전분질원료인옥수 수이며나머지 5% 는보리, 밀, 사탕수수을이용하여생산하고있으며목질계를이용한 바이오에탄올은아직산업화단계에이르러지못하고있음. 기존의바이오에탄올생산은대형기업인 ADM(Archer Daniels Midland), Cargill 와같

47 은농산물가공및사료회사에의해주도되어왔으나벤처기업, 대기업, 정부기관과파트너쉽을이루어바이오벤처및소규모옥수수에탄올회사에의한기술개발및생산설비투자를통한산업화가확대되고있음. 2006년현재미국의 95개의에탄올생산업체가있으며이들로부터연간총 MGY 의에탄올이생산되고있으며 2004년현재 81개소는옥수수를원료료사용하고있고옥수수로부터생산되는에탄올은총 1,063만 kl에이르며전세계시장의 27% 에달함. 1970년유가파동이후연료용에탄올에주목하여 1980년대미농촌의위기해결방안으로본격적으로부각되고바이오에탄올의보급촉진인센티브로는리터당 0.2 센트의세금감면혜택과연방정부및관련기관과일정규모운수업체들에대한바이오에탄올등의대체연료를의무사용도록함. 1990년초기에공표된 Clean Air Act 정책으로휘발유첨가제사용이의무화되었으나,m California 주를중심으로일부주에서는 2004년 1월을시점으로한 MTBE의지하수오염문제때문에사용규제정책때문에이에대용할수있는함산소연료인에탄올사용이증가될것이예상됨. 2004년기준바이오에탄올생산량은 KL이고전체수송용연료의 2% 를차지하고있으며 E10과 E85 혼합연료로각각사용하고있음. 2005년부시대통령에게제출된에너지법에는재생연료보급목표치를 2012년기준으로하여 KL로규정하고있고 2013년부터목질계바이오매스로부터생산한바이오에탄올도매년 KL 씩보급하도록하는규정도포함. 셀룰로오스바이오매스로부터바이오에탄올생산을촉진하기위한다양한지원책을마련중에있음. 현재는미국내 R&D 투자및농업구조개선을통하여수율의점진적향상, 수확후폐기물의수거율향상, 휴경농지등의에너지작물재배확대및에너지작물의개발을통하여기존전분질작물뿐아니라목질계작물을이용한에탄올생산기술개발에집중하고있음. 2006년세계적인정유회사인 BP는 University of California, Berkely와 University of Illinois, Urbana-Champaign, Lawrence Berkeley National Laboratory가연합한민간학연연구개발팀에바이오에너지연구개발비를 4년간총 5천만달러를지원하기로결정하여정유회사가대규모의바이오에너지개발에참여하는획기적인이정표를만듦

48 표. 바이오에너지에대한미국의국가적비젼 구분 2001년 2010년 2020년 2030년 전기및열 - 4% 5% 5% 수송용바이오연료 0.5% 4% 10% 20% 바이오제품및소재 5% 12% 18% 25% 출처 : Vision for Bioenergy and Biobased Products in the US (2002) 캐나다 캐나다의 Iogen은세계에서처음으로목질계원료에서바이오에탄올을생산하는시범공장 (demonstration plant) 을건설하여주목받고있음. 이공장의총투자액은 3,000만캐나다달러이지만, 캐나다의대기업석유회사인페트로캐나다및캐나다정부의자금원조를받아서건설하였음. 일본 일본은 2003년도부터안전성과이산화탄소배출규제의일환으로 휘발유및연료의품질조절에관한법률 에따라에탄올을 3% (E3, v/v) 까지혼합할수있도록했고이후지속적으로고농도에탄올상용화실현을위한기술지원을확대하여 2012년까지 10% (E10) 상용화를목표로하고있음. 일본내석유화학기업에서는 2010년까지 210,000 kl의바이오에탄올을생산하기로결정했음. 일본은경제산업성 (METI), 신에너지산업기술종합개발기구 (NEDO), 농림수산성 MAFF), 환경성 (MOE), 국토교통성 (MLIT), 총무청소방성 (FDMA) 등의정부기관을통하여일본 각주요지역의바이오에탄올연료화정책을실시하고있음. 호카이도현토카시지역 (METI, MOE): 밀과옥수수에서의바이오에탄올생산, E3 시범시행 야마가타현신조시 (MAFF): 수수에서의바이오에탄올생산, E3 시범시행 오사카부사카시 (MOE): 건축자재부산물에서의바이오에탄올생산, E3 시범시행 오카야마현미니와시 (METI): 제재소의목재부산물 ( 톱밥 ) 에서의바이오에탄올생산, E3 시범시행 오카나와현미야코지마섬 (MOE): 사탕수수에서의바이오에탄올생산, E3 시범시행

49 후쿠오카현카타큐슈시 (METI): 음식물폐기물을이요한바이오에탄올생산, E3 시 범시행 일본은국내에서수급이가능한바이오매스폐기자원의이용뿐만아나라원료자원이풍부한해외의국가들과협력활발하여그예로 2006년 5월브라질의 Petrobras와합작하여안정적인연료용에탄올공급체계확립및태국과에탄올생산모델사업에대한기본협정체결하여해외에서바이오에탄올생산및수급에대한전략도마련하고있음. 유럽 현재 EU는세계바이오에탄올산업에서브라질, 미국다음으로많은생산량을차지하고있음. EU 공동농업정책에서환경친화적인농업육성차원에서휴경지에서에너지작물생산시보조금을 45 유로 /ha ( 최대 150 만ha까지 ) 지원하고있으며원료의안전공급및생산원가절감을위해에너지작물생산농가직접경영또는회사와계약체결하고있음. 지역경제활성화를위하여에너지작물이용하여에너지생산하는공장설치시자금지원하고있으며기후변화협약준수, 지역경제활성화를위해바이오연료의수요가확대되고있고스웨덴은잉여소맥이나와인등으로제조한바이오에탄올을사용하여 E-5, E-85 및 FFV를보급하고있음. EU는 Directive 98/70/EC ( 자동차용연료에관한규정 ) 에의거, 가솔린중함산소성분최대허용량으로에탄올의경우에체적비율로 5% 까지혼합이가능하도록규정하고있으나, 아직시판가솔린에에탄올은거의함유되어있지않음. 또한, 2001년에에탄올 10% 혼합가솔린 (E10) 을자동차용연료로인정한바있으나, 이경우에 E10을연료로사용하는자동차는에탄올혼합연료에대응가능하도록변경된차량에한하며주유소에서는급유펌프에 E10 라벨을부착하도록규정함

50 < 국외기술의산업화방향 > 변형체에너지작물 ( 비식용, 비사료용 ) 을이용한수송용대체연료바이오에탄올의생산기반기술 확보를위한산업화뱡향 제품 고효율당화효소 발효균주 목질계바이오매스전처리기술 대상및특징 바이오매스고효율당화효소개발및생산기술개발 1. 셀룰라아제 (endo-, exo-glucanse 등 ) 2. 헤미셀룰라아제 (xylanase, pectinase 등 ) 3. Beta-glucanase 4. 진균류및호기성세균류단위효소개발 ( 칵테일혼합 ) 5. 혐기성복합효소개발 바이오에탄올균주개발및대사공학기술개발 1. 셀룰라아제도입효모균주개발 2. 셀룰라아제도입발효균주호스트 ( 非효모 ) 개발 3. 발효 / 대사공정개발 4. 생물공정최적화 : 발효생산물및부산물 ; 발효환경대시저항성생산성향상균주및조건개발 변형체에너지작물바이오매스물리화학및생물공학적탈중합화융합기술개발 생물및화학공정 수송용무수에탄올분리및정제공정개발 수퍼균주개발 바이오에탄올생산공정일체형슈퍼균주설계및개발 바이오-리파이너리기술개발기관특이적및유도성프로모터개발 마커프리시스템확보 식물엽록체를이용한단백질발현 바이러스벡터 바이오정유공장화기술개발 기관특이적및유도성프로모터에대한상업화 마커프리 - 이종단백질발현이없는 - GM 작물의개발을통한원천기술확보 미생물유래셀룰라제를엽록체에서발현시킨에너지식물개발을통한바이오에너지산업에서의우의성확보 바이러스벡터를이용한외래단백질의일시적발현을시스템을이용한셀룰라제발현효율의증대

51 < 바이오에탄올주요생산업체 > 기업, 국적생산품목과주요특징비고 ADM (Archer Daniels Midland), 미국 VeraSun Energy, 미국 Iogen, 캐나다 Cargill Inc., 미국 세계에서가장큰농업가공물관련기업으로주요생산품목으로는식품재료, 동물사료, 건강식품들을생산하고이와더불어신재생에너지인바이오에탄올과바이오디젤등을생산. 연간에탄올생산량은 1,070 MGY ( 연간메가갤런 ) 로미국총생산량의 23% 를차지함. 연간에탄올생산량 230 MGY 로미국에서두번째의바이오에탄올생산능력을가짐. 세계최초의목질계에탄올생산시범공장운용 (40 tonnes/day of biomass) 연간에탄올생산량 120 MGY 를양산하고있으며 Dow와합작하여 Cargill Dow 유한회사를설립하여생분해성 Polylactic acid 소재를생산하고있음. Iowa 주를비롯하여 5개주에 8개의바이오에탄올생산시설을갖추고있음. Royal Dutch /Shell Gr. Petro Canada, Canada Gov. 로부터투자. 식품, 농작물, 사료, 에너지, 투자등다국적기업. Petrobras, 브라질연간에탄올생산량 4 십억리터. 브라질의주에탄올생산사. 5백만리터수출 (2005년)

52 제 7 장참고문헌 1. Byeong Jo Min, Yang Soon Park, Seong Woo Kang, Yoon Seok Song, Jong Ho Lee, Chulhwan Park, Chan Wha Kim, and Seung Wook Kim. (2007) Statistical Optimization of Medium Components for the Production of Xylanase by Aspergillus niger KK2 in Submerged Cultivation. Biotechnol. Bioproc, Eng. 12, Kang, SW., Park, YS., Lee, JS., Hong, SI and Kim, SW. (2004) Production of cellulases and hemicellulases by Aspergillus niger KK2 from lignocellulosic biomass, Bioresour. Technol. 91, Park, YS., Kang, SW., Lee, JS., Hong, SI and Kim, SW. (2002) Xylanase production in solid state fermentation by Aspergillus niger mutant using statistical experimental designs. Appl. Microbiol. Biotechnol. 58, Kang, SW., Ko, EH., Lee, JS and Kim, SW. (1999) Over-production of β-glucosidase by Aspergillus niger mutant from lignocellulosic biomass. Biotechnol. Lett. 21, 특허등록번호 : Hye Jin Kwon, Yong Jin Park, Young Bok Yoo, Soon Young Park and Won Sik kong (2007) Genetic variability and phylogenetic relationship among proton-beam irradiated strains of Pleurotus ostreatus. J. Microbiol. Biotechnol. 17, Hye Jin Kwon and Won Sik Kong (2006) Proton beam sensitivity of basidiospore and mycelium in Pleurotus ostreatus. Kor. J. Mycol. 34, Jong-Seon Eun, Jun-Su Kim, Hwan-Su Lim, Suk-Kyo Han, So-Ra Choi and Young-Seok Jang (2007) Effect of proton ion and gamma-ray irradiation on radiosensitivity of M1 seedlings in Brassica napus. Kor. J. Hort. Sci. Technol. 25, Fengel, D., Wegener, G (1984) Wood: Chemistry, Ultrastructure, Reactions. ISBN De Gruyter, Berlin

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