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1 세포내 ph 변화가임신쥐자궁 평활근의수축력및이온전류의 활성에미치는효과 연세대학교대학원 의과학과 김영환

2 세포내 ph 변화가임신쥐자궁 평활근의수축력및이온전류의 활성에미치는효과 지도교수 이영호 이논문을석사학위논문으로제출함 2006 년 12 월일 연세대학교대학원 의과학과 김영환

3 김영환의석사학위논문을인준함 심사위원 인 심사위원 인 심사위원 인 연세대학교대학원 2006 년 12 월일

4 감사의글 먼저이논문을완성하기까지열정을가지고지도하여주신이영호교수님과안덕선교수님께감사를드리고또한실험내용에대한조언을해주신김영태교수님과정승수교수님께감사드립니다. 항상따뜻한관심과애정으로지켜봐주신생리학교실선생님들께감사드립니다. 항상옆에서실험을도와주고용기를준조영은, 최수경, 이시은에게고마움을전합니다. 오늘이있기까지사랑과정성으로키워주신부모님과함께기쁨을나누고자합니다. 저자씀

5 차례 국문요약 I. 서론 I. 재료및방법 1. 장력및 [Ca 2+ ] i 의동시측정 2. 단일평활근세포의분리 3. 이온전류측정 I. 결과 세포내 ph 변화가자궁평활근절편의자 발적수축과 [Ca 2+ ] i 에미치는효과 세포내 ph 변화가막전압의존성 Ca 2+ 전 류의활성에미치는효과 세포내 ph 농도변화가막전압의존성 K + 전류의활성에미치는효과 세포내 ph 변화가 Ca 2+ 의존성 K + 통로 활성에미치는효과 IV. 고찰 V. 결론 29

6 참고문헌 영문요약 31 35

7 그림 차례 Fig.1.EfectsofintracelularpH changeon contractility and[ca 2+ ] i inpregnantratmyometrium. 15 Fig. 2. Changes in whole cel Ba 2+ currents by intracelular ph change in pregnant rat myometrialcels. 18 Fig. 3. Efects of intracelular ph change on I dk in pregnantratmyometrialcels. 21 Fig. 4. ph i dependent change in Ca 2+ -activated K + channel activity in pregnant rat myometrial cels. 23

8 국문요약 세포내 ph 변화가임신쥐자궁평활근의수축력및이온 전류의활성에미치는효과 임신쥐의자궁평활근에서자발적수축의빈도와크기가세포내 ph 변화에의해커다란영향을받는다고보고되었으나 ph 변화가어떤과정 을통해서자궁평활근의자발적수축에영향을주는지에대해서는명확하 지않다. 따라서본연구에서는 (i) 세포내 ph 변화가임신쥐자궁평활근 의자발적수축과세포내 Ca 2+ 농도에미치는효과,(i) 세포내 ph 변화 가막전압의존성 Ca 2+ 통로와 K + 통로활성및 kineticproperty 에미치 는효과,(i) 세포내 ph 변화가 Ca 2+ 의존성 K + 통로의활성에미치는효 과등을관찰함으로서세포내 ph 변화가임신쥐자궁평활근의자발적 수축에미치는영향과그기전을규명하고자하였다. 임신 18~20 일되는쥐 에서자궁평활근을적출하여 longitudinallayer 만을분리하여 fura-2/am 을 축적시켜장력과세포내 Ca 2+ 을측정하였고 longitudinallayer 로부터분리 된단일세포에서 patch clamp 방법을통하여이온전류들을관찰하였다. 평활근절편의자발적수축과 [Ca 2+ ] i 는약산인 Na-acetate 를처리하여세 포내 H + 농도를증가시킨경우억제되는반면에, 약염기인 NH 4Cl 을처리 하여세포내 H + 농도를감소시킨경우에는장력의크기및 [Ca 2+ ] i 가증가 - 1 -

9 하는것을관찰할수있었다. 막전압의존성 Ca 2+ 전류의크기가 Na-acetate 처리시모든막전압값에서감소하는반면에,NH 4Cl 처리시 유의하게증가하는것이관찰되었다. 이때 Ca 2+ 전류의전류 - 전압곡선상 최대크기를보이는전압의크기나역전전압값이 Na-acetate 및 NH 4 Cl 에 의해변화되지않았다. 막전압의존성 K + 전류 (I dk) 의크기는막전압의존 성 Ca 2+ 전류의경우와는달리 Na-acetate 처리시모든막전압값에서증 가하는반면에,NH 4 Cl 처리에의해서는감소하는것이관찰되었다.Ca 2+ 의 존성 K + 통로 (BK Ca) 의활성은관류액의 ph 를낮춘경우감소하였다가관 류액의 ph 를높힌경우증가하는것을관찰할수있었다. 이상의실험결과로볼때세포내 H + 증가에의한자발적수축의소실 과세포내 Ca 2+ 농도의감소는주로 H + 에의한막전압의존성 Ca 2+ 통로 를억제하는효과에기인한다고생각되며, 이와같은세포내낮은 ph 에 의한막전압의존성 Ca 2+ 전류억제효과는지연분만시관찰되는자궁근 무력증의주요유발기전의하나라고생각된다 핵심되는말 : 임신쥐자궁평활근, 세포내 ph, 막전압의존성칼슘통로, 막전압의존성포타슘통로, 칼슘의존성포타슘통로 - 2 -

10 세포내 ph 변화가임신쥐자궁평활근의수축력및이온 전류의활성에미치는효과 < 지도교수이영호 > 연세대학교대학원의과학과김영환 Ⅰ. 서론 자궁평활근에서자발적인수축 (spontaneous phasiccontraction) 이일 어나는빈도와수축력의크기는임신주수에따라커다란영향을받는다. 1 임신초기및중기의자궁평활근에선자발적인수축이거의관찰되지않 지만임신말기가되면서자발적수축의빈도와크기가증가함으로써분만 이유도된다. 2 이같이임신말기에관찰되는자궁평활근의자발적인수축은 정상적인출산과정에필수적이지만분만과정이오랫동안지속되거나 (prolongedlabor), 분만유도제등을과다사용한경우자궁무력증 (uterine atony) 과같은치명적산후합병증이유발될수있다. 3-5 자궁무력증의발 생기전에대해선아직명확하지는않으나분만유도제등에의해자궁평활 근의긴장도가과도하게증가되면, 이에의해자궁동맥을통한혈액공급 이감소함으로써자궁평활근의무산소성대사 (anaerobic metabolism) 및 이에따른세포내 H + 의축적이자궁무력증의유발기전중의하나라고생 - 3 -

11 각된다. 4,6 다만세포내 H + 의축적이어떤기전을통해자궁평활근의수축 력에영향을주는가에대해선아직명확하지않다. Taggart 등 (1996) 7 은세포내 H + 변화에따라쥐자궁평활근절편의 수축력이그에비례해서변화할뿐아니라평활근세포내 Ca 2+ 농도역시 영향을받음을보고하였는데, 세포내액의 H + 증가시자궁평활근절편의 자발적수축이소실될뿐아니라안정장력 (baselinetone) 의크기및세 포내 Ca 2+ 농도 (baselineca 2+ concentration;[ca 2+ ] i ) 가감소하는것을관 찰하였다. 이는평활근세포내 H + 농도변화에따른수축력의변화양상 이 H + 에의한세포내 Ca 2+ 농도변화를통해이루어졌음을시사한다. 일반적으로평활근세포내 Ca 2+ 농도는 1) 세포막을통한 Ca 2+ 의유입 량및세포내 Ca 2+ 저장소 (sarcoplasmicreticulum,sr) 로부터의 Ca 2+ 유 리량,2) 세포막의 Ca 2+ -ATPase 나 Na + /Ca 2+ exchange 를통한 Ca 2+ 배출 및 SR 로의 Ca 2+ 재흡수양사이의차이에의해결정되는데, 자궁평활근의 경우 nifedipine 등을사용하여세포막을통한 Ca 2+ 의유입을차단하는경 우, 자발적수축현상이소실될뿐아니라세포내 Ca 2+ 농도가감소하는 것으로볼때, 세포막을통해유입되는 Ca 2+ 의양이세포내 Ca 2+ 농도및 수축력의크기결정에중요한역할을수행함을알수있다 자궁평활근세포막을통해 Ca 2+ 이유입되는경로로는주로막전압 의존성 Ca 2+ 통로 (voltage-dependent Ca 2+ channel) 가사용되는데, 이 - 4 -

12 통로의활성은평활근세포막전압의탈분극정도에비례하여증가할뿐 아니라세포내이차전달자나대사산물 ( 예,H + ) 의농도등에의해영향을 받는다. 10,13 따라서세포내 H + 농도증가시관찰되는세포내 Ca 2+ 농도의 감소현상이 H + 에의해 Ca 2+ 통로의활성이직접적으로억제되던지, 혹은 H + 이자궁평활근세포막전압의과분극을초래하여이차적으로 Ca 2+ 통로의활성저하를초래할가능성이있으나이에대한자세한기전에 대해서는아직명확하지않다.Shmigol 등 (1995) 14 은분리한자궁평활근 세포에서 +10mV 의 testpotential 에의해유도된 Ca 2+ 전류의크기가세포 내 H + 에의해감소하는것을보고하였지만, 어떤기전을통해 H + 이 Ca 2+ 전류의크기를억제시켰는지에대해서는아직보고된바없다. 즉자궁 평활근에서관찰되는 H + 에의한 Ca 2+ 전류억제효과가 Ca 2+ 통로의 kinetic property 에영향을주어서나타난것인지혹은단일통로의 크기 (singlechannelconductance) 감소나 Ca 2+ 통로의 availability 에영향을 주어서나타난것인지에대해서는아직보고된바없다. 한편, 평활근세포막에는여러종류의 K + 통로가존재하며, 이들통로의 활성정도에따라세포막전압의크기가결정됨은잘알려져있다. 15,16 특히 막전압의존성 K + 전류 (delayed rectifierk + current) 와 Ca 2+ 의존성 K + 전류 (Ca 2+ -activatedk + current) 의경우평활근세포막의안정막전압크기 결정에중요한역할을수행한다. 17,18 따라서세포내 H + 에의해이들이온 - 5 -

13 통로의활성이증가하는경우막전압의과분극을초래하고, 이에따라 Ca 2+ 통로의활성이억제됨으로써자궁평활근세포내 Ca 2+ 농도가감소할 가능성이있다. 세포내 H + 이이들 K + 통로의활성에미치는효과에 대해선측정에사용한장기의종류나측정한 K + 통로의종류에따라매우 다양하게보고되고있으므로 13 단일자궁평활근세포를이용하여막전압 의존성 K + 전류및 Ca 2+ 의존성 K + 전류의활성에미치는 H + 의효과와 그의작용기전을직접적으로확인할필요성이있다. 따라서본연구자는세포내 ph 변화가자궁평활근의수축력및세포 내 Ca 2+ 농도에미치는영향과그기전을규명하기위해적출된자궁평활 근절편에서 (i) 세포내 Ca 2+ 농도및장력을동시에측정하면서 H + 농도 의변동이자궁평활근절편의긴장도와세포내 Ca 2+ 농도에미치는효과 를관찰하고,(i) 분리한자궁평활근세포를이용하여막전압의존성 Ca 2+ 통로와 K + 통로의활성및 kineticproperty 에미치는세포내 H + 의효과를 관찰하고,(i)Ca 2+ 의존성 K + 통로의활성에미치는 H + 의효과와그작용 기전을확인하여자궁근무력증의발생기전을밝히자고한다

14 Ⅱ. 재료및방법 1. 장력및 [Ca 2+ ] i 의동시측정 임신 18~20 일째의쥐 (Sprague-Dawley rat) 자궁평활근을다음과같은 방법으로제작하였다. 경추탈골로희생시킨후자궁을적출하였다. 적출한 자궁을 100% O 2 로포화시킨정상 Tyrode 용액 (mm;nacl135,kcl5.4, CaCl 2 2.5,MgCl 2 1.2,HEPES 10,glucose12,pH 7.4) 에담근후수술현 미경하에서자궁조직주위의응고된혈액과결체조직을안과용미세가위 및핀셋을이용하여조심스럽게제거하였다. 이후자궁평활근의 longitudinallayer 만을분리한후이를절편형태 ( 길이 3~4mm, 폭 1mm) 로만들어장력과세포내 Ca 2+ 농도측정에사용하였다. 자궁평활근절편을 10 μm fura-2/am 을첨가한 Tyrode 용액에담근 상태에서 3~4 시간동안실온에서 incubation 하여 fura-2/am 이세포내에 축적되도록하였다. 이때 fura-2/am 의용해도를증가시키기위해 cermophorel (0.01%) 을배양액내에첨가하였다. 이후실험표본을 fura-2 가없는정상 Tyrode 용액으로세척하여근육외부에묻은 fura-2/am 을 제거하였다. Fura-2 가축적된자궁평활근절편의한쪽끝은 strain gauge - 7 -

15 transducer(harvard,holiston,ma,usa) 에고정하여장력의변화를측 정할수있도록하였으며, 다른한쪽끝은 UV light 가통과할수있도록 측정용기의바닥에고정하였다. 이후조직절편에 1g 의안정장력을가한 상태에서자발적수축반응의크기와빈도가일정해질때까지기다린후실 험을실시하였다.[Ca 2+ ] i 의변화를측정하기위해 340nm 와 380nm 파장의 UV light 를자궁평활근절편에번갈아조사 (irradiation) 한후, 이에의해 유발되는 emission light(fluorescence) 를 computer 에기록하였다.340nm 파장의 UV light 에의한 fluorescence 와 380nm 파장의 UV light 에의해 유발된 fluorescence 의 ratio(f 340/F 380) 를계산하여이를세포내 Ca 2+ 농도 의변화로간주하였다. 2. 단일평활근세포분리 자궁평활근조직절편을미세가위로잘게잘라길이와폭이 1mm 정도 되는조직절편을제작한후이를 37 o C 의 Ca 2+ -free Tyrode 용액 ( 정상 Tyrode 용액에서 CaCl 2 를제거한용액 ) 에서 10 분간배양하여조직표면에 존재하는 Ca 2+ 의양을최소화하였다. 이후배양액내에 colagenase(3mg/ml), trypsin inhibitor (0.33mg/ml), DTT(0.33mg/ml), papain(0.033mg/ml),1% bovineserum albumin,50um CaCl 2 를첨가한후 - 8 -

16 35 에서 30 분간배양하였다. 배양이끝난후조직절편이포함된배양액을 500G 로 1 분간원심분리하여조직절편및평활근세포가침전되도록한후 상층액을조심스럽게제거하였다. 이후동량의 KB 용액 (mm; KCl 20, KH 2 PO 4 10,glucose 10,L-glutamic acid 70,B-hydroxybutyric acid 10, taurine10,egta 0.5,albumin1%) 을첨가하여잘흔들어서세포부유액을 만든후다시원심분리를시행하였다. 이같은과정을 2-3 회반복하여세포 부유액내에존재하는 colagenase 등을제거한후유리대롱을이용하여 조직절편을조심스럽게흔들어주어서단일평활근세포가자궁근절편에 서유리되도록하였으며, 실험에사용하기전까지 4 o C 에서냉장보관하였다. 3. 이온전류측정 소량의평활근세포부유액을실험용기에떨어트린후약 5-10 분정 도기다려서평활근세포가실험용기바닥에부착하도록한후실험을실 시하였다. 실험용액은중력에의해 1ml/min 의속도로관류되도록하였으 며, 특별한온도조절없이상온 (25 o C) 에서실험을수행하였다. 실험에사용 한 microelectrode (Suter Co. Novata, CA, USA) 는 vertical puler (NarishigeCo.Tokyo,Japan) 를이용하여, 전극내액을채웠을때전극저 항이 2-3M Ω 이되도록유리미세전극의크기를조절하였다

17 평활근세포막의막전압의존성 Ca 2+ 전류, 막전압의존성 K + 전류의활 성에미치는세포내 H + 의효과는 wholecelclamp 방법, 즉유리미세전극 과세포막사이에 giga ohm seal 을만든후전극내부에음압을가하여 whole cel 을만든후확인하였다 (Hamil 등,1981). 19 Patch clamp 증폭기 (Axopatch 1-D,Axon Inc.USA) 를이용하여자궁평활근세포의막전압 을일정하게고정한상태에서일시적인탈분극자극을세포에가하여얻은 막전류의변화를 analog to digital converter(digidata 1200,Axon Inc. USA) 를이용해서 computerhard disk 에기록하였다. 이때얻은전류를 8 pole Bessel filter(1k Hz) 를이용하여여과한후 5 KHz 의빈도로 digitization 하여 signal 의변형을최소화하였다. 세포내 H + 농도의변화가 이온전류의활성에미치는효과는약산인 Na-acetate 나약염기인 NH 4Cl 를첨가한용액으로세포를관류하면서, 이들약산및약염기에의한이온 전류크기변화를측정함으로써확인하였다. 각각의경우에따른막전압고 정방법은그림설명에따로기술하였다. 막전압의존성 Ca 2+ 전류측정시 K + 전류를차단하기위해관류액의 KCl 대신에 5mM tetraethylammonium chloride 를사용하였고,CaCl 2 를 BaCl 2(5mM) 로치환한 Tyrode 용액을사용하였다. 전극내액으로는다음과

18 같은조성의용액을사용하였다 (mm;cs aspartate100,cscl30,mgso 4 5.7,Na 2ATP 5,Na 2GTP 1,BAPTA 10,HEPES 10,pH=7.2with CsOH). 막전압의존성 K + 전류를측정하는경우에는관류액으로정상 Tyrode 용 액에서 CaCl 2 를 MnCl 2 로치환한용액을사용하였으며, 전극내액으로는다 음과같은조성의용액을사용하였다 (mm; K gluconate 100,KCl 30, MgSO 4 5.7,K 2ATP 5,Na 2GTP 1,BAPTA 10,HEPES 10,pH=7.2 with Tris). 세포내액의 ph 를변화시키기위해 20mM Na-acetate 혹은 20mM NH 4Cl 를관류액에첨가하였는데, 이때관류액의삼투압의변화를막기위 해관류액에서동량의 NaCl 을제거하였다. Ca 2+ -activated K + 통로 (BK Ca) 의활성에미치는세포내 H + 의효과는 inside-outpatch clamp 방법을이용하여확인하였다. 즉유리미세전극과 세포막사이에 gigaohm seal 을만든후미세전극을위로당겨서세포막의 일부 (patch) 를세포에서분리하였다. 이후유리미세전극내전압을일정하 게유지한상태에서관류액의 ph 값을 7.4 에서 7.0 및 7.8 로각각바꾸어 주면서 BK Ca 통로의활성변화를기록하였다. 전극내액의조성은 140mM KCl,1mM MgCl 2,10mM HEPES,pH=7.4 인용액을사용하였고, 관류액으 로는 140mM KCl,1mM MgCl 2,10mM HEPES,5mM EGTA 의조성에 ph

19 값을각각 7.0,7.4,7.8 인용액을만들어서사용하였다. 이때 ph 변동에도 불구하고용액내유리 Ca 2+ 농도를일정하게 (pca6.5) 유지하기위해적 절한양의 CaCl 2 를컴퓨터프로그램 (WinMax 3.2) 을이용하여구한후첨 가하였다

20 I. 결과 1. 세포내 ph 변화가자궁평활근절편의자발적수축과 [Ca 2+ ] i 에미치는 효과 분만과정에서관찰되는모체혈액의산증 (maternalacidosis) 이자궁 평활근의수축력에미치는효과를확인하기위해자궁근절편의자발적수 축과 [Ca 2+ ] i 에대한세포내 H + 의효과를관찰하였다. 임신 18~20 일째쥐에 서얻은자궁평활근절편에 1g 의안정장력을가한경우자발적인수축현 상과이에동반하는 [Ca 2+ ] i 의주기적변화를관찰할수있었다. 세포외액 의 ph 는일정하게유지한상태에서세포내액의 H + 농도만을증가시키기 위해 20mM Na-acetate 를첨가한 Tyrode 용액으로관류시킨경우, 평활근 절편의자발적인수축이소실되었으며, 안정시세포내 Ca 2+ 농도 (baseline Ca 2+ concentration) 도정상에비해감소하였다 (n=10). 반면에 20mM NH 4Cl 을첨가한 Tyrode 용액으로평활근절편을관류하여세포내액의 H + 농도 를감소시킨경우 Na-acetate 용액으로관류한경우와는달리평활근절편 의주기적이며일시적수축현상 (phasiccontraction) 이긴장성수축 (tonic contraction) 으로변화하였으며, 안정시세포내 Ca 2+ 농도역시정상에비 해유의하게증가한것을관찰할수있었다 (n=10). 평활근절편의자발적

21 수축과의변화현상은정상 Tyrode 용액으로재관류시대조군상태로회복 되는것을관찰할수있었다 (Fig.1)

22 Fig.1.EfectsofintracelularpH changeon contractility and [Ca 2+ ] iin pregnant rat myometrium. A. Application of 20mM Na-acetate-containing Tyrode solution decreased baseline Ca 2+ concentration and inhibited spontaneous contraction.b.application of 20mM NH 4Cl-containing Tyrodesolutioninducedatoniccontractionand increased baseline Ca 2+ concentration reversibly.force and [Ca 2+ ] i were recorded simultaneously. Fluorescence ratio(f 340/F 380) is indicative of intracelular[ca 2+ ] i

23 2. 세포내 ph 변화가막전압의존성 Ca 2+ 전류의활성에미치는효과 세포내 ph 변동에따른 [Ca 2+ ] i 농도변화가세포막을통한 Ca 2+ 유입량 의변화를통해일어났는지를확인하기위해막전압의존성 Ca 2+ 전류의 활성에미치는세포내 ph 의효과를관찰하였다. 자궁평활근세포의세포 의막전압을 -80mV 로고정한상태에서 0mV 의 testpulse 를매 10 초간격 으로가하면서얻은내향전류를대조군으로삼았다. 이후관류액을 20mM Na-acetate 가포함된 Tyrode 용액으로대치한경우내향전류의크기가 대조군에비해현저히감소하였으며 (% decrease ofi Ba;47.81±10.44% of control,n=6,p<0.01), 정상 Tyrode 용액으로재관류시감소하였던내향전 류의크기가다시대조군상태로돌아오는것을관찰할수있었다 (Fig. 2A). 이때관류액에 Ca 2+ 통로차단제로알려진 nifedipine(3μm) 을첨가하 는경우내향전류가소실되는것으로보아본실험조건에서기록된내향 전류는막전압의존성 Ca 2+ 전류임을확인할수있었다.Ca 2+ 전류의막전 압의존성질에세포내 ph 변화가영향을끼치는지를확인하기위해 Ca 2+ 전류의전류 - 전압곡선에 Na-acetate 가미치는효과를관찰하였다.Test pulse 의크기를 -50mV 에서 +60mV 까지 10mV 간격으로변화시켜가면서 각각의 testpulse 에의해유발되는내향성전류를기록하여 Ca 2+ 전류의

24 전류 - 전압곡선을작성하였다. 이후관류액을 Na-acetate 가첨가된 Tyrode 용액으로바꾼상태에서동일한방법으로내향성전류를얻은후이를전 류 - 전압곡선상에표시하였다.Na-acetate 가첨가된 Tyrode 용액으로관 류시측정에사용한모든막전압값에서 Ca 2+ 전류의크기가감소한것을 관찰할수있었으며,Ca 2+ 전류의크기가최대로되는전압값이나 Ca 2+ 전 류의역전전압값은유의하게변화하지않았다 (Fig.2B). 관류액을 20mM NH 4Cl 이포함된 Tyrode 용액으로대치하여평활근세 포내 ph 를증가시킨경우 Na-acetate 용액을관류시킨경우와는달리 Ca 2+ 전류의크기가대조군에비해현저히증가하였으며 (% increaseofi Ba; 39.69±7.8% ofcontrol,n=6,p<0.01), 이같은효과는측정에사용한모든 막전압값에서유사하게관찰되었다 (Fig.2C 및 D)

25 Fig.2.Changesin wholecelba 2+ currentsby intracelularph change in pregnantratmyometrialcels.a.timecourse oftypicalchangesin I Ba elicited by testpulsesto0mv from aholding potentialof-80mv on Na-acetate exposure.horizontalbarindicates the time ofperfusion of 20mM Na-acetate-contatining Tyrode solution. B. Efect of Na-acetate on current-voltage relations of I Bȧ Summary of voltage dependence ofi Ba forcontrol( )and 20mM Na-acetate ( ).Ateach voltage steps,peak values of current were determined and averaged (n=8).c.timecourseoftypicalchangesin I Ba by perfusion of20mm NH 4Cl-containing Tyrode solution. D. Efect of NH 4Cl on current-voltage relations ofi Bȧ Summary ofvoltage dependence ofi Ba for control( ) and 20mM NH 4Cl( ).At each voltage steps,peak values of current were determined and averaged (n=8). *represents stasticalysignificant(p<0.01)

26 3. 세포내 ph 변화가막전압의존성 K + 전류의활성에미치는효과 평활근세포막에존재하는여러종류의 K + 통로중에서막전압의존성 K + 전류만을선택적으로기록하기위해관류액의 CaCl 2 를 MnCl 2 로대치하 였고, 전극내액으로는고농도 BAPTA(10mM) 와 ATP(5mM) 를첨가한용 액을사용하여 Ca 2+ 의존성 K + 전류 (I K-Ca) 나 ATP 민감성 K + 전류가발생 하는것을최소화하였다. 이를확인하기위해 I K-Ca 전류의선택적차단제인 iberiotoxin(100 nm) 을처리한경우, 탈분극자극에의해유발되는외향성 전류의크기에영향이없었다. 따라서본실험조건에서측정된외향성 K + 전류는주로막전압의존성 K + 전류 (delayed rectifierk current;i dk) 임을 확인할수있었다. 이와같은실험조건에서기록된 I dk 전류의활성에세포내 ph 변화가 미치는효과를확인하기위해관류액에 20mM 의 Na-acetate 혹은 NH 4Cl 를 첨가한상태에서 I dk 전류의활성변화를기록하였다. 막전압을 -80mV 로 고정한상태에서 +20mV 의탈분극자극을매 10 초간격으로가하여얻은 전류의크기를대조군으로삼은후, 관류액을 20mM Na-acetate 를첨가한 Tyrode 용액으로치환한경우 K + 전류의크기가증가하는것을관찰할수 있었으며, 정상 Tyrode 용액으로재관류시증가하였던 K + 전류의크기가

27 대조군상태로돌아오는것을관찰할수있었다 (Fig.3A).Fig.3B 는탈분 극자극의크기를 -50mV 에서 +65mV 까지 10mV 간격으로변화시켜가면서 얻은 I dk 의전류 - 전압관계 (current-voltagerelation) 에미치는 Na-acetate 의효과를보여주고있다.20mM Na-acetate 를첨가한 Tyrode 용액으로 세포를관류시킨경우측정에사용한모든막전압범위에서 K + 전류의크 기가유의하게증가한것을관찰할수있다. 관류액을 20mM NH 4Cl 이포함된 Tyrode 용액으로대치하여평활근세 포내 ph 를증가시킨경우,Na-acetate 가첨가된 Tyrode 용액으로관류시 킨경우와는달리 K + 전류의크기가대조군에비해현저히감소하였으며 (Fig.3C), 이같은효과는측정에사용한모든막전압값에서유사하게관 찰되었다 (Fig.3D)

28 Fig. 3. Efects of intracelular ph change on I dk in pregnant rat myometrialcels.timecourseoftypicalchangesin I dk elicited by test pulsesto20mv from aholding potentialof-80mv on Na-acetate(A) ornh 4Cl(C)exposure.Horizontalbarindicatesthetimeofperfusionof 20mM Na-acetate or NH 4Cl-contatining Tyrode solution.b.efectof Na-acetate on current-voltage relations of I dk.summary of voltage dependence ofi dk forcontrol( ),and 20mM Na-acetate ( ).Ateach voltage steps,peak values of current were determined and averaged (n=7).d:efectofnh 4Clon current-voltagerelationsofi dk.summary of voltage dependence of I dk for control( ) and 20mM NH 4Cl( ). *representsstasticalysignificant(p<0.01)

29 4. 세포내 ph 변화가 Ca 2+ 의존성 K + 통로활성에미치는효과 세포내 ph 변동이 Ca 2+ 의존성 K + 통로 (BK Ca) 의활성에미치는효과 를확인하기위해 insideoutpatch 를만든상태에서실험을실시하였다. 이 때관류액의 Ca 2+ 농도와막전압이 BK Ca 통로의활성에미치는영향을배 제하기위해막전압을 +20mV 로, 관류액내유리 Ca 2+ 농도를 5x10-6 M (pca6.5) 로일정하게유지한상태에서실험을실시하였다.Fig.4 에서나타 난바와같이관류액의 ph 값을 7.4 에서 7.0 으로감소시킨경우, 그에비례 해서 BK Ca 통로의활성이유의하게감소하는것을확인할수있었으며 (% NPo change:n=5,p<0.05), 정상용액 (ph 7.4) 으로재관류시감소하였던 BK Ca 통로의활성이회복되는것을관찰할수있었다. 이후관류액의 ph 값을증가시킨경우 (ph 7.8), 그에비례해서 BK Ca 통로의활성이유의하 게증가하는것을확인할수있었다 (% NPochange:n=5,p<0.05). 이같 은세포내 ph 변동이 BK Ca 통로의 singlechannelconductance 값에는유 의한효과를보이지않았다 (235.7pS in control; 236.8pS in ph 7.0; 231.2pS inph 7.8,n=5)

30 Fig.4.pH i dependentchange in Ca 2+ -activated K + channelactivity in pregnantratmyometrialcels.a.aftermaking an inside-outpatch,the membranepotentialwasclamp to +20mV.pH ofperfusing solution was changed from 7.4 to 7.0 or 7.8 as indicated in the figure and the resulting change in K + channelactivity was recorded.b.summarized result of ph īdependent changes in K + channelactivity,which was expressed as a percentile of control(ph 7.4).*represents stasticaly significant(p<0.05)

31 IV. 고찰 자궁평활근세포의 [Ca 2+ ] i 농도및막전압의존성이온전류의활성에 미치는세포내 H + 의효과를조사한본실험을통해얻은주요한결과는 다음과같다. 즉 1) 평활근절편의자발적수축과 [Ca 2+ ] i 농도는약산인 Na-acetate 를처리하여세포내 H + 농도를증가시킨경우억제되는반면에 약염기인 NH 4Cl 을처리하여세포내 H + 농도를감소시킨경우에는증가하 는것을관찰할수있었다. 2) 막전압의존성 Ca 2+ 전류의크기가 Na-acetate 처리시모든막전압값에서감소하는반면에 NH 4Cl 처리시 유의하게증가하는것이관찰되었다. 이때 Ca 2+ 전류의전류 - 전압곡선상 최대크기를보이는전압의크기나역전전압값이 Na-acetate 및 NH 4Cl 처 리에의해변화하지않았다.3) 막전압의존성 K + 전류 (I dk) 의크기는 Ca 2+ 전류의경우와는달리 Na-acetate 처리시모든막전압값에서증가하는 반면에 NH 4Cl 처리에의해서는감소하는것이관찰되었다.4)Ca 2+ 의존성 K + 통로 (BK Ca) 의활성은관류액의 ph 를낮춘경우감소하였다가관류액의 ph 를높힌경우증가하는것을관찰할수있었다. 이와같은결과는세포 내산증시관찰되는자궁평활근의수축력저하와세포내 [Ca 2+ ] 농도감 소현상에세포내 H + 에의한이온통로의활성변화, 특히막전압의존성

32 Ca 2+ 통로의활성변화가주로관여함을알수있다. 세포내외의 ph 변동에의해막전압의존성 Ca 2+ 통로의활성이영향을 받음은여러연구자들에의해이미보고된바있다. 즉 Klockner 및 Isenberg (1994) 20 는세포외 ph 를감소시킨경우 Ca 2+ 통로의막전압의존 성질이감소하고,Ca 2+ 통로의전도도가감소함으로써 Ca 2+ 전류의크기가 감소한다고보고하였다. 이같은세포외 H + 의효과와는달리세포내 H + 을 변화시킨경우에는막전압의존성질의변화없이 Ca 2+ 통로의 availability 를변화시켜 Ca 2+ 전류의활성을조절한다고보고하였다. 20,21 본실험에서도 Na-acetate 를관류하여세포내 ph 를감소시킨경우,Ca 2+ 전류의전류 - 전 압곡선에서최대크기를나타내는막전압이나역전전압의크기에변화없 이 Ca 2+ 전류의크기가감소하는것으로볼때자궁평활근세포의경우, 다른평활근세포와유사하게세포내 H + 이온에의해 Ca 2+ 통로의 availability 가감소하여 Ca 2+ 전류의크기가작아짐을의미한다. 다만본실험에서는세포내액의 ph 를직접낮춰준상태에서 Ca 2+ 전류 를기록한것이아니라 Na-acetate 와같은약산을관류시킨상태에서 Ca 2+ 전류의크기를기록하였다. 따라서세포내 ph 변화에의한효과가아니라 Na-acetate 에의한 sideefect 로 Ca 2+ 전류의크기가감소하였을가능성이

33 있다. 그런데 20mM Na-acetate 나 Na-butyrate 와같은약산을관류할경우 세포내액의 ph 가 0.15unit 정도감소한다는보고 22 와 NH 4Cl 과같은약염 기를관류시켰을때 Na-acetate 와같은약산을관류시켰을때와는반대로 Ca 2+ 전류의크기가증가한다는본실험의결과 (Fig. 2B) 로볼때 Na-acetate 에의한 Ca 2+ 전류감소효과는세포내 ph 감소에의한것임을 알수있다. 한편막전압의존성 Ca 2+ 통로의활성은기본적으로평활근세포막 전압의탈분극정도에비례하고, 평활근세포막전압의크기는 K + 통로의 활성정도에따라결정됨은잘알려져있다. 10,18 따라서세포내낮은 ph 에 의해이들 K + 통로의활성이증가하고, 이에의해이차적으로 Ca 2+ 통로의 활성이억제되었을가능성도배제할수없다. 자궁평활근세포막에 존재하는여러종류의 K + 통로중에서막전압의존성 K + 전류 (I dk) 와 Ca 2+ - 의존성 K + 전류 (BK Ca ) 의경우평활근세포막의안정막전압및 수축력의크기결정에중요한역할을수행하므로세포내 H + 농도변화가 이들 K + 통로의활성에미치는효과를확인하고자하였다. 16,18,23 막전압의존성 K + 전류의활성을기록하기위해본실험에선 전극내액에고농도 ATP(5mM) 및 EGTA(5mM) 가첨가된용액을 사용하였으며, 외향전류를얻기위해강한탈분극자극을가하였다. 따라서

34 ATP 민감성 K + 전류나내향성 K + 전류등이측정된외향전류에포함될 가능성은매우미미하며, 또한관류액에 Ca 2+ - 의존성 K + 전류의선택적 차단제로알려진 iberiotoxin 을투여한경우에도외향전류의크기에 변화가없는것으로보아외향전류의대부분이막전압의존성 K + 전류로 구성되어있음을확인할수있었다 (unpresented result, Robertson 및 Nelson,1994). 24 이같은조건에서약산인 Na-acetate 를관류시킬경우 막전압의존성 K + 전류의크기가측정에사용한모든막전압범위에서 유의하게증가하는것을관찰할수있었으며, 약염기인 NH 4Cl 을관류시킨 경우에는막전압의존성 K + 전류의크기가감소하는것을관찰할수 있었다. 이는관상동맥평활근세포막의막전압의존성 K + 전류의활성이 세포내낮은 ph 에의해증가한다는 Berger 등 (1998) 25 의보고와 일치하는결과라고생각되며, 막전압의존성 K + 통로의활성증가는자궁 평활근세포막전압의과분극을초래함으로써이차적으로 Ca 2+ 전류의 활성을억제하였을가능성이있다. 한편 Shmigol 등 (1995) 14 은본실험의 결과와는달리세포내 ph 를변화시키더라도자궁평활근세포의 외향전류의크기에변화가없음을보고하였으나이들의실험조건에선 측정된외향전류가막전압의존성 K + 전류만이아니라 Ca 2+ - 의존성 K + 전류가함께포함되어있어서외향전류의크기가세포내 ph 에의해 변화하지않았을가능성이있다. 막전압의존성 K + 통로이외에도

35 Ca 2+ - 의존성 K + 통로역시평활근세포막전압의크기결정에중요한 역할을수행하므로, 17,23 세포내 ph 변동이 Ca 2+ - 의존성 K + 통로 (BK Ca) 의 활성에미치는효과를확인하였다. Inside-out patch 를만든상태에서 관류액의 ph 를 7.4 에서 7.0 으로변화시킨경우그에비례하여 BK Ca 통로의 활성이현저하게감소하는것을확인할수있었다. 이같은활성변화는 세포내 H + 에의해 BK Ca 통로의막전압의존성이감소하고,Ca 2+ 에대한 반응성이약화되어나타난결과라고생각된다. 26 이와같이자궁평활근세포막전압의크기에중요한역할을하는 막전압의존성 K + 통로의활성은세포내낮은 ph 에의해증가하는 반면에 Ca 2+ - 의존성 K + 통로의활성은억제되는본실험결과로볼때, 세포내낮은 ph 에막전압이과분극되고, 이에의해이차적으로 Ca 2+ 통로의활성이억제되는지의여부에대해선불확실하다. 따라서이에 대해선 intracelular microelectrode 등을이용하여직접평활근세포의 막전압을측정함으로써확인하여야할것으로생각한다

36 V. 결론 임신쥐자궁평활근세포의장력,[Ca 2+ ] i, 그리고이온전류의활성에미 치는세포내 H + 의효과를관찰한본실험을통해다음과같은결과를얻을 수있었다. 1. 평활근절편의자발적수축과 [Ca 2+ ] i 농도는약산인 Na-acetate 를처리 하여세포내 H + 농도를증가시킨경우억제되는반면에약염기인 NH 4Cl 을처리하여세포내 H + 농도를감소시킨경우에는장력의크기및 [Ca 2+ ] i 가증가하는것을관찰할수있었다. 2. 막전압의존성 Ca 2+ 전류의크기가 Na-acetate 처리시모든막전압값 에서감소하는반면에 NH 4Cl 처리시유의하게증가하는것이관찰되었다. 이때 Ca 2+ 전류의전류 - 전압곡선상최대크기를보이는전압의크기나역 전전압값이 Na-acetate 및 NH 4Cl 처리에의해변화하지않았다. 3. 막전압의존성 K + 전류 (I dk) 의크기는 Ca 2+ 전류의경우와는달리

37 Na-acetate 처리시모든막전압값에서증가하는반면에 NH 4Cl 처리에 의해서는감소하는것이관찰되었다. 4.Ca 2+ 의존성 K + 통로 (BK Ca) 의활성은관류액의 ph 를낮춘경우감소하 였다가관류액의 ph 를높힌경우증가하는것을관찰할수있었다. 이상의실험결과로볼때세포내 H + 증가에의한자발적수축의소실 과세포내 Ca 2+ 농도의감소는주로 H + 에의한막전압의존성 Ca 2+ 통로를 억제하는효과에기인한다고생각되며, 이와같은세포내낮은 ph 에의한 막전압의존성 Ca 2+ 전류억제효과는지연분만시관찰되는자궁근무력 증의주요유발기전의하나라고생각된다

38 참고 문헌 1. Bengtsson B. Factors of importance for regulation of uterine contractileactivity.actaobstetgynecolscandsuppl1982;108: Olson DM,MijovicJF.Sadowsky DW.Controlofhuman parturition. SeminPerinatol1995;19: Earley L,Wray S.An investigation into the efects ofhypoxia on uterine force produced by agonists, depolarization and arising spontaneously.jreprodfertil1993;99: Larcombe-McDoualJ,ButelN,Harrison N,Wray S.In vivo ph and metabolite changes during a single contraction in rat uterine smoothmuscle.jphysiol1999;518: WrayS.Hypoxiaintheuterus.NIPS 1994;9: Neilson JP,LavenderT,Quenby S,Wray S.Obstructed labour.br MedBul2003;67: Taggart MJ,Burdyga T,Heaton R,Wray S.Stimulus-dependent modulation of smooth muscle intracelular calcium and force by alteredintracelularph.pflugersarch.1996;432: Coleman HA,HartJDE,Tonta MA,Parkington HC.Changes in the mechansims involved in uterine contractions during pregnancy in guinea-pigs.jphysiol2000;523: NaderaliEK,ButelN,TaggartMJ,BulockAJ,EisnerDA,Wray S. The role of the sarcolemmalca 2+ -ATPase in the ph transients

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42 Abstract E fectsofph i changeon spontaneouscontraction and ionic currentsin pregnantratuterinesmooth muscle. Young HwanKim DepartmentofMedicalScience TheGraduateSchool,YonseiUniversity (DirectedbyAssociateProfessorYoung-HoLee) Itis known thatalteration ofthe intracelularph significantly afects thefrequency andamplitudeofspontaneouscontraction in pregnantrat uterine smooth muscle, however, the precise mechanisms did not elucidated.therefore,thisstudy wasdesignedtodeterminetheefectof intracelular ph change on spontaneous contractions of rat uterine smooth muscle and its possible celularmechanisms.we examined the efect of intracelular ph change on pregnant rat uterine contractility using severalexperiments folowing (i) the efect of intracelular ph change on the spontaneous contraction and intracelular Ca 2+ concentration([ca 2+ ] i)in pregnantratmyometrium and (i)theefectof intracelular ph change on the activity and kinetic property of voltage-dependentca 2+ channels and delayed rectiferk + channels,and (i) the efect of intracelular ph change on the activity of

43 Ca 2+ -activatedk + channels.uterinesmooth musclewasobtainedin rats at18~20daysofgestation.longitudinalstripsweredissectedandloaded with the Ca 2+ sensitive indicatorfura 2/AM. Patch clamp technique on isolated longitudinal single smooth muscle cel was used. The addition ofsodium acetateto spontaneous contractionsproduced a brief abolition ofspontaneouscontractions,folowed by decreased spontaneous contractions.however,the application ofammonium chloride caused a marked increase in the frequency and amplitude of spontaneous contractions. In some preparations, ammonium chloride caused tonic contractions.the force was associated with corresponding increase in the[ca 2+ ] i transients.intracelularacidosis(20mm Na-acetate)decreased the magnitude of the voltage-dependent Ca 2+ current, but the intracelular alkalosis (20mM NH 4 Cl) increased the magnitude of the voltage-dependent Ca 2+ current. Intracelular acidosis increased the delayed rectifier K + current but intracelular alkalosis decreased the delayed rectifier K + current. Activity of Ca 2+ activated K + channels(bk Ca )wasdecreased by intracelularacidosisandincreased by intracelularalkalosis. These results indicate thatph dependentchange in Ca 2+ channeland K + channelmay beinvolvedin theph dependentmodulation ofphasic contraction

44 Keywords:pregnantratuterinesmoothmuscle,intracelularpH, voltage dependent Ca 2+ channel, delayed rectifier K + current,ca 2+ -activatedk + channel