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현진 저
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1 대한배뇨장애및요실금학회지 : 제 5 권, 제 1 호 2001 년 6 월 J. Korean Continence Society, Vol. 5, No. 1, p1~11, June, 2001 종설 적출근편실험의이론과실제 - 배뇨기능과관련된평활근을중심으로 - 영남대학교의과대학약리학교실 Basic Concepts of Experiments with Isolated Smooth Muscle Strips Kwang-Youn Lee Department of Pharmacology, College of Medicine, Yeungnam University, Taegu, Korea 머리말 평활근의수축능력은심혈관계, 소화기계및비뇨생식기계의기능에서매우큰비중을차지하는중요한기능이다. 이러한주요장기의기능을평가하거나그기능에영향을주는인자들에관한연구를수행함에있어서그장기를구성하고있는평활근의수축능력을측정하는실험은매우중요하고실제적인의미를갖는다. 평활근세포나조직은수축과이완을통해서소속장기의기능을조절하고, 그러한평활근조직의기능을조절하는것이결국심혈관계장기의기능, 소화기능및배뇨기능등을조절하는것이되기때문이다. 1) Key Words:Experiment, Smoots musde strips. 교신저자 : 영남대학교의과대학약리학교실 대구시남구대명 5 동 Tel: 오늘날생명과학또는의과학연구의주류를이루는것은유전자를중심으로한연구방법, 즉유전인자의복제와전사, 그에서비롯되는단백의합성, 또거기에관련되는각종인자와효소의활성등에초점이맞추어지고있으며, 그런류의실험을위한방법론과실험결과가수준높은연구결과물의중요한구성요소로자리잡는추세이다. 현대의학이실험적연구에근거하는서양식의과학론에입각하여발전해가는과정에서약물의특정장기또는특정조직에국한된효과를관찰할필요성이강조되었고, 그러한효과의기전을밝히기위해서세포수준에서의실험이불가피하게되었다. 그러나세포수준에서의연구는평활근조직자체의수축과이완을연구하는보조수단일수밖에없으며, 결국은조직자체의수축이냐이완이냐하는문제가궁극적인관심의초점이될수밖에없다. 이런점에서지금부터 1

2 2 고찰해보고자하는 적출평활근절편의실험 ' 은나름대로중요한의미를갖는다. 우선적출근편실험을위한장치의대략을살펴본후에, 근절편실험의방법에는어떤것이있는지, 또그수축과이완의실험성적이얻어지는유형과그성적의평가방법을생각해보기로한다. 평활근조직과절편의준비 요로에는 renal pelvis로부터 ureter, trigone, detrusor, bladder neck 및 prostate 등에평활근조직이분포하고있다. 이중비교적관심을많이끄는것이 ureter, detrusor 및 prostate 의평활근이며, 배뇨기능에결정적역할을하는것은 detrusor라고말할수있다. 이모든평활근을그형태에따라적절히조작하여적출근편실험조 (isolated muscle bath) 에장치하면되는데, 대개요로의평활근들은특별한목적이외에는 circular axis를따라절편을만드는것이통례이다. 일단체외로적출된평활근은가급적생체내에서와유사한환경에서보존해야하는데, 근절편이생체내에서와유사한기능을발휘하게하기위해서는영양액, 산소, 및 온도의 3요소를갖추어주어야한다. 여기서영양액이란완충액, 완충영양액, bathing solution, buffered physiological salt solution 등여러가지로불리우는데, 포도당을포함한생리적식염수에적절한산- 염기완충물질을첨가하여 ph를일정하게유지시킨것이다. 표 1 은몇가지완충영양액의조성을나타낸것이다. 1~4 조직의절편을만드는과정은대개 0-4 의영양액내에서조직을다듬고실로묶거나철사로꿰어준비를한다음에, 37 로유지되고있는근절편실험조에현수하는것이상례이다. 산소는특별한경우를제외하고는대개 95%/5%-산소 / 이산화탄소의혼합가스로공급한다. 만일산소대이산화탄소의비율이높아지면 ph가상승하게되고, 온도가높아져도역시 ph가상승하게된다. ph=pk+log [HCO 3 - ] [H 2 CO 3 ] (pk of carbonic acid:6.1) [H 2 CO 3 ] 는 PCO 2 와 CO 2 의 solubility factor (α) 의곱으로나타나는데 α는상수이다. 그러므로혈중 PCO 2 가높으면 ph는감소되고, 표 1. 적출평활근절편의실험을위한완충영양액의조성 완충액 (mmo1/1) NaCl NaHCO 3 KH 2 PO 4 MgSO 4 KCl CaCl 2 glucose Ref Krebs (1) Krebs-Henseleit (2) Krebs-Ringer (3) Tyrode (4)

3 적출근편실험의이론과실제 3 반대로 PO 2 가높으면상대적으로 PCO 2 가낮아지므로 ph는증가된다. 5 그림 1. 혈중 HCO 3 - 의농도와세포외액의 ph 와의상관관계. CO 2 농도가높을수록 ph 의변화는낮은영역에국한된다. 평활근세포의막전위와탈분극 평활근세포막에서의막전위와탈분극은기본적으로골격근에서와같은양상으로존재하며, 세포의수축이탈분극에의하여유 발되는점도같다. 그러나특이한점은, 종류에따라차이가있으나, 대개 -50 mv 내지 -60 mv 정도로서, 골격근에서보다약 30 mv정도나높다는것이다. 이러한현상은그만큼평활근세포막의탈분극이용이하다는것을시사한다. 더구나어떤평활근세포막의전위는스스로증감을반복하는데 (slow waves, 그림 2의 B), 어떤경우에는 -35 mv을넘는경우도있다. 이런경우에는대개탈분극이유발되기도하는데, 아마도신경지배가모두제거된평활근절편이스스로수축과이완을반복하는것과연관이있을것으로생각된다. 평활근세포막의탈분극은극파전위 (spike potential) 와고원전위 (action potential with plateau) 의두가지가있는데, 극파전위는골격근에서보는것과같은짧은시간동안의전형적인탈분극이다 ( 그림 2의 A). 이것은대부분의평활근에서전기장자극, 호르몬, 또는흥분성수용체효현제등에의해일어나는탈분극이다. 고원전위는재분극의지연으로인해일어나며, 극파전위가 msec 정도지속되는데비해수백-수천 msec동안 Slow waves msec sec sec A B C 그림 2. 평활근세포막의탈분극. A: 전형적인극파전위. B:Slow wave 에의해유발되는극파전위. C: 고원전위.

4 4 지속되는것을볼수있다 ( 그림 2의 C). 이런형태의탈분극은요관 (ureter) 이나자궁또는일부혈관평활근등에서볼수있으며, Ca 2+ 이온의유입이크게영향을미친다. 즉, 최초의막탈분극에의해전위의존성칼슘통로가열리고, 이를통하여상당한시간동안지속적으로유입되는칼슘이온에의하여탈분극이유지되는것이다. 실험적으로고농도 (20 mm~80 mm) 의 KCl 을첨가하여수축을유발하는경우가있는데, 이때의막전위변동은다음과같이설명할수있다. 신경세포에서의 Nernst potential 개념을빌어서계산해보면한가지이온에의해부하되는막전위 (mv) 는 -61 x log x ( 세포내액농도 / 세포외액농도 ) 의수식에의해결정된다. 정상적인상태에서 K + 이온의농도는세포내액이약 140 meq이고세포외액은 4 meq 정도이다. 이때내 / 외비는약 35 로서이때의막전위는약 -94 mv라는계산이나온다 (log1035=1.544). 그러나외부에서 70 meq의 K + 을가하였다고가정하면내 / 외비가 2로줄어든다. 그러므로이때의막전위는 -20정도로높아지게되고 (log102=0.3) 이때는세포막의탈분극이매우용이해지는것이다. 이러한 K + 유발수축이평활근세포막의직접적인탈분극에의해촉발된다는것은배양된방광평활근세포가 K + 에노출되었을때세포내 Ca 2+ 의농도가증가한실험예로서확인할수있다. 6 실험조내에서의자발적수축과이완 평활근절편이생체내에서와유사한환경 에서수축과이완을유지할수있도록해주기위하여적출근편실험조를사용하게되는데, 실험조는근절편을현수하는공간 (chamber), 산소공급장치, 전기장자극을위한전극장치, 영양액의배출을위한장치등과이들장치를둘러싼온도조절장치 (jacket) 로구성된다. 크기는 50 ml의대형으로부터 ml, 10 ml, 5 ml 및 1 ml 짜리가있으며, 실험상의필요에따라대개 4-5개로부터 12-24개까지연결해서사용하기도한다. 수축력을측정하기위한장치로서는근운동기록기 (myograph) 를사용하는데, 과거에는 isometric( 等尺, 等長 ) myograph 와 isotonic( 等力, 等張 ) myograph를병용하였으나오늘날은대부분이 isometric myograph 만을사용한다. 근운동의기록을위해서는고전적으로 physiograph 또는 polygraph를사용해왔으나근래에는 data acquisition system이라하여 myography로얻은데이터를컴퓨터에입력하고, 컴퓨터프로그램을이용하여데이터를읽고분석하기도한다. 평활근절편은장기에따라정도의차이가있으나대부분이자발적으로수축과이완을반복하며, 이러한자발운동은실험조에현수한직후급격하게증가하였다가대개는 20-30분이내에약하고안정적인양상으로정착된다. 어떤평활근은현수한지 30분이상이경과하면자발운동이거의없어지고휴식기장력이서서히증가하는양상을보이기도한다. 이때기록장치의감도를높여보면미미하나마자발운동이지속되고있는것을알수있다. 평활근세포의자발적탈분극과수축은여러가지물리적자극에의해서도일어나

5 적출근편실험의이론과실제 5 는데, 수동적인장 (stretch) 에의한자극뿐만아니라영양액의온도저하나공기방울의움직임에의해서도자극을받는다. 그러므로최초평활근절편을현수한직후에적당한강도의수동장력을가하는것은절편의자발운동과휴식기장력을확보하기위한조치로서필요하다. 전기장자극실험 전기장자극 (electrical field stimulation, EFS) 실험은근절편에분포된신경의작용을관찰하기위한목적으로시행하는데, 근절편을만드는과정에서평활근조직에분포된자율신경중교감신경은척추주위신경절에서출발한축색돌기의일부와신경말단만이포함되며, 부교감신경은대개평활근조직내에접합후신경이존재하므로온전한신경세포가포함될수있다. 따라서전기장자극을가한경우에는주로부교감신경흥분효과만이관찰되게된다. 소화관에서처럼교감신경과부교감신경이외의신경분포 (NANC) 가존재하는경우는전기장자극의효과가복합적 으로일어나기때문에실험이복잡해지며, 실험의계획을면밀하게수립해야한다. 비뇨기계평활근에서도 VIP같은국소호르몬을유리하는신경과관련된실험을할때는이점을유의하여야한다. 전기장자극은대개의경우직류의방형파 ( 方形波, squrewave) 를사용하는데, 이는전압 (voltage, V), 주파수 (frequency, Hz), 및파장 (duration) 의주요 3요소를포함하며, 일정한시간동안반복된자극을가할경우행렬 (train) 의개념을도입하게된다 ( 그림 3). 전기장자극에의한근절편의수축또는이완반응은매우다양하게나타나는데, 자극의개시시점에서즉시수축또는이완이나타나는경우 (on-response) 가있는가하면어떤경우에는반응이약간씩지체 (delay) 되는경우도있다. 또어떤경우에는자극이중단되는시점에서반응이나타나기도한다 (off-response). Permeabilization 평활근절편이나세포를이용하여실험할때검색의대상물질이세포막수용체에 그림 3. 직류방형파의모식도. Baseline 은 0 볼트이며, train duration 은전기자극을지속한시간이다.

6 6 작용하지않는이차전령물질 (inositol 1,4,5- triphosphate 또는 cyclic AMP/GMP 등 ) 이나그유도체인경우이런물질들은대개수용성이고분자량이크기때문에정상적으로는세포막을통과하지못하는경우가많다. 어떤경우세포막을통과할수있는유도체를만들어사용하는경우도있지만그렇지못할때는세포내의어떤부위에작용하게하기위하여세포막의투과성을높임으로써그물질들이세포내로들어갈수있게해준다. 그렇게하기위해서는세포막에약간의손상을가하여인위적으로 pore를만들어주는방법을쓰는데, 이때사용되는물질들이 saponin, digitonin, triton-x 100, beta-escin, alpha-toxin 등의 detergent들이다. 이들은세포막의지질과결합하여그조각을떼어내기때문에 punched-out hole이생기게된다. 이렇게한세포막은세포내부와외부간의경계막으로서의기능이상당한부분까지상실되기때문에물질이동이매우용이해진다. 따라서이러한조직절편이나세포의 bathing medium은보편적으로사용하는영양액을사용할수가없으며, 세포내액과조성이유사하도록만들어진 cytosolic buffer solution을사용해야한다. Cytosolic buffer solution 조성 (in mm) 의한예를보면 20 NaCl, 100 KCl, 5.0 MgSO 4, 0.96 NaH 2 PO 4, 1.0 EGTA, 0.48 CaCl 2, 및 2% bovine serum albumin 을포함하고있다. 7 이와같이세포막의투과성을높일목적으로사용하는물질들중에는 ionophore라불리는 nystatin, amphotericin B and gramicidin 등도있는데, 8 이들은 detergent action에의해세포막에비교적작은크기로천공을만 들어몇가지이온의세포막투과성을증가시키기때문에 ionophore라부른다. 또 Ca 2+ ionophore인 A (calcimycin) 과같이세포막을손상시키지않고, 칼슘이온과결합하여그극성을잃게함으로서함께세포막을통과하는경우도있다. Ca 2+ ionophore를사용하는경우에는일반적인영양액내에서실험을하여도무방하다. 실험에사용할약물의준비 적출근편의실험에사용하는약물은대개 molar 농도로첨가한다. 1 몰 (mol, mole) 은그약물의분자량에 g 단위를붙인양이므로 NaCl 1 몰은 = 58.5 g 이며, 이것을물 1 L에녹이면 1 molar concentration으로서 1 mole/l 또는 1 M로나타낼수있다. 약물이실험조내에첨가되었을때최종적으로얻어질농도를미리계산하여, 그보다 20배또는 50배높은농도의 aliquot을미리만들어두었다가실험시에소량을첨가함으로써실험조내에서희석되어목표하는농도에이르게하는방법을사용한다. 이방법은일정한조건에서미량의약물을용해시켜냉장고나냉동실에준비하여두었다가실험당일에녹이고희석해서사용할수있으므로매우편리한방법이다. 약물을용해시키는용매로서는대개물이나 bathing solution을사용하는데, 지용성을띤약물인경우에는에탄올, dimethylsulfoxide (DMSO), 또는 propylene glycol 등에일단녹인후물로희석하여사용한다.

7 적출근편실험의이론과실제 7 수축과이완의성적읽기 가. 수축실험평활근수축의유형은기본적으로두가지가있는데, phasic contraction과 tonic contraction 이그것이다. Phasic contraction은어떤자극에의해수축이유발되는시점에서관찰되는급격한수축을말하며, tonic contraction은수축이서서히진행되거나장시간일정한수준의수축상태를유지하고있는것을말한다. 이러한수축들이세포질내에증가된 Ca 2+ 에의한것이라는데는이견이없으나, 그 Ca 2+ 의출처에대해서는연구자에따라견해가다른경우가있다. 어쨌거나수축을위한 Ca 2+ 의출처는세포외액으로부터유입되는것과세포내저장소로부터유리되는것이있으며, 유입되는통로의종류가다양하고세포내유리의기전또한여러가지가있어서실험의조건과사용약물에따라여러가지해석이가능하다. 이러한수축을측정하는방법은어떤기준시점의수축강도를중량의단위로나타내는경우가많다. 그림 4 는 K + 에의해유발되는수축이 L-type Ca 2+ 통로개방제인 Bay K 8644와 Ca 2+ 통로봉쇄제인 nifedipine에의해변화되는것을관찰한실험례이다. 저농도의 K + 에의해서는 phasic contraction 만나타나나, 80mM 이상의고농도에서는 tonic contraction이관찰된다. Ca 2+ 통로개방제인 Bay K 8644에의해 tonic contraction이보다 그림 4. Guinea pig ureter 에서 K + 에의해유발되는 phasic contraction 과 tonic contraction 의예.

8 8 저농도의 K + 에의해서도일어나게되며, Ca 2+ 통로봉쇄제인 nifedipine에의해서는저농도에서의 phasic contraction이없어지고 tonic contraction도매우고농도에서나타나는것을볼수있다. 9 어떤자극에의해서는위와같은급격한반응이보이지않으며, 자발운동의진폭도변화하지않고긴장도만조금씩증가하는경우도있다 ( 그림 5). 10 수축실험에서실험성적의평가는비교적간단하다. 실험조건에서의수축고, 즉 phasic contraction 시 spike의높이또는 tonic contraction시 basal tone의높이를 control과비교하거나, 컴퓨터를이용해서일정한시간동안의수축력의합을산출하는방법이있다. 후자의경우는이론상전자에비해훨씬정밀한측정방법이지만그결과는대개단순 히일정한시점에서의장력을읽은성적과별차이가없다. 나. 이완실험평활근을이완시키는요인에관한실험은수축실험에비해방법이다양하고좀더주의를요한다. 그림 6은평활근절편의자율수축이이완제에의해단계적으로약화되는경우이다. 10 이런경우의성적읽기는좀까다롭다. 자율운동의진폭과기초장력이함께줄어들고있기때문이다. 대개이런실험은마지막순서로서근절편을완전히이완시키는과정이반드시필요함을잊어서는안된다. 즉 EDTA 나 EGTA같은 calcium chelater 를대량으로첨가하여상당한시간방치하면세포내외 Control P RP BRL G 1min Bethanechol 그림 5. Rat detrusor 에서 bethanechol 에의한수축이각종 K + 통로개방제 (P 1060, RP 49356, BRL 38227) 에의해억제되는실험예. Bethanechol 이나 K + 통로봉쇄제들이나공히자율수축의진폭에는영향을주지않으면서기초장력에만변화를초래하였다.

적출근편실험의이론과실제 9 RP 49356-8 -7-6 -5-4 BRL 38227 1G 1min -8-7 -6-5 -4 그림 6. Rat detrusor 에서 K + 통로개방제가근절편의자율수축을감소시키는실험례. -5.5-5 -4.5-4 -3.5-3 그림 7.

9 적출근편실험의이론과실제 9 RP BRL G 1min 그림 6. Rat detrusor 에서 K + 통로개방제가근절편의자율수축을감소시키는실험례 그림 7. Dog detrusor 에서 K + 통로개방제 (RP 52891) 가근절편의기초장력을감소시키는실험례. Data acquisition program 에의해서검게선택한부분 ( 약물의다음농도첨가전 2 분간 ) 의그래프아래쪽면적을구할수있다. 의칼슘이결핍되어근이완이가능하며, 경우에따라서는 papaverine같은강력한평활근이완제를첨가할수도있다. 이때얻어진완전이완값을 0으로두고, 실험약물첨가직전의기본장력을 100으로두면약물에의한근이완을 % 값으로나타낼수있다. 자율수축의진폭과기초장력의감소두가지요소를다포함하는성적을원한다면그림 7 과같은방법이있다. 11 근절편을이완시키는요소에관한실험을위해사용하는방법중대표적인수축제를이용하여먼저수축을일으킨다음검색하려는요소를적용하여이완상태를관찰하는실험이있는데, 이런경우에는선행수축제의선택에신중을기해야만한다. 즉, 수축제와이완제가어떤상호작용을하느냐또는약리학적으로어떤길항관계에있느냐하는것을주의깊게고려하지않으면실험

10 10 결과의해석에어려움이있을수있기때문이다. 맺음말 평활근절면을이용한수축또는이완의실험은자칫시대에뒤떨어진낡은실험방법으로오인될수있으나, 인체의생명유지에매우중요한역할을하는장기들의기능을궁극적으로또한정적으로측정할수있다는점에서충분히가치있고유용한실험방법이다. 극단적인예를들어서, 만일우리가단한알만복용하면영원히최고의건강상태를유지하면서늙지도않고죽지도않는약을찾아냈다면더이상의학에관련된어떤연구도하려하는사람이없을것이다. 조금범위를줄여서, 통괄적배뇨기능을최상의상태로유지시킬수있는묘약이있다면무엇때문에전립선의조직을배양하려고애쓰며, 그평활근세포의유전자를가지고실험할필요가있겠는가? 유감스럽게도아직우리는배뇨장애에관한모든것을다알고있지는못하며, 그렇기때문에배뇨기능에가장직접적이고궁극적인역할을하는평활근의수축과이완에대해연구할필요가있고, 그런실험을위해서는근절편과그운동성을측정하는실험장치를효율적으로이용할수있어야하는것이다. References 1. Maggi CA, Giuliani S, Santicioli P: Effect of cromakalim and glibenclamide on spontaneous and evoked motility of the guinea- pig isolated renal pelvis and ureter. Br J Pharmacol 1994; 111: Honda K, Miyata Osawa A, Takenaka T:alpha 1-Adrenoceptor subtype mediating contraction of the smooth muscle in the lower urinary tract and prostate of rabbits. Naunyn-Schmiedebergs Arch Pharmacol 1985; 330: Ueda S, Yoshida M, Yano S, Mutoh S, Ikegami K, Sakanashi M:Comparison of the effects of primary prostaglandins on isolated human urinary bladder. J Urol. 1985; 133: Choppin A, Eglen RM, Hegde SS:Pharmacological characterization of muscarinic receptors in rabbit isolated iris sphincter muscle and urinary bladder smooth muscle. Br J Pharmacol 1998; 124: Guyton AC, Hall JE : Textbook of Medical Physiology. WB Saunders, 10th, 2000, pp Chambers P, Neal DE, Gillespie JI:Ca 2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder. Exp Physiol 1996; 81: Biancani P, Harnett KM, Sohn UD, Rhim BY, Behar J, Hillemeier C, Bitar KN:Differential signal transduction pathways in cat lower esophageal sphincter tone and response to ACh. Am J Physiol 1994; 266(5 Pt 1): G Fan JS, Palade P:Perforated patch

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< 서식 5> 탐구보고서표지 제 25 회서울학생탐구발표대회보고서 출품번호 유글레나를이용한산소발생환경의탐구 소속청학교명학년성명 ( 팀명 ) 강서교육청서울백석중학교 3 임산해 [ 팀원이름 ]

< 서식 5> 탐구보고서표지 제 25 회서울학생탐구발표대회보고서 출품번호 유글레나를이용한산소발생환경의탐구 2010. 09. 28. 소속청학교명학년성명 ( 팀명 ) 강서교육청서울백석중학교 3 임산해 [ 팀원이름 ] 목 차 Ⅰ. 탐구주제 02 Ⅱ. 탐구하게된동기 02 Ⅲ. 배경이론 02 1. 유글레나의특징가. ph 나. 온도 Ⅳ. 선행연구고찰 03 1. 산소결핍과인체에미치는영향