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1 Polymer(Korea), Vol. 30, No. 2, pp , 2006 플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 양희석, ㆍ박귀덕 ㆍ안광덕 ㆍ김병수 ㆍ한동근, 한국과학기술연구원생체재료연구센터, 한양대학교화공과 (2006년 1월 4일접수, 2006년 3월 9일채택 ) Optimal Hydrophilization and Chondrocyte Adhesion of PLLA Films and Scaffolds by Plasma Treatment and Acrylic Acid Grafting Hee Seok Yang*, **, Kwideok Park*, Kwang-Duk Ahn*, Byung Soo Kim**, and Dong Keun Han*, *Biomaterials Research Center, Korea Institute of Science and Technology, P.O. Box 131, Cheongryang, Seoul , Korea **Department of Chemical Engineering, Hanyang University, 17 Haengdang-dong, Seongdong-gu, Seoul , Korea (Received January 4, 2006;accepted March 9, 2006) 초록 : 기존의고분자지지체의소수성및세포친화성을향상시켜조직공학용고기능성지지체로사용하기위해서여러가지플라스마처리와카복실기를함유한아크릴산 (AA) 을직접 chamber 내에서 in situ 그래프트결합을행하여최적의친수성을갖는생분해성 poly(l-lactic acid) (PLLA) 필름및이중기공지지체를제조하였다. 표면분석결과, 표면개질된비다공성 PLLA 필름및이중기공지지체표면은미처리 PLLA control 에비해서접촉각의감소와카복실기함량의증가로친수성이크게증가하였다. 특히여러가지표면개질방법중 Ar( 아르곤 )/AA 시료나 Ar+TP( 열중합 ) 시료보다는 Ar 플라스마와 AA 를차례로처리한 Ar+AA+AA 시료가다른시료들보다접촉각이낮고카복실기가많아서최적의표면친수화처리조건임을알수있었으며, 표면개질된 PLLA 필름및이중기공지지체의경우친수성이증가함에따라서연골세포의점착과증식도크게향상되었다. Abstract: To utilize as highly functional scaffolds for tissue engineering by improving hydrophobicity and cell compatibility of the exist polymer scaffolds, the biodegradable poly(l-lactic acid) (PLLA) films and scaffolds having the optimal hydrophilicity were prepared by in situ plasma treatment and grafting of a carboxyl acid-containing monomer, acrylic acid (AA) in the chamber. From the results of surface analyses, surface-modified nonporous PLLA film and dual pore scaffold surfaces showed high hydrophilicity due to the decrease in contact angle and the increase in carboxylic groups as compared with untreated PLLA control. In particular, among various surface modification methods, Ar(argon)+AA+AA sample prepared by Ar plasma and then acrylic acid treatments displayed lower contact angle and more carboxylic groups than Ar/AA and Ar+TP(thermal polymerization) samples, indicating that Ar+AA+AA sample was optimally treated for improving its hydrophilicity. In the cases of surface-modified nonporous PLLA films and dual pore scaffolds, the adhesion and proliferation of chondrocytes increased with increasing their hydrophilicity. Keywords: tissue engineering, biodegradable scaffolds, plasma treatment, acrylic acid grafting, hydrophilization, chondrocyte adhesion. 서론인간의생명연장에대한무한한탐구노력으로생명과학및의학분야의눈부신발전과더불어미래를선도해나아갈신기술인조직공학분야도하나의학문으로정립되고있다. 1-3 조직공학의필요성은장기이식에대한관심으로부터출발되었으며초창기장기이식분야는인류의건강증진, 나아가생명연장이라는매우중요한역할을하였으나점차필요로하는장기의수보다는기증된장기의숫자가현 To whom correspondence should be addressed. dkh@kist.re.kr 저히부족하다는한계에이르게되었다. 장기이식의수급불균형은여러가지사회적, 윤리적문제를초래하였고이러한문제를해결하기위하여인공적으로생체조직또는장기를재생하려는조직공학이라는분야가현재각광을받고있다. 일반적으로기본적인조직공학기법은먼저환자의몸에서필요한조직을일부채취하고그조직편으로부터세포를분리한다음분리된세포를배양을통하여필요한양만큼증식시킨다음다공성을가지는생분해성고분자지지체 (scaffold) 에주입하여일정기간체외배양한후이하이브리드형세포 / 고분자지지체를다시인체내에이식함으로써인공적으로필요한부분에서조직이나장기를재생하는것이다. 이 168

2 플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 169 렇게이식된생분해성고분자지지체는체내에서주위조직과융화가잘되어야하며염증반응이없고일정기간이지난후원하는시간에스스로분해하여이물질로남지않아야한다. 4,5 최근생분해성 polyglycolide(pga), poly(l-lactic acid)(plla), poly (lactide-co-glycolide) (PLGA), poly(ε-caprolactone) (PCL) 등의합성고분자또는콜라겐 (collagen), 키토산 (chitosan) 및히알론산 (hyaluronic acid) 등의천연고분자가조직공학용지지체로많이연구되고있다. 6,7 합성고분자지지체의경우우수한기계적강도와분해속도를조절할수있는장점이있으나표면의소수성과세포적합성의결여로초기세포점착및성장이천연고분자에비해낮으며, 반면에천연고분자지지체는표면성질이우수하나기계적물성이떨어지고세포배양시지지체자체가수축하여원하는크기및형태를유지할수없는것으로알려져있다. 특히합성고분자재료는모두소수성이고또한기능성기가없기때문에특히조직공학적응용에있어서세포및조직적합성이낮다는단점이있다. 이러한문제점을개선하기위하여여러가지방법으로고분자지지체의표면을개질하려는연구가많이진행되고있다. 조직공학용고분자지지체의친수성및세포친화성을향상시키기위하여물리화학적인방법을이용하고있다. 대표적인화학적인방법으로는수산화나트륨과같은알칼리성이나 8-10 염산과같은산성 11 수용액으로처리하는방법, 과산화수소수용액으로처리하는방법등이 12 알려져있다. 그러나이러한산 / 알칼리또는과산화수소수용액을사용하는방법의경우에는그수용액에의하여지지체자체가분해되어기계적성질이저하될수있기때문에최근에는다른한편으로물리적인방법이더많이연구되고있다. 13 이를위해서주로자외선 (UV) 조사, 12,14 전자선조사, 13 감마선조사, 15 플라스마처리 등이사용되고있으며이중플라스마처리방법은얻어진기능성기를이용하여펩타이드와단백질, 21 콜라겐, 22,23 키토산 10 등을결합하여세포친화성을향상시키고있다. 특히고분자지지체에친수성, 생체적합성및기능성기를동시에부여할수있는카복실기를도입하려는연구도많이진행중이다. 카복실기는중합단량체인아크릴산 (AA) 이나메타크릴산을분해성 PLLA, PCL, 전분 (starch) 이나비분해성폴리에스터 (PET) 고분자에플라스마처리로활성화한다음 UV조사나 14,22,24,25 열중합에 26,27 의해서그래프트하여도입하고있다. 이와관련하여본연구팀은이전연구에서기존고분자지지체의단점을해결하기위해서가스발포법과상분리법을병합하여새롭게고안된제조방법으로단일기공과이중기공의다공성고분자지지체를제조하였다. 이렇게얻어진다공성고분자지지체는조직공학용으로사용할수있는우수한물리적및기계적특성과적당한생분해성을나타내었다. 28,29 또한이러한지지체의소수성과세포친화성을개선시키기위해서같은성분의고분자필름에산소나아르곤 (Ar) 을이용하여플라스마처리한다음 AA를기존의 chamber 외에서의 UV조사나열중합이아닌직접 chamber 내에서 in situ 그래프트중합에의해서결합시켰다. AA로표면개질된고분자필름은친수성이크게증가하였으며이로인하여섬유아세포 (fibroblast) 의배양실험결과미처리필름에비해세포의점착및증식이현저히향상되었다. 30,31 본연구에서는기존의플라스마처리를이용하여최적의친수성및생리활성물질과결합할수있는카복실기를갖는조직공학용생분해성고분자지지체를제조하기위해서 Ar 플라스마에의한여러가지표면개질방법에따라 AA를직접 chamber 내에서 in situ 그래프트결합시켰으며, 이렇게개질된 PLLA 필름및지지체의표면특성 과연골세포 (chondrocyte) 와의상관관계를미처리 PLLA control과비교하여평가하였다. 실험재료및시약. 다공성필름및 3D 이중기공고분자지지체를제조하기위한생분해성고분자재료로 poly(l-lactic acid) (PLLA, 분자량 =220000; 독일 Boehringer Ingelheim사 ) 을사용하였다. 지지체를제조하는데있어서기공형성을위한무독성, 수용성및비등성혼합물로는 sodium bicarbonate(nahco 3 ) 와 citric acid를사용하였으며, 용매는 chloroform 및 1,4-dioxane을사용하였고비용매로는 3차증류수를사용하였다. 카복실기함유친수성중합단량체는 Aldrich사의아크릴산 (acrylic acid, AA) 을사용하였다. 그밖의다른시약들은 1급제품으로정제없이그대로사용하였다. 비다공성 PLLA 필름의제조. 비다공성 PLLA 필름은용매주형방법으로제조하였다. 즉, PLLA를 chloroform에 8% 용액으로제조한다음, Vortex 혼합기를이용하여균일하게완전혼합하여용해하였다. 이혼합액을 glass dish에부어 24시간공기중에서건조하고 48시간상온에서진공펌프를이용하여용매를완전히제거하였다. 제조된비다공성 PLLA 필름의두께는 mm였다. 이중기공 PLLA 지지체의제조. 이중기공 PLLA 지지체는가스발포법에의한큰기공과상분리법에의한작은기공을동시에갖는형태로제조하였다. 29 우선 PLLA를 40 에서 1,4-dioxane 과물 (87/13, vol/vol) 을사용하여용해하였으며고분자농도는 7% 의균일혼합용액으로만들었다. 비등성혼합물인 sodium bicarbonate와 citric acid를막자사발을이용하여분쇄한후 sieve 를사용하여입자크기별로분류하여 µm의입자크기를얻었다. 두개의비등성혼합물 (sodium bicarbonate와 citric acid의혼합몰비=3:1) 을미리제조된고분자용액에비등성염 / 고분자용액의중량비가 20/1이되도록동시에넣고 Vortex 혼합기를이용하여균일하게혼합하였다. 이혼합용액을일정한형태의실리콘재질의틀에붓고액체질소로급랭시킨후동결건조하여용매 / 비용매인 1,4-dioxane과물을모두증발시켜서디스크형태의시편을제조하였다. 이디스크형태의시편을물과에탄올과의혼합비가 50:50인발포매질에넣고교반하면서 48시간정도발포과정을거친후시편을꺼내어진공에서 24시간건조하여최종적으로 3D 이중기공 PLLA 지지체를제조하였다. 플라스마처리및친수성 AA의결합. 플라스마처리장치는높이 25 cm, 내경 20 cm인 chamber형유리관, 플라스마발생을위한라디오파발생기 (FET RF plasma generator, RF-GEN), 유량조절기 (SS- 48 MG), 진공펌프 (SHI DAE Model No ) 및압력측정기 (Terranova Model No. 924) 로구성된국내 IDT Eng. 사제품을사용하였다. 실험에사용된비다공성 PLLA 필름 (1 2 cm 2 ) 과이중기공 PLLA 지지체 ( 지름 1.0 cm, 두께 0.8 cm) 는 in situ 직접적인 AA 결합을다양한방법으로 chamber내에서플라스마를처리하였으며, 더자세한여러가지처리조건을 Table 1에나타내었다. 즉, Ar 가스와 AA를이용한플라스마반응에서비다공성필름과이중기공지지체를플라스마방전장치의 chamber 내에위치한라디오파발생전극판사이에고정시킨후연결된모든밸브를닫고진공펌프를사용하여 chamber내압력이 0.1 torr가되도록한다음이상태에서먼저 Ar 가스를주입하여 chamber내압력이 0.2 torr 가되게하고동시에 Polymer(Korea), Vol. 30, No. 2, 2006

3 170 양희석ㆍ박귀덕ㆍ안광덕ㆍ김병수ㆍ한동근 Table 1. Surface Modification of PLLA Films and Scaffolds Sample Treatment conditions 1. PLLA control No treatment Ar/AA simultaneous treatment 2. Ar/AA a (0.4 torr, 50 W, 1 min) 3. Ar+AA+Ar Ar plasma ---- AA feed ---- Ar plasma (0.2 torr, 50 W, 1 min) (0.2 torr, 0 W, 2 min) (0.2 torr, 25 W, 1 min) 4. Ar+Ar+AA Ar plasma ---- Ar feed ---- AA feed (0.2 torr, 50 W, 1 min) (0.2 torr, 0 W, 10 min) (0.2 torr, 0 W, 2 min) 5. Ar+AA+AA Ar plasma ---- AA plasma ---- AA feed (0.2 torr, 50 W, 1 min) (0.2 torr, 50 W, 1 min) (0.2 torr, 0 W, 2 min) 6. Ar+TP Ar plasma ---- Thermal polymerization (TP) (0.2 torr, 50 W, 1 min) (70, 90 min, 50 rpm) a Ar: Argon gas, AA; acrylic acid. AA를감압, 기화하여 chamber내압력이 0.4 torr가되게하였으며, 라디오주파수 (RF) 전원과펄스형음전압을가하여 50 watt 에서 1분동안플라스마반응을행하여 Ar/AA로명명하는시료를제조하였다. 또한 Ar 가스로 PLLA의표면을활성화하는 Ar 플라스마방법과 AA를 PLLA의표면에공급하는 AA feed 방법을이용하여 Ar 과 AA의처리방법과시간에따라서 Table 1에서와같이 Ar+AA+Ar, Ar+Ar+AA 및 Ar+AA+AA 시료를각각제조하였다. 또다른방법으로본연구에서는건식공정뿐만아니라습식표면처리공정을비교하기위해서비다공성필름과이중기공지지체를플라스마 chamber 내에서앞선방법으로 Ar 가스만으로먼저활성화시킨후실온에서일정시간동안방치하여라디칼을안정시킨다음 10% 수용액으로제조된 AA 용액에담궈서 70 에서 90분동안 50 rpm으로교반하면서그래프트중합하여 Ar+TP 시료를제조하였다. 26,27 표면특성분석. 여러가지방법으로표면개질된 PLLA 필름은표면분석전에에탄올로세척한후건조한다음사용하였다. 먼저 PLLA 필름의화학적인구조를확인하기위하여 1 µm 범위의표면특성을측정할수있는 attenuated total reflection-fourier transform infrared(atr- FTIR, IFS 66 spectrometer, Bruker사 ) 로측정하였다. 그리고표면개질된 PLLA 필름의화학적표면조성분석은 electron spectroscopy for chemical analysis(esca, S-Probe, Surface Science 사 ) 를사용하여측정하였다. 사용한 ESCA 장치의양극에는 300 watt의전압과 1497 ev의 energy source(alkα) 가장착되어있으며측정시 X-ray의입사각은 45도로하였다. 표면의 survey scan과 carbon 1s(C1s) core level scan spectra로부터표면의화학적조성변화를분석하였다. 비다공성 PLLA 필름과이중기공지지체의표면개질전, 후의표면모폴로지는 scanning electron microscopy(sem, S-2500C, Hitachi 사 ) 로관찰하였으며금코팅은 torr의압력하에서 6 7 ma의 ion current 로 5분간행하였다. 표면개질전, 후의 PLLA 필름의친수화정도는물접촉각으로평가하였다. 물접촉각측정장치는 optical bench type contact angle goniometer(vca Optima XE Video Contact Angle System, Crest Technology사 ) 를이용하였으며비다공성 PLLA 필름표면에증류수 (3 µl) 를떨어뜨리고곧바로 goniometer를사용하여측정하였다. 또한 AA 단량체의결합에의한카복실기는 Toluidine Blue O 염료를이용하여정량하였다. 27,32 즉, Toluidine Blue O (0.5 mm, ph 10) 의용액에 PLLA 시료를담궈서 30 에서 6시간동안 Toluidine Blue O 염료와카복실기를반응시켰으며, 이때 Toluidine Blue O 염료와카복실산은 1:1로반응한다. 계속해서수산화나트륨용액 (ph 9) 에서 30초간 50 rpm 으로세척을한후아세트산 50% 수용액에서 12시간동안 1000 rpm으로 Toluidine Blue O를탈착시킨다음이수용액을 633 nm의 UV 흡광도로부터카복실기를정량하였다. 연골세포배양및분석. AA가결합된비다공성 PLLA 필름과이중기공지지체의세포친화성을확인하기위하여, 연골세포의배양실험을행하였다. 사용한연골세포는토끼의무릎에서체외분리한다음 primary culture한것을사용하였다. 표면개질된비다공성 PLLA 필름과이중기공지지체를 UV로 4시간멸균한다음 70% 에탄올수용액에 1시간정도담근후 phosphate buffered saline(pbs, ph 7.4) 용액으로세척하였다. 계속해서 fetal bovine serum(fbs) 이첨가안된배지에시료를 1시간동안담가둔후깨끗한거름종이에하나씩소독된핀셋을이용하여올려놓아잔여수분을제거한다음세포실험에사용하였다. 세포배양은준비된비다공성필름당연골세포 개, 이중기공지지체당 개를 static seeding한후 1시간동안흔들어준다음 Dulbecco s modified Eagle's medium F-12(DMEM F- 12) 배지를사용하여 37, 5% CO 2 에서각각 2, 4 및 6일동안배양하였다. 배양후시료에점착된세포를 SEM으로분석하기위해서 4 o C에서 12시간동안 2.5% glutaraldehyde로고정화를한후일련의에탄올 / 물혼합액 (50/50, 60/40, 70/30, 80/20, 90/10 및 100/0) 을사용하여순차적으로각각 10분씩세척하여최종적으로탈수시켰다. 이어서 deep freezer에 6시간동안냉동한다음 freeze dryer에넣어완전건조시킨후금코팅하여점착된세포의모폴로지를관찰하였다. 또한점착된세포의단백질은비다공성필름과이중기공지지체에고정화된연골세포를 WST-1(cell proliferation reagent) 시약을이용하여염색한후 4시간동안 37 에서 5% CO 2 하에서배양하여 450 nm의최대흡광도에서 ELISA reader로측정하여정량하였다. 결과및토론 PLLA 필름과지지체의표면개질. 조직공학적기법으로인공조직이나장기를재생시대부분의생분해성합성고분자지지체의표면이소수성이기때문에세포접종이어렵고또한세포배양액이잘젖지않아서세포가균일하게배양되지못한다고알려져있다. 이러한단점을해결하기위하여현재여러가지물리화학적방법으로지지체의표면개질을행하고있으며특히플라스마방법을이용하면재료의벌크물성의저하없이단시간에간단히표면만을개질할수있는장점이있다 폴리머, 제 30 권제 2 호, 2006 년

플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 171 Figure 1. Preparation and surface modification of nonporous PLLA films and 3D dual pore scaffolds.

4 플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 171 Figure 1. Preparation and surface modification of nonporous PLLA films and 3D dual pore scaffolds. 본연구에서는제조된비다공성 PLLA 필름과이중기공지지체를플라스마 chamber 에넣은후먼저 Ar 가스를주입하여플라스마처리에의하여표면을활성화한다음 AA를 chamber내로감압, 기화시켜흘려보냄으로써고분자표면에 AA를 in situ 직접그래프트중합을유도할수있었다 (Figure 1과 Table 1). 즉, AA는끓는점 (139 ) 이비교적낮아서적정조건으로감압하면상온에서도기화되어플라스마 chamber 내로들어올수있고또한플라스마처리시 chamber내의온도가 2 3 정도상승하는효과가있기때문에 chamber 의가열없이실온에서 AA의기화에의한표면그래프트중합이가능하였다. 특히본연구에서는플라스마처리및 AA의결합에의한고분자표면의친수화의최적조건을검토하기위해서 Table 1과같이크게 3 가지방법으로나누어표면개질을수행하였다. 첫번째는 Ar 가스와 AA를동시에처리하여 Ar/AA 시료를제조하였으며, 두번째는 Ar 플라스마처리와 AA 공급방법을순서와처리조건 ( 플라스마진공도, 압력및시간 ) 을서로달리하여 3가지의각기다른 Ar+AA+Ar, Ar+ Ar+AA 및 Ar+AA+AA 시료를제조하였다. 마지막으로기존의알려진방법과같이 chamber내에서 Ar 가스만으로먼저활성화시킨다음 chamber 외에서열중합에의해서 Ar+TP 시료를제조하였다. 26,27 이렇게얻어진비다공성 PLLA 필름및이중기공지지체의표면개질정도와특성을몇가지표면분석과연골세포와의점착실험을통해서비교, 평가하였다. 위와같이여러가지새로운방법으로비다공성 PLLA 필름및 3D 이중기공지지체에친수성중합단량체인 AA를플라스마처리에의해서표면개질함으로써친수성뿐만아니라생체적합성및리간드나성장인자등의생리활성물질과결합할수있는기능성기를동시에갖는조직공학용생분해성고분자재료를제조할수있었다. PLLA 필름과지지체의표면특성. 조직공학용친수성고분자지지체 Wavenumber(cm -1 ) Figure 2. ATR-FTIR spectra of PLLA control (a) and AA-grafted PLLA (Ar+AA+AA) (b) films. 로사용하기위하여여러가지플라스마처리방법으로 AA를결합한비다공성 PLLA 필름및이중기공지지체의표면특성은 ATR-FTIR, ESCA, SEM, 접촉각및카복실기함량을각각분석하여평가하였다. Figure 2는미처리 PLLA control 과 AA가결합된 PLLA(Ar+AA+ AA) 표면의대표적인 ATR-FTIR 스펙트럼을나타낸것이다. 특히 AA 가결합된 PLLA의경우플라스마처리방법및조건과관계없이비슷한스펙트럼을보였다. 2개의스펙트럼을비교해보면 PLLA의표면개질전과후의스펙트럼이크게다르지않았다. 즉, PLLA control은 1750 cm -1 근처에서 lactide에의한에스터의특성피크가크게나타났으며, AA가결합된 PLLA의경우도거의같은위치에서 AA의카복실기피크가에스터의특성피크에합쳐져서거의하나의피크로나타났다. 30,31 이와관련하여일부연구에서는 AA의카복실기가 lactide 의에스터기와약간다른위치에서나온다고보고한바도있지만 21 또다른연구에서는본연구와같이서로겹쳐져서구별할수없다고보 Polymer(Korea), Vol. 30, No. 2, 2006

5 172 양희석ㆍ박귀덕ㆍ안광덕ㆍ김병수ㆍ한동근 도한바도있다. 24 따라서 AA가플라스마처리에의해서 PLLA 표면에그래프트결합되었는지를더정확하게확인하기위하여 ESCA, 접촉각및카복실기함량을각각분석하였다. Figure 3은미처리 PLLA control과 AA가결합된 PLLA(Ar+AA +AA) 표면의대표적인 ESCA C1s 스펙트럼을나타낸것이다. FTIR 결과와마찬가지로 AA가결합된 PLLA의경우플라스마처리방법및조건과관계없이비슷한스펙트럼을나타내었다. 일반적으로고분자표면의화학적조성을알기위해서 ESCA 원소분석을행하지만본연구에서는더상세한기능성기를확인하기위해서 ESCA C1s 분석을행하였다. Figure 3(a) 와같이 PLLA control 표면자체는 alkyl carbon(c-c, ev), methine carbon(c-o, ev) 및 ester carbon(o=c-o, ev) 성분으로거의비슷한비율로구성되어있다. 33 그러나 AA가결합된 PLLA(Figure 3(b)) 표면은 alkyl carbon에비해서카복실기에의한 ester carbon이상대적으로증가하는것으로보아효과적으로 AA가결합되었음을확인할수있었다. 21 또한비다공성 PLLA 필름과이중기공지지체의표면모폴로지변화는 SEM 관찰결과, 플라스마처리에의한 AA 결합전후의 PLLA 필름과지지체의표면모폴로지는거의변화하지않았음을확인하였다. Table 2는여러가지표면개질방법으로제조된 PLLA 표면의접촉 Binding energy(ev) Figure 3. ESCA spectra of PLLA control (a) and AA-grafted PLLA (Ar+AA+AA) (b) films. Table 2. Surface Properties of AA-grafted PLLA Films Sample Contact angle (degree) -COOH content (mmol/cm 2 ) 1. PLLA control 75.1± Ar/AA 57.1± Ar+AA+Ar 52.6± Ar+Ar+AA 48.6± Ar+AA+AA 45.3± Ar+TP 64.2± 각과카복실기함량을나타낸것이다. 먼저접촉각의경우, 미처리 PLLA control의접촉각이 75도로전형적인소수성표면을나타내었으며, 이것을 AA로표면개질함에따라서접촉각이감소하였다. 12,16,30,31 이는 AA가결합됨으로써 PLLA 표면이친수화가많이진행되었음을의미한다. 특히 Ar 가스와 AA를동시에처리한 Ar/ AA 시료나 Ar 가스만으로먼저활성화시킨다음 chamber 외에서열중합에의한 Ar+TP 시료보다는 Ar 플라스마처리와 AA 공급방법의순서와처리조건을달리한 3가지의 Ar+AA+Ar, Ar+Ar+ AA 및 Ar+AA+AA 시료가 AA가더많이결합되어서더낮은접촉각을보였다. 이중 Ar 플라스마처리후 AA 플라스마처리한다음마지막으로 AA를다시공급하여일정시간안정화한 Ar+Ar+AA 시료가가장낮은접촉각 (45도) 을보여친수화가제일잘되었음을알수있었다. 한편 Toluidine Blue O 염료를이용하여정량한카복실기의함량으로부터여러가지플라스마처리조건에의하여 PLLA 표면에 AA의그래프트정도를평가하였다. 대체로정량한카복실기의함량은접촉각과반비례관계를나타내었다. 즉, 접촉각이낮아서친수성표면을보일수록카복실기의함량은증가하였다. 21,26,30,31 특히 Ar+Ar+AA 시료가가장높은카복실기함량 ( mmol/cm 2 ) 을보였으며, 이는접촉각결과와잘일치하였다. 그러나기존의방법인플라스마처리후형성된라디칼을안정화시킨다음 70 에서열중합한시료는접촉각과카복실기의함량측정결과, 미처리 PLLA control 과 Ar+Ar +AA 시료의중간값을보였다. 이것은본연구에서 Ar+Ar+AA의플라스마처리로행한표면개질방법이 PLLA의표면을친수화하는데가장효과적인최적의방법임을확인하였다. 이상의표면분석으로부터접촉각은카복실기의함량과아주밀접한관계가있음을알수있으며이렇게그래프트된카복실기가많을수록접촉각이감소하여그표면이어느정도친수화됨으로써세포와의상호작용에호의적으로작용할것으로기대된다. PLLA 필름과지지체의연골세포점착성. 플라스마처리에의한 AA 가결합된비다공성 PLLA 필름및이중기공지지체표면의친수화에따른세포친화성에미치는영향을평가하기위해서연골세포배양실험을행하였다. Figure 4는 PLLA control과 AA가결합된 PLLA(Ar +AA+AA) 필름시료에연골세포를 2, 4 및 6일간배양한후의 SEM 사진이다. 전반적으로미처리 PLLA control에비해서표면개질한비다공성필름이, 또한표면개질한시료중에서는 Ar+AA+AA 필름시료가각각연골세포가더많이점착되었으며 spreading도더잘이루어졌다. 또한배양시간이증가할수록세포의점착과증식은시료의처리방법에관계없이증가하였다. 실제로점착된세포와배양시간에따라이들로부터증식된세포들의수를정량화한결과 (Figure 5) PLLA control에비해표면개질된필름시료에서많은단백질함량을확인할수있었다. 12,25,26 특히 Ar+AA+AA 시료의경우다른시료와달리더많은연골세포가점착되었으며그경향은배양시간이 2 일에서 6일로증가함에따라더현저하였다. 한편 Figure 6은 PLLA control과 AA가결합된여러가지이중기공 PLLA 지지체에 6일간연골세포를배양한후의 SEM사진이다. 모든이중기공지지체내의큰기공과작은기공사이에많은양의연골세포가점착되어있음을관찰할수있었으며, 연골세포를 PLLA 필름에서배양한결과 (Figure 4) 와마찬가지로 PLLA control보다는표면개질한이중기공지지체가, 또한표면개질한지지체중에서는 Ar +AA+AA 지지체가더많은연골세포의점착을확인할수있었 폴리머, 제 30 권제 2 호, 2006 년

플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 173 PLLA control (b) (c) AA-grafted PLLA (a) (a) (b) (c) Figure 4.

Cell number( 10 cell/cm 2 ) 2000 1600 1200 800 400 2 4 6 Culture time(days) Figure 5.

12,25,26 특히기존의방법대로열중합해서제조된지지체 (Ar+TP) 는너무격한반응조건으로인하여크기가상당히많이감소 ( 수축 ) 하여세포점착실험을시행할수없었다.

전술한바와같이조직공학을이용한인공조직이나장기를재생하기위하여기존에사용하고있는소수성고분자지지체의단점을보완하기위해서표면개질방법이많이연구되고있다.

SEM morphologies of chondrocyte adhesion after 6 days culture on various surface-modified dual pore PLLA scaffolds: (a) PLLA control, (b) Ar/AA, (c) Ar+AA+Ar, (d) Ar+Ar+AA, and (e) Ar+AA+AA.

6 플라스마처리와아크릴산결합에의한 PLLA 필름및지지체의최적친수화와연골세포점착 173 PLLA control (b) (c) AA-grafted PLLA (a) (a) (b) (c) Figure 4. SEM morphologies of chondrocyte adhesion on PLLA control and AA-grafted PLLA(Ar+AA+AA) films: (a) 2 days, (b) 4 days, and (c) 6 days. Cell number( 10 cell/cm 2 ) Culture time(days) Figure 5. WST-1 protein content of chondrocyte adhesion on various surface-modified PLLA films: ( ) PLLA control, ( ) Ar/AA, ( ) Ar+AA+Ar, ( ) Ar+Ar+AA, ( ) Ar+AA+AA, and ( ) Ar+TP. 다. 12,25,26 특히기존의방법대로열중합해서제조된지지체 (Ar+TP) 는너무격한반응조건으로인하여크기가상당히많이감소 ( 수축 ) 하여세포점착실험을시행할수없었다. Figure 7은이중기공 PLLA 지지체에점착된연골세포의단백질함량분석에따른증식정도를나타낸것으로, Figure 5의 PLLA 필름과마찬가지로연골세포의점착및증식은미처리이중기공지지체보다는표면개질한지지체가, 표면개질한것중에서는 Ar+AA+AA 지지체가, 또한증식시간이증가할수록증가하였다. 전술한바와같이조직공학을이용한인공조직이나장기를재생하기위하여기존에사용하고있는소수성고분자지지체의단점을보완하기위해서표면개질방법이많이연구되고있다. 특히간단한플라스마처리에의한카복실기의도입은지지체의친수성을크게증가시킬수있으며이로인하여연골세포, 10,12 섬유아세포, 19,24,30,31 및혈관세포 8,26 등의여러세포의점착및증식을크게향상시키는것으 (d) (e) Figure 6. SEM morphologies of chondrocyte adhesion after 6 days culture on various surface-modified dual pore PLLA scaffolds: (a) PLLA control, (b) Ar/AA, (c) Ar+AA+Ar, (d) Ar+Ar+AA, and (e) Ar+AA+AA. Cell number( 10 cell/cm 2 ) Culture time(days) Figure 7. WST-1 protein content of chondrocyte adhesion on various surface-modified dual pore PLLA scaffolds: ( ) PLLA control, ( ) Ar/AA, ( ) Ar+AA+Ar, ( ) Ar+Ar+AA, and ( ) Ar+AA+AA. 로보고되고있다. 34,35 이러한경향은본연구에서의결과와도아주잘일치하는것으로고분자지지체의세포배양은그표면이소수성보다는표면개질에의해서어느정도적당한친수성일때배양액의침투가쉽고세포를고르게분산시킬수있어서세포점착이더잘됨을확인할수있었다. 결 조직재생용기능성고분자지지체로사용하기위해서여러가지플라스마처리와 AA를직접 chamber 내에서 in situ 그래프트결합을행하여최적의친수성및생리활성물질과결합할수있는카복실기를동시에부여할수있는생분해성 PLLA 필름및지지체를제조하였다. 표면개질된 PLLA 필름및지지체는미처리 PLLA에비해서표면분석결과접촉각의감소와카복실기의증가로친수성이증가하였으며이로인하여연골세포의점착과증식도크게향상되었다. 여러가지표면개질방법중 Ar 가스와 AA를동시에처리한 Ar/AA 시료나 Ar 가스만으로먼저활성화시킨다음 chamber외에서열중합에의한 Ar+TP 시료보다는 Ar 플라스마처리와 AA 공급방법의순서와처 론 Polymer(Korea), Vol. 30, No. 2, 2006

7 174 양희석ㆍ박귀덕ㆍ안광덕ㆍ김병수ㆍ한동근 리조건을달리한 3가지의 Ar+AA+Ar, Ar+Ar+AA 및 Ar+AA+ AA 시료가 AA가더많이결합되었으며, 특히 Ar+AA+AA 처리시료가다른시료들보다접촉각이낮고카복실기가가장많아서최적의표면친수화처리조건임을알수있었다. 따라서이상의결과로부터본연구에서제조한 AA가결합된이중기공고분자지지체는연골세포이식후표면의적당한친수성에의하여세포의점착성뿐만아니라점착된세포들이많이증식하여보다안정되게연골조직화할수있을것으로기대된다. 더욱이이러한지지체는조직공학적으로연골조직이나다른장기를재생하는데있어서필요한리간드펩타이드나성장인자들의생리활성물질을고정화할수있는고기능성지지체로사용이가능할것으로사료된다. 감사의글 : 본연구는 KIST 핵심역량심화사업 (2V00940) 과기관고유사업 (2E18652) 으로수행되었으므로이에감사드립니다. 참고문헌 1. R. Langer and J. P. Vacanti, Science, 260, 920 (1993). 2. J. A. Hubbell and R. Langer, Chem. Eng. News, March 13, 42 (1995). 3. R. M. Nerem and A. Sambanis, Tissue Eng., 1, 3 (1995). 4. A. Atala and R. P. Lanza, eds., Methods of Tissue Engineering, Academic Press, San Diego, J. A. Hubbell, Trends Polym. Sci., 2, 20 (1994). 6. R. P. Lanza, R. Langer, and W. L. Chick, Principle of Tissue Engineering, Academic Press, San Diego, C. W. Patrick Jr., A. G. Mikos, and L. V. Mcintire, Frontiers in Tissue Engineering, Elsevier Science Press, Oxford, J. Gao, L. Niklason, and R. Langer, J. Biomed. Mater. Res., 42, 417 (1998). 9. G. E. Park, M. A. Pattison, K. Park, and T. J. Webster, Biomaterials, 26, 3075 (2005). 10. Y. L. Cui, A. D. Qi, W. G. Liu, X. H. Wang, H. Wang, D. M. Ma, and K. D. Yao, Biomaterials, 24, 3859 (2003). 11. E. D. Boland, T. A. Telemeco, D. G. Simpson, G. E. Wnek, and G. L. Bowlin, J. Biomed. Mater. Res.: Appl. Biomater., 71B, 144 (2004). 12. Z. Ma, C. Gao, Y. Gong, and J. Shen, Biomaterials, 24, 3725 (2003). 13. J. P. Nuutinen, C. Clerc, T. Virta, and P. Tormala, J. Biomater. Sci. Polym. Edn., 13, 1325 (2002). 14. Z. Ma, C. Cao, J. Yuan, J. Ji, Y. Gong, and J. Shen, J. Appl. Polym. Sci., 85, 2163 (2002). 15. Y. Yang, M. -C. Porte, P. Marmey, J. Alicia, E. Haj, J. Amedee, and C. Baquey, Nuclear Inst. Method Phy. Res. B, 207, 165 (2003). 16. H. Chim, J. L. Ong, J.-T. Schantz, D. W. Hutmacher, and C. M. Agrawal, J. Biomed. Mater. Res., 65A, 327 (2003). 17. C. E. Holy, C. Cheng, J. E. Davies, and M. S. Shoichet, Biomaterials, 22, 25 (2001). 18. M. B. O. Riekerink, M. B. Claase, G. H. Engbers, D. W. Grijpma, and J. Feijen, J. Biomed. Mater. Res., 65A, 417 (2003). 19. J. Yang, G. Shi, J. Bei, S. Wang, Y. Cao, Q. Shang, G. Yang, and W. Wang, J. Biomed. Mater. Res., 62, 438 (2002). 20. Y. Wan, J. Yang, J. Yang, J. Bei, and S. Wang, Biomaterials, 24, 3757 (2003). 21. G. C. M. Steffens, L. Nothdurft, G. Buse, H. Thissen, H. Hocher, and D. Klee, Biomaterials, 23, 3523 (2002). 22. J. Yang, J. Bei, and S. Wang, Biomaterials, 23, 2607 (2002). 23. J. Yang, Y. Wan, J. Yang, J. Bei, and S. Wang, J. Biomed. Mater. Res., 67A, 1139 (2003). 24. Z. Cheng and S. H. Teoh, Biomaterials, 25, 1991 (2004). 25. C. Elvira, F. Yi, M. C. Azevedo, L. Rebouta, A. M. Cunha, J. S. Roman, and R. Reis, J. Mater. Sci.: Mater. Med., 14, 187 (2003). 26. I. Bisson, M. Kosinshi, S. Ruault, B. Gupta, J. Hilborn, F. Wurm, and P. Frey, Biomaterials, 23, 3149 (2002). 27. B. Gupta, J. G. Hilborn, I. Bisson, and P. Frey, J. Appl. Polym. Sci., 81, 2993 (2001). 28. Y. M. Ju, K. Park, K. -D. Ahn, J. -W. Rhie, and D. K. Han, Biomaterials, submitted (2006). 29. H. J. Jung, K. Park, K. -D. Ahn, D. J. Ahn, and D. K. Han, Biomacromolecules, submitted (2006). 30. H. S. Yang, K. -D. Ahn, and D. K. Han, Biomater. Res., 8, 135 (2004). 31. H. J. Jung, K. -D. Ahn, and D. K. Han, Macromol. Res., 13, 446 (2005). 32. S. Sano, K. Kato, and Y. Ikada, Biomaterials, 14, 817 (1993). 33. D. K. Han and J. A. Hubbell, Macromolecules, 30, 6077 (1997). 34. J. H. Lee, H. W. Jung, I. -K. Kang, and H. B. Lee, Biomaterials, 15, 705 (1994). 35. G. Khang, S. J. Lee, J. H. Jeon, J. H. Lee, and H. B. Lee, Polymer(Korea), 24, 869 (2000). 폴리머, 제 30 권제 2 호, 2006 년

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,