제출문 환경부장관귀하 본보고서를 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반석유대체원료생산기술에관한연구 과제의최종보고서로제출합니다 년 9 월주관연구기관 : 한국과학기술연구원주관연구기관장 : 이병권 ( 주관) 연구책임자 : 김연제 ( 주관) 참여연구원 : 엄영순, 윤

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1 보안과제[ ], 일반과제[ ] 최종보고서 주의문 개산목발물질계기 반폐자석원유을대체원 원료료로한생산유기공산정 기발술효 환경융합신기술개발사업 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반석유대체원료생산공정기술개발 Development of the process for the production of fuels and chemicals from waste biomass through biological and chemical reactions 한국과학기술연구원 / 김연제 환경부 환경부한국환경산업기술원 - 1 -

2 제출문 환경부장관귀하 본보고서를 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반석유대체원료생산기술에관한연구 과제의최종보고서로제출합니다 년 9 월주관연구기관 : 한국과학기술연구원주관연구기관장 : 이병권 ( 주관) 연구책임자 : 김연제 ( 주관) 참여연구원 : 엄영순, 윤영현, 우한민, 공경택, 김기연, 오현주, 이경민, 조숙형, 김은미, 김태연, 홍소연, 엄진희, 김민선, 최재연, 황상원, 위한아, 강성혜, 유기훈, 김영우, 장영재, 오충훈, 이상일, 이재익, 최재희, 이지호 ( 위탁) 연구책임자 : 서영웅 ( 위탁) 참여연구원 : 박종하, 정천우, 현민정 ( 세부1) 연구책임자 : 이태호 ( 세부1) 참여연구원 : 상병인, 김현진, 박정훈, 박효정, 송인웅, 전병승, 전재성, 황신미, 강성혜, 김영우, 오충훈, 위한아, 장영재, 최재희, 황상원 - 1 -

3 요약서 사업명환경융합신기술개발사업과제번호 단위사업명 과제명 최종성과기술 연구책임자 환경융합신기술개발사업 대분류 환경자원순환융합기술개발 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물 기반석유대체원료생산기술 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반석유대체원료생산공정 김연제 해당단계참여연구원수 총연구기간참여연구원수 연락처 이메일 연구기관명및소속부서명 한국과학기술연구원 총: 26 명 내부: 5 명 외부: 21 명 총: 76 명 내부: 16 명 외부: 60 명 yjkim@kist. re.kr ( 청정에너지센터) 중분류 기술단계 참여기업 총연구기간 총연구비 폐바이오매스에너지화융합기술개발 실용 아팩 ~ 정부 : 1,910,000,000원기업 : 641,000,000 원계 : 2,551,000,000원 총연구기간 12.07~ 연구기관유형 정부출연연 위탁기관명한양대학교위탁책임자서영웅 개발목적 및필요성 < 개발목적> 목질계폐자원의 당화액내발효저해산물무독성화기술의최적화, 당화액내혼합당(mixed sugars) 동시발효균주의개발, 유기산의 산업적생산을위한배지최적화 로이루어진일련의 생물학적유기산생 산공정 과이로부터생산된 유기산을바이오알코올연료로전환 하는 유기산전환촉매반응공정 을개발하는것임. 결론적으로본과제의성공 은세계 3위의원유수입국이며세계 7위의석유소비국가인우리나라가앞으 로다가올다른국가와경쟁을통해서살아남기위해폐바이오매스를이용한 청정에너지생산기술을선점하게함으로써개발된기술의수출산업은하나 의새로운국부창출을위한동력이될수있음. < 개발의필요성> 대체에너지보급확대정책에부응하는친환경바이오연료생산기술개 발, 폐바이오매스를이용한유기산전환반응을통한바이오혼합알코올생산 공정은전세계적으로연구가매우미미한실정이므로개발된독자적원천기 - 2 -

4 술을상용화하기위한연구가요구됨. 폐목재를이용한바이오에너지생산을 실용화하기위해, 효율적인바이오매스의전처리및개발미생물을이용한유 기산생산, 그리고생산된유기산을화학촉매반응을이용하여알코올로전환 하는생물/ 화학융합공정을파일롯시스템에적용하기위한연구가필요함. 연구개발 결과 1. 폐바이오매스유래유기산생산을위한생물학적공정개발및유기산생 산최적조건도출 2. 유기산생산속도: 2 g/l/hr 이상 유기산생산성: 육탄당발효대비 85% 이상 유기산생산수율: 모델당화액대비 85% 이상 혼합당동시발효미생물확보를위한유전자기반미생물설계기술및분 리기술확보 3. 2종이상의미생물개발 주요공정변수의영향파악 알코올수율 70% 이상 4. Kinetic data 확보 반응속도식확보 5. 발효/ 추출/ 화학촉매공정연계를위한기초설계자료확보 최종공정연계설계자료확보 < 전체시작품 공정모식도및사진> 공정 제품 사진및도면 - 3 -

5 100 L 발효기 < 시작품도면> 추출기 촉매반응기 성능사양및 기술개발수준 본연구는목질계/ 섬유계기반폐바이오매스를원료로하여유기산을생산 하고이를화학촉매전환을통해바이오혼합알코올연료를생산하는연구로 서, 바이오화학융합기술을이용한매우창의적인연구임. 연구결과, 생물학적 고농도유기산생산과이를이용한촉매화학적알코올생산이효율적으로수 행가능함을확인하였음. 특히, 목질계폐바이오매스전처리공정개발과미생 물생장저해물질의전기화학적제거를통해향후목질계바이오매스활용범 위를획기적으로높일수있는창의적이고우수한연구개발결과임. 본연구개 발을통해유기성폐자원을이용하여바이오혼합알코올를생산함으로써환경 과에너지문제를동시에해결할수있는핵심기술개발이이루어질것이라기 대됨. 대체에너지보급확대정책에부응하는친환경바이오연료생산기술개발 농부산물, 산림부산물, 폐기물등의자원화기술개발로활용 폐바이오매스를이용한유기산전환반응을통한바이오혼합알코올생산 활용계획 공정은전세계적으로연구가매우미미한실정이므로독자적원천기술/ 실 용화의개발가능 개발된폐바이오매스를이용한바이오혼합알코올생산핵심기술과유기 산정제기술활용하여바이오혼합알코올생산상용화추진 개발된기술을특허로출원하여핵심기술및응용기술의기술선점 - 4 -

6 특허 출원( 국내) 1 건등록( 국내) 2 건 출원( 국외) 3 건등록( 국외) 건 주요성과 논문 SCI급 5 건일반건 인증신기술인증건신기술검증건 매출국내매출원해외수출원 기타성과 2020년대한민국산업을이끌미래 100대기술과주역선정 ( 엄영순박사, 한국공학한림원주관) 색인어 ( 각 5 개이상) ( 한글) 목질계폐자원, 유기산, 혼합연료, 미생물재설계, 나노촉매 ( 영문) Wood-biomass, carboxylic acid, mixed fuels, microorganism design, nano-catalyst - 5 -

7 요약문 연구개발결과의보안등급 보안등급분류 보안과제 일반과제 결정사유 보안과제인경우필히전문위원과협의한후결정사유에대해전문위원이내용작성 본문의내용을요약하여작성( 최종평가시평가활용자료이므로반드시작성) 평가의착안점및기준 구분세부내용평가의착안점및기준 목질계바이오매스당화공정개발 혼합당동시발효유기산생산균주 스크리닝 (2 종이상) 전처리기법에따른당화액무독성화기술 최적화 (2 가지이상당화액이용) 당화효율 30% 이상 2가지이상전처리기술개발여부 혼합당동시이용미생물: 2종이상도출 당화액내발효저해물질정성/ 정량분석결과 및무독화방안도출여부 1 차년도 산업용생산을위한배지최적화 저급질소원을이용한최적화배지개발여부 폐목재업체조사및자료수집 폐목재수급방안도출 100 L 발효기구축및육탄당기반발효운전조건확립발효추출물의촉매활성변화조사및원인규명 발효기설치물제시 촉매활성변화결과확보여부 촉매분석결과확보여부 촉매개선을위한조촉매, 지지체선정 알코올수율 30% 이상확인(GC 분석결과) 폐목재당화공정최적화 폐목재당화및당화액성상분석여부 2 차년도 혼합당동시발효균주이용유기산생산 ( 육탄당이용시생산성의 70% 이상달성) 당화액이용고효율유기산생산조건도출 ( 모델당화액대비 70% 이상수율) 유기산생산성: 육탄당발효대비 70% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 70% 이상 - 6 -

8 유기산생산및동시회수를위한발효공정 개발 ( 유기산생산속도 2 g/l/hr 이상) 유기산생산속도: 2 g/l/hr 이상 촉매구성성분함량최적화 알코올수율 50% 이상확인(GC 분석결과) 모델당화액이용 100 L 최적화 유기산전환을위한 발효기공정 화학촉매반응기구축및운전 구성성분함량에따른촉매물성 라이브러리구축 혼합당동시발효균주이용유기산생산 ( 육탄당이용시생산성의 85% 이상달성) 당화액으로부터최적균주이용유기산 생산 ( 모델당화액대비 85% 이상수율) 실험실규모발효기대비 90% 이상유기산 수율달성여부 설치물제시 촉매물성라이브러리확보여부 유기산생산성: 육탄당발효대비 85% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 85% 이상 주요공정변수의영향파악 알코올수율 70% 이상확인(GC 분석결과) 3 차년도 실제당화액이용 100 L 발효기공정최적화유기산포함발효액이용추출공정최적화발효추출물이용알코올생산촉매공정최적화 모델당화액대비 80% 이상유기산수율 달성여부 추출공정연계여부 실험실결과대비 80% 이상알코올전환수 율달성여부 Kinetic data 확보 반응속도식확보여부 최종평가 폐바이오매스유래유기산생산을위한생물학적공정개발및유기산생산최적조건도출혼합당동시발효미생물확보를위한유전자기반미생물설계기술및분리기술확보주요공정변수의영향파악 유기산생산속도: 2 g/l/hr 이상 유기산생산성: 육탄당발효대비 85% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 85% 이상 2종이상의미생물개발 알코올수율 70% 이상확인 (GC 분석결과) Kinetic data 확보 반응속도식확보여부 발효/ 추출/ 화학촉매공정연계를위한 기초설계자료확보 공정연계설계자료확보여부 - 7 -

9 Ⅰ. 연구과제명 주관과제명 : 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반석유대체원료생산기술 ( 세부1) 과제명 : 유기산추출및분리정제를위한에너지저소비형공정개발 Ⅱ. 연구개발의목적및필요성 대체에너지보급확대정책에부응하는친환경바이오연료생산기술개발, 폐바이오매스를이용한유기산전환반응을통한바이오혼합알코올생산공정은전세계적으로연구가매우미미한실정이므로개발된독자적원천기술을상용화하기위한연구가요구됨. 폐목재를이용한바이오에너지생산을실용화하기위해, 효율적인바이오매스의전처리 및개발미생물을이용한유기산생산, 그리고생산된유기산을화학촉매반응을이용하 여알코올로전환하는생물/ 화학융합공정을파일롯시스템에적용하기위한연구가필 요함. Ⅲ. 연구개발의내용및범위 폐목재당화공정최적화 - 다양한당화기술결과비교 - 최적전처리/ 당화기술개발 혼합당동시발효균주선발 - Chemical mutation/ 유전자재조합기술을통한돌연변이획득 - High through-put screening 고효율유기산생산조건도출 - - 당화액무독화방법개발 발효배지최적화 기법개발 발효추출물대응화학촉매개선방안도출 - 발효추출물의촉매활성변화조사및특성분석에의한원인규명 - 촉매개선을위한조촉매, 지지체선정 발효추출물기반알코올생산화학촉매최적화 - 촉매구성성분( 활성금속, 조촉매, 지지체) 함량최적화 - 구성성분함량에따른촉매물성라이브러리구축 발효추출물기반알코올생산공정변수최적화 - 공정변수( 온도, 압력, 수소양, 반응물주입속도등) 의영향파악 - Kinetic data 확보 - 8 -

10 Ⅳ. 연구개발결과 강산당화공정을통해폐목재바이오매스로부터 56.5 g/l의글루코스와 31 g/l의자일로스 회수 Chemical mutagenesis 를통해글루코오스와자일로스를동시에이용하는미생물을발굴하였 고, 유전자재조합기술로항생제내성부여를통해유기산의생산성을육탄당발효대비 90% 이상달성 무독화방법및배지최적화를통해파일롯스케일에서랩스케일과비교하여당화액으로부터 90% 의생산성과수율달성 합성한촉매중최적의촉매를선정하여온도, 압력, 수소양, 반응물주입속도에따라영 향을파악하여전환율최대 84.2% 달성 아팩시제품을통해폐목제당화액유래부티르산의용액으로부터부틸부티레이트생산하 는에스테르화반응의전환율은 로실험실대비약 95% 86%, 부탄올을생산하는수첨분해반응의전환율은 92% 나온것을확인함 Ⅴ. 연구개발결과의활용계획 대체에너지보급확대정책에부응하는친환경바이오연료생산기술개발 농부산물, 산림부산물, 폐기물등의자원화기술개발로활용가능 폐바이오매스를이용한유기산전환반응을통한바이오혼합알코올생산공정은전세계 적으로연구가매우미미한실정이므로독자적원천기술의개발이가능 - 9 -

11 SUMMARY ( 영문요약문) Ⅰ. Title Total Project Name : Development of the process for the production of fuels and chemicals from waste biomass through biological and chemical reactions Unit Research Project 1 : Process Development of Extraction and Purification of Carboxylic acid Ⅱ. The Objective & Necessity of the Research Research to commercialize independent technology that has been developed is required because research on production of environment-friendly biofuel and process of bio-alcohol mixture through the conversion reaction of organic acid using the waste of biomass that meet the policy of supply expansion of the alternative energies is not being made actively. Research is needed to commercialize the use of production of bio energy using the waste of woods, to preprocess biomass and production of organic acid using developed microorganisms efficiently, and to apply biological and chemical process of converting the developed organic acid to alcohol using chemical catalytic reaction. Ⅲ. Contents and Scope Optimization of hydrolysis conditions for efficient waste wood hydrolysis - Comparison of various hydrolysis methods - Development of the optimized pretreatment/hydrolysis method Development of mutant capable of simultaneous utilization of mixed sugars - Application of chemical mutagenesis for random mutation and genetic engineering for targeted mutagenesis - Development of high through-put screening method Development of the process for efficient production of organic acid

12 - Development of detoxification method - Optimization of fermentation medium compositions Design catalyst for butanol production from extracted organic acid - Screening catalytic activity from extracted organic acid and characterization of catalyst - Selection of promoter and support for activity enhancement Optimization of catalyst composition for butanol production - Optimization of catalyst (active metal, promoter and support) - Characterization of catalyst depending on the ratio of composition of active metal, promoter and support materials Optimization of process variables for butanol production - Activity test depending on temperature, pressure, H 2 flow rate, liquid flow rate - Evaluation of pre-exponential factor and activation energy via analysis of the kinetic data of butylbutyrate hydrogenolysis to butanol Ⅳ. Results Through concentrated acid hydrolysis process, 56.5 g/l of glucose and 31 g/l of xylose from the waste of woods has been achieved. Mutants that use both glucose and xylose simultaneously have been discovered through the chemical mutagenesis and the production rate of organic acid has reached more than 90% relative to the fermentation of hexose using these organisms. Through the detoxification method and optimization of culture medium, 90% of production efficiency of saccharification liquid has been achieved from pilot scale relative to that of lab scale production. Determination of optimal catalyst and hydrogenolysis of butylbutyrate to butanol depending on temperature, pressure, H 2 flow rate and liquid flow rate (Maximum yield of butanol 84.2%). Achieving 86% butyric acid conversion to butylbutyrate through esterification of butyric acid and butanol, and 95% butylbutyrate conversion to butanol through hydrogenloysis of butylbutyrate using pilot scale reactors installed in APEC

13 Ⅴ. Business Application Based the Outcomes The production of environment-friendly biofuel that satisfies the policy of supply expansion of the alternative energies. The use of the by-product of agriculture and forest, and the organic waste for resource of sustainable energy. Application as the original technology for the production of bio-alcohol mixture through the conversion of organic acid from the waste of biomass, taking the advantageous position in bio-fuel production

14 목차 제 1 장서론 26 제1 절연구개발과제의개요 연구개발의목적및필요성 연구개발대상기술의차별성 30 제2 절연구개발의국내외현황 연구개발대상의국외시장및전망 연구개발의국외현황 연구개발대상의국내시장및전망 연구개발의국내현황 38 제3 절연구개발의내용및범위 연구개발의최종목표 연도별연구개발목표및평가방법 연도별추진체계 43 제 2 장연구개발수행내용및결과 44 제1 절연구개발결과및토의 폐목재당화액을활용한최적유기산생산배지확보 44 가. 폐목재업체조사및자료수집 44 나. 목질계바이오매스당화공정개발 47 다. 전처리기법에따른당화액무독성화기술최적화 51 (1) 염기전처리/ 효소당화 액의무독성화기술최적화 54 (2) 강산전처리/ 강산당화 액의무독성화기술최적화 57 라. 폐목재당화공정최적화 89 마. 발효공정 scale-up 을위한폐목재당화액확보 95 바. 산업용생산을위한배지최적화 97 사. 당화액이용고효율유기산생산조건도출 혼합당동시발효유기산생산최적상업화균주확보 133 가. 혼합당동시발효유기산생산균주스크리닝 136 나. 혼합당동시발효균주이용및당화액으로부터최적균주이용유기산생산 L 발효기공정최적화 166 제2 절연구개발결과요약 171 제3 절연구개발결과및토의 ( 위탁과제 ) 발효추출물기반부탄올생산을위한화학촉매및공정설계

15 가. 부탄올생산반응경로제안 173 나. 부틸부티레이트생성을위한에스테르화반응 174 다. 부탄올생산반응시스템구축 182 라. HYSYS 이용반응변수에따른물질흐름의변화예측 186 마. 부티르산반응시, 구리함유촉매의변화확인 188 바. 부틸부티레이트/ 부탄올이용촉매반응실험수행 부탄올생산을위한화학촉매최적화 193 가. 고농도의침전제농도및침전제를이용한구리함유촉매제조 193 나. 구리함유촉매특성라이브러리구축 발효추출물기반부탄올생산공정설계및최적화 208 가. 제조한구리함유촉매를이용한최적화실험 208 나. 부틸부티레이트의수첨분해반응의 kinetic 연구 210 다. 부탄올생산을위한공정도 214 라. 고효율부탄올생산을위한신규촉매합성법고찰 217 마. 고활성촉매합성을위한조촉매 ZrO 2 의역할연구 231 바. 시제품설치 ( 안산 APEC) 242 사. 시제품을이용한부탄올생산실험수행결과및토의 246 제4 절연구개발결과요약 ( 위탁과제 ) 250 제5 절연구개발결과기반경제성검토 251 제 3 장목표달성도및관련분야기여도 253 제1 절연도별연구개발목표의달성도 차년도목표및달성도 차년도목표및달성도 차년도목표및달성도 255 제2 절관련분야의기술발전기여도 ( 환경적성과포함) 기술적측면 환경적측면 경제적산업적 측면 일자리창출측면 257 제 4 장연구개발결과의활용계획등 258 제1 절연구개발결과의활용계획 258 제2 절연구개발과정에서수집한해외과학기술정보 259 제3 절연구개발결과의보안등급 259 제4절 NTIS 에등록한연구시설 장비현황

16 제 부 5 장참고문헌 260 록( 기타부록, 지침서, 매뉴얼, 안내서, 핸드북등)

17 그림목차 [ 그림 1] 바이오연료생산을위한폐자원활용의필요성 27 [ 그림 2] 국내연간폐목재발생량 28 [ 그림 3] 석유연료인가솔린과석유연료대체가능바이오연료의물리화학적특성비교 29 [ 그림 4] 본통합형과제기술인생물화학융합공정을통한바이오연료생산 30 [ 그림 5] 기존바이오부탄올생산기술의단점 31 [ 그림 6] 본통합형과제기술인생물화학융합공정을통한바이오연료생산 32 [ 그림 7] 미송환경산업 의취급폐목및취급형태 46 [ 그림 8] 강산전처리/ 당화공정흐름도 49 [ 그림 9] 염기처리추가공정흐름도 49 [ 그림 10] 알칼리전처리/ 효소당화공정 과 강산전처리/ 강산당화공정 의당화수율및 공정비교 51 [ 그림 11] 목질계바이오매스의전처리및당화과정중발생하는저해물질및저해작용 (Mill et al., 2009) 52 [ 그림 12] 폐목재의 염기전처리/ 효소당화액 무독성화방법 54 [ 그림 13] 폐목재의염기전처리/ 효소당화액내발효저해물질의 GC-MS 분석결과 56 [ 그림 14] 염기전처리/ 효소당화액의무독화후클로스트리디움타이로부티리쿰의생장 및부티르산생산 57 [ 그림 15] SMB 공정에의한목질계바이오매스의당화액으로부터산제거공정 58 [ 그림 16] 석고처리에의한당화액으로부터황산제거 59 [ 그림 17] 라이밍에의한황산제거과정 61 [ 그림 18] 폐목재의강산전처리/ 강산당화액에존재하는발효저해물질의정성/ 정량분석 결과 62 [ 그림 19] 참나무의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색 63 [ 그림 20] EFB 의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색 64 [ 그림 21] 소나무의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색 66 [ 그림 22] 목질계강산전처리/ 강산당화액에서검출된발효저해물질이클로스트리디움 타이로부티리쿰의생육에미치는영향 66 [ 그림 23] 수산화칼슘을이용한폐목재강산전처리/ 강산당화액의 ph 적정곡선

18 [ 그림 24] 수산화칼슘에의한 ph 적정곡선에따른폐목재강산전처리/ 강산당화액내 당농도의변화 68 [ 그림 2 5 ] 수산화칼슘에의한 p H 적정곡선에따른폐목재강산전처리 / 당화액내 fu r fu r a l 농도의변화 69 [ 그림 26] 수산화칼슘에의한 ph 적정곡선에따른폐목재강산전처리/ 당화액에배양한 Clostridium tyrobutyricum ATCC 에의한부티르산생산성 70 [ 그림 27] 전기화학적방법을통한당화액으로부터황산제거공정 71 [ 그림 28] 전기화학적처리시음극수조에서의반응 71 [ 그림 29] 기화학적처리시양극수조에서의반응 71 [ 그림 30] 폐목재강산전처리/ 강산당화공정및황산회수공정개략도 72 [ 그림 31] 황산제거를위한최적전극스크리닝 74 [ 그림 32] 전기화학적방법을이용한폐목재의강산전처리/ 강산당화액내의황산제거 조건모니터링 75 [ 그림 3 3 ] 폐목재당화액의전기화학적방법을이용한황산제거시, 당함량의변화와 황산염의이동 76 [ 그림 34] 참나무강산전처리/ 강산당화액의전기화학적방법을이용한황산제거시, 당 함량의변화와황산염의이동 77 [ 그림 35] 전기화학적처리와석회처리로당화액내황산을제거하였을때반응후의 용량과발생하는석고(gypsum) 의비교 (ph 1) 78 [ 그림 36] 전기화학적처리와순수석회처리로당화액내황산을제거한폐목재강산 79 [ 그림 37] 전기화학적방법을통한당화액으로부터황산의제거및석회처리에의해 황산이제거된당화액과의 C. tyrobutyricum 을이용한부티르산생산성비교 81 [ 그림 38] 전극의크기에따른황산제거 83 [ 그림 39] 전류량에따른합성황산용액에서황산제거속도의차이비교 84 [ 그림 40] 폐목재당화액에서의전류량조건에따른황산의제거및당농도의변화 86 [ 그림 41] 최적화된전기화학적방법을통해황산이제거된폐목재전처리/ 당화액을 이용한 C. tyrobutyricum ATCC 의생육및유기산생산 88 [ 그림 42] 강산당화실험장치 89 [ 그림 43] 강산전처리/ 당화공정연구내용 90 [ 그림 44] 참나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도, 120 분) 반응후당농도 91 [ 그림 45] 소나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도, 120 분) 반응후당농도

19 [ 그림 46] 참나무의강산전처리/ 당화반응시간에따른글루코오스와자일로스의변화 92 [ 그림 47] 소나무의강산전처리/ 당화반응시간에따른글루코오스와자일로스의변화 93 [ 그림 48] Pilot scale 강산전처리/ 당화장치및공정흐름 96 [ 그림 49] 클로스트리디움타이로부티리쿰의효모추출물농도에따른부티르산생산 비교 98 [ 그림 50] 실험용효모추출물과산업용질소원이클로스트리디움타이로부티리쿰의초기 생육( 지체기) 에미치는영향 100 [ 그림 51] 실험용효모추출물과산업용질소원이클로스트리디움타이로부티리쿰의성장과 부티르산생산에미치는영향 ( 발효종료시점) 101 [ 그림 52] C. tyrobutyricum ATCC 의대사경로 102 [ 그림 53] 글루코오스이용시 C. tyrobutyricum ATCC 의유기산생산 103 [ 그림 54] MV에의한 hydrogenase 활성억제를통한 NADH 생산 104 [ 그림 55] MV 첨가에따른 C. tyrobutyricum ATCC 균주성장과가스생산비교106 [ 그림 56] MV 첨가에따른 C. tyrobutyricum ATCC 균주의당소모및유기산 생산 108 [ 그림 57] 바이오디젤생산증가에의한글리세롤가격의하락 109 [ 그림 58] 글리세롤첨가시 C. tyrobutyricum ATCC 의예상대사경로 110 [ 그림 59] 계면활성제첨가에따른폐글리세롤의무독화전략 112 [ 그림 60] 글루코오스또는글리세롤을단일탄소원으로사용하였을때의발효패턴 115 [ 그림 61] 글루코스와글리세롤비율에따른 C. tyrobutyricum ATCC 의발효패턴 117 [ 그림 62] C. tyrobutyricum ATCC 25755의글리세롤대사시아세트산이미치는영향 119 [ 그림 63] C. tyrobutyricum ATCC 25755의글루코오스를단일탄소원으로이용시 아세트산이미치는영향 121 [ 그림 64] 피루빈산염과글리세롤이용시 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효패턴 122 [ 그림 65] 발효 7시간후 C. tyrobutyricum ATCC 25755의 NADH/NAD 비율의차이 123 [ 그림 66] 농도별아세트산소모를기준으로적정글리세롤첨가량에대한검량선 124 [ 그림 67] 아세트산첨가농도에따른 C. tyrobutyricum ATCC 25755의글루코스와 글리세롤을포함한배지에서의부티르산생산에대한비교 125 [ 그림 68] 폐글리세롤의 C. tyrobutyricum ATCC 에대한독성확인 126 [ 그림 69] 계면활성제첨가에의한폐글리세롤의무독화효과 127 [ 그림 70] 비누화전처리방법을통한폐글리세롤의무독화

20 [ 그림 71] 폐목재당화액에폐글리세롤을첨가한배지에서의부티르산생산패턴 130 [ 그림 72] 합성배지, 실제폐목재당화액, 실제폐목재당화액에폐글리세롤을첨가한 실험군간의수율비교 131 [ 그림 73] 목질계바이오매스의조성및함량 (Biotechnol. For Biofuels, 2008, 1:7) 133 [ 그림 74] 글루코오스및자일로스를기질로한 C. tyrobutyricum ATCC 25755의 부티르산발효경로 134 [ 그림 75] 글루코오스에의한자일로스이용저해의예 (Microbiology, 2009, 155:1351) 135 [ 그림 76] C. tyrobutyricum ATCC 25755의완화된 CCR 기작 ( 원천기술개발연구결과) 136 [ 그림 77] 적응배양시스템 을통하여개발된포도당자일로스동시소모 C. tyrobutyricum 의돌연변이및그표현형질의회복 ( 원천기술개발연구결과) 137 [ 그림 78] MNNG 에의한돌연변이기작 138 [ 그림 79] 2DG 기반 C6/C5 동시발효미생물 HTS 기법모델 139 [ 그림 80] 2DG 기반 C5/C6 동시발효 C. tyrobutyricum 돌연변이스크리닝방법의단점 140 [ 그림 81] 무작위돌연변이에의한혼합당동시이용균주의지속적개량모식도 141 [ 그림 82] 각종미생물의 xyla 유전자로형질전환된대장균 142 [ 그림 83] 돌연변이에항생제내성형질부여개요도 144 [ 그림 84] ph 감소에의한 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효종료원리및혼합당 소모경향 (Microbiology, 2009, 74: , 원천기술개발연구결과) 145 [ 그림 85] 알도당및케토당의농도에따른시스테인- 카바졸법에의한발색정도 147 [ 그림 86] 돌연변이선별을위한 HTS 기법의모식도 148 [ 그림 87] 다양한미생물유래자일로스이성질화효소의기질특이성 149 [ 그림 88] E. coli JW 에서발현된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스 이성질화효소및정제된효소의분자량 150 [ 그림 89] C. tyrobutyricum의자일로스이성질화효소로반응시킨글루코오스와 자일로스의반응물을시시테인- 카바졸방법으로발색시킨그림 151 [ 그림 90] 완충력에따른 C. tyrobutyricum ATCC 배양액내자일로스잔류도 152 [ 그림 91] C. tyrobutyricum ATCC 25755의접종량에따른배양액내자일로스잔류도153 [ 그림 92] 본연구의 HTS 기법과 HPLC로측정한 C. tyrobutyricum 배양액내자일로스 농도비교 154 [ 그림 93] 개발한 HTS 기법을통한돌연변이선별과정 155 [ 그림 94] C. tyrobutyricum ATCC 25755의무작위돌연변이유발후 HTS 기법에의한

21 혼합당동시이용돌연변이선별 155 [ 그림 95] ph를조절하지않은상태에서 C. tyrobutyricum ATCC 25755와최종선별된 혼합당동시이용돌연변이균주의당소모경향 156 [ 그림 96] C. tyrobutyricum ATCC 와개량된돌연변이균주(M4-4) 의 CCR 유발물질 2DG 를포함한자일로스배지에서각균주의생장 157 [ 그림 97] 혼합당동시이용돌연변이균주의염색체상돌연변이위치 158 [ 그림 98] 돌연변이 M4-4 의표현형질의복귀 159 [ 그림 99] 내성유전자의보존 160 [ 그림 100] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4의 3 L 발효조에서부티르산생산비교 163 [ 그림 101] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4 의최적화된폐목재당화액에서부티르산생산비교 165 [ 그림 102] 아팩에설치된 100 L 발효조및추출장치 169 [ 그림 103] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4의 100 L 발효조에서부티르산생산비교 169 [ 그림 104] 폐목재 1Kg 으로부터생산가능한부탄올생산량 172 [ 그림 ] 연구개발결과기반 1 k g 의바이오매스를이용하여공정운전시물질수지

22 그림목차 ( 위탁) [ 그림위1] 부탄올생산경로및직접수소화반응의문제점 173 [ 그림위2] 용매가없는경우에무촉매( 왼쪽) 또는이온교환수지촉매( 오른쪽) 이용 부틸부티레이트수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2) 174 [ 그림위3] 무용매( 왼쪽) 에서 2종류이온교환수지촉매또는부틸부티레이트용매이용 부틸부티레이트수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2) 175 [ 그림위4] Amberlyst 15 촉매또는 Dowex 50WX8-400 촉매이용에스테르화반응에서 부틸부티레이트용매의효과( 온도 = 110, BuOH/BA = 2) 176 [ 그림위5] TOA 존재하에서무촉매또는이온교환수지촉매이용부틸부티레이트 수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2) 176 [ 그림위6] 부틸부티레이트를생산하기위한회분식반응기구성도 178 [ 그림위7] 부틸부티레이트를생산하기위한 semi- 회분식반응기구성도 180 [ 그림위8] 부틸부티레이트를생산하기위한 semi-회분식반응기의 flask 온도와 junction 온도의위치( 왼쪽), 시간에따른온도곡선( 오른쪽) 180 [ 그림위9] 부탄올생산신규반응시스템 PFD 183 [ 그림위10] 신규반응시스템의구조도( 왼쪽) 및실제모습( 오른쪽) 184 [ 그림위11] 구축반응시스템의 blank 실험 185 [ 그림위12] HYSYS 에서사용한물질흐름구조도 186 [ 그림위13] HYSYS 를통해계산한반응변수에따른생성물의몰흐름 188 [ 그림위14] 구리함유촉매와반응물간의 leaching 확인 189 [ 그림위15] 부티르산 3 mol% 용액으로처리한후, 용액의 UV-Vis. 스펙트럼및 reference 결과 ((J. Ind. Eng. Chem., 2007, 13(4), ) 189 [ 그림위16] 카르복실산의수소화반응시일어나는흡착및반응경로 190 [ 그림위17] 구리함유촉매제조장치및절차 194 [ 그림위18] CZA511N, CZA421N 촉매와 malachite 결정구조비교및참조논문 195 [ 그림위19] C Z A N, C Z A N 촉매의아연결정구조비교및참조논문의침전제농도효과 196 [ 그림위20] CZA241N, CZA151N 의알루미늄포함결정구조분석 197 [ 그림위21] 공침법으로제조한 precursor catalyst 의결정구조분석정리 198 [ 그림위22] Normal precipitation으로제조한 precursor catalyst의결정구조분석정리

23 [ 그림위23] 역공침법으로제조한 precursor catalyst 의결정구조분석정리 199 [ 그림위24] 공침법및역공침법으로제조한 precursor catalyst의 TGA 곡선 200 [ 그림위25] Precursor catalyst CZA511R의 TG-MS 곡선 201 [ 그림위26] Calcined catalyst의 XRD 분석결과 202 [ 그림위27] Calcined catalyst의 TG곡선및 CZA241R의 TG-MS 곡선 203 [ 그림위28] Calcined catalyst의 TPR 및환원온도와 HT-CO 3 의양과의관계 205 [ 그림위29] 구리의비율에따른활성및구리표면적과의활성관계 206 [ 그림위30] Precursor catalyst와 calcined catalyst의 HT-CO 3 양과의활성관계 207 [ 그림위31] 촉매비활성으로시간변화에대한촉매층온도변화및촉매의반응전후모습 209 [ 그림위32] 세가지변수인 B B 의농도, 수소의농도, 온도에따른부탄올생성속도비교 210 [ 그림위33] Empirical power law equation을이용하여얻은 parameter를사용하여계산한 수치와실제속도의비교 212 [ 그림위34] L a n g m u ir- H in s h e lw o o d 모델을이용한 ra te - d e te r m in in g s te p 에따른속도식 213 [ 그림위35] Langmuir-Hinshelwood 모델을이용한계산값과실험값의비교 214 [ 그림위36] 부탄올생성을위한 PFD(Process flow diagram) 215 [ 그림위37] 부탄올생성을위한 P&ID(Piping and instrumentation diagram) 216 [ 그림위38] 수정된 P&ID 의에스테르화반응기및증류탑부분 217 [ 그림위39] 침전물입자크기조절을위한용매가능성 218 [ 그림위40] 글리세롤을이용한침전방법으로제조한촉매의구리비표면적 219 [ 그림위41-1] 구리와아연의 precursor catalyst의 XRD 220 [ 그림위41-2] 구리와아연의제조촉매의 aurichalcite 확인 222 [ 그림위42] 구리, 아연, ( 지르코늄) 촉매결정구조 223 [ 그림위43] 구리, 아연촉매의 XRD 패턴및 DTG 곡선 224 [ 그림위44] CZ촉매의 precursor SEM 이미지 226 [ 그림위45] CZ촉매 oxide 상태의 XRD 패턴과 SEM 이미지 227 [ 그림위46] CZ촉매 oxide 상태의 HR-TEM 이미지 228 [ 그림위47] CZ촉매의구리표면적과 BET 면적결과및 TPR 곡선 229 [ 그림위48] Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의제조방법및구성비 233 [ 그림위49] 환원된 Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의 XRD 패턴 234 [ 그림위50] 환원된 Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의구리표면적과부탄올생성속도의상관관계 235 [ 그림위51] 금속산화물상태의 CuO/ZnO/ZrO 2 촉매의 XRD 패턴

24 [ 그림위52] 금속산화물상태의 CuO/ZnO/ZrO 2 촉매의 SEM 이미지 237 [ 그림위53] Cu/(Cu+Zn)=0.3인 precursor의 XRD 패턴과 DTG 곡선 239 [ 그림위54] CuO/ZnO/ZrO 2 의 HR-TEM 이미지 240 [ 그림위55] Z r의양에따른구리표면적과활성및수소소모량과 C u d isp e rsio n 의변화추이 241 [ 그림위56] 에스테르화반응기도면및사진 242 [ 그림위57] 알코올생산용촉매제조반응기사진 243 [ 그림위58] 촉매소성로 ( 열처리장비) 도면 244 [ 그림위59] 알코올생산용반응기도면및사진 245 [ 그림위60] 알코올생산용촉매제조반응기의최적화실험중시간에따른 ph와온도 248 [ 그림위61] 부틸부티레이트수첨분해반응을통해얻은생성물사진

25 표목차 [ 표 1] B lu e F ire R e n e w a b le 사의자료를기반으로한본바이오화학융합공정의경제성평가 33 [ 표 2] 세계바이오연료소비장기전망 35 [ 표 3] 가솔린대체바이오연료생산전망 36 [ 표 4] 국가별그외바이오연료관련주요연구현황 37 [ 표 5] 국내가솔린대체바이오연료시장규모전망 38 [ 표 6 ] 기타바이오에너지관련핵심기술보유대학현황 39 [ 표 7] 참여기업지근거리페목재수급업체 45 [ 표 8] 주요전처리기술의특징비교 48 [ 표 9] 기존무독화방법에따른저해물질의제거효율 53 [ 표 10] 가스크로마토그래프- 질량분석기분석조건 55 [ 표 11] 전기화학적처리와석회처리로당화액내황산을제거하였을때반응후의당함량에대한비교 78 [ 표 12] 전극크기에따른황산제거시간과전류밀도의비교 83 [ 표 13] 참나무와소나무의강산전처리/ 강산당화조건및당농도 94 [ 표 14] 최적조건을이용한폐목재바이오매스의강산전처리/ 강산당화조건및결과 95 [ 표 15] 산업용질소원의시장조사결과 99 [ 표 16] 폐글리세롤의조성, (Appl Biochem Biotechnol, 2010, 161: ) 111 [ 표 17] L a b. s c a le 발효조에서야생형균주 C. ty ro b u ty ric u m 과최종개량균주에의한부티르산생산비교 166 [ 표 18] Lab. scale 및 pilot scale 발효조에서야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와 최종개량균주 [M4-4(pMTL)] 에의한부티르산생산비교

26 표목차 ( 위탁) [ 표위1] 회분식반응기를통한부티르산비율에따른부틸부티레이트생산 177 [ 표위2] Semi- 회분식반응기를통한부티르산비율에따른부틸부티레이트생산 179 [ 표위3] 구축반응시스템의 blank 실험에의한부티르산의전환율 185 [ 표위4] 부틸부티레이트/ 부탄올이용촉매반응실험결과 191 [ 표위5] 부틸부티레이트/ 부탄올원료로이용하여반응변수에따른영향조사 192 [ 표위6] 고농도의침전제농도및침전제를이용한구리함유촉매의라이브러리 194 [ 표위7] 최대부탄올수율을얻기위한최적화조건실험결과 209 [ 표위8] 부틸부티레이트수첨분해반응의 kinetic 연구를위한조건및결과 210 [ 표위9] Empirical power law equation을이용한 kinetic parameter 212 [ 표위10] Langmuir-Hinshelwood 모델기반 kinetic parameter 213 [ 표위11] Aurichalcite 합성조건정리 221 [ 표위12] Cu, Zn 함유촉매제조한목록 223 [ 표위13] Cu(111) crystal size와 Cu dispersion 비교

27 제 1 장서론 제1절연구개발과제의개요 1. 연구개발의목적및필요성 석유는 2020년까지전세계적으로연평균 2% 이상의소비증가가예상되는바, 앞으로도 국내외주에너지원으로서의위치를유지할것임은자명한사실임. 그러나 2005년부터시작한고유가행진은 2006년배럴당평균 63 불( 뉴욕상업거래소 7월최고 가 장함 불) 에이르는등저렴하고안정적인원유공급이경제운영의가장중요한현안으로등 과거국제유가의불안정한급등락이우리나라의경제및기반산업에미친파장을고려할때, 석유자원공급의자립을위한적극적이고도능동적인노력이요구됨. 국가에너지의 97% 이상을해외에의존하고있는우리나라는유사시석유자원공급라인의 확보에어려움이있고, 최근지구온난화에의한이산화탄소감축이전세계적관심사가되고 있음. 따라서대기중이산화탄소감축과석유화학산업의자립성측면에서바이오매스를원료로 하는 자원순환형의석유대체연료생산기술개발 이절실함. 이와같은이유로세계적으로 대체에너지보급확대정책 이수립되고있으며, 이에미국은 2000년바이오매스 R&D 진흥법을제정하여, 기존석유화학연료에기반한수송연료를 2030년까지 20% 에이르도록바이오매스로부터생산하는바이오연료로대체하려는계획을 수립하였음. 일본은 2002 년에 바이오매스일본 전략을수립하고, 화학기업과바이오전문기업간 기술제휴로바이오연료및바이오플라스틱등의생산을통한약 하고있음. 5조원의시장창출을목표로 이에발맞추어우리나라역시 2007년을기준으로국가에너지공급량대비 2.2% 인 신재생에너지비율을 2030년까지 11% 로확대하기로하는국가에너지기본계획을 수립하였음

28 따라서전세계적으로바이오연료에대한공급및소비인프라구축이활발하여바이오연료활용이가속화될것으로전망되며, 21세기청정에너지인바이오연료사업을놓고앞으로다국적기업의경쟁이더욱치열해국가적차원의집중지원예상됨. 급증하는바이오연료수요에대비하기위해서는바이오연료의원료인바이오매스의확보가 요구됨. 그러나경지면적과기후조건이제한적인우리나라는바이오연료생산을위한원료작물의 안정적인수급에어려움이있고, 전세계적으로도바이오연료생산증가에따른곡물가격 상승이문제로제기되고있는바, 폐목재와같은폐바이오매스를활용한바이오연료생산 기술의개발이필요함. 특히국내신재생에너지총생산량인 498만 TOE 중폐기물에너지분야가전체의 76% 를 차지하고있음을고려할때, 폐바이오매스는향후신재생에너지공급량확대에매우중요한 인자가될것으로사료됨. [ 그림1] 바이오연료생산을위한폐자원활용의필요성 이러한관점에서우리나라폐목재의발생량추이를보면숲가꾸기부산물, 생활폐목, 건설폐목, 사업장폐목, 임지폐목등에서연간약 8,000 톤가량이발생되고있음

29 특히발생되는폐목재중에는재활용뿐만아니라. 심지어소각도불가능하여매립이 불가피한폐목재가상당량발생하고있음( 서울시매립지공사자료). 따라서이와같은폐목재를원료로하여석유대체연료를생산하는기술은친환경적일뿐만 아니라미래지향적인기술임. [ 그림 2] 국내연간폐목재발생량 한편본과제개발에서생산을목적으로하는부탄올은그물리화학적특성이석유연료인 가솔린과매우유사한석유대체연료로서, 에탄올에비하여탄소수가 2개더많기때문에 더높은에너지밀도를가지고있고, 물과의상호용해되지않으므로송유관과같은여러 가지석유화학인프라에대한부식을야기하지않고그대로이용할수있다는장점이있음. 또한부탄올의낮은증기압은연료의 RVP(Reid Vapor Pressure) 를높이지않아옥탄향 상제로서정유공장의높은증기압을가지는값싼부산물( 예, butane) 을기온이높은여름 철에도사용이가능하게하여연료의경제성을높여주는장점이있음. 결론적으로폐목재를이용한바이오부탄올생산기술은세계 3위의원유수입국이며세계 7위의석유소비국가인우리나라가앞으로다가올다른국가와의경쟁에서살아남기위해선점해야할필수불가결한기술이며, 새로운국부창출을위한동력이될수있음

30 [ 그림 3] 석유연료인가솔린과석유연료대체가능바이오연료의물리화학적특성비교 한편 2개또는 3 개이상의기술이결합된융합기술( 예: EBNT, BNT, EBT, ENIT 등) 은 생산공정의경제성을담보할수있는핵심기술임. 따라서본통합형과제는경제성있는바이오혼합알코올을생산하기위하여 목질계 폐자원의당화액내발효저해산물무독성화기술의최적화, 당화액내혼합당(mixed sugars) 동시발효균주의개발, 유기산의산업적생산을위한배지최적화 로 이루어진일련의 생물학적유기산생산공정 과, 이루부터생산된 유기산을 배양액으로부터동시에회수 하기위한 유기산추출/ 분리공정, 분리된 유기산을 바이오알코올연료로전환 하는 유기산전환촉매반응공정 으로이루어진새로운 형태의에너지저소비형신규융합기술을개발하였고, 2단계로바이오부탄올생산을 실용화하기위해파일롯플랜트를구축하고자함

31 [ 그림 4] 본통합형과제기술인생물화학융합공정을통한바이오연료생산 2. 연구개발대상기술의차별성 기존의바이오부탄올생산기술은곡물자원을원료로하거나, 목질계바이오매스를 이용하는경우도 5탄당을제외한 6 탄당만을이용하여아세톤, 부탄올, 에탄올 (ABE) 을 3: 6: 1의비율로생산하는 ABE 발효를통하여생산하고있음. 이러한 ABE 발효를통해부탄올을생산할경우, 기질(6 탄당) 중약 35% 만이 ABE로 전환되고, 그중 60% 만이부탄올에해당하므로생산수율이낮은경향이있음. 최근대사공학을통하여 5탄당과 6 탄당을동시에이용하고, ABE 발효미생물의아세톤 생산경로를부탄올생산경로로전환하여부탄올생산수율을이론수율의높인사례가있음 ( 0.8 mol BuOH/1 mol glucose). 87% 까지

32 [ 그림 5] 기존바이오부탄올생산기술의단점 그러나본과제개발기술은목질계바이오매스, 특히폐목재로부터생산되는 6탄당과 5 탄당을동시에이용하여, 부탄올의전구체인부티르산을 45% 이상의수율로생산하고, 이부티르산을화학촉매반응을통하여생산되는부탄올수율이 99% 를상회하므로 경제적으로상당한이점이있는기술임 ( 0.9 mol BuOH/1 mol glucose)

33 [ 그림 6] 본통합형과제기술인생물화학융합공정을통한바이오연료생산 다음은본과제의 원천기술개발결과 와, 강산전처리공정을이용하여바이오부탄올 생산을계획하고있는 BlueFire Ethanol Fuel 사 의자료 를토대로, 연간 40톤 규모의바이오부탄올생산을가정하고작성한 생물화학융합공정 의경제성평가표임. 경제성평가를위한주요인자로, 원료비는수도권매립지공사의 건설폐기물연료화시설 경제성검토 에서제시된비성형우드칩의판매가격 (32,000 원/ 톤) 에근거하였으며, 바이오매스로부터강산전처리/ 당화를통해당으로전환되는당화수율 (30%; 300 kg 당/1 톤우드칩) 은 KIST 의연구결과를토대로작성되었으며, 부티르산발효효율은 C. tyrobutyricum ATCC 의이론수율(50%) 을채택하였음. 부티르산회수율(99%) 은 배양액에서부티르산이완전히추출될것을가정하여작성하였고, 나노촉매를이용한 부탄올전환율(70%) 은본과제개발의목표치를기입한것임. 마지막으로부탄올의 시장가격은톤당 1,200 달러설정하였음. 상기적용값에의한본통합형과제를통한연간 40톤규모의바오오부탄올생산은연간 순수익이 21,167,000 원으로계산됨

34 [ 표 1] BlueFire Renewable 사의자료를기반으로한본바이오화학융합공정의경제성평가 Tech. Assumption Feed Biomass Price 32,000 주 1 Won/ton Pretreatment Sugar Yield : 30% Sugar Yield 30.0% 주2 Fermentation Yield 50.0% 주 3 Separation Yield 99.0% 주 4 Catalyst conversion Yield 70.0 % 주 5 Capacity 40 주 6 t/yr Capital Cost Total Investment 10,000 주 7 Mil. Won Variable Cost Feed Cost Total Feed Price 1,216 주 8 Mil. Won Biomass Price 32,000 주 9 Won/ton Biomass Amount 380 주 10 ton Operation Cost Total Operation Cost 16 주 11 Mil. Won Unit Operation Cost 400,000 주 12 Won/ton Butanol Fixed Cost 1,200 주 13 Mil. Won Depreciation (10 yr. life) 1,000 주 14 Mil. Won Capitalized Maintenance 200 주 15 Mil. Won Tax & Insuarance (1.2% of F.C.) 14.4 주 16 Mil. Won Butanol Production Price(Gate) 24,704 주 17 Won/ton Butanol G&A, sales, research 1,729 주18 Won/ton Net Production Cost 26,433 Won/ton ROIBeforetaxes 10,000 주19 Won/ton Product Value 36,433 Won/ton Butanol Price (commercial) 1,200 주 20 USD/ton Exchange rate 1,200 주 21 Won/USD Sales 5,760 주22 Mil. Won/yr Profit 2,116.7 주23 Mil. Won/yr 주1) 원료비는수도권매립지공사의 건설폐기물연료화시설경제성검토 에제시된비성형우드칩의판매가격 (32,000 원/ 톤)

35 주2) KIST 에서의선행연구결과를토대로제시된당화효율 ( 목재 1톤당약 300 kg 의당획득) 주3) C. tyrobutyricum ATCC 25755의글루코오스로부터생산되는부티르산이론수율 주4) 주5) 추출공정을통한발효액으로부터부티르산회수율 나노촉매를이용한부티르산의부탄올로의전환율 주6) 바이오부탄올생산을연간 40톤규모로가정 주7) 연간 40 톤규모의바이오부탄올생산가능한발효탱크설치투자비 (100 억원설정) 주8) 사용된총우드칩가격 주9) 우드칩의판매가격 (32,000 원/ 톤) 주10) 사용한우드칩의량 ( 연간 40 톤의부탄올을생산하는데필요한우드칩의량; 380 톤) 주11) 총공정비용 주12) 단위공정비용 ( 부탄올생산 1톤당 40 만원) 주13) 고정비 ( 주14와주15 의합) 주14) 고정비 ( 감가상각비로매년시설투자비의 10%; 1,000 만원) 주15) 시설유지비 ( 시설투자비의 2%; 200 만원) 주16) 세금과보험료 ( 고정비의 1.2%; 14.4 만원) 주17) 부탄올생산단가 ( 톤당 24,704 원) 주18) 영업비 ( 부탄올생산단가의 7%; 1,729 원) 주19) ROI ( 투자비의 10%; 부탄올생산 1톤당 10,000 원) 주20) 부탄올시장가격 ( 톤당 1,200 달러로설정) 주21) 환율 ( 달러당 1,200 원으로설정) 주22) 연간매출액 (57,600,000 원) 주23) 연간순수익 (21,167,000 원)

36 제2절연구개발의국내외현황 1. 연구개발대상의국외시장및전망 현재바이오연료전세계시장은연간 10 조원이상이며, 향후 5년내 2배이상성장이예 측됨. 또한각종환경규제및기후변화협약에따른이산화탄소의무감축등이청정바이오연 료사용을촉진시킬것으로보이며, 향후 10년내주요국가의연료 3% 이상대체의무화 할것이예상됨. 따라서바이오연료산업은과거인터넷산업의성장과비교될정도로막대한성장잠재력을보유하고있어, 경제적으로그가능성을높게평가받고있음. 국제에너지기구(IEA) 는세계바이오연료소비가 2010년까지는연평균 16% 의높은증가 세를지속한후 2010~2015년중에는 5%, 2030년까지세계바이오연료소비는연평균 7% 의증가를전망함. [ 표 2] 세계바이오연료소비장기전망 ( 만톤,%) 년도 (04~10 년) 2015 (10~15 년) 2030 (15~30 년) 전세계 1,550 4,150 (16.4) 5,440 ( 5.4) 9,240 ( 3.5) 기본전망 북미 700 1,540 (13.1) 2,050 ( 5.7) 2,420 ( 1.1) 유럽 200 1,480 (33.4) 1,800 ( 3.9) 2,660 ( 2.6) 아시아개도국 (13.3) 1,610 ( 9.8) 남미 ( 4.5) 1,040 ( 4.3) 2,030 ( 4.5) OECD 890 3,050 (20.5) 3,900 ( 4.9) 5,180 ( 1.9) 자료 : "Wold Energy Outlook 2006"(IEA, 2006), ( ) 내는해당기간연평균증가율 한편본과제가대체하고자하는가솔린은바이오연료가 2020년까지약 8% 를대체할것 으로전망됨

37 [ 표 3] 가솔린대체바이오연료생산전망 Gasoline Biofuel World 1,260조원 1,600조원 33조원 130조원 자료 : "Wold Long-term Oil & Energy Outlook 2. 연구개발의국외현황 바이오부탄올은가솔린을대체할수있는연료물질로서그성상이기존가솔린과매우유 사하여최근많은각광을받고있음. 이에미국 JBEI(Joint BioEnergy Istitute) 는 2007년부터 2016년까지물과미생물을이 용한바이오부탄올을포함한바이오연료개발을진행중이며, 초기 5년간 12,500 만$ 확보 한상태이며 EBI(The Energy Biosciences Institute) 는 2007년부터 10년간바이오매스 의변환에의한바이오연료생산기술개발을진행중임. 2012년 5월 24일미국의 Gevo사는 UCLA의 Liao 교수팀의연구결과(Nature 2008, 451, ) 를활용하여바이오매스로부터 2-부탄올을생산하기위한상업공장을미네 소타 Luverne 에건설하기시작하였고, 생물학적전환공정을활용하여매월 380만리터의 2- 부탄올을생산하겠다고발표함. Du Pont과영국 BP의합작벤처기업인 Butamax는옥수수원료의발효를통해부탄올을 생산하는공정을상용화하고자하였음. 그외에도 Metabolic Explorer, Advanced Biofuels, Cobalt와같은벤처회사들에의해 고농도부탄올생산미생물개발연구가이루어지고있음. 영국에서는 Green Biologics가비식량자원인셀룰로오즈와유기폐기물을활용하여 ABE 발효를통해 1- 부탄올을생산하고, 미국의기존에탄올생산시설을개조하여 1-부탄올생 산시설로활용하였음. 이회사는현재중국의 Laihe Songyuan Chemical과같은회사에 기술이전하여연간 3800 만리터의바이오부탄올을생산하고있음. 일본은당을알코올로변환할때효율성을대폭향상시킨미생물을개발하고, 셀룰로오스와

38 헤미셀룰로오스를당으로변환시키는과정에서생성되는발효저해물질을현저히감소시 키는 RITE-HONDA 프로세스를개발하는데성공했다고보고하였음. 중국은 Tongliao Zhongke-Tianyuan, Jinmaoyuan biochemical Co. Ltd, JiAn Biochemical Co. Ltd, 등의기업이연간약 111,000 톤의부탄올을생산하고있으며, 향후 연간 687,000 톤의부탄올이추가로생산될예정임. 특히 C. acetobutylicum을모델로하여부탄올생산을증가시킨균주, 산소에노출되어도 일시적으로생존할수있는균주등을개발하고있으며, switch grass, molasse 등다양 한목질계바이오매스로부터부탄올을생산하는기술이개발중임. [ 표 4] 국가별그외바이오연료관련주요연구현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 미국 (National Renewable Energy Laboratory) 중국 캐나다 (Iogen) (Zhejiang 대학) 인도 (National Institute for Interdisciplinary Science and Technology) 바이오매스전처리바이오매스당화공정고부가가치화학물질전환기술바이오에너지전환기술 미국에너지부의슈가플랫폼의 핵심기술로개발된약산전처리 공정을리그노셀룰로오스에적용시 셀룰라제에의한당화율이이론적 수율의 90% 이상임 Trichoderma reesei 유래재조합 당화효소를 cellulosic demonstration plant 밀짚의 시도하여약 wheat straw에적용하여 에탄올을생산하는 운용에사용중 Levulinic acid로의전환을 20% 얻음 정도의수율을 조류를바이오매스로이용한 바이오에탄올생산연구

39 3. 연구개발대상의국내시장및전망 [ 표 5] 국내가솔린대체바이오연료시장규모전망 구분 2015년 2020년 2030년 수요 내수 수출 2,850억원 6,264억원 14,688억원 285억원 624억원 1,469억원 공급 국내생산 3,135억원 6,888억원 16,157억원 수입 자료: 2004년국내가솔린수요 16만 bbl/d, 연간성장률 2% 기준, 대한석유협회 4. 연구개발의국내현황 국내에서수행되고있는바이오연료관련과제는대부분디젤이나휘발유에혼합하여사용 하는에탄올을개발하려는수준의연구이며, 기존화석원료에서출발한다양한수송용연료 를완전대체하기위해서는다양한연료물성을만족시킬수있는바이오부탄올생산기술 개발이필수적임에도불구하고, 현재바이오부탄올생산연구는 KAIST의이상엽교수와 GS칼텍스연구팀이 ABE 발효를통한부탄올생산연구 와본연구과제에서수행한 바 이오화학융합공정을통한부탄올생산연구 외에는전무한실정임. 바이오부탄올생산의근간이되는국내연구는 1980년대말한국과학기술원부설유전공 학센터에서수행한 섬유자원의액체에너지화를위한부탄올발효기술에관한연구 와 팜유제조부산물의부탄올발효에관한연구 로, 연구내용은셀룰로오스를분해하는 혐기성섬유소분해세균을분리하고, 이섬유소분해세균( 섬유소로부터당생산) 과부탄올 을생산하는 C. acetobutyricum( 당이용) 을혼합배양함으로써섬유소로부터 ABE 발효를 통해부탄올을생산했던연구임. 본한국과학기술원연구팀또한 2007년부터에너지자원기술개발사업의일환으로 GS 칼텍 스주관 목질계바이오매스로부터부탄올생산기술개발 과제를수행한바있으며, 부탄올생산미생물인 C. acetobutylicum 의 ABE 발효동안부탄올생산영향인자를연구 하였고, 기초기술연구회협동연구과제인 바이오부탄올생산을위한이온성액체활용기 술개발 과제를수행하여바이오부탄올생산및분리에대한핵심기술을개발한바있 음

40 이와같이본연구개발과달리국외는물론, 국내의바이오부탄올생산연구는 ABE 발효 에근간을두고있음. 한편국내 ABE 발효를통한부탄올생산연구의선두그룹은 KAIST의이상엽교수와 GS 칼텍스의공동연구팀에의해수행되고있으며, 상기에서언급하였듯이 ABE 발효의단점 인낮은수율문제 ( 야생성 C. acetobutyricum ATCC 824 는글루코오스로부터아세톤 : 부탄올 : 에탄올을 3 : 6 : 1 의비율로로생산함) 를대사공학기술을이용하여 6탄당과 5 탄당을동시에이용하면서아세톤 : 부탄올 : 에탄올을약 1 : 8 : 1 의높은수율로부탄 올을생산하는균주를개발하였으며, 글루코오스발효시부탄올을동시에추출함으로써 1.32 g/l/h 의속도로생산하였음. 이기술은향후 2 년안에상용화를계획하고있음(GS 칼텍스의홍보자료 ). 본과제개발과같이바이오화학융합공정을통하여부탄올을생산한경우는, 자사의화학촉 매기술개발경험을바탕으로 SK가 6탄당의발효산물에서추출한부티르산을바이오부탄 올로전환하는기술을개발한바있음. [ 표 6] 기타바이오에너지관련핵심기술보유대학현황 연구수행기관연구개발의내용연구개발성과의활용현황 성균관대학교 서울대학교 ( 심상준) 바이오매스전처리 ( 최인규) 바이오매스당화공정 암모니아와이온성액체를이용한볏짚의전처리를통해 90% 이상의글루코오스로의전환율을보임갈색부후균으로부터추출한효소를이용하여소나무로부터슈가를생산 고려대학교 ( 이관영) 고부가가치화학물질 전환기술 리그닌을이용하여구아야콜 (Guaiacol) 로의전환을연구 서울대학교 ( 서진호) 바이오에너지전환기술 자일로스대사균주개발을통한 5 탄당 발효

41 제3절연구개발의내용및범위 1. 연구개발의최종목표 목질계페자원으로부터생물학적공정으로생산된유기산의화학촉매전환반응을통한 바이오알코올연료생산실용화공정개발 < 실험실규모> 목질계폐자원유래당화액이용고농도유기산생산을위한생물학적공정개발 ( 모델당화액대비 85% 이상생산수율, 유기산생산속도 2 g/l/hr 이상) 당화액내혼합당이용고농도유기산생산을위한동시발효균주개발및당화액무독성화 기술개발 ( 육탄당이용대비 85% 이상생산성달성) 발효추출물기반알코올생산촉매공정기술개발 ( 알코올수율 70% 이상, 알코올연료생산실용화공정을위한촉매및반응기초데이터확보) < 파일럿규모> 목질계폐자원유래유기산생산생물학적공정 scale-up을위한 ( 모델당화액대비 80% 이상의유기산수율달성) 100 L 발효기운전최적화 생물학적유기산생산/ 추출공정연계 ( 실험실규모공정대비 80% 이상유기산최종농도및 생산성달성 ) 발효추출물이용알코올생산촉매공정최적화( 실험실결과대비 80% 이상알코올전환 수율달성 ) 생물학적유기산생산공정, 추출/ 분리공정, 촉매화학반응공정연계를위한기초설계자료확보

42 2. 연도별연구개발목표및평가방법 구분세부내용평가의착안점및기준 1 차 년도 목질계바이오매스당화공정개발 혼합당동시발효유기산생산균주스크리닝 (2 종이상) 전처리기법에따른당화액무독성화기술 최적화 (2 가지이상당화액이용) 산업용생산을위한배지최적화 폐목재업체조사및자료수집 100 L 발효기구축및육탄당기반발효 운전조건확립발효추출물의촉매활성변화조사및원인 규명 당화효율 30% 이상 2가지이상전처리기술개발여부 혼합당동시이용미생물: 2종이상도출 당화액내발효저해물질정성/ 정량분석결과 및무독화방안도출여부 저급질소원을이용한최적화배지개발여 부 폐목재수급방안도출 발효기설치물제시 촉매활성변화결과확보여부 촉매분석결과확보여부 촉매개선을위한조촉매, 지지체선정 알코올수율 30% 이상확인(GC 분석결과) 폐목재당화공정최적화 폐목재당화및당화액성상분석여부 2 차 년도 혼합당동시발효균주이용유기산생산 ( 육탄당이용시생산성의 70% 이상달성) 당화액이용고효율유기산생산조건도출 ( 모델당화액대비 70% 이상수율) 유기산생산및동시회수를위한발효공정 개발 ( 유기산생산속도 2 g/l/hr 이상) 유기산생산성: 육탄당발효대비 70% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 70% 이상 유기산생산속도: 2 g/l/hr 이상 촉매구성성분함량최적화 알코올수율 50% 이상확인(GC 분석결과) 모델당화액이용 100 L 발효기공정최적화유기산전환을위한화학촉매반응기구축및운전구성성분함량에따른촉매물성라이브러리구축 실험실규모발효기대비 90% 이상유기산수율달성여부 설치물제시 촉매물성라이브러리확보여부

43 구분세부내용평가의착안점및기준 혼합당동시발효균주이용유기산생산 ( 육탄당이용시생산성의 85% 이상달성) 당화액으로부터최적균주이용유기산생산 ( 모델당화액대비 85% 이상수율) 유기산생산성: 육탄당발효대비 85% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 85% 이상 주요공정변수의영향파악 알코올수율 70% 이상확인(GC 분석결과) 3 차 년도 실제당화액이용 100 L 발효기공정최적화유기산포함발효액이용추출공정최적화발효추출물이용알코올생산촉매공정최적화 모델당화액대비 달성여부 추출공정연계여부 80% 이상유기산수율 실험실결과대비 80% 이상알코올전환 수율달성여부 Kinetic data 확보 반응속도식확보여부 최종 평가 폐바이오매스유래유기산생산을위한 생물학적공정개발및유기산생산최적조건 도출 혼합당동시발효미생물확보를위한유전자 기반미생물설계기술및분리기술확보 주요공정변수의영향파악 Kinetic data 확보 발효/ 추출/ 화학촉매공정연계를위한 기초설계자료확보 유기산생산속도: 2 g/l/hr 이상 유기산생산성: 육탄당발효대비 85% 이 상 유기산생산수율: 모델당화액대비 85% 이상 2 종이상의미생물개발 알코올수율 70% (GC 분석결과) 반응속도식확보여부 이상확인 최종공정연계설계자료확보여부

44 3. 연도별추진체계 목질계폐자원을원료로한유기산발효산물기반 석유대체원료생산기술 1 차년도 (2012 년) [ 주관기관 ] 목질계바이오매스의당화공정개발 혼합당동시발효유기산생산균주 스크리닝 전처리기법에따른당화액무독성화 기술최적화 산업용생산을위한배지최적화 [ 위탁기관 - 한양대 ] 발효추출물의촉매활성변화조사및특성 분석에의한원인규명 촉매개선을위한조촉매, 지지체선정 [ 참여기업- 아팩] 폐목재업체조사및자료수집 Scale-up 연구를위한 100L 발효기구축 육탄당을이용 100L 발효기의유기산생산운전조건확립 2 차년도 (2013 년) [ 주관기관 ] 폐목재당화공정최적화 혼합당동시발효균주이용유기산생산 당화액이용고효율유기산생산조건 도출 유기산생산및동시회수를위한 발효공정 [ 위탁기관 - 한양대 ] 촉매성분함량최적화 구성성분함량에따른촉매물성 라이브러리구축 [ 참여기업- 아팩] 모델당화액이용 100 L 발효기공정최적화 유기산전환을위한화학촉매반응기구축및운전 3 차년도 (2014 년) [ 주관기관 ] 혼합당동시발효균주이용유기산생산 당화액으로부터최적균주이용유기산 생산 [ 위탁기관 - 한양대 ] 주요공정변수의영향파악 Kinetic data 확보 [ 참여기업- 아팩] 실제당화액이용 100 L 발효기공정최적화 유기산포함발효액이용추출공정최적화 발효추출물이용알코올생산촉매공정최적화

45 제 2 장연구개발수행내용및결과 제1절연구개발결과및토의 1. 폐목재당화액을활용한최적유기산생산배지확보 가. 폐목재업체조사및자료수집 (1) 이론적 실험적접근방법 화석연료가격의급등과더불어온실가스배출문제등으로인해자원순환형바이오매스를 이용한바이오연료의생산이대두되고있다. 본연구에서는자원순환형바이오매스인목질계 바이오매스중폐자원을이용하여미생물발효의기질이되는당화액( 글루코오스와자일로스 의혼합액) 을생산하고, 이당화액으로부터미생물발효를통해생산된부티르산을나노화학촉 매를이용하여부탄올을생산함으로써기존석유연료를대체하려한다. 석유대체연료를생산하는데앞서, 본연구팀에서는당화액확보를위한원활한목질계바 이오매스( 폐목재) 의수급을위하여, 건설폐목등의폐목재를공급하는업체에대한자료를수 집하였다. 폐목재공급업체의선별기준은본실용화과제의참여기업인 아팩 의연간바이오부탄 올소요량 (40 톤/ 년) 에근거하여산출된폐목재요구량 (300~400 톤/ 년) 을공급할수있으 며, 운송비를고려하여참여기업의지근거리에있는업체를선별하여 폐목재수급방안을도 출 하였다. (2) 연구수행내용 본실용화과제의참여기업인 아팩 의연간바이오부탄올소요량 (40 톤/ 년) 에근거하 한폐목재요구량 (300~400 톤/ 년) 을공급할수있으며, 운송비를고려하여참여기업의지근 거리에있는폐목재취급업체조사후선별하였다

46 (3) 연구개발결과 국내폐목재취급업체는 한국목재재활용협회 ( 인천시부평 구삼산동 461-1, Tel: ) 에서관리되고있으며, 참여업체인 아팩 의지근거리에있는폐목재취급업체는다음과같다. [ 표 7] 참여기업지근거리페목재수급업체 업체주소업무분야취급목재 미송환경산업 인천서구백석동 폐목재재활용 ( 우드칩생산및 판매 ) 산업가공패목, 임목폐기물, 건설폐목재 자원산업 경기도화성시북양동 364 폐목재재활용 ( 우드칩/ 고형연료제품 생산 ) 건설폐목재, 건설해체목, 산업가공폐목재, 임재폐목재 근우산업이엔지 경기도고양시덕양구덕은동 327 폐목재재활용 ( 우드칩, 톱밥, 분쇄목 ) 폐목재제조, 건설폐목, 우드칩, 나뭇가지, 임목 유진이앤씨 경기도화성시송산면삼존리 폐목재재활용 ( 톱밥) 건축폐목재전문업체, 벌목및임목폐기물 처리, 재활용톱밥 창덕환경산업 경기도용인시처인구백암면박곡리 583 임목폐기물처리 전문업체 나무뿌리, 가지, 톱밥, 폐목재 이들중참여업체인 아팩의연간바이오부탄올소요량 (40 톤/ 년) 에근거하여산출된 폐목재요구량 (300~400 톤/ 년) 을공급할수있는업체는, 참여기업으로부터 42.4 km의거리 에있는 미송환경산업 (51,700 톤/ 년) 이유일하였다. 해당업체는그림에서와같이패목재를산업가공패목, 건설패목, 건설해체목, 임지패목으로 구분하여관리하고있었으며, 최종적으로당화가가능한형태인 우드칩, 톱밥, 분쇄목 의 형태로판매되고있었다. 따라서본과제를위한폐목재는 미송환경산업 에서충분히공급 받을수있을것으로사료된다

47 [ 그림 7] 미송환경산업 의취급폐목및취급형태

48 나. 목질계바이오매스당화공정개발 (1) 이론적 실험적접근방법 상기에서언급한것과같이, 본연구는폐목재를이용하여미생물발효의기질이되는당화 액[ 글루코오스(glucose) 와자일로스(xylose) 의혼합액] 을생산하고, 이당화액으로부터미생 물발효를통해생산된부티르산을나노화학촉매를이용하여부탄올을생산하는과정으로이 루어진다. 목질계바이오매스인폐목재는가수분해( 당화) 과정을통하여미생물발효의기질이되 는글루코오스와자일로스의고분자물질인셀룰로스(cellulose) 및헤미셀룰로스 (hemicellulose) 와, 일반적으로발효미생물이이용하지못할뿐만아니라미생물의생장에도 저해를주며셀룰로스와헤미셀룰로스의당화효율을저해하는리그닌(lignin) 이물리적으로결 합되어있다. 따라서셀룰로스와헤미셀룰로스를당화하기전리그닌제거및셀룰로스와헤미 셀룰로스에대한당화효율을높일수있는효과적인전처리기술이필요하다. 일반적으로전처리공정은셀룰로오스나헤미셀룰로오스를각각의단량체( 글루칸혹은자 일란등) 까지분해하여리그닌과분리시키는공정이다. 당화공정은글루칸혹은자일란을발효 공정에서발효될수있는글루코오스와자일로오스로당화시키는공정이다. 바이오매스전처리 및당화는바이오매스의조성과성분들의분자크기와구조뿐만아니라칩(chip) 의크기, 사용 하는산혹은알카리용액의농도와점도등의물리적조건, 각공정의운전조건( 온도, 압력, 처리방법및반응시간) 에따라반응속도및생성물의조성이달라진다. Alizadeh 등 (Appl. Biochem. Biotechnol., (2005) 121: 1133~1141) 은전처리를한시 료와하지않은바이오매스를이용하여효소를통한당화후당화수율을비교하였을때, 당화 수율이각각 90% 와 15% 로큰차이를보이는것을관찰하였다. 즉, 전처리공정은상당히중 요하며현재까지전처리공정없이는당화수율을 20% 이상넘지못하고있다. 기존에사용되고있는전처리기술의특징에대해서는아래표에요약하였다

49 [ 표 8] 주요전처리기술의특징비교 전처리기술명장점단점비고 산가수분해헤미셀룰로스분리효율이높음 Gypsum 발생 기초연구수행 암모니아침출 리그닌제거효율높음 암모니아회수가능 낮은생산성 기초연구수행 암모니아폭발 대량처리가능 수율이낮음 - 증기폭쇄 대량처리가능 수율낮음 벤치실험수행 SEDAP 헤미셀룰로스수율높음 수율낮음 - ph control 대량처리가능 - - Lime 처리 처리비용이낮다 반응속도낮음소요면적대 - 현재국내외에서최적전처리기술로판명된기술은없으며, 셀룰로스와헤미셀룰로스를가 장경제적으로회수할수있는전처리기술의개발에대한연구가필요하다. 상기전처리후수행되는대표적인당화방법으로는산처리법과효소법이있다. 산에의한 당화공정의경우, 사용하는산의농도에따라강산(10~30%) 당화나묽은산(2~5%) 당화방법 으로나눌수있다. 강산당화방법은상온, 상압에서당화가가능하고, 90% 정도의높은당화 수율, 그리고짧은반응시간이장점이지만, 사용한산을회수하여야하고강산에의한부식을 견딜수있는고가의장치를사용해야하는문제점이있다. 약산당화의경우고온, 고압하에 서반응이이루어지므로에너지소비가클뿐만아니라, 자일로스의과도한분해로인해퍼퓨 랄(furfural) 과 HMF (hydromethylfurfural) 등이발생되고, 이러한물질은미생물의생장을 저해하여발효수율을저하시킬우려가있다. 효소당화법의경우반응온도가낮고폐기물이거 의나오지않아친환경적이고낮은에너지가필요하다는장점이있지만, 아직은효소가격이 비싸고반응시간이길다는단점이있다. 강산을이용한전처리및당화공정은아래그림에서보는바와같이목질구조의파괴를위 해고농도의황산으로처리( 전처리) 한후물을첨가해저농도의황산으로가수분해( 당화) 하기 때문에연속공정의구현이가장용이한목재의당화방법이다. 뿐만아니라, 원심분리나막여과

50 를통하여최종적으로산성당화액( 글루코오스, 자일로스, 황산) 과고상의리그닌을분리및 추출해낼수있다. [ 그림 8] 강산전처리/ 당화공정흐름도 한편, 고온고압에서염기를이용한전처리는고형분을물로세척하는과정을통하여리그닌 을선택적으로사전에제거할수있을뿐만아니라, 중성 ph가유지되므로효소에의해당화 가가능하다. [ 그림 9] 염기처리추가공정흐름도 따라서, 본연구에서는두가지조건( 강산, 염기) 을이용하여전처리를수행하고, 각각산가수분해와효소가수분해과정을통하여당화를수행한후당화효율및공정의효율성을기준으로전처리및당화공정을선별하였다

51 (2) 연구수행내용 폐목재는 한국목재재활용협회 ( 인천시부평구삼산동 461-1, Tel: ) 으로부터 분쇄목 의형태로공급받아, 전처리및당화 공정을수행하였다. 각공정조건은 KIST 기관고유과제에서수행하였던기초실험을토대로설 정하였다. 강산을이용한전처리및당화과정은폐분쇄목 (1 kg) 과황산의비율을 1:1.5로하여약 75% 의황산을가해 40 로 30 분전처리후, 황산첨가량의 4배에해당하는끓는물을첨가 하여약 30% 의황산으로희석하여 80 에서 2시간반응하는 2 차가수분해를실시하였다. 가 수분해가끝난후반응물을냉각하고, 여과한당화액의성상을확인하였다. 염기에의한전처리조건은폐분쇄목 (1 kg) 에최종농고가 5% 가되도록 NaOH 용액을첨 가한후 120 에서 60 분간반응시켰다. 반응이종료된시료는수돗물로중성 ph가될때까 지세척후, 효소칵테일( 노보자임) 을 10 ml 첨가한후 54 에서 24 시간가수분해하였다. 가수분해가완료된시료는강산처리와동일한방법으로여과한후그성상을확인하였다. 당화효율은 Wood conversion rate (%) = (Total sugar concentration (g/l) x hydrolysate volume (L)) / net wood weight (g) x 100% 로계산하였다. (3) 연구개발결과 강산전처리/ 강산당화공정 과 알칼리전처리/ 효소당화공정 의당화수율을비교했을때, 각각 42.93% 와 33.22% 로목표하였던목질계바이오매스( 폐목재) 의당화효율인 30% 를모두상 회하였으나, 강산전처리/ 강산당화공정을통한당화효율이알칼리전처리/ 효소당화공정보 다높았으며, 공정면에서도훨씬유리한것으로사료된다

52 [ 그림 10] 알칼리전처리/ 효소당화공정 과 강산전처리/ 강산당화공정 의당화수율 및공정비교 다. 전처리기법에따른당화액무독성화기술최적화 목질계바이오매스는전처리및당화과정을거친후에는미생물이이용할수있는글루코 오스나자일로스등의당이발생하지만, 이와함께미생물의생장을저해하는발효저해산물도 함께발생한다. 일반적으로알려진목질계바이오매스의당화액내포함되어있는저해물질(inhibitor) 은 사용된바이오매스의종류와전처리방법등에따라매우다양한데, 이를두부류로나누면 크게페놀계화합물과비페놀계화합물로나눌수있다. 페놀계화합물에는 ferulic acid, p-coumaric acid, hydroxybenzoic acid, syringaldehyde, vanillin 등이있으며대부분리그 닌의가수분해산물이다. 비페놀계화합물은 furan, furfural, hydroxymethyl furfural(hmf), 약산(weak acids) 등이며주로셀룰로스와헤미셀룰로스를단당으로만드는가수분해과정 중발생한다. 이러한저해물질들의독성에대해서는주로에탄올발효와관련되어연구되어왔 는데, furan과 HMF는알코올합성에관여하는효소들을저해하며해당과정과관련한에너지

53 대사에영향을주는것으로알려져있다. 유기산들은 ATP 합성메커니즘에영향을줘 ATP의 생산을방해하며방향족아미노산의흡수를줄여미생물성장에직접적인영향을주는것으로 알려져있다. 페놀계화합물들은미생물의세포막기능을상실하게하거나미토콘드리아막의 전기화학적균형을파괴하여미생물의성장과에탄올생산성에큰영향을주는것으로알려져 있다. [ 그림 11] 목질계바이오매스의전처리및당화과정중발생하는저해물질및저해작용(Mill et al., 2009) 목질계바이오매스분해산물중저해물질(inhibitor) 을제거하는무독화방법은크게물리

54 화학적방법과생물학적방법으로나눌수있다. 물리화학적방법에는증발(evaporation), 용 매추출(solvent extraction), 알칼리처리(overliming), 흡착(adsorption) 등이있는데증발은 저해물질중아세트산이나 furfural과같은휘발성화합물들을제거하고용매추출은 diethyl ether나 ethyl acetate와같은용매를이용하여저해물질들을액- 액추출하는방법이고, 알칼 리처리는리그노셀룰로스가수분해물을 Ca(OH)2나 NaOH 로 ph를강알칼리상태로만들 어저해물질들을침전시키는방법이며, 흡착은활성탄이나이온교환수지를이용하여저해물질 들을흡착제거하는방법이다. 생물학적방법에는 peroxidase나 laccase와같은효소를이용 하여저분자의페놀계단량체들을고분자화시켜침전시키는방법이있고, Trichoderma reesei 와같은곰팡이를이용하여저해물질들을분해하는방법이있다. 아래표에서보는바와 같은각각의무독화방법은특정저해물질을특이적으로제거하므로사용되는당화액내의주 요저해물질을확인하고그에따른적합한제독방법을선택하는것이중요하다. [ 표 9] 기존무독화방법에따른저해물질의제거효율 방법 각저해물질에대한제거효율 증발 (evaporation) - 아세트산 : 97% - furfural: 58% 용매추출 (solvent extraction) - 아세트산 : 56% (ethyl acetate 사용) 물리화학적방법 알칼리처리 (over-liming) 활성탄 (activated charcoal) - furfural: 20% - 페놀계화합물 : 20% - 아세트산 : 47% - furans: 39% - 페놀계화합물 : 57% 이온교환수지 (ion exchange resin) - 아세트산 : 85% - furans: 63% - 페놀계화합물 : 76% 생물학적 방법 효소처리 (enzymatic) - 페놀계화합물 : 76% ( laccase 사용 )

55 따라서본연구에서는상기 목질계바이오매스당화공정개발 에서기술한두가지방법에 의해생산된각 폐목재당화액내발효저해물질의정성/ 정량분석 을수행하고, 그에따라각 당화액에적합할것으로사료되는 무독성화방법에대한최적화방안을도출 하였다. (1) 염기전처리/ 효소당화 액의무독성화기술최적화 ( 가) 이론적 실험적접근방법 본연구그룹의원천기술개발과정중당화액내포함되어있는발효저해물질인페놀화합 물(phenolics) 들을전기적으로산화시켜페놀화합물들이중합반응이일어나게하여침전되게 함으로써무독화할수있음을밝혔다 ( 이방법을 페놀전기법 으로명명함). 따라서본연구 에서는폐목재당화액내페놀화합물을무독화하기위하여원천기술의최적화를수행하였다. [ 그림 12] 폐목재의 염기전처리/ 효소당화액 무독성화방법 무독성화정도는본연구의부티르산발효미생물인 Clostridium tyrobutyricum ATCC ( 클로스트리디움타이로부티리쿰) 을상기방법으로무독화한당화액에접종한후생장 및부티르산의생산정도를측정하여무독화정도를판별하였다. ( 나) 연구수행내용 폐목재의염기전처리및효소당화액은상기 나. 목질계바이오매스( 폐목재) 당화공정개 발 에서기술한내용으로수행하였다

56 이후폐목재의염기전처리및효소당화액내발효저해물질은 GC-MS를이용하여정성 및정량분석을수행하였다. 본연구팀에서는원천기술개발과정에서얻어진결과를바탕으로 당화액내에존재하는저해물질을추출하는데적합한용매를선정하였고, 이를이용하여당화액 내의발효저해물질을추출하였다. 추출방법은액- 액추출법 (liquid-liquid extraction) 을 이용하였다. 1 ml의당화액에 2 ml 의추출용매인에틸아세테이트 (ethyl acetate) 를첨가한 후볼텍스믹서 (vortex mixer) 를이용하여 10 분간잘혼합해주었다. 혼합이완료된시료 는 2,500 rpm에서 10 분간원심분리후용매층만분리하여 100 μl로농축하였다. 추출이 완료된시료를이용하여 GC/MS 분석을진행하였다. 사용한기기는 GC Agilent 6890 N with Leco TOF/MS 이고분석조건은표로정리하였다. [ 표 10] 가스크로마토그래프-질량분석기분석조건 기기장비 주입량 GC Agilent 6890 N with Leco TOF/MS 1 μl 주입방식 split mode (3:1) 주입부온도 220 오븐온도이동상가스이온화방법질량범위 10 /min 15 /min 80 (5 min) (10 min) He ( %), 1.0mL/min, constant flow EI mode (electro impact), 70eV m/z 이후무독화는 cyclic voltammetry를통한폐목재내발효저해물질의최적산화조건도 출하고페놀화합물들의중합반응( 페놀전기법) 을수행하였다. 폐목재염기전처리/ 효소당화액의무독성화정도는본연구의부티르산발효미생물인 C. tyrobutyricum ATCC 을무독화한폐목재염기전처리/ 효소당화액에접종한후 3 7 에서 24 시간발효후생장및부티르산의생산정도를측정하였다. 미생물생장은분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm에서의흡광도를측정하 였다. 부티르산의농도는불꽃이온화검출기(flame ionized detector) 가설치된가스크로마 토그래피(Agilent technology 6890N Network GC system) 로분석하였으며,

57 HP-INNOWax column(30m 250 μm 0.25 μm, Agilent Technologies) 을사용하였다. ( 다) 연구개발결과 폐목재의염기전처리및효소당화액내발효저해물질은 아래그림에나타내었다. GC-MS로정성분석한결과를 [ 그림 13] 폐목재의염기전처리/ 효소당화액내발효저해물질의 GC-MS 분석결과 분석결과이후설명할 강산전처리/ 강산당화액 에서는검출되지않는 phenolics를포 함한다양한종류의발효저해물질검출되었다. 뿐만아니라, 상기 페놀전기법 에의한폐목재의염기전처리/ 효소당화액의무독화정도를 부티르산발효미생물인클로스트리디움타이로부티리쿰의생장및부티르산의생산정도로측 정한결과역시, 아래의그림에서보듯이볏짚의염기전처리/ 효소당화액에는매우효과적이 었으나폐목재의염기전처리/ 효소당화액의경우에는효과적이지못함을확인할수있었다

58 [ 그림 14] 염기전처리/ 효소당화액의무독화후클로스트리디움타이로부티리쿰의생장및부티르산생산 (2) 강산전처리/ 강산당화 액의무독성화기술최적화 폐목재의강산전처리/ 강산당화액내에는위에서언급한발효저해물질외에다량의황산 이포함되어있다. 따라서폐목재의강산전처리/ 강산당화액은매우낮은 ph 를형성하고, 고 농도의황산이미생물발효조로투입되게되면발효조에있는미생물은대사를하지못하고 죽게된다. 따라서적절한방법을이용하여당류와황산을분리하는것이바람직하다. 일반적으로강산으로전처리및당화시켜얻어진당과산의혼합액에서당과산을분리하 는방법으로 Simulated moving bed (SMB) 를이용한연속흡착분리방법이알려져있다. 이 방법에서는당혹은산을선택적으로흡착시켜분리하는크로마토그래피( 흡착) 칼럼을다수 설치하고각각의칼럼에밸브와펌프를연결하여연속시료주입과연속제품배출이가능하도 록시스템을구성하여당화액으로부터당과산을연속적으로분리할수있다. 그러나복잡한 장치의구성이필요하며운전이매우까다롭고또한물을매체로사용함에따라산(acid) 용 액이희석되는문제점이있다. 특히흡착제의내구성이떨어지고운전중팽창(swelling) 되는 문제점이있어실용화되지못하고있다. 그러나고가의크로마토그래피( 흡착) 컬럼을사용하고 장치구성이복잡하여운전이매우까다로우며, 특히물을이송매체로사용함에따라산(acid) 용액이 1% 정도로희석되어산을재활용하기어려운문제점이있다. 이와더불어산을흡착 함에따라흡착제의팽윤(swelling) 이심하게일어나므로흡착- 탈착싸이클(cycle) 이반복됨

59 에따라흡착제의내구성이떨어지는문제점도있어서실용화되지못하고있다. [ 그림 15] SMB 공정에의한목질계바이오매스의당화액으로부터산제거공정 따라서, 본연구팀에서는이러한사실을바탕으로가장널리이용되는칼슘하이드록사이드 (calcium hydroxide) 를이용한황산제거공정을수행하였고, 전기화학적처리와음이온교환 막 (anion exchange membrane) 을이용한황산제거공정( 이방법을 황산전기법 으로명명) 을개발하여상호비교하였다. ( 가) 석고 (lime) 처리기법에의한황산제거공정최적화 1 이론적 실험적접근방법 칼슘하이드록사이드를이용한황산제거방법은기존에개발된석고 그세부반응은아래와같다. (lime) 처리기법으로

60 H 2SO 4 + Ca(OH) 2 CaSO4 + 2H 2O 발생되는석고 (CaSO 4, gypsum) 는시멘트혼재, 비료, 의료용깁스등에사용할수있고, 사용하는 Ca(OH) 2 역시가격이저렴한석회석 (CaCO 3 ) 이나생석회(CaO) 로대체할수있으 므로경제적으로유리하다. 또한, 황산의제거율이 90 % 을상회하고, 석고형성후일정시간 이상반응시키면당류에에스테르화되어있는 p- 쿠마린산및페룰릭산(ferulic acid) 과같은 발효저해물질염을형성함으로황산외의독성물질을제거하는데널리이용되고있는방법이다. 따라서강산당화공정후 Ca(OH) 2 처리는중화( 황산제거) 와무독화를동시에이룰수있는 장점이있다. 그러나폐목재당화액내에는순수한황산외에다양한불순물이섞여있기때문에, 경우에 따라중화후형성된석고는폐기물이될수있으며, 당화액에포함된황산을회수할수없 고, 당용액에서석고를분리할때상당량의당이유실되는단점이있다. [ 그림 16] 석고처리에의한당화액으로부터황산제거 따라서, 석고처리기법에의한중화( 황산제거) 및무독성화기술의최적화는본연구팀에서 개발한전기화학적처리와음이온교환막 공정과비교하기위하여수행하였다. (anion exchange membrane) 을이용한황산제거 강산전처리및당화공정을거친당화액에존재하는발효저해물질을 GC-MS 분석을이 용하여정성및정량분석하였고, 황산은석고처리기법으로제거및무독화한후 C. tyrobutyricum 하였다. ATCC 25755의배양에따른부티르산생산으로상기공정의적합성을판별

61 2 연구수행내용 강산전처리및강산당화공정을거친당화액내에존재하는발효저해물질의탐색은상기 언급한 염기전처리/ 효소당화액의무독성화기술최적화 에서와동일한방법으로가스크 로마토그래프- 질량분석기 (Gas chromatograph-mass spectrophotometry) 를이용하였다. 이후약 30 %wt의황산을함유하고있는폐목재강산당화액을냉각수에중탕한상태에 서플라스틱막대로저어주면서고체 Ca(OH) 2 를 ph가 1.0 이될때까지첨가하였다. ph는리 터머스종이를이용하여측정하였다. 이후막투과(filterlation) 를통하여형성된황산칼슘 (gypsum) 을제거하였다. 이상에서획득한용액을향후오버라이밍(overliming) 에이용하였 다. 오버라이밍은다음과같이수행하였다. 상기용액을 60 로고정된열수조(water bath) 에 중탕한상태에서 Ca(OH) 2 를첨가하면서각각 ph 6.0, 7.5, 9.0, 10.5 로조절하였다. ph 변 화를 ph meter를이용하여실시간으로측정하면서 ph 적정곡선(pH titration curve) 를작성 하였다. 각각 ph 6.0, 7.5, 9.0, 10.5로조절된중화액은 7000 rpm으로 30분간원심분리하 여형성된고형물을제거하였다. 이상의용액은영하 20 에보관하여향후연구에이용하였 다. 이후과도한오버라이밍에의해형성될수있는 furfural의농도는불꽃이온화검출기 (flame ionized detector) 가설치된가스크로마토그래피(Agilent technology 6890N Network GC system) 로분석하였으며, HP-INNOWax column(30m 250 μm 0.25 μm, Agilent Technologies) 을사용하였다. 상기황산제거과정을수행한폐목재당화액을이용하여미생물배양을위한배지는다음 과같이조제하였다. 상기보관용액에추가로 1 g/l가되도록효모추출물을첨가한후 3 M 의 HCl을이용하여 ph를 6.0 으로동일하게보정하였다. 이후아르곤가스를이용하여 1시간 동안기체치환하고막멸균(filter sterilization) 균후 60 ml 의혈청병(serum bottle) 에상기 배지를 20 ml 씩분주하고, 고무마개와알루미늄실(seal) 로봉입후섭씨 121 도, 1.5기압에 서 15 분간멸균후실험에사용하였다. 이후대수증식기(log phage) 에도달한점배양(seed culture) 액을 5% 가되도록접종하였다. 배양에사용한미생물은 C. tyrobutyricum ATCC ( 미국미생물보존센터) 를사용하였다. 배양은진탕배양기에서섭씨 37 의온도및 150 rpm 의회전속도로진행하였다

62 점배양을위한배지는총부피 1리터당 7.5 g의포도당과 7.5 g 의목당, 1 g의효모추 출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ),0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ), 2g의아세트산나트륨 (sodium acetate) 를포함하는배지(mP2) 에첨가하고, 60 ml 의혈청병(serum bottle) 에상 기배지를 20 ml씩분주한후각배지는아르곤가스를이용하여기체치환하고고무마개와 알루미늄씰로봉입후섭씨 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후실험에사용하였다. 발효동안일정시간간격으로주사바늘이연결된주사기로배양물을채취하여분광광도 계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm에서의흡광도를측정하여미생물생장을분석하 고, rpm의회전속도로원심분리하여획득한상층액내당농도및발효산물의농도 를측정하였다. 각당농도및발효산물의농도는 Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 이부착된액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 의굴절률검출 기로로분석하였다. 조건은다음과같다. (mobile phase, 0.01M sulfuric acid; flow rate, 0.5 ml/min; temperature, 65 ). [ 그림 17] 라이밍에의한황산제거과정 3 연구개발결과 강산전처리및당화공정을거친폐목재당화액에존재하는발효저해물질을 석을이용하여정성및정량분석한결과는다음과같다. GC-MS 분

63 [ 그림 18] 폐목재의강산전처리/ 강산당화액에존재하는발효저해물질의정성/ 정량분석결과 분석결과아세트산과푸르푸랄은검출되었으나, 특이하게 폐목재염기전처리/ 효소당화 액에서다양하게검출된페놀계화합물이검출되지않았다. 이는강산당화공정의낮은 ph로 인해 lignin 이당화액용액에녹지않기때문인것으로사료되어진다. 강산전처리및당화공 정을거친폐목재당화액에가장미생물생장을저해하는것으로알려진페놀계화합물이검 출되지않았다는것은강산전처리및당화공정을거친폐목재당화액에서황산을제거하는 것외에추가적인무독화공정이필요하지않음을시사한다. 상기가설을규명하기위해, 본연구팀에서는수종별폐바이오매스당화액을강산당화를이 용하여확보하였고, 각당화액에존재하는발효저해물질을 GC/MS로분석해본결과는다음 그림에서보는바와같다

64 mass 1. mass 2. Hit Name Similarit y Reverse Probabilit y 1 ACETIC ACID Furfural CAS Formula Weight C2H4O2 60 C5H4O2 96 [ 그림 19] 참나무의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색

65 mass 1. mass 2. Hit Name Similarit y Reverse Probabilit y 1 ACETIC ACID Furfural CAS Formula Weight C2H4O2 60 C5H4O2 96 [ 그림 20] EFB 의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색

66 mass 1. mass 2. mass

67 Hit Name Similarit y Reverse Probabilit y 1 ACETIC ACID Furfural CAS Formula Weight C2H4O2 60 C5H4O HMF C6H6O3 126 [ 그림 21] 소나무의강산전처리/ 강산당화액의 GC/MS 분석을통한저해물질탐색 강산전처리및당화공정으로준비한참나무와 EFB 당화액의경우아세트산과푸르푸랄이 검출되었고, 소나무당화액의경우아세트산과푸르푸랄그리고 5-하이드록시메틸푸르푸랄이 검출되었다. 이들당화액역시폐목재당화액과같이페놀계화합물이검출되지않았다. 위의결과를기반으로상기에서검출된발효저해물질의표준물질을사용하여 C. tyrobutyricum 의발효저해도를측정해보았다. [ 그림 22] 목질계강산전처리/ 강산당화액에서검출된발효저해물질이클로스트리디움타이로부티리쿰의생육에미치는영향 예상한바와같이페놀계화합물의경우 1 g/l 이하의농도로도클로스트리디움타이로부 티리쿰에상당한저해작용을보이는것이관찰되었으나, 퓨란계화합물인푸르푸랄과 5-하이

68 드록시메틸푸르푸랄의경우전혀균주의생육에저해를주지않는것을관찰할수있었다. 보 고된바에따르면소량의퓨란계화합물은오히려클로스트리디움의발효에도움을준다고하 였으므로, 위의결과는보고와일치하며당화공정시발생한푸르푸랄과 5-하이드록시메틸푸 르푸랄은특별한제거가필요치않은것으로사료된다. 다음은약 30 %wt 의황산을함유하는폐목재강산전처리/ 강산당화액에황산을제거하기 위하여수산화칼슘을과량투입(overliming) 하면서, 상온과 60 에서 1시간반응하고상온에 서냉각한후 ph 변화를기록하였다. 그림은이에따른수산화칼슘에의한 ph 적정곡선이다. [ 그림 23] 수산화칼슘을이용한폐목재강산전처리/ 강산당화액의 ph 적정곡선 (, 상온;, 60 ) 상온에서적정한 ph는시간이지남에따라 ph 가지속적으로변하였다. 이는발효를위해 당화액을중화할때초기 ph 를믿을수없고, 안정적 ph 적정을위해서는상당한시간이소 요됨을의미한다. 그러나 60 에서 1시간동안반응후 ph는반응전의 ph가상당히낮았으 나, 거의안정적으로변화가없었다. 따라서이는보고된바와같이온도와 ph가높을수록당 분해와새로운산화물(acidic product) 이형성되기때문으로사료된다(Essentials of Carbohydrate Chemistry, 1998, pp 50-57, New York: Springer). 그러나 60 에서반응 은강산당화중화후온도를내릴필요가없고, 중화를위해필요한수산화칼슘의양을줄일 수있으며, 중화과정동안미생물오염을막을수있는장점이있다. 따라서향후당화액의

69 ph 적정을위해서는 60 에서 1시간동안반응후 ph 를측정하였다. 냉각한후 다음그림은수산화칼슘을과량투입하면서, 상온과 60 에서 1시간반응하고상온에서 ph 변화와이에따른당화액내당농도의변화를기록한것이다. [ 그림 24] 수산화칼슘에의한 ph 적정곡선에따른폐목재강산전처리/ 강산당화액내 당농도의변화 상기그림에서보듯이산화칼슘의첨가에의한 ph 가올라갈수록( 보다많은수산화칼슘 이첨가될수록) 육탄당과오탄당모두천천히감소되는경향을보이다가 ph 9.0 이후에급격 히감소되는경향을보였다. 이는보고된바에따르면에의한마이야드반응에의해가형성되 기때문으로사료된다. 마이아드반응(Maillad reaction) 은보다높은 ph와온도에서반응이 쉽게일어난다고알려져있다. 이는 60 에서 1시간동안반응후 ph 적정곡선에서높은 ph에서의 ph 변화가더큰이유를설명할수있다. 한편 60 에서 1시간동안반응하지않 았을때는보다낮은 ph(7.0) 에서도급격한당감소를보였다. 이는 60 에서 1시간동안반 응하면서중화액의농축에의해당감소가없는것처럼보이는것으로사료된다. 다음그림은수산화칼슘을과량투입하면서, 상온과 60 에서 1시간반응하고상온에서냉 각한후 ph 변화와이에따른당화액내대표적미생물의발효저해물질로알려진퍼퓨랄 (furfural) 농도의변화를기록한것이다

70 [ 그림 25] 수산화칼슘에의한 ph 적정곡선에따른폐목재강산전처리/ 당화액내 furfural 농도의변화 상기그림에서보듯이산화칼슘의첨가에의한 ph 가올라갈수록( 보다많은수산화칼슘이 첨가될수록) 농도가천천히감소되는경향을보이다가 ph 9.0 이후에급격히감소되는경향 을보였다. 이역시문헌에서보고된바와같이 ph 9.0 이상으로수산화칼슘의첨가가당화액 의무독화에적절하다는것과일맥상통한다. 다음그림은상기방법으로목질계바이오매스의당화액을각각의 ph 로조절하고, 배지화한 후동일한초기 ph 6.0에서 C. tyrobutyricum ATCC 25755의배양에따른부티르산생산 성을기록한것이다

71 [ 그림 26] 수산화칼슘에의한 ph 적정곡선에따른폐목재강산전처리/ 당화액에배양한 Clostridium tyrobutyricum ATCC 25755에의한부티르산생산성 그림에서알수있듯이목질계바이오매스의당화액을수산화칼슘으로 ph 7.5로적정한당 화액에서가장높은부티르산생산성을보였다. 이상의결과는향후본연구팀에서개발한전 기화학적처리와음이온교환막 (anion exchange membrane) 을이용한황산제거공정의대 조군으로이용될수있을것으로사료된다. ( 나) 전기화학적처리와음이온교환막을이용한황산제거공정개발 1 이론적 실험적접근방법 본연구팀에서는 KIST 자체기관고유과제로비식량바이오매스의강산당화및강산당화 액으로부터황산을분리하는전기화학적기술연구를수행한바있다. 본연구에서는 KIST에 서개발된강산당화기술과황산분리기술을폐목재에적용하였으며, 또한부티르산생산미생 물을이용하여당화액의발효적합성에대해서연구하였다. 전기화학적황산제거방법은황산 의전기적분해를이용한것으로전기분해는화합물에충분히높은전압을걸어전기화학적 으로산화환원반응을일으켜화학분해하는것을말한다. 전기화학적방법을통한황산분리공정은아래그림과같이음이온교환막으로분리된전

72 기분해조의음극(-) 수조과양극(+) 수조에각각황산당화액( 당과산의혼합액) 과물( 혹은황 산수용액) 을넣고전기물분해를실시한다. 음극수조에충진된황산당화액의황산은이온화되 어수소이온(H+) 과황산염이온(SO 2-4 ) 으로존재하는데전기를공급하면음극( 또는캐소드 (cathode)) 표면에서는수소이온(H + ) 이전자를받아서수소(H 2 ) 가스를발생하게되고, 황산 염이온 (SO 2-4 ) 은음이온교환막을통해양극으로이동하게된다. [ 그림 27] 전기화학적방법을통한당화액으로부터황산제거공정 [ 그림 28] 전기화학적처리시음극수조에서의반응 양극수조에서는양극( 또는아노드(anode)) 표면에서물이분해되고양극측으로전자를 뺏기면서산소 (O 2 ) 가스가발생하고, 물분해로생성된수소이온(H + ) 은음극수조로부터이동된 황산염이온 (SO 2-4 ) 과만나황산으로전환된다. [ 그림 29] 기화학적처리시양극수조에서의반응

73 즉양극수조인전기분해조에서물의전기분해가일어나며동시에당과산의혼합물이있는 음극수조내의황산염이온 (SO 2-4 ) 은양극수조로이동하게된다. 결국, 황산이음극수조에서 양극수조로이동되며분리, 농축되는결과가이루어진다. 이에따라음극수조에는황산이제거 된당화액을만들수있으며, 양극수조에서는황산을회수함으로써전처리및당화에재사용할 수있게된다. 이상을그림으로요약하면다음과같다. [ 그림 30] 폐목재강산전처리/ 강산당화공정및황산회수공정개략도 따라서본연구팀에서는강산전처리및당화공정을거친당화액에존재하는발효저해물 질을 GC-MS 분석을이용하여정성및정량분석하였고, 전기화학적처리와음이온교환막 을이용한황산제거공정최적화한후일부잔류된황산은상기최적화한석고처리기법으로 제거및무독화한후 C. tyrobutyricum 기공정의적합성을판별하였다. ATCC 25755의배양에따른부티르산생산으로상

74 2 연구수행내용 폐목재강산전처리/ 강산당화액내황산을제거하기위하여, 음이온교환막이장착된전 기화학적처리방법을수행하였다. 우선황산제거에적합한최적전극을스크리닝하기위하여 탄소전극(carbon electrode) 과철전극(Fe electrode), 그리고백금전극(Pt electrode) 을 이용하여비교하였다. H 형반응기에음이온교환막(anion exchange membrane) 을양극과 음극사이에위치하고, 양극에는 300 ml의증류수를넣고전류의흐름을돕기위해 1 ml의 황산을참가하였다. 음극에는 300 ml 의당화액을넣고실험을진행하였다. 반응기에공급하는 전기는전원공급장치(power supply, Instek, GPS-3303) 를이용하였고, 기계가수용할수 있는최대전압인 31.6 V로 10 시간동안전기를흘려주며전류(current) 값을측정하였다. 선발된전극을이용하여당화액의저해물질인황산을제거하였다. H형반응기에음이온 교환막(anion exchange membrane) 을양극과음극사이에위치하고, 양극에는 300 ml의 증류수를넣고전류의흐름을돕기위해 1 ml 의황산을참가하였다. 음극에는 300 ml의당화 액을넣고실험을진행하였다. 시간대별로양극과, 음극에서시료를채취하여당화액에존재 하는글루코오스및자일로스그리고황산염농도를측정하였다. 이후최종황산을제거하고일부잔류된황산은상기최적화한석고처리기법으로제거및 무독화한당화액내글루코오스와자일로스그리고황산염농도는액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 를이용하였으며, Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 을사용하여분석하였다. 상기당화액의발효적합성은상기언급한 폐목재염기전처리/ 효소당화액무독성화기술최적화 에서와동일한방법으로수행하였다. 3 연구개발결과 당화액내에존재하는황산을효율적으로제거하기위해음이온교환막 (anion exchange membrane) 과 H 형반응기를제작하였고, 실험에사용된음의전극은백금(Pt) 으로고정하고 양의전극을탄소(C) 와철(Fe) 그리고백금(Pt) 으로교환하며, 합성황산용액에각각 10시간 동안 31.6 V 의전압으로전기를흘려준결과는다음과같다

75 [ 그림 31] 황산제거를위한최적전극스크리닝 탄소전극과철전극의경우최대전압으로전기를흘려주어도전류의흐름이 0.15 A 또 는 0.25 A 까지만올라가는반면, 백금전극을이용하였을때전류의흐름이 2.4 A 에서 2.95 A 까지증가하는것을관찰할수있다. 전류의흐름이원활하게흐른다는것은당화액내에 황산 (H 2SO 4 ) 가원활하게전기분해되며전류를수소이온(H + ) 이받는다는것을뜻하므로황산제거에적합한전극은백금인것을확인하였다. 백금전극사용시전압이떨어진이유는실험에이용한전원공급장치의최대전압이 31.6 V이고최대전류량이 2.95 A 이므로, 최대전류량에도달했을때전류의흐름이월활하 므로전극간의전위차가떨어진것으로사료된다. 이로미루어보아전원공급장치의최대출 력이높은것을사용하였을때좀더효율적으로당화액내에존재하는황산을제거할수있 을것으로예상되어진다. 본실험을통해당화액내황산을전기적으로제거하는데적합한전극을선발하였고, 추후 실험은이를이용하여진행하였다. 전기화학적인황산의제거를위해진한황산전처리를통해얻어진폐목재당화액 (waste wood hydrolysate) 을이용하였다. H 형반응기의양극(+) 수조에 300 ml의당화액을넣고 음극(-) 수조에는 300 ml의증류수와 1 ml 의황산을넣은후전압(voltage) 과커런트 (current) 그리고발생되는수소가스를모니터링하였다

76 [ 그림 32] 전기화학적방법을이용한폐목재의강산전처리/ 강산당화액내의황산제거조건모니터링 반응시작시에는 31.7 V, 2.4 A에서 1시간후전압은 13.6 V로낮아지고커런트는 2.95 A 로높아졌다. 48시간까지약 2.95 A를유지하며전압또는 10.0 V 이하로낮아지는것을 관찰할수있었다. 반응이종료되는시점인 64시간에는전압이 31.6 V 로올라가고, 커런트는 1.57 로낮아졌는데, 이는양쪽전극의수조에이동할수있는황산염의농도차가심해져, 전류 의흐름이느려짐으로전압이올라간것으로사료된다. 생산되는수소는가스를포집할수있 는테들러백(tedler bag) 을이용하여반응을진행하며생산량을측정하였다. 반응이종료되 는시점까지수소가스는일정하게발생하며반응종료시 80.9 ml 생산되었다. 상기반응동안폐목재전처리/ 당화액내의황산염과당농도변화를살펴보았다

77 [ 그림 33] 폐목재당화액의전기화학적방법을이용한황산제거시, 당함량의변화와 황산염의이동 양극(+) 수조에서시간이지남에따라황산염의수치가낮아졌고, 이와동시에음극(-) 수조에서는황산염의수치가유의적으로높아지는것을확인할수있다. 또한황산염을제거 하기위한석회처리(lime) 와같은염기처리는상당한당손실을유발하므로바이오매스투입 량대비최종목표산물의수율을떨어뜨리는반면, 본연구팀에서개발한전기화학적황산염 제거방법은글루코스와자일로스와같은당화액내존재하는당의함량이각각 59.2 g/l에서 65.2 g/l로그리고 22.8 g/l에서 25.0 g/l 로늘어나는것을볼수있다. 이는당화액내에상 당한부피를갖는황산이제거됨으로반응후의용량이줄어들기때문인것으로사료된다. 이러한결과는참나무강산전처리/ 강산당화액에서도확인할수있다

78 [ 그림 34] 참나무강산전처리/ 강산당화액의전기화학적방법을이용한황산제거시, 당 함량의변화와황산염의이동 참나무당화액역시글루코스와자일로스의함량이각각 56.5 g/l에서 70.0 g/l로그리고 31.0 g/l에서 38.0 g/l로늘어나는것을볼수있고황산염의역시음극수조에서양극수조 로유의적으로이동하는것을관찰할수있다. 석회처리와전기화학적황산염제거의효과를비교하기위해동일한당화액으로실험을진 행하였을때, 300 ml의용량으로시작한당화액에서최종적으로얻을수있는발효가능한 당화액은전기화학적처리시 250 ml로석회처리시얻은 50 ml에비해상당히많은양을 얻을수있는것을확인하였고, 또한석회처리시황산염제거로인해발생하는석고의건조중 량이 ph 1까지올리는데리터당 560 g이발생하는반면전기화학적처리는석고의발생이 전혀없고황산을재사용할수있다는장점을갖고있는것을확인하였다

79 [ 그림 35] 전기화학적처리와석회처리로당화액내황산을제거하였을때반응후의용량과 발생하는석고(gypsum) 의비교 (ph 1) 전기화학적처리는당화액내에황산염이다제거된시점까지진행하였다. 이때의 ph는 1정 도로아직상당히낮으므로미생물이생장가능한중성 ph (ph 7) 까지칼슘하이드록사이드 를이용하여맞춘후시료를채취하였다. 이와비교하기위해당화액내의오직석회처리로 ph 7 까지맞춘당화액과당의함량을비교분석하였다. [ 표 11] 전기화학적처리와석회처리로당화액내황산을제거하였을때반응후의당 함량에대한비교 (ph 7) electrochemical treatment lime treatment glucose (g/l) xylose (g/l) 분석결과전기화학적처리의경우글루코스와자일로스의함량이각각 67.5 g/l와

80 g/l 로석회처리한시료(56.5 g/l와 22.9 g/l) 와비교했을때각각 1.2배와 1.3배증가하는 것이관찰되었다. 최종적으로폐목재의강산전처리/ 강산당화액에서전기화학적으로황산을제거하고, 일부 잔류황산을석회처리로제거및무독화한당화액의발효적합성을판별하기위하여, 순수석회 처리만을통하여중화및무독화한당화액에서클로스트리디움타이로부티리쿰의균주생육 및부티르산발효을비교해보았다. [ 그림 36] 전기화학적처리와순수석회처리로당화액내황산을제거한폐목재강산 전처리/ 강산당화액을이용한클로스트리디움타이로부티리쿰의균주성장과부티르산발효 전기화학적황산을제거한당화액의경우균주의생육이더빠른것을관찰할수있고, 최 대 OD 값또한높은것을관찰할수있다. 또한, 부티르산생산에있어서도최종부티르산생 산량이 g/l로 8.09 g/l가생산된석회처리한당화액에비해 1.3 배높은것을관찰했 다. 당화액을 GC/MS 로분석한결과값에서알수있듯이, 당화액내에는클로스트리디움타 이로부티리쿰에특별히저해를주는물질을발견할수없었다. 그러므로석회처리한당화액에 서균주의성장과부티르산의생산이전기화학적처리한당화액에비해떨어지는것은당화액 내에황산을제거하기위해과도한칼슘하이드록사이드첨가로당뿐만아니라일부영양소 들도함께제거혹은변성된것으로사료된다. 결론적으로, 본연구에서개발한 전기화학적방법 은 폐목재강산전처리/ 강산당화액 내

81 포함된당의손실을유발하지않고, 황산을재이용할수있으며, 반응동안생산된수소는사 용한전기의값을상충할수있으므로, 상기기술한석회처리기법에비해월등히우수한황 산제거공정이라고할수있다. 또한폐목재당화공정중 강산에의한전처리/ 강산당화공정 은 염기전처리/ 효소당화공정 에비해상기에서기술한바와같이당화효율이보다우수할 뿐만아니라, 본연구에서개발한 전기화학적방법 으로황산을제거한 폐목재강산전처리/ 강 산당화액 은발효균주의성장과부티르산의생산에저해를주지않으므로, 향후 폐목재당화 공정 은 강산전처리/ 강산당화공정 을통해수행하였다. ( 다) 전기화학적처리와음이온교환막을이용한황산제거공정최적화 1 이론적 실험적접근방법 상기에서개발한전기화학적처리에의한폐목재강산전처리/ 강산당화액으로부터황산 을제거하는방법은, 법과비교하였을때, 당화액내함유된황산의중화시가장널리이용되어왔던석회처리방 석고가발생하지않으며당손실없이황산만이회수되는장점이있음을 확인하였다. 또한, 부티르산발효에사용되는 C. tyrobutyricum ATCC 25755를이용하여발 효한결과균주의생육또한우수한것으로확인하였다. 하지만전기화학적처리에의한당화 액내황산의제거시아래그림에서보는바와같이당화액에있는황산이모두제거되는시 간까지약 60 시간이넘게소요되므로, 실용화공정에적용하기위해서는황산이제거되는시 간을단축할필요가있다

82 [ 그림 37] 전기화학적방법을통한당화액으로부터황산의제거및석회처리에의해황산이 제거된당화액과의 C. tyrobutyricum ATCC 25755을이용한부티르산생산성비교 따라서, 본연구에서는실용화공정에적용하기위해서는황산이제거되는시간을단축할 수있는방법을모색하였다. 2 연구수행내용 당화액에서황산을제거하기위한시간을단축하기위하여, 크게전극크기와전류량에따 른황산제거속도를비교하였다. 우선전극의크기에의한효과를보기위해 cm2의백금전극과 cm2 의백금전극을이용하여동일한전류를흘려주며, 당화액으로부터황산이제거되는속도를비 교해보았다. 음이온분리막으로음극수조와양극수조가분리된전기분해조의음극(-) 수조에 30% 농황산당화액을 250 ml 넣고양극(+) 수조에동일한부피의 1% 의황산수용액을넣 은후, 전원공급장치(power supply) 를이용하여전압을 31.6 볼트(V) 를유지( 목표전류양은 3 암페어) 하며정전압전기분해를실시하였다. 분리막으로는음이온인황산염이온(SO 2-4 ) 이 선택적으로통과할수있는 ASTOM사의 NEOSEPTA-AMX 이온교환수지막을사용하였다. 모든실시예에서의전극과의거리는 15 cm 를유지하였고, 지름 4.5 cm의음이온교환막을이

83 용하여실험에임하였다. 당화액의황산의농도및당의농도는액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 로분석하였다. 당과황산의농도는굴절률검출기로분 석하였으며 Hi plex H 컬럼 ( mm, agilent) 을사용하였다. 전류량에따른황산제거속도는투입되는전류량을늘려반응종료시간의변화를관찰하 였다. 음이온분리막으로음극수조와양극수조가분리된전기분해조의음극(-) 수조에 30% 농 황산당화액을 250 ml 넣고양극(+) 수조에동일한부피의 1% 의황산수용액을넣은후, 전 원공급장치(power supply) 를이용하여 3, 10, 15 암페어의조건으로정전류전기분해를실 시하였다. 분리막으로는음이온인황산염이온(SO 2-4 ) 이선택적으로통과할수있는 ASTOM 사의 NEOSEPTA-AMX 이온교환수지막을사용하였다. 모든실시예에서의전극과의거리는 15 cm 를유지하였고, 지름 4.5 cm의음이온교환막을이용하여실험을진행하며전압과전류 량의변화를관찰하였다. 당화액의황산의농도및당의농도는액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 로분석하였다. 당과황산의농도는굴절률검출기로분 석하였고 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효에의해생산된아세트산및부트르산의농 도는자외선검출기로분석하였으며 Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 을사용하였다. 상기방법들에의해전기화학적으로산을분리하고얻은음극수조내당화액이발효에적합 한지를확인하기위해, 클로스트리디움타이로부티리쿰을이용하여균주생장및부티르산생 산을측정하였다. 당농도를 1/2 로희석하고, 희석된당화액에 1리터당 5 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g의염화나트륨을첨가하 여발효배지로사용하였다. 배지의초기 ph는 6.5 로조정하였으며, 121 에서 15분간고압 멸균하여발효실험에사용하였다. 회분식배양(batch culture) 은 60 ml 의시료병(serum bottle) 에 20 ml의배지를넣고미생물을접종한후진탕배양기에서섭씨 37 의온도및 200 rpm의회전속도로 48 시간배양하였다. 배양을진행하면서배양시간에따라당, 아세트 산및부티르산의농도를액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 를사용하여측정하였고에탄올의농도는가스크로마토그래프 (Agilent model 6890N gas chromatograph) 를이용하여측정하였다. 미생물생장은분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm 에서의흡광도로측정하였다

84 3 연구개발결과 cm2의백금전극과 cm2의백금전극의크기에따른황산제거속도는다음그림과표와같다. [ 그림 38] 전극의크기에따른황산제거 [ 표 12] 전극크기에따른황산제거시간과전류밀도의비교 반응종료시간 (h) 전류밀도 (ma/cm 2 ) cm cm cm2의백금전극을이용하여당화액으로황산을제거하였을때 55시간만에당화액의모든황산이물쪽으로회수되었으나, cm2의백금전극을이용하였을때

85 황산이모두회수된시간이 47시간으로 8 시간단축되었음을알수있다. 당의농도또한 cm2의백금전극의경우초기글루코오스와자일로스의농도가 56.5 g/l와 31 g/l에서 70 g/l와 38 g/l 로증가하였고, cm2의백금전극을이용하였을때 g/l와 g/l에서 g/l와 g/l로증가한것으로보아전극의크기를늘려도당의손 실에는영향이없는것을관찰하였다. 본실험은 3암페어의정전류실험으로전극의사이즈를 제외한모든조건을동일한상태에서진행하였다. 그러므로전극의사이즈가더늘었을때전 류의밀도가상대적으로낮아지는것을알수있다. 전류밀도(current density) 란도체의단 면에서단위면적당흐르는전류를의미한다 cm2의백금전극으로실험을진행하 였을때전류밀도는 120mA/cm2이고 cm2의백금전극으로실험을진행하였을때 전류밀도는 67mA/cm2로약 2 배가까이전류의밀도가줄어든것을알수있다. 만약동일 한전류밀도로전기화학적물분해를진행하였을때전극의크기를늘렸을때상기결과보다 당화액으로부터황산이제거되는시간을더단축할수있을것으로사료된다. 전기화학적방법을통해물이분해될때양극수조에서는 2개의물분자가분해되어 4개의전 자가생성된다. 이를빠르게당화액이있는음극수조로전달해준다면황산이분해되는속도와 분해된황산이양극수조로이동하는속도가빨라질것으로예상하여전류량의변화에따른황 산제거실험을진행하였다. 당화액의조성과동일한농도의황산을음극수조에넣고동량의물 (1% 황산수용액) 을이용하여실험을진행하였고, 흘려주는전류량은각각 3, 10, 15 암페어 로정전류로각각흘려주며황산의이동속도를관찰하였다. [ 그림 39] 전류량에따른합성황산용액에서황산제거속도의차이비교 전기화학적방법을통해당화액으로부터황산이제거되는시점을관찰하였을때, 3 암페어

86 로정전류실험을한경우 64시간만에모든황산이제거되었고 10 암페어및 15 암페어로 실험을한경우각각 12 시간, 10 시간만에모든황산이제거되는것을관찰하였다. 10 암페 어의조건에서 3암페어와비교하여황산이모두제거된시간이 52시간빨라졌으며 15 암페어 의조건에서실험한경우는 54 시간이단축된것을알수있다. 10 암페어의조건과 15 암페어의조건에서황산이모두제거된시간은 2시간만이차이가 있는데, 이는 15 암페어의조건에서투입되는전기에너지가열에너지등으로소실되는것으로 추측되어진다. 또한사용하는막의크기가일정하기때문에이동할수있는황산의농도에대 한한계로인해황산이모두제거되는시점이크게차이가나지않는것으로사료되어진다. 따 라서, 전극간의거리또는막의크기를조절하는등반응기의구조를바꾼다면고전류 (15 암 페어) 에서황산이제거되는시점을더욱단축시킬수있을것으로사료된다

87 실제폐목재당화액을이용하여 3 암페어와 10 암페어의정전류조건에서황산의제거및 당농도의변화를관찰하였다. [ 그림 40] 폐목재당화액에서의전류량조건에따른황산의제거및당농도의변화 3 암페어의조건에서모든황산이제거된시점은 45시간으로관찰되었고 10 암페어의조 건에서는 12 시간만에모든황산이제거되는것이관찰되었다. 암페어를높임으로써반응종료 시간을 33 시간단축할수있었다. 전기화학적방법을이용하여황산의제거와더불어당의농 도또한관찰하였다. 3 암페어로실험한결과글루코스와자일로의농도가초기 g/l와 g/l에서반응이종료된 45시간후 g/l와 g/l 로증가하였고, 10 암페어 로실험한결과글루코스와자일로의농도가초기 g/l와 g/l에서반응이종료된 12시간후 g/l와 g/l 로증가하였다. 이로미루어보아당화액에포함된황산을 제거할때속도를높여도당의농도에는큰차이를보이지않는것을확인하였다. 당화액의당 농도가높아지는것은전기화학적반응시, 당화액에있는황산이물쪽으로넘어가며전체볼

88 륨이줄어서나타나는현상이다. 3 암페어와 10 암페어모두반응시작볼륨이 250 ml인반 면반응종료시볼륨을측정하였을때 3 암페어의경우 200 ml로 10 암페어의경우 180 ml 로볼륨이줄어들어두조건에따른결과물에서당의농도가차이가나는것을알수있다. 실 제양을확인했을때 3 암페어의경우글루코스와자일로스가 g과 5.36 g에서 g과 5.74 g 으로유지되었고, 10 암페어의경우글루코스와자일로스가 g과 5.45 g에 서 g과 5.78 g으로유지되는것으로보아당손실이없음을확인하였다 상기결과에서볼수있듯이 10 암페어의조건에서반응 10 시간후, 황산의제거속도가 늦어지는것이관찰되어반응시전류와전압을확인하였다. 10 암페어정전류가흐르도록전 압공급장치를설정하였을때실제전류의흐름을측정한결과반응초기(0 ~ 0.5 시간) 와 반응종료시점부근(9 ~ 12 시간) 에서목표전류가흐르지않는것을확인하였다. 이는전기 화학적반응에사용되는반응환경에서기본적으로잡혀있는저항과반응초기황산이회수되 는양극수조의황산의농도( 약 1% 황산) 와반응이종료시점의당화액이있는음극수조의 황산의농도( 약 3% 황산, 반응후 10 시간) 가전해질로서충분한양이아니기때문에높아진 저항이합해져사용한전원공급장치의한계전압인 30 볼트에서전류의흐름이낮아져황산의 이동속도가늦어지는것으로사료된다. 각각의수조에서의황산의농도가 50 g/l 이상일때, 목표전류치인 10 암페어의전류가흐르는것으로보아사용되는전기에너지와중화시사용 하는알칼리화학물질의양을비교하여적합한반응종료시점을선정할필요가있을것으로 보인다. 전극의크기와전류의양을조절하여반응속도를높인방법을이용하여폐목재당화액으로 부터황산을제거하였고, 이를통해제조된당화액이부티르산발효에적합한지확인하기위해 C. tyrobutyricum ATCC 의생장 (OD600), 당소모경향, 부티르산생산경향을확인 하였다

89 [ 그림 41] 최적화된전기화학적방법을통해황산이제거된폐목재전처리/ 당화액을이용한 C. tyrobutyricum ATCC 25755의생육및유기산생산 실험결과미생물생장이잘이루어지는것을흡광도가증가하는것을통해확인하였고, 26.4 g/l의글루코스와 3.5 g/l의자일로스를소모하여 13.8 g/l의부틸산을생산하는것을 확인할수있었다. 본연구를통해, 개발한전기화학적방법으로폐목재강산전처리/ 당화액내황산의제거및 회수공정을최적화하였고, 상기최적화된공정은황산의제거속도를높일수있을뿐만아 니라, 당화액의글루코오스와자일로스의함량이줄어들지않았으며, C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효에도적합한것을확인하였다

90 라. 폐목재당화공정최적화 (1) 이론적 실험적접근방법 강산전처리/ 강산당화공정 이상기에기술한바와같이당화효율, 공정의편의성, 무독 화결과등이 염기전처리/ 효소당화공정 에비해우수하므로, 강산전처리/ 강산당화공 정 의최적화를수행하였다. 폐목재는잡목의혼합물이므로, 우선최적조건을확립하기위하여, 목재의대표적인두부 류인활엽수와침엽수의수종을선택하여전처리및당화후글루코오스및자일로스의수율 을확인하였다. 활엽수로는참나무(Oak), 침엽수로는소나무(Pine) 을이용하였으며, 공정조건 을확인하기위하여실험실규모에서진행하였다. 이후두종류의목재에서공통적으로가장 높은글루코오스및자일로스의수율을보이는조건을실제폐목재에적용하여전처리및당 화후그성상을분석하였다. (2) 연구수행내용 강산전처리/ 강산당화공정은아래의장치에서실행되었다. [ 그림 42] 강산당화실험장치

91 각각참나무및소나무목분에 60~80% 의황산을가해 40 로 30 분전처리후, 황산첨 가량의 4배에해당하는끓는물을첨가하여약 30% 의황산으로희석하여 80과 100 에서 2 차가수분해를실시하며약 30분단위로시료를채취후반응물을냉각하고여과하여당화액 을수집하여그성상을확인하였다. [ 그림 43] 강산전처리/ 당화공정연구내용 실제폐목재의당화조건은상기조건에서확립된조건으로, 상기 나. 목질계바이오매스 ( 폐목재) 의당화공정개발 에이용한동일폐목분으로전처리및당화를수행하였다. (3) 연구개발결과 참나무와소나무의강산전처리/ 당화결과는아래그림및표에나타내었다. 다양한실험 조건에서반응종료후총당(C sugar) 의농도및수율(sugar yield) 과글루코오스농도/ 자 일로스농도비를비교하였다. 아래그림은각각참나무및소나무목분에 60~80% 의황산을가해 40 로 30분전처리

92 후, 황산첨가량의 4배에해당하는끓는물을첨가하여약 30% 의황산으로희석하여각각 80과 100 에서약 120분간 2차가수분해를실시한후채취한시료의당성분을분석한결 과이다. [ 그림 44] 참나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도, 120 분) 반응후당농도 [ 그림 45] 소나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도, 120 분) 반응후당농도

93 동일조건에서소나무가참나무보다높은당화액농도를보였다. 이는글루코오스/ 자일로스 비율에서보는바와같이소나무에서상대적으로많은자일로스가추출됨에서기인한것으로 보인다. 그러나수종에관계없이당화반응온도가 100 일때보다 80 일때당회수율이 좋았다. 전처리시첨가한황산의농도가높을수록당회수율이높아지는경향을보이다가 75% 에서 80% 로높였을때는거의차이가없거나오히려낮아지는경향을보였다. 따라서다 양한수종이포함된폐목재는 80 에서 75~80% 의황산으로당화공정을수행하는것이적합 한것으로사료된다. 한편, 글루코오스/ 자일로스의비는 80 일때보다 100 일때가높았으 며, 첨가한황산의농도가높을수록높아지는경향을보였다. 아래그림은각각참나무및소나무목분에 60~80% 의황산을가해 40 로 30분전처리 후, 황산첨가량의 4배에해당하는끓는물을첨가하여약 30% 의황산으로희석하여각각 80과 100 에서 2차가수분해시간에따른글루코오스와자일로스의변화를나타낸그림이 다. [ 그림 46] 참나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도) 반응시시간에따른 글루코오스와자일로스의변화

94 [ 그림 47] 소나무의강산전처리( 황산농도)/ 당화( 반응온도) 반응시시간에따른 글루코오스와자일로스의변화 보다저농도(65, 70%) 의황산용액을이용한전처리조건에서는당화온도에관계없이당화처리시간에따라글루코오스의함량이증가하였으나, 75%/100 를제외한고농도(75, 80%) 황산용액을이용한전처리조건에서는당화온도에관계없이당화처리시간에따라글 루코오스의함량이오히려감소하였다. 반면자일로스의농도는전처리시이용한황산용액의 농도및당화온도에관계없이전반적으로시간이지남에따라줄어들었는데, 이는주로자일 로스의과분해에의해일어나는것이고, 그로인해글루코오스/ 자일로스의비가높아진다는것을확인하였다. 폐목재혼합물내의대표적인두부류인활엽수( 참나무, oak) 와침엽수( 소나무, pine) 바이 오매스를이용한당수율을기반으로다양한조건에서의결과는아래표로요약하여정리하였 다

95 [ 표 13] 참나무와소나무의강산전처리/ 강산당화조건및당농도 이상의결과에서볼때두종류의바이오매스가혼재하는폐목재의경우, 80% 의황산을이 용하여 80 에서 30분처리했을때가장효율적인당화가이루어지는것으로사료된다. 따라 서본연구결과를통해실제폐목재를이용하여당화를진행하였다. 최적화된당화조건을통 한폐목재바이오매스당화액의조성은다음표와같다

96 [ 표 14] 최적조건을이용한폐목재바이오매스의강산전처리/ 강산당화조건및결과 Input parameter Output parameter Raw material H 2 SO 4 (wt%) Hydrolysis ( ) Hydrolysis (min) G/X ratio Glucose (g/l) Xylose (g/l) waste wood 최종당화액내에는 56.5 g/l의글루코오스와 31 g/l의자일로스가존재하는것을확인 하였고, 글루코오스와자일로스의비율이 1.82 로나타났다. 폐목재바이오매스로부터회수한 총당의함량은 87.5 g/l로이는당화효율이 49.0% 로 나. 목질계바이오매스( 폐목재) 의당화공 정개발 과정에서의당화효율인 42.93% ( 글루코오스함량: g/l, 자일로스함량: g/l) 보다높은당화효율로폐목재의당화가성공적으로이루어졌음을확인하였다. 이러한 나. 목질계바이오매스( 폐목재) 의당화공정개발 에서의낮은당화효율의결과는상기최적 당화조건중당화시간이 30분인것에반해 2시간으로길었기때문에과도한당의분해에기 인한것으로사료된다. 마. 발효공정 scale-up을위한폐목재당화액확보 (1) 이론적 실험적접근방법 Pilot scale 의발효조 (100 L 규모) 에서실제부티르산발효가이루어지기위해서는최소 30 L 이상의당화액이요구된다. 따라서대량의당화액을확보하기위하여, 폐목재의강산전 처리및당화역시 pilot scale 에서수행되어야만한다. (2) 연구수행내용 폐목재의강산전처리및당화는아래 KIST에구비된 pilot scale (20 L) 규모의강산전 처리/ 당화장치에서수행하였다

97 [ 그림 48] Pilot scale 강산전처리/ 당화장치및공정흐름 당화조건은상기최적조건인 1 kg의폐목분에 80% 의황산을가해 40 로 30분전처리 후, 황산첨가량의 4배에해당하는끓는물을첨가하여약 30% 의황산으로희석하여 80 에 서 2차가수분해를실시한후반응물을냉각하고여과하여당화액을수집하여그성상을분석 하였다. (3) 연구개발결과 KIST에구비된 pilot scale (20 L) 규모의강산전처리/ 당화장치로상기조건에서 1회당화 시회수한당화액의량은약 5~6 L 로, 최종수거한약 30 L의당화액내글루코오스와자일로 스의함량은각각 g/l와 g/l로총당함량이약 g/l에해당하였다. 이는연 구실규모에서수행한결과보다글루코오스(56.5 g/l) 는조금높게생산되었으나, 자일로스 (31.0 g/l) 는낮게생산된결과( 총당함량: 87.5 g/l) 이다. 이러한결과는아마도각회마다 수행한강산전처리/ 당화에이용된폐목분의성상이달랐기때문으로사료된다

98 바. 산업용생산을위한배지최적화 (1) 이론적 실험적접근방법 미생물에서탄소, 산소, 수소, 질소, 황, 인, 칼륨, 칼슘, 마그네슘, 철등의원소가세포건조 중량의 95% 이상을차지한다. 미생물의생장에비교적많은양이필요하기때문에이러한원 소를대량원소또는대량영양소라부른다. 이중질소는아미노산, 퓨린피리미딘, 탄수화물의일부, 지질분자, 효소의보조인자등여 러생체구성분자의합성에필요하다. 미생물가운데에는아미노산을질소원으로사용하는것 이많으며, 글루탐산탈수소효소, 글루타민합성효소나글루탐산합성효소등의효소가작용하 여암모니아를직접유기물합성에사용하기도한다. 그러나, 목질계바이오매스는단백질의함량이낮기때문에, 폐목재강산전처리/ 당화액을 미생물발효를위한배지로이용하기위해서는추가적인질소원의공급이요구된다. 선행실험 에서폐목재당화액만을클로스트리디움타이로부티리쿰의발효배지로사용하였을때, 5 g/l 의효모추출물을첨가한당화액을발효배지로사용하였을때보다현저히부티르산생산속도가느리고, 심지어완전히당화액내당을완전히소모하지못하는경향을관찰할수있었다. 효모추출물은미생물발효배지에널리이용되는대표적인질소원으로그처리의다양한 형태에대한일반적인이름이다. 효모세포의내용물을 ( 세포벽을제거) 추출하여만들어진제 품으로, 질소원일뿐만아니라다양한미량원소들을함유하고있기때문에, 이들은식품첨가 물이나맛, 또는박테리아문화미디어영양소로사용된다. 본연구에사용되고있는부티르산생산균주인클로스트리디움타이로부티리쿰은선행실험결과질소원인효모추출물(yeast extract) 의농도에따라균주의생육이크게증가하는것이관찰되었다

99 [ 그림 49] 클로스트리디움타이로부티리쿰의효모추출물농도에따른부티르산생산비교 그러나최고의부티르산생산성을확보하기위해서는상기그림에서보듯이효모추출물이 25 g/l 까지배지에첨가되어야한다. 부티르산생산에대한경제성평가시배지함유물의가 격또한상당한비중을차지하므로, 고가의효모추출물을대체할수있는저가의대체질소원 의선발은필수불가결하다. 대체질소원후보로는농업부산물인콘스팁파우더(corn steep powder) 와맥주발효후 버려지는이스트로부터얻을수있는효모추출물을들수있다. 하지만, 이둘은실험용에비 해정제된형태가아니므로, 미생물발효에적합한질소원뿐만아니라, 미생물생장에저해를 유발할수있는유기산등이일부포함되어있으므로적합한질소원을찾는것이중요하다. (2) 연구수행내용 저가질소원을사용하기위해맥주발효후버려지는효모로부터얻어진산업용효모추출 물과농업부산물인콘스팁파우더에대한정보를조사하였다. 선발된저가질소원이클로스트리디움타이로부티리쿰의균주성장및부티르산의생산에 영향을미치는지관찰하기위해실험용효모추출물과산업용효모추출물, 그리고콘스팁파우 더를각각 5 g/l 씩부티르산발효배지 ( 리터당 20 g 의글루코스, 5 g 의효모추출물, 0.2 g

100 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨 (KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의아세트산암모늄(ammonium acetate) 를포함) 에첨가한후아르곤가스를이용하여기체치환후섭씨 121도에서 15분멸 균후실험에사용하였다. 초기 ph는 1 N 수산화칼륨(KOH) 으로 6.8 으로조정되었다. 회분식 배양(batch culture) 의경우, 60 ml 의시료병(serum bottle) 에 20 ml의배지를넣고배지 의 5% 에해당하는배양액을접종한후진탕배양기에서섭씨 37 의온도및 150 rpm의회 전속도로배양하였다. 미생물생장은분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm에서의흡광도를측정하 였다. 글루코스와자일로스그리고아세트산과부티르산의농도는액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 를이용하였으며, Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 을사용하여분석하였다. (3) 연구개발결과 다음은고가의실험용효모추출물 (200,000 원/kg) 을대신할수있는저가질소원을조사 한결과이다. [ 표 15] 산업용질소원의시장조사결과 분류 제품명 성상 포장 Gistex LS Ferm Powder Powde r 25kg Bakers Yeast Gistex LS Powder AGGL Powde r 25kg Springer 0202 Powde r 25kg Brewers Yeast Yeastex LSP Powde r 20kg 판매가 ( 세별도) 16,000 원 /kg 16,000 원 /kg 17,000 원 /kg 12,000 원 /kg 제조원( 국가) DFS ( 네덜란드) DFS ( 네덜란드) BioSpringer ( 프랑스) Leiber ( 독일) Brewers yeast인 Yeastex LSP 가가장저렴한것으로나타났고, 이는실험용효모추출 물에비해약 17 배가량저렴한것으로확인되었다. Yeastex LSP 역시다른산업용효모추 출물과같이효소를이용하여가수분해한제품이지만맥주발효후폐기하는효모로부터만들

101 어진제품이므로다른제품에비해저렴한것을알수있다. 그리고콘스팁파우더의경우농 업부산물로서유기산및알코올의산업적발효에이미널리사용되고있다. 하지만, 이두산 업용질소원은실험용효모추출물에비해정제가덜된상태이므로부티르산발효균주인클 로스트리디움타이로부티리쿰의생육에미치는영향을조사해야한다. 미생물의생장은크게지체기대수기정체기로나눌수있고, 부티르산발효에중요한생산 성(productivity) 을높이기위해서는초기생장인지체기가줄어야한다. 지체기란미생물이처 음새로운배양액에접종되면세포수가즉시증가하지않는상태로, 이기간중에는세포분열 이일어나지않지만, 분열이일어나기전까지생육에필요한여러인자들을합성하는시기이 다. 배지의화학적인조성이달라질경우지체기가길게나타나므로실험용효모추출물과산 업용효모추출물, 그리고콘스팁파우더가첨가된배지를이용하여초기생육정도와발효가 종료된시점에서의부티르산생산정도를비교해보았다. [ 그림 50] 실험용효모추출물과산업용질소원이클로스트리디움타이로부티리쿰의초기 생육( 지체기) 에미치는영향 실험용효모추출물과산업용효모추출물그리고콘스팁파우더를배양액에 5 g/l 씩첨 가한배지에클로스트리디움타이로부티리쿰을배양한결과, 그림에서보는바와같이초기 생육에차이가없는것을관찰할수있었다. 아래그림의발효종료시점인 24시간후시료채취결과역시산업용효모추출물과콘스

102 팁파우더는실험용효모추출물에비해크게떨어지지않는것이확인되었다. [ 그림 51] 실험용효모추출물과산업용질소원이클로스트리디움타이로부티리쿰의성장과 부티르산생산에미치는영향 ( 발효종료시점) 선행실험결과에서알수있듯이질소원인효모추출물의함량이높을수록균주의초기 생육이빨라지는것을알수있으므로, 조사된저가산업용질소원을이용하여동일한가격으 로배양액을만들시상당히높은생산성을확보할수있을것으로사료된다

103 사. 당화액이용고효율유기산생산조건도출 우리나라의경우제한된경지면적과한정된자원으로바이오매스의수급이어렵고, 버려지 는폐목재를이용하여바이오연료및바이오케미칼을생산한다하여도, 미생물이이용할수 있는당으로전환하는전처리및당화공정이까다롭기때문에투입되는바이오매스대비최 대목표생산물을얻어내어야한다. 본과제를통해생산하는부티르산은 Clostridium 계열의균주가생산하며대표적인부티 르산생산미생물로는본과제를통해계속해서연구중인 C. tyrobutyricum ATCC 이다. 상기균주의대사경로를살펴보면 5탄당과 6탄당을이용하여목표로하는부티르산뿐 만아니라아세트산과젖산역시생산할수있는것으로나타나있다. [ 그림 52] C. tyrobutyricum ATCC 25755의대사경로 본연구팀에서 C. tyrobutyricum ATCC 25755를이용하여글루코오스가포함된합성배 지에서의실제유기산생산을관찰한결과, 젖산은생산되지않았으나부티르산과아세트산이 생산되는것을관찰하였다

104 [ 그림 53] 글루코오스이용시 C. tyrobutyricum ATCC 25755의유기산생산 약 10 g/l의글루코스를소모했을때 0.77 g/l의아세트산과 3.39 g/l의부티르산을만 드는것으로보아아세트산과부티르산의생산비율이 1 : 4.4 로전체생산된유기산에서아 세트산의생산이약 20% 로상당히높다. 그러므로높은수율로본연구개발의목적산물인 부티르산을얻기위해서는아세트산으로흐르는탄소의대사흐름을제한하고, 이흐름을부티 르산생산으로돌릴필요가있다. 혐기성발효를하는미생물은자신의성장에필요한 ATP 생산을위해해당작용 (glycolysis) 을하고, 이를통해생성된환원력을발효를통해제거한다. 본연구에서사용하 고있는 C. tyrobutyricum ATCC 역시혐기성발효를하는미생물로, 당화액에포함 된글루코오스및자일로스의해당과정을통한분해와아세트산및부티르산발효를통하여 ATP 를얻고, 해당과정중생성되는환원력은수소생산과부티르산발효를통해배출한다. C. tyrobutyricum ATCC 25755에의해글루코오스로부터부티르산이생산될때의대략 적인대사경로를살펴보면, 1분자의글루코오스가 2 분자의피루빈산염(pyruvate) 으로전환되 고, 이때 2분자의 NADH 가생성된다. 2분자의피루빈산염은다시부티르산으로전환될때 2 분자의 NADH 를이용하게된다. 따라서만약당화액에포함된글루코오스및자일로스의해 당과정중형성되는환원력외에추가적인환원력을공급하면, 여분의환원력을배출하기위하 여탄소대사흐름이부티르산으로만대사될것으로예상하였다. 따라서본연구에서는폐목재당화액으로부터생산되는부티르산생산수율을높이기위하

105 여, 폐목재당화액내당( 글루코오스및자일로스) 의해당과정중형성되는환원력외에추가로환원력을제공할수있는방법을모색하고자하였다. (1) Methyl viologen 첨가에의한부티르산생산수율향상 ( 가) 이론적 실험적접근방법 혐기성발효에서피루빈산염이아세틸코에이(acetyl-CoA) 로전환될때산화된페레독신 이환원되고이를수소생산효소(hydroganase) 가수소를생산하여산화/ 환원전위를맞추게된 다. 한편, Methyl viologen(mv) 는 hydrogenase 활성을억제하는물질로, 수소생산으로빠 져나가는환원력을막아주는것으로알려져있다. 즉, MV는수소생산효소의활성에저해를주 어환원된페레독신이다시산화될때 NADH 가생성되게된다. [ 그림 54] MV에의한 hydrogenase 활성억제를통한 NADH 생산 따라서본연구에서는 MV 첨가에의한환원력보존여부가, C. tyrobutyricum ATCC

106 25755 의부티르산생산수율에미치는영향을관찰하였다. ( 나) 연구수행내용 부티르산발효배지로는배지의총부피 1리터당 20 g 의글루코스, 5 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ),0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ),2g 의아세트산암모늄(ammonium acetate) 를포함하는배지를사용하였고상기배지에 MV를각각 0, 0.25, 0.5 mm이되도록 첨가하였다. 배지의초기 ph는 4 N 수산화칼륨(KOH) 으로 6.5 으로조정되었다. 회분식배양(batch culture) 의경우, 60 ml 의시료병(serum bottle) 에 20 ml의배지를넣고미생물을접종한 후진탕배양기에서섭씨 37 의온도및 150 rpm의회전속도로 24 시간배양하였다. 배양을진행하면서배양시간에따라당, 아세트산및부티르산의농도를액체크로마토그래 프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 를사용하여측정하였고, 미생물생장은분 광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm 에서의흡광도로측정하였다. ( 나) 연구개발결과 MV는독성이있기때문에 0, 0.25, 0.5 mm 의농도로발효배지에첨가하였고, C. tyrobutyricum ATCC 25755를접종하여시간대별로균주의성장및발효패턴을관찰한결 과 MV의농도가 0.5 mm 까지균주의성장에영향을주지않는것을관찰하였다. 가스생산은 24시간발효결과 MV를넣지않은실험군에서 104 ml이생산되었고 0.25 mm의 MV를넣은경우 105 ml로유사한가스생산량을보였으나 0.5 mm의 MV 첨가의경 우가스생산량이 98.5 ml 로줄어든것을관찰하였다. 이로미루어보아 0.5 mm의 MV를첨 가한경우수소생산효소의활성이억제되는것을알수있다

107 [ 그림 55] MV 첨가에따른 C. tyrobutyricum ATCC 균주성장과가스생산비교

108 당소모에따른유기산생산패턴을보았을때 MV를넣지않은실험군의경우 g/l 의글루코오스를소모하여 4.91 g/l의부티르산과 1.25 g/l 의아세트산을생산하였다. MV를 0.25 mm 첨가한실험군의경우 14 g/l 의글루코오스를소모하였으며, 5.71 g/l의부티르산 을생산하였고아세트산은 0.27 g/l 만을생산하였다. 또한 MV를 0.5 mm 첨가한실험군의 경우 g/l의글루코오스를소모하였고 6.66 g/l 의부티르산을생산하였다. 흥미롭게도 0.5 mm의 MV를첨가한경우초기배지성분에포함되어있던아세트산을 1.06 g/l 이용한 것이관찰되었다. 아세트산및부티르산생산경향으로보았을때, 0.25 mm의 MV를첨가하여도수소생산 효소의활성을일부억제하여 C. tyrobutyricum 의대사시 NADH가추가적으로발생하여균 주가산화/ 환원전위를맞추기위해 NADH를소모하는생산물인부티르산의양이 0.8 g/l 증 가하였고, 이에반하여아세트산의생산량이대조군에비해 0.98 g/l 감소한것이관찰되었 다. 또한 0.5 mm의 MV 첨가시가스생산량에서도알수있듯이, 0.25 mm의 MV를첨가하 였을때보다수소생산효소의활성을더강력하게억제하여 NADH의공급이증가되고높아진 환원력으로인해이를배출하기위해아세트산을부티르산으로전환한것으로사료된다. 즉, 글루코오스의해당과정중공급된환원력과수소생산및부티르산생산으로배출되던환원력 의균형이, MV 첨가에의해수소생산으로배출되는환원력을차단됨으로써과잉의전자를 소모하기위하여아세트산이아세틸-CoA 로전환되고, 이는최종부티르산으로전환된것으로 사료된다. 따라서폐목재당화액에 MV 첨가는수소로배출되는환원력을보존함으로써, 아세트산의 소모를유도할수있고, 결국목적부티르산의선택도를높여생산수율을높일수있는한방 법이될수있다. 또한다른방법으로도배지내환원력을높이면, 폐목재당화액에서생산되 는부티르산의생산수율을높일수있음을시사하고있다

109 [ 그림 56] MV 첨가에따른 C. tyrobutyricum ATCC 균주의당소모및유기산생산

110 (2) 글리세롤첨가에의한부티르산생산수율향상 ( 가) 이론적 실험적접근방법 상기 Methyl viologen 첨가에의한부티르산생산수율향상 의연구결과에서, 추가적인 환원력을제공하는방법역시부티르산의생산수율을증가시킬수있는방법임을유추할수 있다. 추가적인환원력제공하는한방법으로는폐목재당화액내당보다높은환원성을보유 한탄소원을제공하는것이다. 대표적인고환원성을갖는탄소원으로는글리세롤 (C 3H 8O 3 ) 이있다. 글리세롤과글루코오스 의해당과정을비교해보았을때, 2분자의피루빈산염을생산할때글루코오스의경우 2분자 의 NADH가생산되는반면글리세롤의경우그 2배인 4분자의 NADH 가생산된다. 또한글리세롤은바이오디젤생산시부산물로서바이오디젤생산시발생하는비율이 10% 로상당히높다. 최근세계적으로바이오디젤의사용량이증가하고있으며, 국가별로바이 오디젤사용계획을발표함에따라, 향후바이오디젤의생산이더욱증가할것으로예상되어 부산물인글리세롤의공급과잉으로인한가격저하가발생되고있다. 국내역시대규모바이오 디젤생산기술은확보하였으므로, 다량의폐글리세롤이발생할것으로예상된다. [ 그림 57] 바이오디젤생산증가에의한글리세롤가격의하락

111 한편, 산업적인부티르산생산에있어서최종산물에대한단가를측정할때가장많은비 중을차지하는것은기질의가격이다. 본연구에서는기질의가격을낮추기위해폐목재를이 용하여기질로이용하고있으나, 당화후얻을수있는발효가능한당의농도는약 100 g/l 미만이다. 부티르산의이론수율은기질대비 50% 이므로, 더높은부티르산생산을위해저가 의보조탄소원을투입한다면좀더나은경제성을확보할수있을것으로사료된다. 석유자원고갈및유가상승등으로계속하여바이오디젤생산이늘어가고있는상황이기때문에글리세롤의생산역시도증가하고있고, 그로인해그가격이상당히떨어져있으므로, 본연구팀에서는버려지는폐자원인환원력이높은탄소원으로폐글리세롤을선택하여폐목재당화액에추가탄소원으로첨가함으로써부티르산의수율을높이고자하였다. 더나아가, 과잉의환원력은폐목재당화액내다량함유 ( 약 3~7 g/l) 된아세트산을부 티르산으로전환해줄수있으므로, 첨가하는글리세롤과당화액에포함된아세트산의비율이 맞으면, 모든아세트산을소모할수있을것이다. 따라서최고부티르산생산수율을획득하기 위하여글리세롤과아세트산비율을최적화하였다. [ 그림 58] 글리세롤첨가시 C. tyrobutyricum ATCC 25755의예상대사경로 한편, 폐글리세롤에는글리세롤뿐만아니라표와같이글리세롤뿐아니라불순물들이함께 존재한다

112 [ 표 16] 폐글리세롤의조성, (Appl Biochem Biotechnol, 2010, 161: ) 폐글리세롤은상기그중많은비중을차이하고있는 MONG은대부분장쇄지방산으로구 성되어있고, Clostridium 계열의발효에독성이있는것으로알려져있다. 본연구에서는폐 글리세롤의독성을제거하고자계면활성제를첨가하는방법과비누화를통해지방산을제거하 는전처리방법을이용하여독성제거효과를비교하였다. 계면활성제는묽은용액속에서계면에흡착하여그표면장력을감소시키는물질로표면활 성제라고도한다. 계면활성제는친유성과친수성의성질을모두가지고있고친유성은긴사슬 모양의알킬기, 카르복시기는친수성의성질을갖는다. 따라서계면활성제는용액내에서접합

113 체를형성하는데이를미셀(micelle) 이라고한다. 계면활성제농도가높아지면용액의계면은 계면활성제분자로완전히덮이며농도가더높아지면액체내부에도계면활성제의친유기끼 리뭉쳐서접합체를이루게되는데이것을미셀이라고한다. [ 그림 59] 계면활성제첨가에따른폐글리세롤의무독화전략 미셀의모양은농도가비교적낮은때는구상에가까우며, 농도가더욱높아지면층상이나 원통형의미셀을이루는것으로알려져있다. 그래서계면활성제의농도를미셀한계농도, critical micelle concentration 약자로 CMC 라고한다. 미셀은계면활성제의수십~ 수백개의 접합체로서구상, 층상, 봉상의여러가지형태를이루는것으로생각된다. CMC를전후로계 면활성제수용액의계면장력, 표면장력등이급격히변화한다. 따라서계면활성제의사용시 이특성을이용하여 CMC 이상에서사용하면효과적이다. 따라서, 본연구에서는상기와같은계면활성제의성질을이용하여소수성성질이강한장 쇄지방산과계면활성제간의소수성반응에의해폐글리세롤의독성이낮아질것을기대하고 진행하였다. 최종적으로실제폐목재당화액에폐글리세롤를첨가하여부티르산생산수율증진효과를 확인하였다. ( 나) 연구수행내용 우선 C. tyrobutyricum ATCC 25755이글리세롤을탄소원으로이용할수있는지관찰

114 하기위해총부피 1리터당 5 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ),0.5g의제2 인산칼 륨 (K 2 HPO 4 ),2g 의아세트산암모늄(ammonium acetate) 를포함하는배지에글루코오스와글 리세롤을각각 10 g/l 첨가하여균주의생육을관찰하였고, 최적농도비율을탐색하기위해 다양한비율( 글루코스 : 글리세롤 = 7.5 : 2.5, 5 : 5, 2.5 : 7.5) 로글루코오스와글리세롤을 첨가하여생육및부티르산생산을확인하였다. 이후 C. tyrobutyricum ATCC 25755가글리세롤을이용할때아세트산의이용여부를 확인하기위해아세트산의유무에따른발효패턴을비교하였다. 총부피 1리터당 15 g의글 루코스, 3 g 의글리세롤, 5 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ),0.5g의제2 인산칼 륨 (K 2 HPO 4 ) 을포함하는배지에각각 2g 의아세트산암모늄(ammonium acetate) 과 2.2g의 황산암모늄(ammonium sulfate) 를첨가하여균주의생육을비교하였다. 폐글리세롤의독성제거를위해계면활성제에의한 1 g/l의 Tween 80을첨가하였으며 폐글리세롤의첨가농도는 2, 4, 6 g/l 가되도록첨가하였다. 비누화에의한독성제거를위 해폐글리세롤과물을 1:3 의비율로섞은뒤, 6 N의 HCl을이용하여 ph를 4까지떨어뜨렸 다. 1시간가량반응후상층에있는비누화된지방산을제외한하층액을 6,000 rpm, 20 분 간원심분리하여하층액을이용하여실험을진행하였다. 전처리한글리세롤의첨가농도는 2, 4, 6 g/l 가되도록첨가하였다. 상기처리된글리세롤을첨가하여발효에사용한배지는상기 배지와동일한조성으로부피 1리터당 20 g 의글루코스, 5 g 의효모추출물, 0.2 g의황산 마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨 (KH 2PO 4 ),0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ),2g 의아세트산암모늄(ammonium acetate) 를포함 하는배지를사용하였다. 실제강산전처리/ 당화공정을거친폐목재당화액에폐글리세롤의첨가에의한부티르산 수율향상효과를검정하기위해서, 당화액을 1/4로희석한후부피 1 리터당, 5 g의효모추출 물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의황산암모늄(ammonium sulfate) 를첨가하고 0, 1.9, 2.3, 2.8, 3.7, 5.4 g/l의전처리한폐글리세롤을첨가하여발효 배지로이용하였다. 상기조제된배지들은초기 ph를 4 N 수산화칼륨(KOH) 으로 6.5 으로조정하였다. 회분식

115 배양(batch culture) 의경우, 60 ml 의시료병(serum bottle) 에 20 ml의배지를넣고미생 물을접종한후진탕배양기에서섭씨 37 의온도및 150 rpm의회전속도로 24시간배양 하였다. 배양을진행하면서배양시간에따라당, 아세트산및부티르산의농도를액체크로마 토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 를사용하여측정하였다. 미생물생장 은분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm 에서의흡광도로측정하였다. (3) 연구개발결과 글리세롤은상당히높게환원된형태의탄소원으로써대부분의절대혐기성균주들은이 를단일탄소원으로이용하지못한다. 하지만일부 1,3-프로판다이올을생산하는 Clostiridium 은이를단일탄소원으로이용할수있으므로, C. tyrobutyricum ATCC 도단일탄소원으로글리세롤을이용하는지와단일탄소원으로이용시높은환원력을제거하 기위해탄소원이부티르산이아닌생산물로흘러가는지를글루코오스와글리세롤의동시발 효에적합한농도를찾기이전에확인하였다

116 [ 그림 60] 글루코오스또는글리세롤을단일탄소원으로사용하였을때의발효패턴 10 g/l의글루코오스만을넣은경우 14시간만에 9.65 g/l의글루코오스를소모하여 0.77 g/l의아세트산과 3.39 g/l의부티르산을생산하였으나글리세롤을단일탄소원으로넣 은경우균주의성장이없었다. 이는 C. tyrobutyricum ATCC 25755가글리세롤을대사할 때상당히높은환원력을제거할수없기때문에발생하는결과이다. 상기언급한바와같이일부 Clostridium 균주는글리세롤을단일탄소원으로이용하여성 장할수있는데대부분의균주는 1,3- 프로판다이올을생산하는미생물이다. 1,3-프로판다이 올은글리세롤이해당과정을거치지않고 NADH를배출하는대사경로로생산되므로글리세 롤해당과정시발생하는고환원력의일부를낮출수있기때문에 1,3-프로판다이올을생산 하는 Clostridium 균주가글리세롤을단일탄소원으로이용할수있는것으로사료된다

117 글리세롤을단일탄소원으로이용하지못하더라도 C. acetobutyricum ATCC 824의경우 글루코오스와글리세롤이동시에존재할때두가지탄소원을동시에이용할수있다고보고 되었다. 본연구에서사용하는 C. tyrobutrycium ATCC 역시글루코스와글리세롤이 동시에존재할때글리세롤을이용하는지와동시이용시최적비율을알아보기위해다양한 농도비로실험을진행하였다. 다음은글루코오스와글리세롤을각각 7.5 : 2.5, 5 : 5, 2.5 : 7.5의비율로첨가하여 C. tyrobutyricum ATCC 성장을관찰한결과이다

118 [ 그림 61] 글루코스와글리세롤비율에따른 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효패턴비교

119 글리세롤이단일탄소원으로존재할때 C. tyrobutyricum ATCC 25755는글리세롤을이 용하지못하였으나, 글루코오스와함께있을때글리세롤을이용하는것이관찰되었다. 글루코 오스와글리세롤을 7.5:2.5 의비율로첨가한실험군의경우첨가한모든탄소원(7.31 g/l의 글루코오스와 2.32 g/l 의글리세롤) 을이용하였으며, 4.72 g/l 의부티르산을생산하였다. 글 리세롤의해당과정중발생하는 NADH를제거하기위해 0.95 g/l의아세트산을이용하여 부티르산으로전환하는것이관찰되었다. 글루코오스와글리세롤을 5:5의비율로첨가한실험 군의경우첨가한글루코오스(4.93 g/l) 는모두소모하였다. 그러나글리세롤은첨가한글루 코오스를모두소모한시점인 11시간까지 2.64 g/l를소모하다가이후부터이용되지못하는 것이관찰되었다. 이와동일하게글루코오스와글리세롤을 7.5:2.5의비율로첨가한실험군의 경우첨가한글루코오스(2.64 g/l) 가다소모된 8시간부터글리세롤의이용이멈추는것을 볼수있다. 상기결과를통해, C. tyrobutyricum ATCC 25755는글리세롤이용시반드시글루코 오스와같은다른탄수화물이필요하며, 글루코스와글리세롤의최적농도비는 7.5:2.5인것을 확인하였다. 또한, 글리세롤이용시발생되는높은환원력을없애기위해아세트산을부티르 산으로전환하는것을확인하였다. 이는글리세롤의해당과정에서발생하는많은양의 NADH 를제거하기위해아세트산을부티르산으로전환하는것으로사료되므로아세트산이없을때 글리세롤해당과정에서발생한고환원력을배출할수없을것으로예상되어실험을진행하였 다

120 [ 그림 62] C. tyrobutyricum ATCC 25755의글리세롤대사시아세트산이미치는영향

121 15 g/l의글루코오스와 3 g/l 의글리세롤이있는배지에서아세트산의유/ 무에따른 C. tyrobutyricum ATCC 의생육을관찰한결과, 아세트산이있는경우 18시간만에 g/l의글루코오스와 2.64 g/l의글리세롤을모두이용하여 8.17 g/l의부티르산을생 산하였다. 글리세롤은 12 시간안에모두소모되었으며, 글리세롤을이용한 12시간까지는첨가 한아세트산이함께소모되는것이관찰되었다. 또한글리세롤을다소모한 12시간이후부터 는아세트산이다시생산되는것을확인하였다. 아세트산이없는경우발효 48시간까지 6.28 g/l와 1.5 g/l의글리세롤만을이용하였고 2.35 g/l의부티르산만을생산하는것을확인하였 다. 아세트산의농도는초기생산한농도에비해크게증가또는감소하지않는것으로미루어 보아글루코오스를이용하여부티르산을생산함과동시에아세트산을함께생산하고글리세롤 이해당과정을거치는중에발생하는많은양의 NADH를생산한아세트산을부티르산으로전 환하는데이용하며제거한것으로추정된다. 효율적인 C. tyrobutyricum ATCC 25755의글 리세롤발효를위해서는외부에서환원력을받아줄수있는아세트산이필요한것으로사료된 다

122 [ 그림 63] C. tyrobutyricum ATCC 25755의글루코오스를단일탄소원으로이용시 아세트산이미치는영향 아세트산의유/ 무에따라 C. tyrobutyricum ATCC 25755이글루코오스를단일탄소원으 로이용할때생육에차이가있는지를관찰하였다. 아세트산이없는경우배양초기( 배양후 10 시간이내) 까지아세트산을넣은경우에비해성장이느리지만 24시간이내에두실험군 모두배지에포함된글루코오스를다이용하는것을확인하였다. 아세트산이있는경우 24시 간에 g/l의글루코오스를이용하여 1.3 g/l의아세트산과 4.95 g/l의부티르산을생 산하였고아세트산이없는경우도 24시간에 g/l의글루코오스를이용하여 1.54 g/l의 아세트산과 4.93 g/l 의부티르산을생산하였다

123 상기결과들로미루어보아 glycerol을이용하기위해서는반드시그대사과정에서생기는높 은환원력을제거해줄외부전자수용체(external electron acceptor) 가필요한것을확인하였다. 글리세롤을넣은경우 NADH 생산이높아져부티르산생산에도움을주는지를 NADH/NAD 비율로확인하기위해대사과정중 NADH를생산하지않는피루빈산염을탄소 원으로이용하여 C. tyrobutyricum ATCC 의발효패턴을조사하였다. [ 그림 64] 피루빈산염과글리세롤이용시 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효패턴 피루빈산염또는글루코오스를단일탄소원으로이용시 C. tyrobutyricum ATCC 의발효패턴을살펴보았을때, 글루코오스를단일탄소원으로이용한경우부티르산을 주로생산하는반면피루빈산을단일탄소원으로이용한경우발생하는 생산하는데 NADH 가필요없는아세트산을주로생산하는것이관찰되었다. NADH가없기때문에

124 글루코오스와글리세롤이함께있는배지와피루빈산염과글리세롤이함께있는배지에서 의 C. tyrobutyricum ATCC 의발효패턴을비교하였을때, 글루코오스와글리세롤이 함께있는경우 3.02 g/l의글루코오스와 1.62 g/l의글리세롤을이용하여 2.62 g/l의부티 르산을생산하였고배지에첨가한 1 g/l 의아세트산또한모두이용한것을확인하였다. 피루 빈산염과글리세롤이함께있는경우 2.26 g/l의피루빈산염과 2.44 g/l의글리세롤을이용 하여 2.71 g/l의부티르산을생산하였고글루코오스와글리세롤을이용할때에비해적은 0.56 g/l 의아세트산을이용하였다. 각각의배지에서발효패턴을관찰하며얻은시료를이용하여발효 7시간대에 NADH/NAD 의비율을확인하였다. 실제로부티르산의생산에도움을주었던글리세롤을첨가한실험군에 서그렇지않은실험군에비해높은 NADH/NAD 비율을갖는것이관찰되었다. [ 그림 65] 발효 7시간후 C. tyrobutyricum ATCC 25755에서의 NADH/NAD 비율의차이

125 [ 그림 66] 농도별아세트산소모를기준으로적정글리세롤첨가량에대한검량선 C. tyrobutyricum ATCC 25755이글리세롤을이용할때반드시아세트산이외부전자수 용체로필요하기때문에앞서구한글루코오스와글리세롤의최적농도비율인 7.5 g/l의글 루코오스와 2.5 g/l의글리세롤이함께존재하는배지에 0, 0.25, 0.5, 1, 2 g/l의아세트산 염을각각첨가하여발효패턴을확인하였다. 아세트산이없는경우상기결과와마찬가지로발효가진행되지않는것을다시한번확인 하였다 g/l의아세트산을첨가한경우아세트산이다소모되는 8시간까지만발효가원 활히이루어지며, 아세트산이다소모된이후에는부티르산생산이멈추는것을확인할수있 다. 0.5, 1 g/l 의아세트산을첨가한경우에서도동일하게보여진다. 모든실험군에서아세트 산을다소모하고글리세롤이남아있는경우, C. tyrobutyricum ATCC 25755은글루코오스 와글리세롤을이용하지않는것이확인되었다. 2 g/l의아세트산을첨가한경우모든글리세 롤(3.16 g/l) 을이용할때까지아세트산이소량남아있으므로글루코오스와글리세롤의이용 이 7.35 g/l와 3.16 g/l로가장높았고부티르산의생산도 6.06 g/l로다른실험군에비해 많은것을확인하였다. 상기결과들을바탕으로당화액내에포함된아세트산의농도를확인하고그에적합한글 리세롤을넣기위해아세트산의소모농도대비글리세롤의소모농도에대한검량선을만들었 을때신뢰가능한값 (R 2 =0.998) 을보이는것을관찰하였다. 본연구를통해계산된값을적 용하여추후당화액에적용하고자한다

126 [ 그림 67] 아세트산첨가농도에따른 C. tyrobutyricum ATCC 25755의글루코스와글리세롤을포함한배지에서의부티르산생산에대한비교 무독화과정에앞서폐글리세롤의독성을확인하기위해전처리하지않은폐글리세롤을 0, 2, 4, 6 g/l 첨가하여 C. tyrobutyricum ATCC 25755의성장및부티르산의생산을확인하 였다. 균주의성장은생산하는가스로확인을하였는데하기그림과같이 2 g/l의폐글리세롤 을첨한경우대조군에비하여큰저해를받지않지만 4 g/l와 6 g/l 첨가한경우그독성이 높아지는것을확인할수있다. 발생하는부티르산은 15 g/l의글루코오스를동일하게넣어

127 준배지에추가로폐글리세롤을첨가하였기때문에 2 g/l의폐글리세롤을첨가한경우 6.6 g/l의부티르산을생산하여 5.44 g/l의부티르산을생산한대조군에비해높은생산량을보 이는것을확인하였다. 4 g/l와 6 g/l의폐글리세롤을넣은실험군에서각각 4.64 g/l와 3.53 g/l의부티르산이생산되는것으로보아폐글리세롤은 4 g/l만존재하여도균주의성장 뿐만아니라부티르산생산에영향을주는것을확인하였다. [ 그림 68] 폐글리세롤의 C. tyrobutyricum ATCC 25755에대한독성확인 2 g/l 의폐글리세롤이함유된배지에서의계면활성제첨가유/ 무에따른발효패턴을비교 해보았을때, 최종부티르산생산농도는대조군의경우 6.57 g/l의부티르산을생산하였고 Tween 80을첨가한경우 6.45 g/l 의부티르산을생산한것을확인하였다

128 [ 그림 69] 계면활성제첨가에의한폐글리세롤의무독화효과 2 g/l 의폐글리세롤은상기에서언급한바와같이독성이크지않기때문에계면활성제첨 가로무독화되는경향을보기어려운것으로사료된다. 4 g/l의폐글리세롤이함유된배지에 서의경우, 최종부티르산생산농도가대조군에서 5.33 g/l와계면활성제첨가한경우 5.34 g/l로동일하였지만 11시간대에부티르산생산농도를확인한결과 2.08 g/l에서 3.85 g/l 로증가하는것을관찰하였다. 이는 11 시간대이후에첨가된아세트산을모두소모하여산화/

129 환원전위가맞지않기때문으로 2 g/l의폐글리세롤을넣은경우 11시간대의부티르산생산 량인 3.77 g/l와비교했을때차이가없는것으로보아계면활성제에의해그독성이제거되 었음을알수있다. 6 g/l 의폐글리세롤이함유된배지에서의경우, 최종부티르산의농도는 5.04 g/l( 대조군) 와 5.39 g/l(6 g/l 폐글리세롤) 로유사하였으나, 11시간발효한시료에서 1.11 g/l( 대조군) 와 3.21 g/l(6 g/l 폐글리세롤) 로큰차이를보이는것을관찰하였다. 상기결과로미루어보아계면활성제의첨가는폐글리세롤의독성을충분히제거하는방법 으로별다른공정없이발효시단순히첨가만해주면되기때문에산업적으로유용하게사용 될것으로사료된다. 비누화반응을통한폐글리세롤전처리는가장널리사용되는방법으로효과적으로폐글리 세롤내에발효저해물질들을제거할수있다. 상기에언급한방법으로전처리한폐글리세롤을 각각 0, 2, 4, 6 g/l 를첨가하여균주의성장과부티르산의생산정도를확인하였다

130 [ 그림 70] 비누화전처리방법을통한폐글리세롤의무독화 각각의농도로전처리한폐글리세롤을첨가한배지에 C. tyrobutyricum ATCC 25755을 접종하여 24 시간동안배양하며대조군과비교하였다. 대조군의경우 11시간대에균주의생장 이 OD600을기준으로 7.3이었고전처리한폐글리세롤을각각 2, 4, 6 g/l 첨가한경우각각 7.04, 7.1, 7.31 로유사한것으로보아비누화전처리방법은폐글리세롤의독성을강력하게 제독하는방법임을확인하였다. 발효종료시점으로비교하였을때, 대조군의경우균주의성장 이 9.85 OD600이었고 13.4 g/l의글루코오스를이용하여 0.99 g/l의아세트산과 4.82 g/l 의부티르산을생산하였다. 전처리한폐글리세롤을첨가한경우첨가한모든아세트산을소모 하였으며, 2, 4, 6 g/l의폐글리세롤을첨가하였을때부티르산의농도가 6.54, 7.41, 6.26 g/l 를각각생산하는것을확인하였다. 6 g/l의전처리한폐글리세롤을첨가한경우최종부티르산생산농도가낮은것은글리세롤이다소모되기이전에아세트산이모두소모되어일

131 어나는현상으로사료된다. 상기두방법을비교하였을때, 계면활성제처리방법에비해비누화전처리방법을거친 폐글리세롤에서독성이많이제거되어추후의연구에서는비누화전처리한폐글리세롤을이용 하여실험하고자한다. 폐목재당화액에는고농도의당이포함되어있기때문에회분식배양을통해모든당을이 용할수없으므로 1/4 로희석하여배지조성첨가후발효를진행하였다. 전처리한폐글리세롤 을다양한농도로첨가하여폐당화액발효시수율이향상되는지여부와적당한농도의전처 리한폐글리세롤의첨가량을조사하였다. [ 그림 71] 폐목재당화액에폐글리세롤을첨가한배지에서의부티르산생산패턴

132 다양한농도의전처리한폐글리세롤을첨가한결과 12 시간대에서의균주성장(OD600) 이 대조군인 6.05와비교하여 6.39, 6.13, 6.11, 6.47, 6.5로폐목재당화액에폐글리세롤을첨 가하여도균주의성장에저해를받지않는것을관찰하였다. 폐목재당화액에서역시합성배지에서와마찬가지로당화액에포함된아세트산이외부전 자수용체역할을하기때문에 3.7 g/l의폐글리세롤첨가부터당화액내의아세트산이모자라 발효후반대인 24시간부터글루코오스의소모및부티르산의생산이원활하게진행되지않는 것을확인하였다. 2.8 g/l 의폐글리세롤을첨가한경우아세트산을추가적으로생산하지않으면서당화액에 포함된글루코오스를모두소모하는것을관찰하였고 g/l의글루코오스와 4.44 g/l의 자일로스를이용하여 g/l 의부티르산을생산하였다. 첨가한글리세롤역시모두소모하 였으며추가적으로당화액에포함된아세트산을 0.38 g/l 소모한것을확인하였다. [ 그림 72] 합성배지, 실제폐목재당화액, 실제폐목재당화액에폐글리세롤을첨가한실험군 간의수율비교 최종적으로글루코오스만을포함한합성배지, 글루코오스와자일로스를포함한합성배지, 실제폐목재당화액, 실제폐목재당화액에폐글리세롤을첨가한배지에서생산되는부티르산 의생산수율을비교한결과, 글루코오스만을포함한합성배지에서의생산수율은상기에서보 여준바와같이 0.35 g/g 수준이었으나, 글루코오스와자일로스를포함한합성배지및실제 폐목재당화액으로부터생산된부티르산의생산수율은 0.36 g/g과 0.37 g/g으로글루코오스 만을포함한합성배지와큰차이를보이지않았다. 반면폐목재당화액에폐글리세롤을첨가하 여발효동안생산되는아세트산과폐목재당화액에포함되어있는아세트산을을모두부티

133 르산으로전환하면, 거의이론수율과동일한 0.5 g/g ( 글루코오스로부터생산되는부티르산의 이론수율 g/g) 의생산수율로부티르산을생산하였다. 이수치는 6탄당발효대비 150% 및모델당화액대비 139% 에달하는부티르산생산수율이다

134 2. 혼합당동시발효유기산생산최적상업화균주확보 목질계바이오매스는셀룰로오스(cellulose), 헤미셀룰로오스(hemicellulose), 리그닌 (lignin) 등으로구성된리그노셀룰로오스(lignocellulose) 이다. 셀룰로오스는 6탄당인글루코오스가 ß-1,4 결합으로연결된선형의중합체가상호간에 수소결합을형성하고있으며, 헤미셀룰로오스는주로 5 탄당인자일로스(xylose) 의중합체이 나, 일부 5 탄당인아리비노오스(arabinose) 나 6 탄당인만노오스(mannose), 갈락토오스 (galactose), 글루코오스등도포함되어있다. 따라서목질계바이오매스의당화액(hydrolysate) 내단당류의조성과함량은수종과수령 및당화방법에따라다를수있지만, 일반적으로글루코오스와자일로스가주를이룬다. [ 그림 73] 목질계바이오매스의조성및함량 (Biotechnol. For Biofuels, 2008, 1:7) 한편, 본과제개발을위하여사용된 C. tyrobutyricum ATCC 25755는글루코오스와자 일로스각각을기질로이용하여높은수율( 최대 0.43 g/g) 과생산량(42 g/l) 으로부티르산을 생산할수있음이많은연구에서보고된바있다

135 [ 그림 74] 글루코오스및자일로스를기질로한 C. tyrobutyricum ATCC 25755의부티르산발효경로 그러나, 폐목재당화액과같이글루코오스와자일로스가혼합된기질을발효에사용할경 우, 많은미생물들은자기가선호하는당을대사하는동안에는다른당은이용하지않는다. 이 러한현상은선호당의대사산물( 이화물, catabolite) 이다른당의대사를억제하기때문이며, 탄소이화물억제 (Carbon Catabolite Repression, CCR) 라고불린다. 일반적으로많은 미생물들이혼합당(mixed sugar) 중에서글루코오스를가장선호하므로, 이러한기작을 glucose repression' 또는 glucose effect' 라고도한다. 결과적으로글루코오스와자일로 스가혼합된폐목재당화액을발효하면, 낮은생산성(productivity (g/l/h), 시간당생산되는 발효산물의농도) 으로발효산물이생산된다. 또한경우에따라자일로스의대사가지속적으로 억제되면, 자일로스가완전히이용되지못한상태에서발효가종료되는경우도있으며, 이러한 경우낮은생산수율 (yield (g/g), 발효에투입된기질당생성되는발효산물의량) 을보인 다. 따라서 CCR 기작이존재하는미생물은폐목재당화액과같은혼합당을발효하기위한산 업미생물로는적합하지않다. 아래의그림은전형적인글루코오스에의한자일로스대사의억제기작을보여주고있다

136 [ 그림 75] 글루코오스에의한자일로스이용저해의예 (Microbiology, 2009, 155:1351) 그림에서보는바와같이발효초기빠른글루코오스대사에기인하여발효산물또한빠른 속도로생산되는반면, 자일로스는글루코오스가대사되는동안거의이용되지않고, 글루코오 스의고갈후에도글루코오스의대사산물이지속적으로자일로스의이용을억제하기때문에, 자일로스대사에의한발효산물생산속도는매우느림을알수있다. 한편, 본과제개발에이용한 C. tyrobutyricum ATCC 25755는자일로스이용속도가글루코오스의이용속도에비해느리기는하지만, 글루코오스와자일로스를동시(simultaneous) 에이용할수있다고기존의많은연구에서보고되었다. 그러나본연구그룹에서수행된원천 기술개발결과에의하면, 기존의연구결과들처럼 C. tyrobutyricum ATCC 25755는글루코 오스를이용하는동안소량의자일로스를동시에이용하기는하지만, 글루코오스를완전히이 용한후에는 CCR 기작이존재하는미생물들처럼발효산물이이중적으로생산(dauxic production) 되는양상을보였다. 아래그림은글루코오스와자일로스를각기다른비율로혼합한배지에서 C. tyrobutyricum ATCC 에의해생산되는부티르산의생산양상을보여주는그림이다

137 [ 그림 76] C. tyrobutyricum ATCC 25755의완화된 CCR 기작 ( 원천기술개발연구결과) 그림에서보듯이, 글루코오스고갈후에일정기간부티르산의생산속도가느려졌다가(lag) 다시빨라지는전형적인이중적생산양산을보인다. C. tyrobutyricum ATCC 가 소 량의자일로스를글루코오스와동시에이용하기는하지만, 글루코오스고갈후부티르산생산 의지체기를보이는원인 은, 선호하는글루코오스가자일로스이용을어느정도억제하기는 하지만, 완전히억제하지못하는어느정도완화된 CCR이존재하기때문으로원천기술개발 과정동안밝혔다. 한편혼합당내글루코오스가더높은농도로포함된배지에서, 글루코오스고갈후자일로 스의대사가더욱억제됨을볼수있다. 따라서폐목재당화액과같이글루코오스/ 자일로스의 비가 3/1 인경우자일로스를완전히소모하는데매우오랜시간이소요된다. 따라서 C. tyrobutyricum ATCC 가부티르산의산업적생산에이용되기위해서는, 글루코오스와자 일로스를같은속도로소모하게하여, 글루코오스고갈후형성되는지체기가존재하지않도록 개량될필요가있다. 가. 혼합당동시발효유기산생산균주스크리닝 (1) 이론적 실험적접근방법 글루코오스와자일로스를같은속도로소모하여글루코오스의고갈후형성되는지체기가 존재하지않는 C. tyrobutyricum ATCC 의돌연변이를개발을위하여, C. tyrobutyricum ATCC 의기질로는이용되지않으나 (non-metabolizable) 글루코오스

138 같이자일로스이용을억제할수있도록글루코오스의아날로그(analogue) 인 2-deoxy-D-glucose (2DG) 와 C. tyrobutyricum ATCC 25755가기질로이용할수있도 록자일로스를혼합한배지에서 C. tyrobutyricum ATCC 을적응시키는 적응배양 시스템(adaptive cultivation system) 을원천기술개발과정동안개발하였다. C. tyrobutyricum ATCC 25755의 CCR 기작을없애기위해본시스템을이용할경우, 기존의 적응배양시스템에비해시간과비용을절감할수있으며, 조작이간단하다는장점이있었다. 그러나본시스템을통하여개발된글루코오스와자일로스를같은속도로소모하여글루코오 스의고갈후형성되는지체기가없는돌연변이를글루코오스가존재하는배지에서장시간배 양할경우, 각각의당소모속도가원래모균주(parental strain) 의소모속도로회복 (regeneration) 되는것이관찰되었다. [ 그림 77] 적응배양시스템 을통하여개발된포도당자일로스동시소모 C. tyrobutyricum ATCC 의돌연변이및그표현형질의회복 ( 원천기술개발연구결과) 이는개발된균주의유전형질(genotype) 이안정하게유지되지않거나, 획득된당소모표 현형(phenotype) 이유전적변이에의한것이아니라생리학적적응(physiological adaptation) 에의한것임을의미한다. 물론개발된적응배양시스템을이용하여글루코오스와 자일로스를같은속도로이용하여글루코오스의고갈후형성되는지체기가존재하지않는 C. tyrobutyricum ATCC 의돌연변이를쉽게다시획득할수있지만, 농축배양과같이 한번발효에이용한균체를또다른배치(batch) 에이용할수있도록유전형질을보다안정되 게유지할필요가있다. 따라서, 본실용화연구에서는화학돌연변이원(chemical mutagen) 의일종인

139 N-methyl-N'-nitro-N -nitrosoguanidine (MNNG) 를이용하여 C. tyrobutyricum ATCC 를연속적으로무작위돌연변이(random mutation) 시킨후모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 보다빠른시간에글루코오스와자일로스의혼합당을발효할 수있는유전형질이보다안정되게유지된돌연변이를선별하고자하였다. MNNG는염색체 (chromosome) 의다양한위치에서점돌연변이(point mutation) 를유발하므로산업체에서 균주개량을위해널리이용되고있는방법이다. [ 그림 78] MNNG 에의한돌연변이기작 (Microbiology, 5/e by L. Prescott et al., Life Science Publishing Co.) 본실용화연구의조건에서 C. tyrobutyricum ATCC 25755를 MNNG로무작위돌연변 이시켰을경우, 약 10 3 cells/ml 의세포가생존함을알았다. 따라서돌연변이수행후대량 의세포 (10 3 cells/ml) 중에서모균주보다빠른시간에혼합당을발효할수있는돌연변이만 을선별해내기위해서는, 단시간에대량의세포(10 3 cells/ml) 중에서돌연변이균주만을시 각적으로스크리닝(screening) 할수있는 High Throughput Screening(HTS)' 기법의확 립이선행되어야했다. 글루코오스가포함된혼합당을동시에이용할수있는돌연변이균주를선별하는기존의 가장일반적인방법은, 상기에서언급한 2DG 와글루코오스에의해이용이저해되는당( 이경 우는자일로스) 을혼합한한천배지(agar plate) 에모균주를도말한후생장하는돌연변이를 선별하는것이다. 글루코오스에의한 CCR이존재하는미생물의경우 2DG 가존재하면, 이용 할수있는다른당이존재하더라도 2DG에의해그당의이용이저해를받기때문에생장할

140 수없다. 따라서 2DG를이용하는방법은 CCR 기작을유발하는유전자에돌연변이가발생하 여글루코오스를포함한혼합당을동시에이용할수있는돌연변이를선별하는매우유용한 방법이다. [ 그림 79] 2DG 기반 C6/C5 동시발효미생물 HTS 기법모델 즉, 돌연변이유발후 2DG 와자일로스가혼합된배지에도말하면, 자일로스대사에대한 글루코오스억제가완화된돌연변이는생장이가능하지만, 글루코오스억제가그대로유지된 모균주는생장이불가능하다. 그러나자일로스대사에대한글루코오스억제가어느정도완화된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의경우는 2DG 가첨가된배지에서도자일로스를이용할수있기때문에, 글루 코오스에의한자일로스대사억제기작이완전히완화된돌연변이를스크리닝하는데적합하 지않음을본연구기간동안알수있었다

141 [ 그림 80] 2DG 기반 C5/C6 동시발효 C. tyrobutyricum 돌연변이스크리닝방법의 단점 따라서 2DG를이용한 HTS 기법대신글루코오스와자일로스를같은속도로이용할수있 는돌연변이균주를선별할수있는새로운 HTS 기법의개발이요구되었다. 이후개발한신규 HTS 기법을통하여혼합당을동시에이용할수있는돌연변이를스크리닝하고자하였다. 이상을요약하면화학돌연변이원(chemical mutagen) 의일종인 N-methyl-N'-nitro-N -nitrosoguanidine(mnng) 를이용하여, 우선 CCR이존재하는야생 균주(wild type strain) 인 C. tyrobutyricum ATCC 를무작위돌연변이(random mutation) 시킨후모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 보다빠른시간에글루코오스와 자일로스의혼합당을발효할수있는돌연변이를상기개발한 HTS 기법을통하여 1차선별 하였다. 이후 1차선별된혼합당동시이용돌연변이를보다빠르게혼합당을소모하며유전형 질이보다안정되게유지된부티르산을생산할수있는균주로개량하기위하여, 1차돌연변 이를 MNNG 로동일한방법으로재차무작위돌연변이시킨후, 1차돌연변이보다빠르게혼 합당을소모하여부티르산을생산할수있는유전형질이보다안정되게유지된 2차돌연변이 를상기개발한 HTS 기법을통하여선별하였다

142 [ 그림 81] 무작위돌연변이에의한혼합당동시이용균주의지속적개량모식도 이후최종선별된혼합당을동시에이용할수있는돌연변이들의발효및보존기간중오 염으로부터안정적으로유지하기위하여, 형질전환가능한플라스미드(plasmid) 로항생제내 성을부여하였다. ( 나) 연구수행내용 자일로스이성질화효소를발현하기위하여 C. ljungdahlii, C. tyrobutyricum, Bacillus subtilis, Lactobacillus brevis, E. coli 의 xyla 유전자를플라스미드 pqe-80l에클로닝 (cloning) 후자일로스이성질화효소를암호화하고있는 xyla 유전자가녹-아웃 (knock-out) 된대장균(E. coli JW ) 에형질전환(transformation) 하였다. xyla 유전 자는 forward primer 자리에제한효소(restriction enzyme) BamHI 서열을, reverse primer자리에 HindIII 자리를각각추가한 primer로각미생물의 genome을주형으로 PCR 증폭하여획득하였다

143 [ 그림 82] 각종미생물의 xyla 유전자로형질전환된대장균 xyla 유전자가형질전환된 E. coli JW (pQE80L-xylA) 의자일로스이성질화효 소를발현은 LB배지에접종후 18 에서 OD600=0.3일때 IPTG의농도가 0.1~1 mm이되 도록첨가하여효소의발현이유도(induction) 되도록하였다. 자일로스이성질화효소의발현 의여부는, 배양한 E. coli JW (pQE80L-xylA) 와 E. coli JW (pQE80L) 를 원심분리하여획득한세포를 1 mm MnCl 2 가첨가된 100 mm sodium acetate 완충용액에 부유(suspension) 시킨후초음파파쇄기(sonicator) 를이용하여파쇄하고원심분리하여얻은 상층액(supernatant) 들의효소활성(enzyme activity) 과 SDS-PAGE 결과를비교하여확인 하였다. E. coli JW (pQE80L-xylA) 에형질전환된자일로스이성질화효소의정제는상 기상층액을 His-taq 정제킷트를이용하여정제하였다. 정제의여부는 SDS-PAGE를통하 여확인하였다. 정제된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스이성질화효소의기질 특이성은글루코오스와자일로스각각을기질로반응시킨후시스테인-카바졸방법으로발색 시켜판단하였다. 모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755의콜로니를동량의글루코오스와자일로스를 함유한 96 well micro-titer plate에배양하여발효종료후글루코오스가완전히소모되는 동안자일로스는거의소모되지않는완충능력을조사하기위하여, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate), 각각 7.5 g/l의 글루코오스와자일로스를첨가한배지에 potassium phosphate 완충용액을 1 mm 간격으로 최종농도가 6 mm이되도록각각첨가한배지를 96 well micro-titer plate에가각분주후 C. tyrobutyricum ATCC 25755를접종하여 37 에서혐기배양하였다. 발효가종료된후각 시료의상층액 10%(V/V) 를채취한후상기에서획득한자일로스이성질화효소로 37 에서

144 20분간반응후시스테인- 카바졸법으로발색시켜자일로스잔류여부를판단하였다. 96 well micro-titer plate 에콜로니의접종량에따른자일로스소모여부를판단하기 위하여 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 2g의아세트산나트륨 (sodium acetate), 각각 7.5 g/l 의글루코오스와자일로스, potassium phosphate 완충용액 이최종 2.4 mm이되도록첨가한배지를 96 well micro-titer plate에분주후 OD600이 0.1의간격이되도록 C. tyrobutyricum ATCC 25755를접종하여 37 에서혐기배양하였다. 발효가종료된후각시료의상층액 10%(V/V) 를채취한후상기에서획득한자일로스이성 질화효소로 37 에서 20분간반응후시스테인-카바졸법으로발색시켜자일로스잔류여부 를판단하였다. 이후글루코오스와자일로스가완전히소모되도록리터당 1 g 의효모추출물, 0.2 g의황 산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼 륨 (KH 2PO 4 ),0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate), 각각 7.5 g/l의글루코오스와자일로스를첨가한배지에 100 mm의 MES를추가하여완충력을높 인액체배지에 C. tyrobutyricum ATCC 를배양하면서, 일정한시간간격으로시료를 채취하여상기에서확립된기질로써효소반응에이용할배양액의양을첨가하고 HTS 기법을 통한자일로스농도와 HPLC를통하여분석한자일로스농도를비교분석하여개발한방법의 실효성을규명하였다. 미생물생장및시스테인- 카바졸방법의발색은분광광도계(UVmini-1240, SHIMAZU) 로각각 540 nm와 600 nm 에서의흡광도를측정하였다. 글루코오스그리고자일로스의농도 를측정하기위한액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 는 Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 을사용하여분석하였다. 안정된유전형질을가진혼합당동시발효균주를확보하기우하여 이시킨후선별된돌연변이를 MNNG로무작위돌연변 MNNG로재차돌연변이시키는반복돌연변이과정을수행하였 다. 돌연변이조건은리터당 1 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼 륨 (K 2 HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate), 15 g/l의글루코오스를첨가한배지에 모균주를접종하여 37 에서 8 시간혐기배양하여지수기(exponential phase; OD600=2.0) 에도달하였을때 MNNG를최종농도 25 ug/ml이되도록첨가한후 20분동안추가배양하 였다. 이후 1 ml를채취하여 0.8% NaCl로 3번씻어낸후상기동일한조성의한천배지에

145 도말하여 37 에서혐기배양하였다. 이후형성된콜로니들을상기 HTS 기법에서확립된액체 배지를분주한 96 well micro-titer plate 에접종하고, 약 48시간배양하여모든콜로니들이 완전히발효를종료하도록하였다. 이후상층액을취하여 96 well micro-titer plate에분주 한후상기획득한자일로스이성질화효소로 20분반응시킨후시스테인-카바졸법으로발 색시켜돌연변이균주를선별하였다. 선별된돌연변이균주의콜로니를다시리터당 1 g의효 모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g의염화나트 륨, 0.5 g의 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ), 2g의아세트산 나트륨(sodium acetate), 각각 7.5 g/l의글루코오스와자일로스를첨가한배지에 100 mm 의 MES를추가하여완충력을높인액체배지에접종하여 HPLC로당소모경향을분석하여 최종돌연변이여부를판단하였다. 획득한 C. tyrobutyricum 돌연변이들에항생제내성을부여방법은아래그림과같다. [ 그림 83] 돌연변이에항생제내성형질부여개요도 간단히요약하면, 야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755을사멸시킬수있는항 생제(Erythromycin) 와그농도(10 ug/ml 간격으로 100 ug/ml 까지) 를일차스크리닝하고, 형질전환가능한플라스미드(pMTL) 를이차스크리닝하였다. 이때항생제내성유전자를포함 한플라시미드가 C. tyrobutyricum 야생형균주(ATCC 25755) 및야생형균주유래돌연변 이들의세포질에존재하는 endonuclease에의해분해되는것을막기위하여항생제내성유 전자를포함한플라시미드를특정대장균을이용하여 methylation시킨후 C. tyrobutyricum 의 protoplast cured extract 에노출시켜분해되지않음을확인하였다. 이후형질전환과정은 electroporation 과정을통하여수행하였다. 형질전환여부는 PCR을통하여 erythromycin 내 성유전자의존재여부로확인하였다

146 ( 다) 연구개발결과 신규 HTS 기법은 C. tyrobutyricum ATCC 25755를동량의글루코오스와자일로스를 첨가하고, 두당이완전히소모되지못하는완충능력(buffering capacity) 을가진배지에서 ph 를조절하지않고배양하면자일로스가완전히소모되지못한상태에서발효가종료된다는 원천기술개발의결과를이용하였다. 자일로스가완전히소모되지못한상태에서발효가종료되는이유는다음과같다. [ 그림 84] ph 감소에의한 C. tyrobutyricum ATCC 25755의발효종료원리및혼합당 소모경향 (Microbiology, 2009, 74: , 원천기술개발연구결과) C. tyrobutyricum ATCC 25755가글루코오스와자일로스를동시에발효하는동안생산 하는유기산(organic acid) 인아세트산(acetic acid) 및부티르산(butyric acid) 은해리된상 태(dissociated) 로세포질(cytoplasm) 밖으로배출되고, 함께생산되는바이오가스(biogas) 인이산화탄소 (CO 2 ) 에의해세포주위환경의 ph가두유기산의 pka값보다낮아지면두유 기산은다시해리되지않은상태(undissociated) 가되어세포막을통과하여다시세포질로들 어가게된다. 들어간해리되지않은상태의지방산은세포질내부의 ph가두지방산의 pka 값보다높기때문에다시해리되면서세포질의 ph 를떨어뜨려포자형성(sporulation) 을유도

147 한다. 따라서 C. tyrobutyricum ATCC 25755를동량의글루코오스와자일로스를혼합하고 두당이완전히소모되지못하는완충능력(buffering capacity) 을가진배지에서 ph를조절하 지않고배양하면자일로스에비해글루코오스의소모속도가더빠르기때문에글루코오스로 부터생산된유기산에의해포자형성이유도되어자일로스는완전히소모되지못하고발효가 종료된다. 따라서만약글루코오스와자일로스를같은속도로이용할수있는돌연변이를배양하면, 발효종료후잔류된자일로스의농도는모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755를배양했 을때보다낮을것이다. 따라서발효종료후자일로스의농도만측정하면발효균주의글루코 오스와자일로스의동시이용여부를알수있을것이라생각하였다. 한편상기에서언급하였듯이돌연변이를유발하기위하여 MNNG를처리한후생존한세포 의수는 10 3 cells/ml 이다. 따라서 MNNG 처리후형성된거의모든콜로니들의발효종료 후자일로스의농도를가장일반적인방법인 HPLC로측정하는것은너무많은시간이소요 되는단점이있다. 따라서발색반응을통하여시각적으로 96 well micro-titer plate에서자 일로스농도만을측정할수있는방법을개발하였다. 문헌조사결과자일로스농도를발색으로측정할수있는방법은없었다. 그러나자일로스 의구조이성질체(constitutional isomer) 인자일룰로스(xylulose) 의농도는발색으로측정할 수있는방법이존재하였다. 가장일반적으로사용되는방법은 시스테인-카바졸 (cysteine-carbazole) (J. Biol. Chem. (1951) 192: ) 법으로, 자일룰로스와같 은케토당(ketose) 을포함한시료에시스테인및카바졸과황산을첨가하여반응시키면보라 색으로발색된다. 이후 540 nm에서측정된발색정도를표준물질의검량선과비교함으로써 시료내케도당의농도를예측할수있다. 글루코오스및자일로스와같이화학구조에알데하 이드(aldehyde) 기를가지고있는당(sugar) 을알도당(aldose) 라고하고, 각각의구조이성 질체인프럭토스(fructose) 및자일룰로스는케톤(ketone) 기를가지고있기때문에케토당 이라한다. 다음은글루코오스및자일로스와, 그구조이성질체인프럭토스와자일룰로스의표준물질을 시스테인- 카바졸법으로발색을유도한그림이다

148 [ 그림 85] 알도당및케토당의농도에따른시스테인-카바졸법에의한발색정도 그림에서볼수있듯이, 알도당중글루코오스는농도에따라전혀발색되지않는반면, 자 일로스는농도가높아짐에따라약하게발색되었다. 그러나이들각각의이성질체인동일농도 의프럭토스와자일룰로스는각농도에따라확연한발색의차이를보였으며, 540 nm에서측 정된발색도도일정하게증가됨을확인할수있었다. 그림에서 540 nm에서측정된발색도가 2.5 에서일정한것은분광광도계(spetrophotometer) 검출기의 spectrometric limitation 때 문이다. 한편알도당인자일로스는 자일로스이성질화효소(xylose isomerase) 에의해케토당 인자일룰로스로전환이가능하므로, 시스테인-카바졸법은자일로스이성질화효소의활성 (enzyme activity) 측정에널리이용되고있다. 따라서시료에포함된자일로스의농도는자 일로스이성질화효소를이용하여자일로스를자일룰로스로전환시킨후, 전환된자일룰로스를 시스테인- 카바졸법으로발색시킴으로써자일로스의농도를간접적으로알수있다. 따라서상

149 기에서언급하였듯이글루코오스와자일로스를같은속도로이용할수있는돌연변이를배양하면, 발효종료후배양액내잔류된자일로스의농도가모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 를배양했을때보다낮을것이므로, 각각의시료를자일로스이성질화효소로반응시 킨후시스테인-카바졸법으로발색시키면돌연변이를배양한시료는모균주를배양한시료보다옅은보라색을나타낼것이다. 따라서다음과같이 혼합당동시이용돌연변이선별을위한 HTS 기법의모식도 를완 성하였다. [ 그림 86] 돌연변이선별을위한 HTS 기법의모식도 효소는특이적이고(specific), 재현성이높으며(reproducible), 민감하고 (sensitive), 반응

150 성이높기때문에(rapid) 분석목적에적합하다. 효소의높은특이성과민감성때문에분석하고 자하는시료를거의변형없이그대로분석이가능하다. 따라서시그마(Sigma-Aldrich, Inc.) 등에서글루코오스와프럭토스등의농도를효소반응후발색에의해측정할수있는 분석킷트(assay kit) 를산업적으로생산판매하고있으나, 자일로스농도를효소반응후발 색에의해분석할수있는분석킷트는없었다. 또한현재까지알려진자일로스이성질화효소 는글루코오스도기질로이용하여프럭토스로전환이가능한것으로알려져있다. 로스이성질화효소는글루코오스이성질화효소(synonym) 또는 따라서자일 D-xylose aldose-ketose-isomerase (systematic name) 로도불린다. 이는글루코오스와자일로스를 혼합한배양액에서자일로스의농도만을측정하기위해기존의자일로스이성질화효소를이 용하여자일로스를자일룰로스로전환하고자할경우, 글루코오스도프럭토스로전환되기때문 에, 상기시스테인-카바졸방법은프럭토스및자일룰로스등의모든케토당을발색시키므로 글루코오스와자일로스를혼합한배양액에서자일로스의농도만을측정하는것은불가능하다. 따라서본연구에서는글루코오스와자일로스를혼합한배양액에서자일로스에만반응하는기 질특이성(substrate specificity) 높은자일로스이성질화효소를먼저선별하였다. 본연구에서는 C. ljungdahlii, C. tyrobutyricum, Bacillus subtilis, Lactobacillus brevis, E. coli의유래자일로스이성질화효소를 E. coli에서발현한후 His-tag 정제하여사용하 였다. 먼저이효소들의기질특이성을확인해본결과, 그유래에관계없이자일로스에비해 글루코오스에대한기질특이성은매우낮은것으로판명되었다. [ 그림 87] 다양한미생물유래자일로스이성질화효소의기질특이성

151 그러나본연구에서사용한자일로스이성질화효소중 C. tyrobutyricum ATCC 의자일로스이성질화효소의활성이가장우수하였으므로, C. tyrobutyricum ATCC 의자일로스이성질화효소를본 하였다. HTS 기법에활용할목적으로대장균에서대량발현및정제 xyla 유전자가녹- 아웃(knock-out) 된대장균(E. coli JW ) 에형질전환된 C. tyrobutyricum ATCC 의자일로스이성질화효소(pQE80L-xylA) 의최적발현조건 은 18 에서 1 mm IPTG 로발현을유도하는것이다. [ 그림 88] E. coli JW 에서발현된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스 이성질화효소및정제된효소의분자량 각농도별글루코오스와자일로스표준물질을정제된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의 자일로스이성질화효소로반응시킨후시스테인- 카바졸방법으로발색을유도하였다

152 [ 그림 89] C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스이성질화효소로반응시킨 글루코오스와자일로스의반응물을시시테인-카바졸방법으로발색시킨그림 그림에서보는바와같이글루코오스표준물질을 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일 로스이성질화효소와반응시킨후시스테인-카바졸방법으로발색을유도하여도발색이거 의되지않았으나, 자일로스표준물질은농도에따라일정하게발색정도가증가함을확인할수 있었다. 즉 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스이성질화효소가글루코오스는프럭 토스로이성질화시킬수없는반면, 자일로스는자일룰로스로일정하게변화시켜줄수있음 을의미한다. 다시말해글루코오스와자일로스가혼합된배양액을 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자일로스이성질화효소로반응시켜자일로스만을자일룰로스로전환시킨후시스테인- 카바졸방법으로자일로스의농도만을간접적으로측정할수있음을보여준다. 한편혼합당동시이용돌연변이를선별하기위한본스크리닝방법은글루코오스와자일로 스의혼합당을돌연변이들로발효한후발효가종료된시점의자일로스농도만을측정하는방 법이므로추가적으로고려할사항이있다. 첫째, 모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755를동량의글루코오스와자일로스를함유 한 96 well micro-titer plate에배양후글루코오스가완전히소모되는동안자일로스는거 의소모되지않는배지의완충능력의조사가요구되었다

153 [ 그림 90] 완충력에따른 C. tyrobutyricum ATCC 배양액내자일로스잔류도 모균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755를동량의글루코오스와자일로스를함유한 96 well micro-titer plate 에배양후글루코오스가완전히소모되는동안자일로스는거의 소모되지않는완충능력을조사한결과, potasium phosphate 완충용액의농도가높아질수록 잔류된자일로스의농도가낮았다. 따라서 potasium phosphate 사용한 6 mm 농도이상의 높은완충력은혼합당내의자일로스도모두소모하게하므로, 본연구방법에서개발한발색법 으로 96 well micro-titer plate에서글루코오스와자일로스를동시에소모하는돌연변이균주 를선별할수없다. 그러나그림에서보듯이 potasium phosphate 완충용액의농도가 2.4 mm 일경우글루코오스가완전히소모되는동안자일로스는거의소모되지않았다. 두번째고려사항은, 콜로니의접종량에따라생장속도가달라 (Current Opinion in Chemical Biology (2004) 8: ) 당소모속도가달라질수있으므로, 접종량의변 화에따른자일로스잔류정도를조사할필요가있었다

154 [ 그림 91] C. tyrobutyricum ATCC 25755의접종량에따른배양액내자일로스잔류도 96 well micro-titer plate 에콜로니의접종량에따라발효종료후자일로스잔류농도 를조사한결과, OD600 값으로 5배차이가발생하더라도상기조건에서배양할경우잔류되 는자일로스농도에는크게차이가없었다. 이는콜로니들을 96 well micro-titer plate에접 종한후균주의배양상태를균일하게만들어주기위하여 96 well micro-titer plate로 2차 계대할필요가없음을의미한다. 최종적으로글루코오스와자일로스가완전히소모되도록완충력을높인액체배지에 C. tyrobutyricum ATCC 를배양하면서, 일정한시간간격으로시료를채취하여 HTS 기 법을통한자일로스농도와 HPLC를통하여분석한자일로스농도를비교분석하여개발한 HTS 기법의실효성을검토하였다

155 [ 그림 92] 본연구의 HTS 기법과 HPLC로측정한 C. tyrobutyricum ATCC 배양액 내자일로스농도비교 본 HTS 기법의실효성을판단하기위하여혼합당을실제로발효한발효액의농도를상기 에서기술한 HTS 기법으로측정한발효중자일로스농도와 HPLC로분석한농도를비교한 결과이다. 비교결과 7 g/l 이상과 1 g/l 미만의자일로스농도는본연구에서개발한방법으 로자일로스를측정하기는어려우나, 1~7 g/l 내의자일로스농도는 HPLC 분석결과와동일 함을보여주었다. 따라서본연구에서개발한 HTS 기법은글루코오스와자일로스가혼합된 C. tyrobutyricum ATCC 25755의배양액내에서자일로스농도만을발색법으로측정가능 하므로, 본 HTS 기법으로혼합당을동시에이용할수있는돌연변이선별할수있다. 이상에서확립된글루코오스와자일로스를동시에소모할수있는돌연변이스크리닝과 정을도식화하면다음과같다

156 [ 그림 93] 개발한 HTS 기법을통한돌연변이선별과정 아래그림은상기 HTS 기법으로야생균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755와이야생 균주를 MNNG로무작위돌연변이유발후상기 HTS기법을활용하여획득한혼합당동시발효 돌연변이인 M4 및이일차돌연변이균주를 MNNG로재차돌연변이를유발하여동일한 HTS 기법으로획득한 M4-4를다른돌연변이균주들과비교한그림이다. [ 그림 94] C. tyrobutyricum ATCC 25755의무작위돌연변이유발후 HTS 기법에의한혼합당동시이용돌연변이선별 그림에서보듯이 C. tyrobutyricum ATCC 는자일로스가다량 ( 표준자일로스농

157 도와비교했을때약 0.75 g/l 수준) 잔류되어있었으며, MNNG를처리후획득한돌연변이 콜로니를접종한배양액에는자일로스가적게남아있음이 ( 돌연변이 M4를재차돌연변이를 수행한 M4-4의경우 g/l 수준) 확인되었다. 또한야생균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755와이야생균주를 MNNG로무작위돌 연변이유발후상기 HTS기법을활용하여획득한혼합당동시발효돌연변이인 M4를지속적 으로돌연변이를유발하여획득한 M4-4를 ph를조절하지않은상태에서글루코오스와자일 로스의혼합당소모경향을 HPLC 로확인해보았다. [ 그림 95] ph를조절하지않은상태에서 C. tyrobutyricum ATCC 25755와최종선별된혼합당동시이용돌연변이균주의당소모경향 그림에서보듯이야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755는발효종료시점에서 글루코오스는모두소모하였으나, 자일로스는거의소모되지않았다. 그러나최종선별된돌연 변이 M4-4는글루코오스와자일로스를동시에소모하여발효종료시점에는자일로스가완전 히고갈되었다. 따라서본연구에서개발한혼합당동시이용돌연변이선별을위한 HTS 기법 이성공적으로수행되고있음이판명되었다. 또한최종획득한혼합당동시이용돌연변이균주 M4-4 는글루코오스에의한자일로스대사의억제기작이보다완화되었음을시사한다. 따라서실제로돌연변이균주 M4-4가글루코오스에의한자일로스대사의억제기작이야 생균주인 C. tyrobutyricum ATCC 보다완화되었는지알아보기위하여, 대사되지는

158 않으나글루코오스와같이자일로스의대사를억제할수있는 에서두균주를배양해보았다. 2DG를자일로스와혼합한배지 [ 그림 96] C. tyrobutyricum ATCC 와개량된돌연변이균주(M4-4) 의 CCR 유발 물질 2DG를포함한자일로스배지에서각균주의생장 그림에서보듯이야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755도어느정도 CCR이완 화되었기때문에, 2DG를포함한자일로스배지에서오랜시간이지나면생장이가능함을확 인할수있다. 그러나개량된돌연변이균주인 M4-4는 2DG를포함한자일로스배지에서 야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 보다생장속도가크게향상된것을알수있 다. 이는자일로스의대사에대한글루코오스의 CCR 기작이야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 보다더욱완화되었음을시사한다. 따라서돌연변이균주(M4-4) 의자일로스대사에대한글루코오스억제의완화원인과, 이 러한표현형질이안전적으로유지될수있는지알아보기위하여, 돌연변이 M4-4의유전자변 이를조사하였다

159 [ 그림 97] 혼합당동시이용돌연변이균주의염색체상돌연변이위치 확인결과, 글루코오스 uptake system 중 PTS(phosphoenolpyruvate-dependent phosphotransferase system) 의 enzyme II C domain 유전자에 295 bp의 DNA가결손 (deletion) 되었음을확인할수있었다. C. tyrobutyricum이속하는 Firmicute의일반적인 CCR 기작을살펴보면, 글루코오스의대사산물농도가높아지면, 자일로스의대사에관여하는 유전자발현을억제하여자일로스가대사되지않는것으로알려져있다. 돌연변이균주 (M4-4) 의혼합당대사경향을보면, 자일로스소모속도는빨라졌으나, 글루코오스의대사속 도가약간느려졌음을확인할수있다. 따라서, 실제로결손된유전자를복구시켰을경우원래야생형균주의당소모경향을로복귀 되는지확인하였다

160 [ 그림 98] 돌연변이 M4-4의표현형질의복귀 그림에서보는바와같이글루코오스 uptake system 중 PTS의 enzyme II C domain 유 전자에 295 bp의 DNA가결손이일어나글루코오스가존재하더라도빠르게자일로스를소모 했던 M4-4에다시 ptsg 유전자를복귀시켜준결과, 원래야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 처럼다시자일로스소모속도가느려진것을확인할수있다. 따라서최종혼합 당동시이용돌연변이균주인 M4-4가야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755의자 일로스대사에대한글루코오스억제가보다완화된원인은 PTS의 enzyme II C domain의 돌연변이에기인한것이며, 이유전자부위에 DNA 결손은글루코오스와자일로스를동시에 이용하는 M4-4 의표현형질이안전적으로유지될수있음을의미한다. 이렇게최종적으로획득한혼합당동시이용돌연변이 M4-4의보존및이를통한발효중 오염으로부터안정적으로유지하기위하여, 형질전환가능한플라스미드(pMTL) 로항생제내 성을부여하였다

161 [ 그림 99] 내성유전자의보존 그림에서보는바와같이항생제 erythromycin을 100 ug/ml의농도로첨가한배지에서 M4-4 는생장하지못하였으나, erythromycin에대한내성유전자를포함한플라스미드 (pmtl) 을형질전환한 M4-4(pMTL) 은생장이가능하였다. 또한 M4-4(pMTL) 을 erythromycin을포함하지않은배지에지속적으로계대배양하여도 erythromycin에대한내 성유전자가지속적으로유지되고있음을확인할수가있었다. 따라서배지에 erythromycin 을 100 ug/ml로넣고 M4-4(pMTL) 를배양하면, 발효중다른균주의오염을최소화하여 혼합당을동시에이용하는 M4-4 의특성을안정적으로유지할수있다. 나. 혼합당동시발효균주이용및당화액으로부터최적균주이용유기산생산 (1) 이론적 실험적접근방법 돌연변이들의혼합당동시발효능력의비교는폐목재모델당화액 ( 폐목재당화액내혼합 당의농도인약 60 g/l글루코오스와약 20 g/l 의자일로스를함유한합성배지) 을 1 L 함유 한실험실규모 (3 L) 의발효조에서수행하였으며, 돌연변이의개량기준은모델당화액내

162 혼합당을완전히소모하는데걸린시간당최종부티르산농도를계산한 overall productivity (g/l/h) 가야생균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755가폐목재당화액내 혼합당농도의합인약 80 g/l의글루코오스를함유한합성배지에서부티르산을생산하는속 도(1.26 g/l/h) 의약 70% 에해당하는속도(0.88 g/l/h) 이상으로부티르산을생산할수있 도록 1 차개량하였다. 이후최종개량된균주가상기 당화액무독성화기술최적화, 산 업용생산을위한배지최적화, 및 당화액이용고효율유기산생산조건도출 을통한 최적조건의폐목재당화액에서약 90% 에해당하는속도(1.13 g/l/h) 로부티르산을생산하는 지확인하였다. (2) 연구수행내용 야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755의점배양을위한배지는총부피 1리터당 15 g의글루코오스또는 7.5 g의글루코오스와 7.5 g 의자이로스, 1 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨 (KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하는배지에첨가하고, 60 ml 의혈청병(serum bottle) 에상기배지를 20 ml씩분주 한후각배지는아르곤가스를이용하여기체치환하고고무마개와알루미늄씰로봉입후섭 씨 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후실험에사용하였다. 상기배지에접종한돌연변이는 37 에서 12시간배양한후 1 L 발효조에접종하였다. 돌연변이균주인 M4-4와항생제 erythromycin의내성을부여한 M4-4(pMTL) 의점배 양을위한배지는총부피 1리터당각각 7.5 g 의글루코오스와자일로스, 1 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하는배지에첨가하고, 60 ml 의혈청병(serum bottle) 에상기배지를 20 ml 씩분주한후각배지는아르곤가스를이용하여기체치환하고고무마개와알루미늄씰로 봉입후섭씨 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후실험에사용하였다. 한편 M4-4(pMTL) 의 접종전에는 erythromycin을 100 ug/ml 이되도록첨가하였다. 상기배지에접종한돌연변이 는 37 에서 12시간배양한후 1 L 발효조에접종하였다. ph를 6.0으로조절한 1 L 발효조에서상기점배양한야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755로발효하기위한배지는총부피 30 L에 1리터당 25 g의 yeast extract

163 LSP, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g의아세트산나트륨 (sodium acetate) 를포함하는배지에 80 g의글루코오스또는 60 g의글루코오스와 20 g의 자일로스를각기달리 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를 이용하여 1시간동안기체치환하고점배양액을 5% 접종하였다. ph 조절은 6N NaOH로하였 으며, 37 에서 200 rpm 으로발효를수행하였다. ph를 6.0으로조절한 1 L 발효조에서상기점배양한돌연변이균주인 M4-4로발효하기 위한배지는총부피 30 L에 1리터당 25 g의 yeast extract LSP, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨 (KH 2PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하 는배지에 60 g의글루코오스와 20 g의자일로스를각기달리 121 도, 1.5기압에서 15분간 멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를이용하여 1시간동안기체치환하고점배양액을 5% 접종하였다. ph 조절은 6N NaOH 로하였으며, 37 에서 200 rpm 으로발효를수행하였다. ph를 6.0으로조절한 100 L 발효조에서상기점배양한최종돌연변이균주인 M4-4(pMTL) 로발효하기위한배지는총부피 30 L에전기화학적방법으로황산을회수 후, Ca(OH) 2 를첨가하여 ph를 7.0 이되도록조절하였고, 추가로발효초기와중간에각각 10 g 의폐글리세롤을첨가하였다. 이후상기언급한기타배지성분과폐글리세롤이첨가된 당화액을각기달리 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를이 용하여 1시간동안기체치환하고점배양액을 5% 접종하였다. 접종전발효중발생가능한 오염을방지하기위하여 100 ug/ml의 erythromycin 을첨가하였다. ph 조절은 6N NaOH로 하였으며, 37 에서 200 rpm 으로발효를수행하였다. 발효동안일정시간간격으로배양물을채취하여분광광도계 (UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm 에서의흡광도를측정하여미생물생장을분석하고, 12,500 rpm의회전속도로 원심분리하여획득한상층액내당농도및발효산물의농도를측정하였다. 각당농도및발 효산물의농도는 Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 이부착된액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 의굴절률검출기로로분석하였다. 조건은다 음과같다. (mobile phase, 5 mm sulfuric acid; flow rate, 0.6 ml/min; temperature, 6 5 )

164 (3) 연구개발결과 [ 그림 100] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4의 3 L 발효조에서부티르산생산비교 야생형균주 (C. tyrobutyricum ATCC 25755) 로부터글루코오스에서생산되는발효종료 시점의부티르산생산성(Overall productivity, 1.26 g/l/h) 대비모델당화액( 글루코오스와 자일로스의농도를폐목재당화액수준으로혼합한합성배지) 에서생산되는부티르산의생산 성은 0.68 g/l/h ( 글루코오스대비 54% 수준) 로감소되었으나, 지속적으로개량된돌연변이 (M4-4) 는모델당화액에서부티르산을 1.06 g/l/h( 야생형균주가글루코오스에서생산하는 부티르산생산성대비 84% 수준) 의속도로생산하였다. 글루코오스와자일로스가포함된혼 합당에서개량된돌연변이균주(M4-4) 의당소모경향을보면자일로스를빨리소모함으로 써야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755에서보이는글루코오스고갈후나타나는 지체기가관찰되지않았다. 이는야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755의특성인글 루코오스에의한 CCR 이존재하지않기때문에, 전체부티르산의생산성역시개량균주에서 보다증가한것으로사료된다. 한편폐목재강산당화액을상기와같이무독화한후질소원으 로는저가의 yeast LSP와환원력을제공하기위한폐글리세롤을추가한최적화된폐목재당

165 화액에서개량균주를발효하면, 모델당화액으로부터생산되는부티르산의생산성보다증가 (1.15 g/l/h, 야생형균주가글루코오스에서생산하는부티르산생산성대비 91% 수준) 하였 다. 이는아래그림에서보는바와같이개량균주 M4-4는자일로스대사에대한글루코오스 의억제기작은존재하지않으나, 상기에서언급된것과같이첨가된폐글리세롤에의해환원력 이추가됨으로써생산된아세트산이부티르산생산으로전환되어전체생산성이증가한것으 로사료된다. 또한동일한이유로폐글리세롤이첨가된폐목재당화액에서개량균주가폐목재 당화액내포함된총당으로부터생산한부티르산의생산수율 (0.48 g/g sugar ) 이글리세롤이첨가되지않은모델당화액내총당으로부터생산한부티르산생산수율 (0.33 g/g sugar ) 보다높았다. 한편야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755를폐글리세롤이첨가된폐목재 당화액에서발효하면, 생산된아세트산을완전히부티르산으로전환함으로써실제사용한총 당으로부터생산된수율은 0.50 g/g sugar 로글루코오스당생산되는부티르산이론수율 (0.49 g/g glucose ) 보다높았으나, 자일로스는완전히소모하지못하였기때문에당화액으로투입한총 당으로부터생산된부티르산의생산수율은 0.46 g/g input sugar 로오히려자일로스를완전히소 모한개량균주에서생산되는수율보다낮았다. 지수성장기(log phase) 동안생산되는최대부 티르산생산성(maximum productivity, g/l/h) 은모델당화액에서생산되는최대생산성(2.21 g/l/h) 과비교해최적화된실제당화액에서생산되는최대생산성(2.08 g/l/h) 이조금낮았다. 이러한이유는실제당화액이나첨가된글리세롤이완전히무독화되지않았거나, 생산되는부 티르산의농도(titer, 55.0 g/l) 가높아부티르산에의한생육의저해에기인한것으로사료된 다. 그러나목표로한최대부티르산생산속도(2 g/l/h) 보다는높았기때문에추출공정과연 계가가능할것으로사료되었다

166 [ 그림 101] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4의최적화된폐목재당화액에서부티르산생산비교 이상의결과를아래표에요약하였다

167 [ 표 17] Lab. scale 발효조에서야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와최종개량균주[M4-4(pMTL)] 에의한부티르산생산비교 사용배지 합성배지발효최적화주 1 C6 C6+C5 C6+C5 폐목재당화액 발효균주 개량전균주 개량전균주 최종개량균주 최종개량균주 Overall productivity (g/l/h) Maximum Lab. scale productivity (1 L) (g/l/h) Yield (g/g sugar) 주1) 폐목재강산당화액을무독화한후 Yeast LSP 및폐글리세롤첨가한당화액 L 발효기공정최적화 (1) 이론적 실험적접근방법 상기연구는실험실규모(lab-scale) 에서수행된연구이므로산업적생산체제를갖추기 위해서는대량생산공정의개발을위한검토가필요하다. 일반적으로보다큰스케일에서의발 효공정은실험실규모에서획득했던수율(yield) 이나생산성(productivity) 보다낮은결과를 보인다. 따라서수율(yield) 이나생산성(productivity) 에영향을주는환경요소( 온도, 교반 속도등) 들을판단하는것은공정을스케일- 업(scale-up) 할때매우중요한연구주제이다. 특히본연구에서사용된 C. tyrobutyricum 은혐기성발효에의하여부티르산을생산함으로 혐기성발효조건에서스케일-업할때연구실규모보다낮은발효성능에영향을주는요소들 을판단하여야한다. 만약스케일-업된발효조에서수행된발효결과가실험실규모에서의발 효결과와차이를보이면예상되는여러변수를교정하여실험실규모의발효결과에근접하게 해야한다. 따라서스케일-업을위하여 100 L 규모의발효조에서배양실험을실시하며, 실험실규모 와의비교를통하여 100 L 발효조로의스케일- 업시최적조건을확립고자하였다. 또한, 공 정의상업화를위하여서는사용균주의안정적생산성이필수적이므로, 예상되는여러변수에 대한생산균주의부티르산생산에대한안정성을평가하고자하였다

168 (2) 연구수행내용 본연구팀에서는실험실수준의부티르산발효수준을기반으로 scale-up한 100 L의발 효기를참여기업인 아팩에설치하였다. 야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755의점배양을위한배지는총부피 1리터당 15 g 의글루코오스, 1 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g의 황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨 (K 2 HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하는배지에첨가하고, 500 ml의 혈청병(serum bottle) 에상기배지를 250 ml씩분주한후각배지는아르곤가스를이용하 여기체치환하고고무마개와알루미늄씰로봉입후섭씨 121 도, 1.5기압에서 15분간멸균 후실험에사용하였다. 상기배지에접종한돌연변이는 37 에서 12시간배양한후 100 L 발 효조에접종하였다. 돌연변이균주인 M4-4와항생제 erythromycin의내성을부여한 M4-4(pMTL) 의점배 양을위한배지는총부피 1리터당각각 7.5 g 의글루코오스와자일로스, 1 g 의효모추출물, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의 제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하는배지에첨가하고, 500 ml 의혈청병(serum bottle) 에상기배지를 250 ml 씩분주한후각배지는아르곤가스를이용하여기체치환하고고무마개와알루미늄씰로 봉입후섭씨 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후실험에사용하였다. 한편 M4-4(pMTL) 의 접종전에는 erythromycin을 100 ug/ml 이되도록첨가하였다. 상기배지에접종한돌연변이 는 37 에서 12시간배양한후 100 L 발효조에접종하였다. ph를 6.0으로조절한 100 L 발효조에서상기점배양한야생형균주인 C. tyrobutyricum ATCC 25755로발효하기위한배지는총부피 30 L에 1리터당 25 g의 yeast extract LSP, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨(KH 2 PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ), 2g의아세트산나트륨 (sodium acetate) 를포함하는배지에 80 g의글루코오스를각기달리 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를이용하여 1시간동안기체치환하고점배양액 을 5% 접종하였다. ph 조절은 6N NaOH 로하였으며, 37 에서 200 rpm으로발효를수행 하였다. ph를 6.0으로조절한 100 L 발효조에서상기점배양한돌연변이균주인 M4-4로발효하 기위한배지는총부피 30 L에 1리터당 25 g의 yeast extract LSP, 0.2 g 의황산마그네슘, 0.01 g 의황산망간, 0.01 g 의황산철, 0.01 g 의염화나트륨, 0.5 g의제1 인산칼륨

169 (KH 2 PO 4 ), 0.5g의제2 인산칼륨(K 2 HPO 4 ), 2g 의아세트산나트륨(sodium acetate) 를포함하 는배지에 60 g의글루코오스와 20 g의자일로스를각기달리 121 도, 1.5기압에서 15분간 멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를이용하여 1시간동안기체치환하고점배양액을 5% 접종하였다. ph 조절은 6N NaOH 로하였으며, 37 에서 200 rpm 으로발효를수행하였다. ph를 6.0으로조절한 100 L 발효조에서상기점배양한최종돌연변이균주인 M4-4(pMTL) 로발효하기위한배지는총부피 30 L에전기화학적방법으로황산을회수 후, Ca(OH) 2 를첨가하여 ph를 7.0 이되도록조절하였고, 추가로폐글리세롤을첨가한폐목 재당화액을사용하였다. 당화액내에는 3.31 g/l의아세트산이존재하기때문에상기에서언 급한글리세롤연구결과를통해얻어진데이터를기반으로계산하여 5.6 g/l의농도가되도록 첨가하였다. 또한 아팩으로의이동중오염을방지하기위해 100 ug/ml의 erythromycin을 첨가하였다. 이후상기언급한기타배지성분과폐글리세롤이첨가된당화액을각기달리 121 도, 1.5기압에서 15 분간멸균후혼합하였다. 이후아르곤가스를이용하여 1시간동안 기체치환하고점배양액을 5% 접종하였다. 접종전발효중발생가능한오염을방지하기위 하여 100 ug/ml의 erythromycin 을첨가하였다. ph 조절은 6N NaOH 로하였으며, 37 에 서 200 rpm 으로발효를수행하였다. 발효동안일정시간간격으로배양물을채취하여분광광도계 (UVmini-1240, SHIMAZU) 로 600 nm 에서의흡광도를측정하여미생물생장을분석하고, 12,500 rpm의회전속도로 원심분리하여획득한상층액내당농도및발효산물의농도를측정하였다. 각당농도및발 효산물의농도는 Aminex HPX-87H 컬럼 ( mm) 이부착된액체크로마토그래프 (Agilent model 1200 liquid chromatograph) 의굴절률검출기로로분석하였다. 조건은다 음과같다. (mobile phase, 5 mm sulfuric acid; flow rate, 0.6 ml/min; temperature, 6 5 ). (3) 연구개발결과 다음은 아팩에추출장치와연계하여설치된 100 L 발효조그림이다. 아래발효조에서스 케일- 업(3 L 발효조에서실제 1 L의용량으로수행하던발효를 pilot-scale인 100 L 발효 기에서실험실규모보다 30배스케일-업된실제 30 L 요량으로발효를수행) 시최적발효 조건을조사하였다

170 [ 그림 102] 아팩에설치된 100 L 발효조및추출장치 혐기성발효조건에서스케일-업할때연구실규모보다낮은발효성능에영향을주는요소 들을알아보고교정이필요한요소들에대한기준을정하기위하여, 먼저글루코오스를기질로 야생형균주 (C. tyrobutyricum ATCC 25755) 를 1 L 조건에서와동일조건( 아르곤가스를 이용하여발효전배지를 1 시간동안기체치환, 37, 교반속도는 200 rpm, 6N NaOH를 0.1 ml/sec 로 ph6.0 으로조절) 으로발효하였다. [ 그림 103] 야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 25755와지속적으로개량된돌연변이 M4-4의 100 L 발효조에서부티르산생산비교 그결과발효종료시점의부티르산생산성(Overall productivity, 1.22 g/l/h) 은실험실 규모(1.26 g/l/h) 대비 97%, 최대부티르산생산속도(Maximum productivity, 2.23 g/l/h) 는실험실규모(2.34 g/l/h) 대비 95%, 모두이용된글루코오스당부티르산생산수율

171 (Yield, 0.32 g/g) 은실험실규모(0.35 g/g) 대비 91% 로모든발효성능이실험실규모에비해 감소하였으나, 모든발효성능의결과가실험실규모발효기에서수행된발효성능대비 90% 이 상으로초기기준으로삼았던 80% 이상이었으므로, 이후돌연변이균주들을이용한스케일- 업연구에서도상기의공정변수들을교정하지않고발효를실시하였다. 상기동일한공정변수( 아르곤가스를이용하여발효전배지를 1 시간동안기체치환, 3 7, 교반속도는 200 rpm, 6N NaOH를 0.1 ml/sec 로 ph6.0 으로조절) 에서글루코오스와 자일로스가포함된혼합당( 모델당화액) 에서개량된돌연변이균주(M4-4) 에의한부티르산의 overall productivity는 1.05 g/l/h 로실험실규모(1.06 g/l/h) 대비 99%, 부티르산의 maximum productivity는 2.21 g/l/h 로실험실규모(2.28 g/l/h) 대비 97%, 이용된모든당 으로부터생산된부티르산의 yield는 0.32 g/g 로실험실규모(0.33 g/g) 대비 97% 로모든발 효성능이실험실규모에비해야생형균주 (C. tyrobutyricum ATCC 25755) 를글루코오스로 발효한것과같이감소하였으나, 모든발효성능의결과가실험실규모발효기에서수행된발효 성능대비 90% 이상이었다. 최종적으로항생제 erythromycin의내성을부여한최종돌연변이인 M4-4(pMTL) 로 고효율유기산생산을위한무독화와배지최적화( 폐글리세롤을초기에 5.6 g/l 첨가) 를 수행한실제폐목재당화액을상기동일한공정변수에서발효한결과, 부티르산의 overall productivity는 1.18 g/l/h 로실험실규모(1.15 g/l/h) 대비 103%, 부티르산의 maximum productivity는 2.08 g/l/h 로실험실규모(2.08 g/l/h) 대비 100%, 이용된모든당으로부터 생산된부티르산의 yield는 0.44 g/g 로실험실규모(0.48 g/g) 대비 92% 로 overall productivity와 maximum productivity 는실험실규모와동일하거나오히려높았다. 이러한결 과의원인은실험실규모에사용된실제당화액이황산제거과정동안과도한반응 (pilot scale 에사용한당화액보다더장시간황산제거로인한농축현상) 으로인해당화액에포함된총 당의농도( g/l) 가 pilot scale 에서발효를수행한발효액의총당의농도(85.23 g/l) 보다높았기때문에당저해(sugar inhibition) 에의한것으로사료된다. 반면생산된부티르 산의 yield가더낮은이유는그림에서보듯이실험실규모에서수행된발효와는달리단한번 의글리세롤만첨가해주었기때문에실험실규모에서부티르산으로전환된아세트산보다적은 아세트산이부티르산으로전환되었기때문으로사료된다. 아래의표에이상의 pilot-scale에서의결과를상기 lab-scale 과비교하였다

172 [ 표 18] Lab. scale 및 pilot scale 발효조에서야생형균주 C. tyrobutyricum ATCC 와최종개량균주 [M4-4(pMTL)] 에의한부티르산생산비교 사용배지 합성배지발효최적화주 1 C6 C6+C5 C6+C5 폐목재당화액 발효균주 개량전균주 개량전균주 최종개량균주 최종개량균주 Overall productivity (g/l/h) Maximum Lab. scale productivity (1 L) (g/l/h) Yield (g/g sugar) Pilot scale (30 L) Overall productivity (g/l/h) Maximum productivity (g/l/h) Yield (g/g sugar ) 주1) 폐목재강산당화액을무독화한후 Yeast LSP 및폐글리세롤첨가한당화액 제2절연구개발결과요약 폐목재당화액의제조를위해 2 가지당화기법을비교하였고, 비교결과강산당화공정에서 폐목재로부터당의회수율이가장높은것을확인하였다. 개발된강산당화공정을통해폐목재 로부터 49.0% 의당화효율로 56.5 g/l의글루코오스와 31.0 g/l 의자일로스를생산하였다. 상기와같이목질계바이오매스당화액에는글루코오스뿐만아니라자일로스가함께존재한다. 대부분의미생물들은글루코오스존재시자일로스를이용하지못하는경우가있다. 본연구에서 사용한 C. tyrobutyricum ATCC 역시글루코오스에의해자일로스이용이지연된다. 그러 므로본연구에서는 연변이를쉽게발굴할수있는 chemical mutagenesis 를통해글루코오스와자일로스를동시에이용하는돌 HTS 기법을개발하였고, 무독화한폐목재당화액에고효율로부디 르산을생산할수있는조건을부여한배지에서최종개발한돌연변이로육탄당으로부터 C

173 tyrobutyricum ATCC 25755이생산하는부티르산생산성대비 90% 이상으로부티르산을생산 하였다. 이상최적조건을파일롯규모에적용하여실제폐목재당화액으로부터부티르산을생산하여실험 실규모대비총생산성은 103%, 최대생산성은 100%, 수율은 92% 에도달하게하였다. 따라서부티르산추출 100%, 부탄올전환 100% 를가정할경우, 폐목재 1 Kg 으로부터 0.17 Kg 의부탄올생산이가능하다. [ 그림 104] 폐목재 1Kg 으로부터생산가능한부탄올생산량 (100% 추출및 100% 부탄올 전환시 )

174 제3 절연구개발결과및토의 ( 위탁과제 ) 1. 가. 발효추출물기반부탄올생산을위한화학촉매및공정설계 부탄올생산반응경로제안 [ 그림위1] 부탄올생산경로및직접수소화반응의문제점. 반응 반응 반응 1 ( 에스테르화반응): 부티르산 + 부탄올 부틸부티레이트 + 물 2 ( 에스테르수첨분해반응): 부틸부티레이트 + 수소 2부탄올 3 ( 카르복실산수소화반응): 부티르산 + 수소 부탄올 + 물 [ 그림위1] 의왼쪽을보면본과제에서생산하고자하는물질에대해 van krevelen diagram 을통해서평가하였다. Van krevelen diagram의형태는주로 x축에 H/C, y축에는 O/C 을표기하는데, 주로일상생활에서사용하는 gasoline, diesel, kerosene은 O/C은 0 이고, H/C은 사이의값을가진다. 이범위에가까운물질을만드는것은연료의성질에가 깝게다가가는것을의미한다. 본과제가당인 glucose 형태로부터출발한다고보면, H/C는 2, O/C는 1 이다. 이물질로부터발효를통해서부티르산을생산한다면, H/C는 2, O/C는 0.5로 변하게된다. 그후, 부탄올로전환을하게되면, H/C는 2.5, O/C는 0.25 가된다. 목질계당류의발효공정을통해생성되는부티르산을부탄올로전환하기위해서는두가지 반응경로가있을수있다. 첫번째는반응 3인카르복실산인부티르산을직접수소화반응시 켜부탄올을생산하는방법이거나두번째는반응 1과반응 2 를이용하는방법이있다. 반응

175 1 은에스테르반응으로부티르산과부탄올을반응시켜부틸부티레이트로합성하는것이고, 반 응 2 는부틸부티레이트를수첨분해반응을통하여부탄올을생산하는것이다. 두가지반응경로중첫번째로소개하였던방법인직접수소화반응을통해부탄올생산 을하는방법은문제점이발견되었다. [ 그림위1] 의오른쪽에부티르산에촉매를넣고온도를 100 C 정도가열한경우, 촉매에포함되어있는구리금속이구리이온으로 leaching되는 것을 UV-Vis 스펙트럼결과로확인하였다. 그렇기에반응 3을통해부탄올생산을하면촉 매의 deactivation 이심각하게진행될것으로예상되어, 공정에이반응경로를적용하는것은 불가능할것이라판단하였다. 이문제점으로인해두단계를거쳐진행되는반응경로를선택하 게되었고, 부티르산을부틸부티레이트로전환시킨후, 수첨분해반응을이용한다면촉매가 decactivation 되는문제점을해결하면서부탄올생산할수있을것으로판단하였다. 나. (1) 부틸부티레이트생성을위한에스테르화반응 고농도의부티르산을이용한에스테르화반응 [ 그림위2] 용매가없는경우에무촉매( 왼쪽) 또는이온교환수지촉매( 오른쪽) 이용 부틸부티레이트수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2). 반응온도는 110, 부탄올/ 부티르산몰비가 2 인조건에서에스테르화반응을수행하였다. 촉매및용매가없는경우( 그림위2, 왼쪽), 반응이 6시간동안진행되었을때부틸부티레이 트의수율은 25% 에달하는것으로보아, 열역학적으로에스테르화반응이진행됨을알수있 었다. 이온교환수지(Amberlyst 15) 를촉매로이용하여용매가없는조건에서반응을수행하였다

176 그결과, 반응이 6시간동안진행되었을때부틸부티레이트의수율은 89% 에도달하였다. 거 의정상상태에도달한것으로보아이온교환수지촉매의활성이평형에의해약 90% 에서유 지되는것으로판단된다. 상기와동일한조건에서이온교환수지촉매로 Dowex 50WX8-400 촉매를사용한결과, Amberlyst 15 촉매보다우수한부틸부티레이트수율을보였다( 그림위2, 왼쪽). 거의 100% 수율에도달한것으로보아, 향후연구에서에스테르화반응을수행할필요가있는경우 Dowex 계열의촉매가가능성있을것으로판단하였다. 한편부틸부티레이트를용매로사용하여 Amberlyst 15 촉매의활성을확인하였다( 그림 위2, 오른쪽). 그결과, 부틸부티레이트의수율이 74% 로감소하였다. 이는부틸부티레이트가 생성물인관계로정반응으로의전환이쉽지않음을의미한다. 이에부틸부티레이트를용매로 사용하는경우, 부티르산전환율을 100% 로하기위해서는몰수의조절이필요하다. [ 그림위3] 무용매( 왼쪽) 에서 2 종류이온교환수지촉매( 오른쪽) 또는부틸부티레이트 용매( 오른쪽) 이용부틸부티레이트수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2). 부틸부티레이트를용매로사용하는것에대하여보다면밀히살펴보기위하여반응에사용 하는양을변화시켜에스테르화반응을수행하였다. 앞서실험한바와같이, 부틸부티레이트에 의해촉매활성이감소하는것을확인하였다. 특이한점은 Amberlyst 15 촉매에비해 Dowex 50WX8-400 촉매의활성감소가현저히낮았다. 부틸부티레이트 50 ml를사용했음 에도불구하고 Dowex 50WX8-400 촉매의경우약 85% 정도의부틸부티레이트수율을보 였다. 이결과로부터 Dowex 50WX8-400 촉매의성능을재확인할수있었다

177 [ 그림위4] Amberlyst 15 촉매( 왼쪽) 또는 Dowex 50WX8-400 촉매( 오른쪽) 이용 에스테르화반응에서부틸부티레이트용매의효과( 온도 = 110, BuOH/BA = 2). 부티르산추출제로알려져있는 trioctylamine(toa) 을용매로사용하여에스테르화반응 의성능을살펴본결과, 부틸부티레이트의생성이매우미미하였다( 그림위5). 이온교환수지 촉매를사용했음에도불구하고부틸부티레이트수율이 5% 미만인것으로보아, 염기성인 TOA 는에스테르화반응을억제하는효과뿐만아니라촉매를비활성화시키는효과를가지는 것으로판단된다. 대부분의부티르산추출제들이염기성이므로, 추출제의제거없이에스테르 화반응으로부틸부티레이트를생성하는것은불가능하다고판단된다. [ 그림위5] TOA 존재하에서무촉매( 왼쪽) 또는이온교환수지촉매( 오른쪽) 이용 부틸부티레이트수율( 온도 = 110, BuOH/BA = 2)

178 (2) 저농도의부티르산을이용한에스테르화반응 초기에스테르반응을설계할당시부티르산을 100% 추출하여고농도의부티르산을이용하 여부틸부티레이트를생산할것으로공정을설계하였다. 하지만 TOA와같은추출제의사용이 촉매의활성에안좋은영향을미치는것을확인하였다. 그래서부티르산을추출하는물질로 반응물인부틸부티레이트로사용하는것을결정하였다. 그결과추출효율이예전에비해서많 이떨어지게되었다. 추출결과최대얻을수있는부티르산의농도는대략 1.9wt.% 정도가 될것이라는결론이나와, 이에대한부틸부티레이트를생산할수있는전략을수립하고자하 였다. [ 표위1] 을보면순수한부티르산이아닌 50 wt.% 의부티르산을이용하고, 부탄올/ 부티르 산=2 로주입하고, 활성이매우강한황산을이용하여회분식반응기에반응을하면부티르산 전환율은 84.2% 이다. 하지만부티르산의비율이더낮아져 5 wt.% 만되면부티르산의전환 율은 37.9% 로매우급격하게감소한다. 이는에스테르반응은평형반응이므로생성물인부틸 부티레이트가많아지게되면르샤틀리에법칙에의해많이전환되지못한다. 그래서이평형 을정반응으로유도하기위해서는반응물의비율을높여주는것인데부티르산의비율은고정 되어있기때문에부탄올의비율을 10까지높이게되면전환율은 65.9% 까지증가된다. 하지 만부티르산의농도가 2 wt.% 까지낮아지고부탄올/ 부티르산의비율을 20으로하게되면겨 우전환율 60.1% 를유지할수있다. 만약부티르산의추출이예상한것보다잘진행되지않 아부티르산의농도가 1 wt.% 까지낮아진다고가정하면, 부탄올/ 부티르산의비율이 40으로 반응조건을만들어도전환율은 27.8% 이다. [ 표위1] 회분식반응기를통한부티르산비율에따른부틸부티레이트생산 Entry BA/BB (wt.%) BuOH/BA (mol/mol) Catalyst Cat./BA Time T ( C) (wt.%) (hr) Wt. Bal. (%) C Bal. (%) X BA (%) H 2 SO H 2 SO H 2 SO H 2 SO H 2 SO H 2 SO

179 [ 그림위6] 부틸부티레이트를생산하기위한회분식반응기구성도. [ 그림위6] 과같이회분식반응기를이용해서부틸부티레이트를생산할수있는한계점이 존재하는것같아이를개선하고자 [ 그림위7] 과같은 semi-회분식반응기형태를도입하게 되었다. 부티르산의비율이 2wt.% 일때부탄올/ 부티르산의비율을 20으로하고부탄올을 20 g 외부에서계속공급해주는형태로반응시스템을설계하였다. 그리고플라스크의온도를높 여주면생성되는물과부탄올이 azeotrope 를형성하게되며, distillation 이일부진행된다. 이 반응시스템에서는삼구플라스크에남아있는반응물의구성물중물은제거되지만부탄올도마 찬가지로제거되어반응이진행안될수있기때문에펌프를통해서외부에서부탄올을공급 해주는방식을사용하였다. 그결과부티르산의전환율 98.9% 를얻을수있었다. 반응이충분 이진행된다면부탄올과부틸부티레이트를증류를통해분리하는것은상대적으로유리할것 이라판단하였다. 반응물인부티르산의농도가더낮아진다고가정하여부티르산/ 부틸부티레이트의비율이 1wt.% 인반응물을사용하여비슷한전환율을얻을수있는지실험을수행하였다. 부탄올/ 부티 르산의비율을 10으로하였더니전환율은 49.6% 밖에되지않았다. 이를극족하고자부탄올/ 부티르산의비율을 40으로올리고반응온도를 140 C 로설정하였더니, 전환율 98.5% 인것 을확인할수있었다

180 Semi- 회분식반응기의장점에의해서반응이진행될수있다고생각하여, 추출공정에서 모델당화액을이용하여추출한부티르산의농도가 1.9wt% 인반응물을사용하여 blank 실험 을수행하였다. 부탄올/ 부티르산의비율은 40 으로하였고, 온도는 140 C, 반응시간은 1.5시 간수행하였다. 촉매인황산이들어가지않은결과는전환율 9.7% 로매우낮은것을확인할 수있었다. 실제 pilot scale 반응기에서부틸부티레이트를생산하기위해서는반응이충분히진행될 수있는조건이야할것으로판단하여기존에실험을통해얻은조건을이용하여반응조건을 다음과같이결정하였다. 부탄올/ 부티르산의비율은 40, 촉매는황산, 황산의양은부티르산의 20wt.%, 반응온도는 140 C, 반응시간은 1.5 시간, 주입은약 1시간동안진행하고 30분간 은남아있는부탄올을최대한제가하는동시에반응이진행될수있도록하였다. 다음과같은 반응조건으로실험을하였을때부티르산의전환율은 99.1% 에달하는것을확인하였다. [ 표위2] Semi-회분식반응기를통한부티르산비율에따른부틸부티레이트생산 BA/BB Entry (wt.%) BuOH/BA (mol/mol) Catalyst Cat./BA (wt.%) T ( C) Time (hr) BuOH Wt. Bal. C Bal. feed (g) (%) (%) H 2 SO H 2 SO H 2SO H 2 SO SAC-13 (solid) X BA (%) 추가적으로, 황산은액체로반응물에녹아균질계반응이진행되므로, 산업적으로분리시키 는비용이발생한다. 이를조금이라도줄이기위해서는촉매를불균질계를사용하면경제적일 수있다. 그래서이온교환성수지인 SAC-13 을이용하여반응을진행하였다. 이온교환성수지 는물성으로질량당가지고있는양이온의수치가나와있고, 황산의양에해당하는값을게산 하여반응물에주입하였다. 그결과, 부티르산의전환율은 86.6% 이였다. 낮은전환율은아니 지만부티르산의농도가매우낮기때문에반응후에는부티르산이거의남아있지않게해야 하기때문에촉매로선정을하지않았다

181 [ 그림위7] 부틸부티레이트를생산하기위한 semi- 회분식반응기구성도. (3) 시제품제작을위한최적반응조건을이용한부틸부티레이트생산실험 [ 그림위8] 부틸부티레이트를생산하기위한 semi-회분식반응기의 flask 온도와 junction 온도의위치( 왼쪽), 시간에따른온도곡선( 오른쪽). 앞서, 저농도의부티르산을함유하고있는반응물을이용하여부틸부티레이트를생산하기

182 위해서는일반적으로알려진회분식반응기로불충분하다. 그렇기에 sem-회분식반응기를설 계하게되었고, 이는플라스크내의온도도중요하지만 distillation이일부진행되기때문에끓 어서 condensor에서넘어가는온도가어느정도되고시간에따라어떤형태가되는지보는 것이중요하다. 그렇기에한번더같은실험조건으로온도의변화형태를확인하는실험을수 행하였다. 반응물은추출된부티르산을이용하였고, 부탄올/ 부티르산의비율은 40, 촉매는황산을사 용하였으며플라스크의온도는 140 C, 반응시간은 1.5 시간, 주입은약 1시간동안진행하고 30 분간은남아있는부탄올을최대한제가하는동시에반응이진행될수있도록최대한같은 조건을이용하였다. 그랬을때플라스크의온도와 junction 온도는다음과같은곡선을나타냈 다. 플라스크의온도는 140 C 의온도설정값을바로충족시켜주지못하였다. 플라스크내 존재하는액체가끓는시점이약 90 C부터시작되어약 20분정도지나면플라스크의온도 가 120 C 정도를유지하며끓기시작한다. 이는주입하는부탄올이어느정도많은비중을 차지하면서끓는과정에서에너지는기화열로다빠져나가기때문에바로온도가증가되지않 은것으로볼수있다. 하지만반응이조금씩진행될수록플라스크의온도는조금씩증가하게 되어 140 C 근방까지올라가게된다. 그렇게되면거의플라스크내에존재하는액체는끓는 정도가적어지는것을확인할수있다. 이때쯤부터부탄올의주입을종료시킨후, 약 30분동 안플라스크내에존재하는액체중존재하는부탄올을제거하기위해끓여준다. 그과정에서 플라스크의온도는약 140 C 이상올라갔다가낮아지는현상을발견할수있다. 이어서 junction 의온도를보면약두구간으로나눌수있다. 첫번째구간은약 120 C로유지되 는구간이있다. 이는주로부탄올로구성되어있는액체가끓어서올라가 junction에서약부 탄올의끓는점과비슷한수치를읽은것으로볼수있다. 이후, 부탄올의주입이종료되면액 체가끓어서넘어가는양이거의없기때문에낮아지게되며약 30분이후에는상온에가까워 지는것을확인할수있다. 시간에따른온도곡선을이용하여시제품을제작할때온도설정 을대략적으로어느정도해야할지초기값을정할수있다

183 다. (1) 부탄올생산반응시스템구축 부탄올생산반응시스템설계및제작 부탄올생성을위한반응시스템을제작및구축하였다. 과제착수후, 2012년 10월경에 KHT Engineering 사에문의하여제작에착수하였다. 한달간의협의를통해그림위7에서보 이는 PFD(Process Flow Diagram) 을 10 월말경에완성하였다. 장비제작을위해구로공단에위치한공장을방문하여반응시스템제작을시작하여, 3개월 의시간이걸려 [ 그림위10] 에보이는장비를 2013년 1 월말경에완성하였다. 구체적으로살펴보면, 반응시스템은주입물이총두종류가있다. 액상으로펌프를통해서 들어가는것과 MFC(Mass Flow Controller) 를통해기상의물질이들어가게구성하였다. 펌 프는 YL9110 Quaternary Pump 를사용하는데, PC를통해서제어가가능하며미세유량을 흘려반응을진행시킬수있게하였다. 반응기체로는수소와질소가모두사용할수있게하 였다. 그중수소는고압에서반응이진행되므로고압에서도작동이가능한 MFC로설치를하 였다. 전체적으로보면열을가해주는부분은두곳이다. 하나는 PH-140이고다른하나는 R-100 이다. PH-140은 PFD에 Preheater&Mixer 라고명명되어있는데, 펌프를통해서들어 온액상의물질과 MFC를통해서들어온기상의물질이만나서혼합되며동시에열을받도록 구성하였다. 이를통해서이루고자하는바는두개의상이서로잘섞여서반응기에들어갈 때일정하게혼합되어들어갈수있도록하는것과반응중열역학적으로진행되는반응 1이 어느정도진행되었는지파악할수있도록설계를하였다. 그리고반응기로들어가기전 V-170이라고명명된 separator를통해반응 1 의진행정도를확인할수있도록하였다. 반응에사용할촉매를활성화시키기위해서는수소를통한환원처리를해야한다. 이때액 상과만나서는안되므로유속이느린액상의물질은 V-170으로흘러가게하고수소를흘려 주며촉매를환원시키는다른 SUS 라인을통해 R-100 으로들어가게하였다

184 [ 그림위9] 부탄올생산신규반응시스템 PFD. 반응시스템에서 R-100은 furnace 에해당하며, 촉매반응기가있어서수첨분해반응및 수소화반응이진행되는부분이다. 반응기내부후단에는 quartz wool이위치하여촉매가아 래로내려가지않도록하였고, glass bead 를통해서원료가잘섞일수있도록해주었다. 촉 매는 3회에걸쳐 bead 와촉매를번갈아가며채워잘분산시켰다. 촉매층위에는 filter gasket 을두어촉매입자가반응기후단으로넘어오지못하도록반응기를설계하였다. 반응기후단에는냉각기에해당하는 C-150 을설치하였는데, 1/4인치 SUS 튜브를감싸는 1/2 인치튜브를체결하여그사이공간으로냉각제( 에틸렌글리콜과물의혼합물) 가흘러반응 생성물의온도를낮추도록하였다. 충분히온도가떨어진생성물은 V-160으로명명된 separator 에서포집하게하였다. 생성 물이나오는구간에서모두액상이아니라수소가다량이기때문에이를분리하기위해서 dip 튜브가내부에설치되어, 액상을제외한기상물질은 BPR(Back Pressure Regulator) 을통과 하게하였다. 기상의유량은 Wet Gas Meter를통해서측정하고재확인을위하여최종출구 에 bubble flow meter 를설치하여실시간으로유량을확인할수있도록하였다

185 [ 그림위10] 신규반응시스템의구조도( 왼쪽) 및실제모습( 오른쪽). (2) 구축된반응시스템이용 blank 실험( 무촉매실험의미) 수행 앞서설명한바와같이, 촉매층에도달하기전에열이공급되어열역학적반응이진행될수 있으므로이에대한성능평가가필요하다. PH-140과 R-100 을통해열을공급하므로, 촉매 층전단과후단으로구분하여반응을진행시켜보았다. 여기서 blank 실험이라고하는것은 반응기에촉매가없이반응을진행시켜열역학적으로구성물질이어떻게바뀌는지살펴보는 것을의미한다. 총 8 회의실험을하였는데, 네번은 PH-140까지만온도를올려반응을진행시켰으며 (bead라고되어있는부분을 X 로표기) 나머지는 PH-140과 R-100을모두작동시켜반응을 진행시켰다(jacket과 bead 모두 O 로표기). 액체유량은모두동일하며온도설정과압력을 바꾸어가며실험을진행하였다. 여기서진행되는반응은반응 1로서부티르산의에스테르화 반응만진행이되는데, 그이유는촉매가존재하지않기때문에수소가흡착되어진행되는반 응 2와반응 3 은일어나지않기때문이다

186 [ 그림위11] 구축반응시스템의 blank 실험. 표위1에노란색으로표기한부분은전단을이용한반응으로수소를흘려줄수없으므로 압력을수소로잡은뒤액체만흘려주어반응을하였다. 1 bar에서는 jacket의온도를 160 에서 218 까지올렸지만부티르산의전환율(conversion) 은크게바뀌지않았다( 약 10%). 이어서 20 bar와 30 bar 압력을유지시켜주며반응실험을진행한결과, 압력이증가하여반 응이많이진행되었지만부티르산기준으로전환율은 20 bar에서 55.5% 이며 30 bar에서는 35.7% 여서 20 bar 보다 30 bar 에서오히려반응이진행되지않은것을확인할수있었다. [ 표위3] 구축반응시스템의 blank 실험에의한부티르산의전환율 Jacket Bead P(bar ) Temperature( ) Flow rate Balance BA Conversion(% Jacket Furnace H 2(ml/min) Liq.(g/min) Weight Carbon ) 1 O X O X O X O X O O O O O O O O 나머지네번의실험은반응기에촉매가아닌 glass bead만채워반응을수소분위기에서 진행하였다. 압력을 20, 30, 40 bar, furnace의온도는약 212, jacket의온도는

187 에서 190 까지, 수소의유량은 230 ml/min에서 ml/min으로변화시켜살펴보았지만 부티르산의전환율은크게변화하지않았다. 결과적으로부티르산의전환율은 80 85% 사이에 수렴하는것으로보였다. 전체적인시스템상으로볼때, 부티르산이열역학적으로바뀔수있 는비율은약 80% 라고판단된다. 이는반응물에부티르산이 1/3 mol% 만큼들어있으므로 80% 전환을통해실제촉매층으로들어가는부티르산의함량은 7 mol% 정도일것으로예측 되었다. 라. HYSYS 이용반응변수에따른물질흐름의변화예측 열역학적으로변화하는반응에대해서 blank 실험을수행하였지만 HYSYS를통해서시뮬 레이션을하여온도나압력의조건에대해서이론적으로바뀔수있는값을예측해보았다. 변 수로는온도, 수소유량, 액체유량을설정하였다. 반응압력의경우, 부티르산전환에대해서 상압과많이달라진것을보았지만열역학적인상수는압력과는무관하므로변수를조정하다 고할지라도시뮬레이션에서는크게바뀌지않는결과가나왔다. [ 그림위12] HYSYS 에서사용한물질흐름구조도. 시뮬레이션결과는공통의변수중하나의변수를변화시켜그영향을살펴보았다. 압력은 40 bar, furnace 온도는 270, 수소/ 부틸부티레이트비율은 30 이며액체의유량은 0.06 g/min 으로동일하게하였다

188 반응온도가증가할수록부탄올의몰흐름은매우감소하고부틸부티레이트와부티르산의 몰흐름은올라가는데, 이는열역학적으로온도가올라가게되면반응이제약을받기때문이 다. 하지만실제반응에서는촉매가활성화되는온도가있기때문에충분한온도에도달하기 전까지반응정도가높아져부탄올의몰흐름이증가하는경향을보이게된다. 수소/ 부틸부티레이트몰비에대해서생성물의몰흐름을살펴본결과, 수소가많이들어갈 수록수소의분압이높아져르샤틀리에법칙에의하여평형이생성물쪽으로이동되어부탄올 이많이생성되는양상을보였다. 마지막으로액체유량을변화시킨결과, 반응물이증가할수록평형반응인부티르산과부탄 올의반응으로부틸부티레이트로바뀌는에스테르화반응이촉진되어생성물에부틸부티레이 트가많아진다. 이러한예측결과로부터볼때, 3 개의반응변수모두가부탄올생성에매우중요하며, 특히 부티르산대비수소의유량이높을필요가있다

189 [ 그림위13] HYSYS 를통해계산한반응변수에따른생성물의몰흐름: (a) 반응온도, (b) 수소/ 부틸부티레이트몰비, (c) 액체유량. 마. 부티르산반응시, 구리함유촉매의변화확인 앞서제안한신규반응기술을토대로, 반응물을부티르산 1몰과부탄올 2몰이들어있는혼 합물을원료로공급한결과촉매반응실험에서예기치않은문제가발생하였다. 부티르산/ 부탄올혼합물을원료로사용한결과액체로들어가는질량과나오는질량이 60 % 이상차이가났다. 이에반응물이촉매에영향을미치는것으로예상하고반응후촉매의 질량을측정하니 50% 정도감소하였다

190 이에반응물이촉매에미치는영향을고찰할필요가있다고판단하여, 그림위12와같이 반응물에구리가함유된촉매를넣어 120 까지가열하였다. 그결과, 부탄올, 부틸부티레이 트, 부티르산중중용액의색깔이바뀐것은오직부티르산이들어있는용액이었다. 다음으로 부티르산의농도가용액의색깔에중요한변수일것으로판단되어부티르산농도별로용액을 만들어촉매가 leaching 되는지살펴보았다. 부티르산농도를 3.07, 6.15, 8.76, 11.53, mol% 로변화시켜용액을제조하고 120 에서끓인결과모든용액이푸른색으로바 뀌었다. UV-Vis spectroscopy 로푸른색용액을분석한결과, 다. 700 nm의파장에서강한흡수 피크가관찰되었다. 이는문헌조사를통해구리( Ⅱ) 이온인것으로결론지었다. [ 그림위14] 구리함유촉매와반응물간의 leaching 확인; 왼쪽: 부티르산(BA), 부틸부티레이트(BB), 부탄올(BuOH) 이용, 오른쪽: BA 함량이다른용액이용. [ 그림위15] 부티르산 3 mol% 용액으로처리한후, 용액의 UV-Vis. 스펙트럼및 reference 결과 ((J. Ind. Eng. Chem., 2007, 13(4), )

191 이는그림위13에서보는것처럼 carboxylate 의강한흡착에기인한다. 일반적으로유기산 은 η 1 (C)-acyl 모드로흡착한후, η 2 (C,O)-acyl 모드로바뀌고여기에프로톤이공급되면 서알코올을생성하게된다. 이때, η 2 (C,O)-acyl 모드에서반응물흡착종과금속의결합에너 지가매우커금속의용출이일어나게되는것이다. 그러므로부티르산을반응물로이용할경우, 1) 부티르산을부탄올과완전히반응시켜부 틸부티레이트가촉매층과접촉하게하거나, 2) 에스테르화반응을사전에수행하여수첨분해 반응에공급하는반응기술을선택해야할것이다. [ 그림위16] 카르복실산의수소화반응시일어나는흡착및반응경로. 바. 부틸부티레이트/ 부탄올이용촉매반응실험수행 부틸부티레이트실험1의결과및해석: 반응물을부티르산을사용하였을때촉매가 leaching 되는현상이발견되어, 부티르산이 100% 전환되어부틸부티레이트를반응물로이용 하는실험을수행하였다. 공통된조건은부틸부티레이트과부탄올의비율이 1이며촉매양은 1 g, 압력은 20 bar 이며, 서로다른 4 개의반응조건에서실험을수행하였다. 표위2의 1번결과 는부틸부티레이트의전환이 27.9% 가되었는데, jacket, furnace와 junction의온도를조금 높인경우부틸부티레이트의전환율은크게변화가없었다. 그래서수소의유량을증가하였지 만실험측정값에서오차가크게나반응결과로서의의미가크지않다고판단된다. 이에수소

192 의유량을줄여실험오차를감소시켜소기의목적은달성하였지만부틸부티레이트의전환율 이 26.9% 로다시감소하였다. [ 표위4] 부틸부티레이트/ 부탄올이용촉매반응실험결과 Temperature( ) Flow rate Balance(%) BB error(%) Jacket Furnace Junction H 2 (ml/min) Liq.(g/min) Weight Carbon Conversion (%) , 55, SK 특허와비교: 상기반응을위하여참고하였던문헌은 SK 이노베이션에서발표한 KR 특허이다. 실험변수를면밀히살펴본결과, 반응물로서부탄올/ 부티르산 몰비가 2 이고, 액체의유량은 0.1 cc/min, 부티르산에대한수소의비율은 15, 압력은 1에서 부터 40 bar, 온도는 175 이었다. 여기서주목한것은촉매양인데, 특허에서는 13.6 g의 촉매를사용하여반응을수행하였다. 특허에발표된부탄올의수율은 20 bar에서 90 %, 30 bar에서 95 % 정도였다. 온도, 압력, 유량등의변수로볼때, 현반응조건과가장큰차이점 은촉매양이라고판단하였다. 부틸부티레이트실험2의결과및해석: 실험 1과마찬가지로반응물은부틸부티레이트와 부탄올의비율은 1 이며촉매는상용촉매(KATALCO 83-3M) 3.0 g을넣고반응변수를조 절하면서반응을수행하였다. 총 6 개의다른조건에서실험을수행하였는데, 1번을기준으로 수소의유량이 116 ml/min에서 168 ml/min 으로늘었을때, 부탄올의전환율이 25.3% 에서 38.9% 로증가하였고부탄올수율역시 8.7% 에서 25.8% 로증가하였다. 이는 HYSYS 시뮬레 이션결과와일치하는결과이다. 앞서실험한부틸부티레이트와부탄올비율이 1인실험에서 는수소의유량이증가해도전환율이크게증가하지않았는데이미유량이과하게흘러전환 율이 28% 에서크게증가하지않아압력의증가를다음으로고려하였다. 반응압력을 40 bar 까지상승시키면서 furnace 온도를 243 로증가시켜수첨분해반응이원활이일어나도록 하였다. 그결과, 부틸부티레이트의전환율은 74.3% 로증가하였고부탄올의수율역시 61.7% 로높아진것을확인하였다. 다음으로부탄올의수율을높이고자 furnace의온도를 273 까 지증가시켰더니부틸부티레이트의전환율은증가하였으나부탄올의수율은 60.0% 로감소하

193 였다. 이결과로보아 40 bar 의수소압력에서온도증가는큰의미가없는것으로판단된다. 그다음으로수소유량증가를통한부탄올생성율을높이고자하였다. 그결과, 부탄올의수 율은 65.7% 까지증가하였다. 마지막으로반응조건중에크게작용했던압력을 40 bar에서 50 bar 로증가하여촉매반응실험을수행한결과, 부틸부티레이트의전환율은 82.6%, 부탄올 의수율은 64.5 % 로크게결과차이가나지않았다. 이와같은일련의반응실험결과로부터 이상적인반응조건은반응압력은 40 bar, furnace의온도는 270, 부틸부티레이트와수소 비율은 30 정도라고판단하였다. [ 표위5] 부틸부티레이트/ 부탄올원료로이용하여반응변수에따른영향조사(BB/BuOH = 1) P (bar) Jacket Temperature ( ) Flow rate Balance (%) Furnace Junction H 2 (ml/min) Liq. (g/min) Weight Carbon BB Conv. (%) BuOH Yield (%)

194 2. 부탄올생산을위한화학촉매최적화 가. 고농도의침전제농도및침전제를이용한구리함유촉매제조 부틸부티레이트를수소첨가하여부탄올로생성하기위해서는수소를흡착할수있는금속 이들어있는촉매가필요하였다. 이를위해서귀금속계열의촉매보다는값이저렴하면서널리 사용되는구리기반촉매를제조하였다. 1 차년도에서제조하였던촉매는구리, 아연, 알루미늄 또는지르코늄전구체를이용하고염기침전제로촉매를제조하는공침법을이용하였다. 공침법은두가지이상의금속산화물이혼합된촉매를제조하거나활성점의개수를많게 하기위한방법으로, 금속전구체용액과침전을일으키는침전제용액을섞어촉매전구체를 합성한다. [ 그림위17] 를보면본과제를연구하면서두가지방법( 일반공침법과역공침법) 을 사용하였다. 첫번째방법을사용하였을때는오일조에있는 3구플라스크안에금속전구체 용액을넣고침전제용액을펌프를이용해일정한속도로주입하게되면침전물질이얻어진 다. 역공침법은물질을혼합하는순서를바꾸어서침전제용액을오일조에들어있는 3구플라 스크에넣고금속전구체용액을넣어주었다. 공침법을이용하여촉매전구체를합성한후필터를통해서여과한물질을오븐에건조하 게되면 precursor catalyst라고부르는 M x(oh) y(co 3) z 형태의물질을얻게된다. 이어서 box furnace를통해서열처리를하게되면 metal oxide 형태인 calcined catalyst 가된다. 이를실제반응에사용하기위해서는산화구리를환원시켜활성물질인구리금속형태인 reduced catalyst 로바꾸어반응에사용하게된다. 반응실험을하기전에세가지형태의촉 매(precursor, calcined, reduced catalyst) 에대해서성질을알아야하므로, 이에 X-ray diffraction, thermogravimetry, temperature-programmed reduction, N 2 O chemisorption 분석법을수행하였다

195 [ 그림위17] 구리함유촉매제조장치및절차. [ 표위6] 고농도의침전제농도및침전제를이용한구리함유촉매의라이브러리 Catalyst code Cu Zn Al Method CZA151N NP CZA241N NP CZA421N NP CZA511N NP CZA151R RP CZA241R RP CZA421R RP CZA511R RP 나. 구리함유촉매특성라이브러리구축 (1) Precursor catalyst 의결정구조분석 구리함유촉매특히구리, 아연, 알루미늄이들어간촉매는합성가스로부터메탄올을합성 하는촉매로서많이사용되었고연구도많이진행되었다. 특히, precursor catalyst의결정구 조가매우중요하다고알려져있는데들어가는금속의비율및이온의형태에따라서

196 malachite (Cu 2 (CO 3 )(OH) 2 ), rosasite ((Cu,Zn)(CO 3 )(OH) 2 ), zinc carbonate hydroxide hydrate(zn 4CO 3(OH) 6!H 2O), hydrozincite(zn 5(CO 3) 2(OH) 6), aurichalcite ((Cu x Zn 1-x ) 5 (CO 3 ) 2 (OH) 6 ), zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate (Zn 6 Al 2 (OH) 16 CO 3 4H 2 O), copper zinc aluminum oxide (Cu 0.4 Al 0.75 Zn 1.85 O 5 ), copper zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate (Cu 2Zn 4Al 2(OH) 16CO 3 4H 2 O) 등이생성된다 고보고되고있다. [ 그림위18] CZA511N, CZA421N 촉매와 malachite 결정구조비교및참조논문. 본연구에서합성한구리함유촉매에대한결정구조를파악하기위해서공침법으로합성한 촉매에대해서살펴보았다. [ 그림위18] 의왼쪽그림을보면아연과알루미늄이빠진구리만 첨가된물질을합성하면 malachite 가형성된다. 구리가가장많이들어있는 CZA511N, CZA421N 촉매와비교하면비슷한형태를가지지만 2 theta 값이다른것을확인하였다. Behrens 연구진(Eur. J. Inorg. Chem., 2009, ) 의결과에서아연이구리자리를 대신하고들어가면서 2 theta 값이점점바뀐다고밝혔다([ 그림위3] 의오른쪽그림). 이는 본연구에서합성한촉매에서도 CZA511N 보다 CZA421N이약 32 에존재하는피크가높 은 2 theta 로이동하는것을확인할수있었다. 그러므로합성한촉매 CZA511N, CZA421N 은구리만존재하는형태인 malachite라부르는것보다아연이치환해서들어간구조인 zincian malachite 로봐야한다. 아연의비율이높은 CZA241N과 CZA151N 촉매는유사한 XRD 패턴을보였다. 아연의

197 비율이높기때문에 hydrozincite와 zinc carbonate hydroxide hydrate 형태중하나로예 상을하였다. [ 그림위19] 의왼쪽그림을보게되면파란선은 zinc carbonate hydroxide hydrate에해당하고빨간선은 hydrozincite의 2 theta 위치이다. 두결정구조를비교해보았 더니 hydrozincite보다는 zinc carbonate hydroxide hydrate 에가까운것을확인하였다. 다 른점은 CZA241N 촉매에서는 zincian malachite 가일부존재하는것으로확인이되었다. 아 연의비율이높음에도구리의결정구조를확인할수있었던이유는침전제의농도와관련이 있다. Matsuhisa 연구진(Catalysis, 1996, 12, 1-20) 의결과에의하면, 침전제의농도에따 라서결정구조의형태가변화한다고보고하였다. 자세히말하면, 농도가높은 1.2 M의탄산수 소나트륨을사용하는경우는 Cu/Zn비율이 4/6까지비율에서 malachite가 100% 나타나지만 그뒤로감소를하는반면에 0.1 M의낮은농도를사용하는경우는 8/2부터감소를시작하여 5/5에서는 0 에수렴하는것을보았다. 그러므로본연구에서는침전제의농도를 1.2 M로사 용하였기때문에아연의비율이높은 CZA241N 촉매에서도 malachite가관찰되는것으로판 단된다. [ 그림위19] CZA241N, CZA151N 촉매의아연결정구조비교및참조논문의침전제농도효과. 세가지금속이서로공존하는촉매에서알루미늄의위치는 [ 그림위20] 의왼쪽그림을통 해서알수있다. 2 theta 위치로판단하건데 zinc carbonate hydroxide hydrate와 zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate(zn 6 Al 2 (OH) 16 CO 3 4H 2 O) 결정구조가비슷해보이 지만 11, 23 를통해 zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate 임을확인하였다. 이 결정구조는뒤에설명할 thermogravimetry 결과에의해뒷받침되는데, 높은온도에서무게 감소가존재하지않는것으로보아이결정구조로보는것이타당하다. [ 그림위20] 의오른쪽

198 그림은 P. Gao 연구진(Catal. Sci. Technol., 2, 2012, ) 의결과로앞서설명한 zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate 결정구조에서는 400 C 이상에서무게감소 가없다는것을볼수있다. [ 그림위20] CZA241N, CZA151N 의알루미늄포함결정구조분석. [ 그림위18], [ 그림위19], [ 그림위20] 를통해서공침법으로제조한네가지촉매에대 해결정구조를전체적으로분석한결과를 [ 그림위21] 에정리하였다. 총세가지의결정구조 zincian malachite, zinc carbonate hydroxide hydrate, zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate 가있었으며, 촉매는구리와아연의비율에따라서존재하는양이변화하 였는데 CZA511N, CZA421N 촉매의경우구리의함량이매우많아 zincian malachite로주 로존재하였으며, CZA241N, CZA151N 촉매의경우 zinc carbonate hydroxide hydrate, zinc aluminum carbonate hydroxide hydrate로주로존재하지만 부 zincian malachite 가있는것을확인하였다. CZA241N 촉매에서는일 앞서정리한결정구조분석처럼역공침법으로제조한촉매에대해서도유사하게정리한결 과, 이전방법으로만든촉매와는다른형태의결정구조가존재하는것이파악되었는데이는 hydrotalcite 형태였다. [ 그림위22] 을통해서보면구리, 아연, 알루미늄이다같이존재하는 (Cu x Zn 6-x )Al 2 (OH) 16 CO 3 4H 2 O 결정구조에서구리와아연의비율에따라 2 theta가변화한 다는결과가보고되었다 (J. Catal., 1984, )

199 [ 그림위21] 공침법으로제조한 precursor catalyst 의결정구조분석정리. [ 그림 22] 에서구리의비율(x) 이 0, 2, 4일때의 hydrotalcite 결정구조와제조한촉매를 2 theta 기준으로비교했다. CZA421R 촉매는빨간색선과가장비슷하였는데이결정구조는 (Cu 2Zn 4)Al 2(OH) 16CO 3 4H 2 O 이다. 그리고일반공침법에서도나타난아연과알루미늄의혼 합결정구조인 Zn 6 Al 2 (OH) 16 CO 3 4H 2 O가 CZA241R, CZA151R 촉매에서도존재하는것을 확인하였다. 앞서 [ 그림위18] 에서보았던것과같이 CZA511R 촉매에서는 malachite와비슷한구조 가나타나는데, 2 theta 이동이보이는것으로보아구리대신아연이일부치환된 zincian malachite 인것으로판단되었다. CZA421R 촉매에서는 hydrotalcite 구조가대부분을차지하 였지만그보다구리함량이높은 CZA511R 촉매에서는 hydrotalcite 형태외에도 zincian malachite 가상당한양으로존재하는것을알수있다

200 [ 그림위22] Normal precipitation으로제조한 precursor catalyst 의결정구조분석정리. [ 그림위23] 역공침법으로제조한 precursor catalyst 의결정구조분석정리. 역공침법으로제조한촉매의결정구조를파악하여 [ 그림위22] 로정리할수있었다. 총네 가지결정구조가있다고볼수있는데구리함량이높은 CZA511R, CZA421R 촉매에는 zincian malachite 및 (Cu 2Zn 4)Al 2(OH) 16CO 3 4H 2 O 가있다. 그리고아연함량이높은 CZA241R, CZA151R 촉매에는 Zn 4 CO 3 (OH) 6 H 2 O, Zn 6 Al 2 (OH) 16 CO 3 4H 2 O 가존재한다

201 (2) Precursor catalyst의 TGA 분석 결정구조분석뿐만아니라열적안정성에대해서도알아보기위해서 TG 분석을실시하고 DTG(derivative thermogravimetry) 로무게감소기울기에대해서자세히살펴보았다. [ 그림 위24] 를보게되면일반공침법및역공침법으로만든 precursor catalyst에서 C 사이에관찰되는피크는분자사이에존재하는물에기인하는것으로알려져있다. 그리 고구리및아연함량에따라열분해피크의위치가변화하였다. 아연함량이높은 CZA241, CZA151 그룹의촉매는약 270 C 근방에서무게감소가일어나는데, 이는아연과관련된 zinc hydroxide carbonate 구조와관련이있는것으로보고하고있다(J. Chem. Soc., Faraday Trans., 94, 1998, ). 이논문에서는 Zn 5(CO 3) 2(OH) 6 가열분해로인해서 물과이산화탄소로빠지고아연산화물이만들어진다고보고하고있는데, 그온도가 263 C 로합성한촉매의 TGA 분석결과와동일하였다. 그리고 CZA421N, CZA511N 촉매는약 370 C 에서열분해피크가관찰되는데, 이역시같은논문에서 Cu 2(CO 3)(OH) 2 가물, 이산 화탄소, 구리산화물로분해되는온도가 327 C인것으로보고하였기때문에 malachite 형태 의구조가있는것으로유추할수있었다. 앞서 XRD 분석결과에서 2 theta 값이정확하지않 아아연이일부치환된 zincian malachite 라고가정하였는데, TGA 결과를통해서내린가정 이옳다는것으로결론낼수있었다. [ 그림위24] 공침법및역공침법으로제조한 precursor catalyst의 TGA 곡선. TGA 결과에서는이뿐만아니라특이사항이발견되었다. 역공침법으로합성한촉매의경 우 400 C부터최대 600 C 까지무게감소가관찰되었다. 문헌(Appl. Catal. A, 450,

202 2013, 1 12) 을통해확인한결과이는 high-temperature carbonate(ht-co3) 라고불리는 물질이라생각되었다. 일반적으로공침법을이용하여합성한촉매에서는금속과 hydroxy(oh - ) 기와 carbonate(co 2-3 ) 기가존재하는데열처리과정에서물과이산화탄소로 빠져나온다. 이중 carbonate가다른물질에비해서높은온도에서분해되는특이한성질이 역공침법으로제조한촉매에서발견되었다. [ 그림위24] 에서 C에서나오는피크가 HT-CO3에해당하는지를명확히하고 자 TG-MS 분석을실시하였다. CZA511R 촉매의경우 400 C 이상의온도에서무게감 소가가장많이일어나고있으며, [ 그림위25] 을통해서이는이산화탄소임이밝혀졌다. MS 분석에서 m/e=44 는이산화탄소분자량에해당하는데, MS 곡선이동일한형태를보이므 로이산화탄소는 HT CO3 분해에기인한것으로판단된다. [ 그림위25] Precursor catalyst CZA511R의 TG-MS 곡선. (3) Calcined catalyst의 XRD 분석 Precursor catalyst 의분석뿐만아니라소성을통한열처리후촉매(calcined catalyst) 의 분석도중요하여결정구조분석을실시하였다. [ 그림위11] 을보면두가지결정구조 tenorite(cuo) 와 zincite(zno) 가나타나는것을확인할수있다. 하지만알루미늄과관련된 결정구조는열처리온도가낮아서결정형태로나타나지않았다. Cu/ZnO/Al 2 O 3 촉매의경우 대부분 C 사이의온도에서열처리하여산화구리와산화아연형태의결정구조를 보인다. CZA511과 CZA421 촉매에서는산화구리형태만관찰되지만, 그보다구리함량이낮

203 은 CZA241 촉매에서는산화구리와산화아연이함께존재하고, CZA151 촉매는구리의함량 이낮아산화아연만관찰된다. [ 그림위11] 에서검정색선은역공침법으로제조한촉매를소 성하여얻은 XRD 패턴이며, 회색선은일반공침법으로제조한촉매의 XRD 패턴이다. 검정 색선을보게되면회색선보다피크의높이가낮은것을알수있다. 이는 Scherrer equation 을통해계산한산화구리의결정크기면에서역공침법을통해서제조한촉매가공침 법으로제조한촉매보다작기때문이다. Scherrer equation은 FWHM(full width at half maximum, 피크최대높이의절반에서폭) 을이용하여결정구조를분석하는방법으로피크의 높이가커질수록폭은줄어들게된다. 그러므로결정의크기는폭의크기와반비례하여폭이 작을수록결정의크기는커지게된다. : The mean size of the ordered crystalline domain : Shape factor; : X-ray wavelength; : Bragg angle : The line broadening at half the maximum intensity [ 그림위26] Calcined catalyst의 XRD 분석결과

204 (4) Calcined catalyst의 TGA 분석 [ 그림위27] 에 calcined catalyst의 TGA 결과를도시하였는데, 마찬가지로검정색선은 역공침법으로제조한촉매를나타내고, 회색선은일반공침법으로제조한촉매를가리킨다. 파란색으로표시한박스는소성전촉매와마찬가지로분자층내에존재하는물과관련된무게 감소에해당하며, 역공침법으로만든촉매중일부는열처리를하였음에도불구하고 400 C 이상의높은온도에서무게감소가일어나는것을확인할수있었다. TG-MS 분석을통해서 이산화탄소가나오는것으로보아이또한 HT CO3라고판단된다. [ 그림위27] Calcined catalyst의 TG곡선및 CZA241R의 TG-MS 곡선

205 (5) Calcined catalyst의 TPR 분석 열적안정성을평가한후, 소성촉매를이용하여 TPR(temperature programmed reduction) 분석을실시하였다. TPR 분석을통해소성된촉매의구성중산화구리가수소에 의해환원되는정도를알수있다. 제조한촉매는구리의함량이서로달라환원되는양이서 로다르기때문에, 아래식에의해계산되는 K값을동일하게맞추기위하여시료양을조절하 였다. : K-value, : Sample weight, : H 2 flow rate, : H 2 concentration [ 그림위28] 의위쪽그림에역공침법으로만든촉매( 검정색선) 및일반공침법으로제조 한촉매( 회색선) 의 TPR 곡선을나타내었다. TPR 곡선의형태를보게되면아연의양이많 아질수록환원온도가고온으로이동하는것을알수있다. 합성법의차이로인하여환원온도 가증가하는정도가달라지는데, 일반공침법으로만든촉매보다역공침법으로만든촉매가환 원이고온에서일어남을알수있다. CZA241 촉매의환원은 C에서 C로 늦춰지고, CZA151 촉매의경우 C에서 C 로늦춰졌다. 아연의함량에따라서환원온도가이동하는현상은 calcined catalyst에서존재하는 HT-CO 3 의양과관련이있는것으로확인되었다. 소성을통해서완벽히제거되지못한카보 네이트가잔존하는촉매에서는산화구리가환원되는것을막고있는것으로보였다. 이는 [ 그 림위28] 의아래쪽그림을통해서확인할수있다. 구리의비율이낮을때 HT-CO 3 의양이 역공침법으로만든촉매에서많기때문에산화구리의환원이고온으로이동한것으로판단된 다

206 [ 그림위28] Calcined catalyst의 TPR 및환원온도와 HT-CO 3 의양과의관계. (6) 부틸부티레이트수첨분해반응활성평가 부틸부티레이트를수첨분해반응하여부탄올을생성하는반응에합성한촉매를도입하여실 험을수행하였다. 촉매량 0.4 g, 압력 10 bar, 촉매층온도 230 C, WHSV 9, H 2 /BB 20으 로반응조건을정하였다. [ 그림위29] 의위쪽그림을살펴보면구리의비율및합성방법에 따라활성이다른것을알수있다. 합성방법에따라활성이조금씩다르긴했지만 CZA421 촉매를제외한나머지비율에서는역공침법으로합성한촉매의활성이우수하였다. 특히, 구리 의비율이높은경우촉매활성이크게차이가났다. 이러한차이에대한이유를알아보기위해 촉매의활성을특성과연관시켜보았다

207 [ 그림위29] 구리의비율에따른활성및구리표면적과의활성관계. 구리기반의촉매에서는구리의표면적이활성과관련이높은것을알려져있다. 구리표면 적이증가함에따라촉매의활성이증가하는사전연구 (Catal. Comm., 12, 2011, ) 에서살펴보았던것처럼, 두개의제조법으로합성한촉매의구리표면적과활성을연관 시켜보았다([ 그림위29] 의아래쪽그림). 그결과, 일반공침법으로만든촉매와역공침법으 로만든촉매역시선형적인관계를보이지만그기울기가달랐다. 역공침법으로합성한촉매 는넓은범위의구리표면적을가져서활성은높게관찰되지만그만큼활성이증가하지않아 기울기가낮은것으로판단된다. 구리표면적뿐만아니라, HT-CO 3 가하나의활성지표로사용할수있을것으로판단되었 다. HT-CO 3 는역공침법으로제조한 precursor catalyst와 calcined catalyst에서발견되었

208 으며, TGA 결과를바탕으로정량화할수있었다. Precursor catalyst의 HT-CO 3 양이많은 촉매가부탄올수율이높았다. Calcined catalyst에서는 HT-CO 3 양이적은촉매가부탄올 수율이높았다. 이는 precursor catalyst가가지는 HT-CO 3 양이많을수록, 소성과정을통해 얻어진 calcined catalyst가가지는 HT-CO 3 양이적을수록활성이좋게나온다고볼수있 다. M. Schur 연구진의결과에서 HT-CO 3 의존재로 Cu/ZnO 촉매의활성이증가한다고보고 하였다 (Angew. Chem. Int. Ed., 42, 2003, ). HT-CO 3 가촉매에존재하여구 리분산도를높여주고, 그결과구리의표면적이증가하여메탄올합성의활성도증가시켰다고 하였다. 그러므로본과제에서합성한 Cu/ZnO/Al 2 O 3 촉매의활성지표로구리표면적뿐만아 니라 precursor catalyst와 calcined catalyst가가지는 HT-CO 3 양이사용될수있음을확인 하였다. [ 그림위30] Precursor catalyst와 calcined catalyst의 HT-CO 3 양과의활성관계. [ 그림 30] 과같은고농도의침전제를이용하여제조한촉매의특성에대해활성과연과시 킬수있었다. 이런결과를정리하여, SCI 학술지인 catalysis commmunication에 2014년 volume 에개재하는성과를달성할수있었다

209 3. 발효추출물기반부탄올생산공정설계및최적화 가. 제조한구리함유촉매를이용한최적화실험 부탄올수율을최대로하는반응조건을찾기위하여, 구리표면적이 m 2 /g cat 인합성 한 CZA421R 촉매를이용하였다. 2 g의 CZA421R 촉매를사용하고, 35 bar 압력에서수행 하여얻은실험결과를 [ 표위7] 에정리하였다. 1번실험은촉매층온도 255 C, 부틸부티레 이트 3.69 g/hr, H 2 /BB 9.4 로하였고, 부탄올수율 78.1% 를얻었다. 1번실험대비부탄올 수율을높이기위해서 2 번실험에서는반응층온도를올려그결과, 부탄올수율은 78.1% 에 서 80.6% 로소폭증가하였다. 부탄올수율향상을위해서촉매의부담을줄여보고자부틸부티레이트주입량을 3.75 g/h 에서 2.64 g/h, 1.86 g/h으로줄이면서 3, 4번실험을동일한 H 2 /BB 값에서수행하였다. 부 탄올수율은 80.6% 에서 81.0%, 72.3% 으로변화폭이크지않았다. 5번실험에서는 H 2 /BB 값을올려수율을높이고자하였지만수율은 84.2% 에머물렀다. 이에 6번실험에서는부틸부티레이트의유속 7.42 g/h, 수소의유속 347 ml/min (H 2 /BB=18.1) 을이용하여촉매의처리능력을최대화하고자하였다. 그결과, 초반부탄올 수율은 82.3% 을보이다촉매층온도가일정하게유지하지못하면서 deactivation이일어나는 것을확인하였다. 이는온도그래프를통해약 40 C 정도변화가생기게되어실험을중지 할수밖에없었고, 그때의촉매는반응후촉매가빨갛게변한것을알수있었다([ 그림위 31] 아래쪽그림)

210 [ 표위7] 최대부탄올수율을얻기위한최적화조건실험결과 EXP. Liq. (g/hr) H2 rate jacket( C) junction furnace( C) weight carbon Conv. Yield H2/BB (ml/min) outer inner ( C) outer inner balance balance BB BuOH % 94.4% 83.8% 78.1% % 95.1% 85.4% 80.6% % 98.0% 83.0% 81.0% % 85.6% 86.6% 72.3% % 93.0% 91.2% 84.2% % 93.9% 88.5% 82.3% [ 그림위31] 촉매비활성으로시간변화에대한촉매층온도변화및촉매의반응전후모습

211 나. 부틸부티레이트의수첨분해반응의 kinetic 연구 [ 표위8] 부틸부티레이트수첨분해반응의 kinetic 연구를위한조건및결과 No. SV (h-1) T ( C) H2 BB Diluent (kpa) (kpa) (kpa) H2/BB BuOH Yield (%) 비고 1 120, , , , , , , by-products 8 40, by-products 9 40, 부틸부티레이트수첨분해반응의 kinetic 연구를위해 [ 표위8] 과같은조건에반응기는 Quartz Reactor 를사용하였으며, P=1atm, Total flow rate = 100 or 200 cc/min, Time=3hr, Catalyst volume = 0.1 or 0.15 cc 의실험조건으로실험을수행하였다. 앞서사 용한조건과는많이차이나는이유는전환율이높을수록역반응도진행되는문제점도있을수 있으며, 정확한 kinetic을조사하기위해서는낮은전환율에서측정을해야하기때문에조건이 상이하다. [ 그림위32] 세가지변수인 BB 의농도, 수소의농도, 온도에따른부탄올생성속도비교. [ 그림위32] 는부탄올생성속도를세가지변수인부틸부티레이트, 수소의농도및온도에 따른변수와비교하는것이다. 먼저부틸부티레이트의농도는부분압력으로변환하여부탄올의 생성속도의 log 값과비교하였을때거의직선의경향을잘따르는것을볼수있다. 특히높 은온도일때생성속도를일정비율로높여준것으로볼수있다. 이는수소의비율에따라서

212 도마찬가지이다. 하지만부틸부티레이트의비율이증가하는것에따른생성속도의증가만큼 증가하지않는것으로보아부틸부티레이트의영향이더큰것을생각할수있다. [ 그림위32] 의오른쪽에있는그림은온도의역수와비교한것으로이를비교하는것은 arrhenius plot 이잘적용되는지보기위해서이다. 아래의식이 arrhenius plot에사용되는식 이며, k 는속도상수이다. 그리고 A는 pre-exponenetial factor 이고, Ea 는활성화에너지, R은 기체상수, T 는온도를가리킨다. 촉매를사용하여반응을활성화시킨다고할때활성화에너지 값을낮춰준다고하며, 낮은온도를통해서더많은생성물을생산하는것을목표로한다. 이식을다시변형하여보면, 속도의 log 값은온도의역수와선형적인값을가진다. 이론적 으로는선형적이지만여러반응이합쳐져있거나예상하지못한변수가들어가게되면실제로 는선형적인형태가나오지않을수도있다. 하지만본연구진의결과는거의선형적으로잘 맞는것을볼수있다. log log log Arrenhius 식을다시변형하여 empircal power law reaction으로변형하면아래의식으 로정리할수있다. 온도에대해서도변화하며, BB의농도와수소의농도에도영향을받기때 문에이에대한상수값을찾을수있다. 여기에사용한반응조건은촉매 0.15 g, space velocity 120,000 h -1, 부틸부티레이트의농도 4 7 kpa, 수소의농도 kpa 이다. 온도 는 546 K부터 575 K로약 10 K 마다속도를측정하였다. 546K에서의속도상수는 1.11X10-4 mol/h/gcat/kpa -( α+ β) 575 K에서는 2.31X10-4 mol/h/gcat/kpa -( α+ β) 의수치를 가지는것을확인하였고, 이결과를토대로계산을하였을때, pre-exponenetial factor의값 은 94.8 mol/h/gcat/kpa -( α+ β) 을가지며, α 는 0.67±0.02, β 는 0.25±0.02 이다. 그리고최 종적으로활성화에너지는 62±0.5 kj/mol 이라는결과를얻을수있었다. log log log log

213 [ 표위9] Empirical power law equation을이용한 kinetic parameter T (K) k (mol/h/gcat/kpa -( α+ β ) ) A (mol/h/gcat/kpa -( α+ β ) ) α β Ea (kj/mol) ± ± ± 앞서계산한수치를기반으로 empirical power law equation에대입하여실제속도값과 얼마나차이가나는지 [ 그림위33] 에비교하여보았다. 거의차이없이잘맞는것을확인할 수있었다. 이는반응이어떻게진행되지고려하지않고, 농도나온도에비례한다는일반적인 이론을이용하여계산한값이기때문에조금더정확한 가지고수행해야했다. kinetic 연구를위해서는반응모델을 [ 그림위33] Empirical power law equation을이용하여얻은 parameter를사용하여계산한 수치와실제속도의비교

214 [ 그림위34] Langmuir-Hinshelwood 모델을이용한 rate-determining step에따른속도식 설정. 촉매반응모델중활성점에부틸부티레이트와수소가흡착된다는가정을한 Langmuir - Hinshelwood 모델을사용하였다. 그리고속도결정단계 (rate-determining step, RDS) 를 네가지가정하였다. 먼저부틸부티레이트가두개의활성점에붙는다고가정을하는것 (RDS-1), 부틸부티레이트의절반이활성점에붙은것과수소한원자가활성점에붙어있는 것이반응하여 C 3 H 7 CHO 로반응하는단계 (RDS-2), C 3 H 7 CHO가활성점에붙어있는수소와 반응하여 C 3H 7CH 2 O 가흡착점에붙어있는반응단계 (RDS-3), 나머지하나는 C 4H 9 O가흡 착점에붙어있는수소와반응하여부탄올로탈착되는단계(RDS-4) 가있다. [ 표위10] Langmuir-Hinshelwood 모델기반 kinetic parameter. T (K) k (mol/h/gcat/kpa) K 2 (kpa) K 3 (kpa -1 ) K 4 (kpa) K 5 (kpa -1 ) R 2 E a (kj/mol) ±

215 RDS-1 의반응식을이용하여계산한수치는 [ 표위10] 에나타냈다. 온도는 K 에해당하는결과값을이용하였다. 반응조건으로는촉매 0.15 g, space velocity 120,000 h -1, 부틸부티레이트의농도는 4-7 kpa, 수소의농도는 kpa 이다. 그결과활성화에 너지는약 61.5±8.0 kj/mol 이라는값을얻을수있었다. 모델을이용한식의결과로 R 2 은 0.96 이였다. 이결과는모델이없는 empirical power law equation을이용하여얻은수치와 거의차이가없는것을확인할수있었다. 각속도결정단계를가정하여얻은모델식을기반으로 [ 그림위35] 와같은결과를얻을수 있었다. X축은 observed rate 로측정값을나타내며, Y축은 calculated rate로 parameter를 계산하여계산된값을나타낸다. 그결과, RDS-1이거의정확하게들어맞는것을볼수있 다. [ 그림위35] Langmuir-Hinshelwood 모델을이용한계산값과실험값의비교. 다. 부탄올생성을위한공정도 실제공정을구축하기전에실험결과를기반으로 PFD(Process flow diagram) 을 [ 그림 위36] 과같이설계했다. 본 PFD 는여러가지실험변수가가정되어있다. 첫번째가정은전

216 단발효기에서오는부티르산의농도가 시간당 100 g의부티르산이 2 L 수용액으로들어온 다 였다. 두번째가정은추출기에서 부틸부티레이트가부티르산을 100% 추출한다 였다. 이가정을통해부티르산추출기를통과하면순수한물만빠져나가고 100 g 부티르산 / ml 부틸부티레이트용액이나오게된다. 이용액을촉매반응후배출되는부탄올 g/ 부틸부티레이트 20.9 ml 의용액과만나에스테르화반응기에들어간다. 세번째가 정으로 에스테르화반응기는부티르산과부탄올이 100% 반응하여모두부틸부티레이트전 환된다 고보았을때 84.1 g 부탄올/20.5 g 물/ ml 부틸부티레이트흐름이된다. 이 중끓는점이가장낮은물을먼저제거하고다음증류탑에서부탄올을모두제거한다 ml 부틸부티레이트는추출탑으로재순환하여추출용매로사용되고, 나머지 ml 의부틸부티레이트는촉매반응기로주입된다. 촉매반응기에서는부틸부티레이트전환율을 90%, H 2 /BB 비율 20 이로가정하였다. 반응기내부에는시간당 590,742 ml 수소가흐르고 반응으로부족해진 50,478 ml 수소는채워진다. [ 그림위36] 부탄올생성을위한 PFD(Process flow diagram). 설계한 PFD를기반으로 P&ID(Piping and instrumentation diagram) 를설계하였다. [ 그 림위37] 을보면추출기에서부티르산을물에용해된부틸부티레이트로추출한다. 분리된부

217 티르산은촉매반응으로생성된부탄올과만나에스테르화반응을한다. 첫번째 reboiler에서 물을제거하고두번째 reboiler를이용하여부탄올을제거한후남은부틸부티레이트를회수 한다. 이후일부의부틸부티레이트는촉매반응기에서수첨분해되어부탄올로전환된다. 미반응 수소는부스터를통해압력을상승시킨후, 저장탱크로재순환된다. 이공정도가조금더현실적으로실현되기위해서는증류를통해부탄올과물, 부틸부티레 이트를고순도로분리하는것이중요하다. 끓는점을보면부틸부티레이트 165 C, 부탄올 C, 물 100 C 이다. 부틸부티레이트는물과부탄올의끓는점차이가커서문제가되 지않지만부탄올과물을분리하는방법에있어서쉽지않을것이라판별되어, 분리하는순서 를바꾸었다. 물과부탄올을증류를통해기화시켜제거한후부틸부티레이트를활용하고그 뒤에물과부탄올을제거하는방법으로수정하였다. [ 그림위37] 부탄올생성을위한 P&ID(Piping and instrumentation diagram)

218 [ 그림위38] 수정된 P&ID 의에스테르화반응기및증류탑부분. [ 그림위36] 에서분별증류를통해부탄올과부틸부티레이트를분리하는순서를바꾸고에 스테르화반응기의구성요소를수정하는과정등을거치면서 [ 그림위37] 의 P&ID를설계하 였다. 빨간색부분은부티르산또는부틸부티레이트가흐르는흐름을나타내었고초록색선은 부탄올이흐르는흐름이고하늘색은물이빠져나오는부분이다. [ 그림위36] 의 PFD를구상할때추출기를통해서나오는물질의구성을 100 g 부티르산 / ml 물이나오는것으로가정하였지만, 정확한구성물질비율을확정하지못하여일 반적인에스테르화반응기로가정하였다. 두개의컬럼을사용하고내부에는이온교환수지가 채워질예정이며한쪽이반응되고있을때, 다른쪽은재생과정을거치며서로번갈아가며반 응할수있도록할예정이다[ 그림위38]. 라. (1) 고효율부탄올생산을위한신규촉매합성법고찰 신규촉매합성법고찰 구리함유촉매는구리표면적과밀접한관련이있으며, 구리표면적을획기적으로늘릴수 있는방법을고안한다면고효율의부탄올생산을할수있을것이라판단하였다. 이 A. Budiman 등(Appl. Catal. A, , 2013, ) 의결과에따르면에틸렌글리콜을

219 이용하여 Cu/ZnO/Al 2 O 3 촉매의구리표면적을넓힐수있었다. 구체적으로살펴보면에틸렌 글리콜의효과만존재하는것이아니라역공침법에에틸렌글리콜을더추가하여일반공침법과 비교를하였다. 만일촉매의합성에영향을준다면, 침전시금속이온과 hydroxy 및 carbonate 기가리간드로연결되어있는복합체가형성될것으로판단하였다. 이지나면서입자성장이되므로복합체들이서로뭉쳐질때에틸렌글리콜이 공침법에서시간 chelate를형성 하게되면입자의성장을조절할수있을것으로예상하였다. 에틸렌글리콜대비 hydroxy기의수가증가한다면복합체에많은영향을줄수있을것이 고, chelate 를형성할확률이높을것으로예상할수있다. [ 그림위39] 에서보는것처럼보 면글리세롤또는자일리톨, 솔비톨도가능성이있을것이라보았다. 또는탄소의수가증가할 수록 chelate 길이를조절할수있다면, hydroxy기가금속과결합하는데필요한최적길이가 존재할것으로생각되어글리세롤을먼저이용하였다. [ 그림위39] 침전물입자크기조절을위한용매가능성. 이에금속전구체용액또는침전제가들어있는용액에 200 ml의물대신 200 g의글리 세롤을넣어서합성하였다. 합성한촉매의구리표면적을계산해보니, 기존의 CZA511R 촉매 보다구리표면적이높지않은것을확인하였다[ 그림위40]

220 [ 그림위40] 글리세롤을이용한침전방법으로제조한촉매의구리비표면적. 이러한이유에대해서살펴보면사용한용액농도가매우높았기때문으로추측된다. 즉, 높은농도로인해글리세롤이금속과결합을하는것보다침전을일으키는 carbonate와 hydroxy 이온과결합을많이했을것으로보인다. 금속전구체와침전제의농도를낮게하면 글리세롤의농도를높이는효과가있을수있으므로, 이를이용해현재보다높은구리표면적 을가지는촉매를합성할수있을것으로기대된다. 구리기반촉매중지지체로써알루미늄도쓰이지만지르코늄도자주사용된다. 1차년도에 제조한촉매중지르코늄이포함된촉매가있었다. 이에대해서분석을자세히표현하지못한 이유는아직까지지르코늄에대한연구가충분하지않기때문이다. 먼저알루미늄은구리, 아 연과함께어우러져다양한결정구조가관찰되지만, 다양한연구들이수행되어많은결과가발 표되었다. 그러나지르코늄이포함된촉매는 precursor catalyst에서부터지르코늄과관련된 결정이나타나지않으며, 550 C 이상의높은온도에서만나타난다고알려져있다. 하지만 많은연구진들이지르코늄이지지체또는조촉매로서활성을높여준다고보고하고있어이에 대한연구가필요하다. 지르코늄과관련된연구결과(Peter Southon, Ph. D thesis, 2000) 에서 ZrOCO 3 에질산을 넣어지르코늄이 OH와 NO 3 가이온상태로존재하는것이아니라고분자처럼 OH 다리를통해 연속적으로연결되어있는것을발견하였다. NO 3 이온은세가지상태가있었는데, 지르코늄 에직접연결되어있거나지르코늄과인력은존재하되특정층에존재하거나층외곽에이온

221 상태로존재한다고보고하고있다. 이에지르코늄의이러한특징을이용해구리와아연이포함 되어있는지르코늄촉매를제조하고자하였다. [ 그림위41-1] 구리와아연의 precursor catalyst의 XRD. 상술한지르코늄의특성을증명하고자구리와아연이혼합되어있는결정구조를만들고이 를지르코늄이치환해들어가게되면결정구조를바꿀수있을것이라보았다. 구리와아연이 혼합되어있는 aurichalcite 를합성하려하였지만기존의합성방법으로는 [ 그림위41-1] 에서 보듯이생성되지않았다. 회색선은일반공침법으로제조한촉매의 XRD 패턴이고검정색선 은역공침법으로제조한촉매의 XRD 패턴이다. Rosasite, aurichalcite, aurichalcite와닮은 형태도합성되지않은것을확인하였다. 구리와아연의비율이 3:7 정도면다른문헌에서는 충분히합성이되는것과달리결정구조가달랐다

222 [ 표위11] Aurichalcite 합성조건정리 Aurichalcite 를합성하기위해다른문헌들에서사용한합성조건을정리하였다[ 표위11]. 비교 분석한결과, 침전제의농도차이로인해 aurichalcite가합성되지않은것을확인하였 다. 이를토대로 aurichalcite를합성하기위해노란색박스로표기한부분에침전제의농도를 기존 1.2 M에서 0.1 M 로바꾸었으며, 침전온도역시맞춰주기위해 5 C 낮게설정하였다. 주입속도는기존 4 cc/min을 2 cc/min 으로줄였고, 구리와아연의비율은 3:7 로하였다. 합성방법을변경한후, 구리와아연의비율이 3:7인촉매는성공적으로 aurichalcite로제 조되었다. 근거로는 [ 그림위41-2] 의왼쪽그림을보면 (Cu 0.2 Zn 0.8 ) 5 (CO 3 ) 2 (OH) 6 (PDF# ) 인 aurichalcite 와합성한촉매가일치하는것을확인할수있다. [ 그림위 41-2] 의왼쪽그림안의그림(Chem. Eur. J., 9, 2003, ) 을통해서구리/ 아연의 비율이 30:70, 70:30 인촉매가기존과동일하게합성되었음을확인하였다. [ 그림위41-2] 의 오른쪽그래프는 FT-IR 결과로, M. Behrens 의결과(Eur. J. Inorg. Chem., 2009, ) 와흡사한데, aurichalcite의 footprint인 1208 cm -1 에서흡수가일어나고다른 wavenumber 에서도거의일치하는것을볼수있다

223 [ 그림위41-2] 구리와아연의제조촉매의 aurichalcite 확인. [ 그림위41-2] 를통해서합성한촉매에지르코늄을넣어 aurichalcite를 malachite나 hydrozincite 로분리시키기위해서구리/ 아연비율이 3/7인금속전구체용액에지르코늄과 같이공침법으로촉매를제조하였다. 세가지금속전구체를한번에넣는방법이외에구리와 아연을먼저넣는방법, 지르코늄을먼저침전시키는방법을도입하여촉매를합성하였다. 세가지합성방법을도입한결과, 2 theta가나타나는위치뿐만아니라피크의크기역시 동일하였다([ 그림위42]). 지르코늄을구리및아연과같이넣어서합성을하였음에도 aurichalcite 가형성이되고, 구리와아연을같이혼합된결정구조를만드는것을확인하였다. 이를통해서지르코늄은결정구조를분리시키지못한다고판단하였다. 이뿐만아니라지르코늄 이처음또는나중에침전이되어도결정구조에는큰영향을주지못하였다

224 [ 그림위42] 구리, 아연, ( 지르코늄) 촉매결정구조. [ 그림위42] 을통해지르코늄이구리와아연의결정구조를분리시켜주지못하지만촉매의 화학적인특성관점에서다른점이있을것이라생각하였다. 그래서먼저지르코늄이들어간 효과를보기이전에두가지의금속으로이루어진 Cu, Zn의촉매의특성에대해서완벽한이 해가필요하다고생각하여지르코늄이제외된촉매에대해연구를진행하였다. (2) Cu, Zn 의원소로구성된촉매연구 [ 표위12] Cu, Zn 함유촉매제조한목록 Catalyst Code Cu Zn CZ100/ CZ90/ CZ70/ CZ50/ CZ30/ CZ10/ CZ0/

225 Cu, Zn 함유촉매의구성비는 Cu/Zn 100/0, 90/10, 70/30, 50/50, 30/70, 10/90, 0/100 으로제조하였다. 제조한촉매의이름은 [ 표위12] 와같이명명하였다. 공침법의변수는 앞서 aurichalcite 를제조할때의값과동일하며, 변하는값은금속전구체의비율이다. 이촉 매들을제조하여파악하고자하는것은 Cu, Zn 가어떤비율일때, 어떤특징과변하는형태를 살펴보고자한다. [ 그림위43] 구리, 아연촉매의 XRD 패턴및 DTG 곡선. [ 그림위43] 의왼쪽그림을보면 Cu, Zn precursor의 XRD 패턴이다. Cu만존재하는 CZ100/0의결정구조는 malachite(cu 2 (CO 3 )(OH) 2 ) 이고, Zn만존재하는 CZ0/100의결정구 조는 hydrozincite(zn 5(CO 3) 2(OH) 6 ) 이다. Cu와 Zn의비율에따라서 2 theta가달라지는것 을확인할수있는데, 먼저 Cu 가많은분위기인경우, 31.3 에해당하는 XRD peak가 32.5 로바뀌는것을 XRD 패턴을통해서확인할수있다. 다른 2 theta 구간 에해 당하는 XRD peak 는거의움직이지않았다. 이는 Cu 이온과 Zn 이온이가지는 d orbital의 특성에의해바뀐다고알려져있다. Cu 이온은 d orbital에전자가 9개존재하여 Jahn-teller distortion 을일으키는것을선호하는데, Zn 이온은 d orbital에전자가 10개존재하여 Jahn-teller distortion 을거의일으키지않는다고알려져있다. 그래서 Cu만존재하는 malachite의결정구조에 Zn가치환되어생성되는 zincian malachite (Cu,Zn) 2 (CO 3 )(OH) 2 는 Jahn-teller distortion 효과가줄어들어 XRD peak 가이동하는것을알려져있다. 그리고

226 malachite의 d(20-1) 에해당하는면은 Zn 가치환되는정도를나타내는지표로사용되며, 이 는약 28% 의 Zn 가최대로치환될수있는양이라보고하고있다. 본연구진의결과를보아 도, CZ70/30의 XRD peak가 CZ50/50 에서움직이지않은것으로판단하면, 30% 의 Zn가최 대한치환될수있는양이라생각할수있다. Zn만존재하는 CZ0/100의결정구조 hydrozincite(zn 5 (CO 3 ) 2 (OH) 6 ) 에 Cu가치환되면서 변화하는 XRD peak 도볼수있다. 이는 33.4 에서 33.8 로 2 theta가바뀐것을확인할 수있다. 앞서설명한것과마찬가지고 hydrozincite의 Zn자리에 Cu가치환되면서 aurichalcite (Cu,Zn) 5 (CO 3 ) 2 (OH) 6 의형태를가지는것을볼수있다. 특히 aurichalcite의 특징적인 XRD peak는 34 에해당하는데이는 hydrozincite의 XRD peak가 Cu의치환으로 이동되면서나타나는특징이라볼수있다. [ 그림위43] 의오른쪽그림은 Cu,Zn의 precursor의 DTG 곡선이다. CZ100/0은 malachite 가분해되면서나타난 DTG peak인데약 321 C 에서분해된것이며, CZ0/100은 hydrozincite 가분해되면서나타난것이며, 약 249 C에서 DTG peak 가나타났다. Cu에 Zn 가치환되어있는 zincian malachite 의경우를보면, CZ90/10의 DTG peak는높은온도로 움직인것을확인할수있고, Zn가최대한치환되었다고볼수있는 CZ70/30의 precursor의 DTG를보면 peak 가두개로나뉜것을확인할수있다. 두개의 DTG peak 중 400 C 이 상에서나타나는무게감소의원인을 HT-CO3라고하며 carbonate가분해되는것을앞의결 과에서도확인할수있지만 Cu, Zn 만존재하는촉매에서도나타나는것을확인할수있었다. 반대로 Zn 자리를 Cu가치환하는 aurichalcite 의경우를보면, zincian malachite와마찬가지 로높은온도로 DTG peak가바뀌며 CZ30/70에서 peak가두개로나뉘는것을확인할수 있었다. 그결과, CZ50/50에서도 DTG peak 가두대로존재하는결과를얻을수있었다. 이 는전형적으로 Cu, Zn precursor 에서나타나는결과이며, DTG peak가나뉘는것을볼때 Cu, Zn의어떤 synergy로인해 carbonate가분해되는온도를높여준것으로결론지을수있 다

227 [ 그림위44] CZ촉매의 precursor SEM 이미지. Zn만존재하는 CZ0/100의결정구조 hydrozincite(zn 5(CO 3) 2(OH) 6 ) 가가지는형태를보 기위해 SEM 분석을 [ 그림위44] 와같이실시하였다. 그결과 CZ0/100이가지는모양을보 면넓적한판이겹쳐져있는구형의입자로이루어져있다. Zn 자리에 Cu가치환되어있는 CZ10/90 의형태를보면판형의형태가무너지고긴막대기가뭉쳐져있는입자로이루어진 것을확인할수있다. CZ30/70의형태를보면 CZ10/90 의형태와비슷한것을볼수있다. 이를볼때 hydrozincite에서 Cu가치환된 aurichalcite는긴막대기의형태를가지며 hydrozincite 의판형모양을잃어버리는것으로이해할수있다. Cu만존재하는 malachite의모양은직육면체가모여있는형태로위쪽에서보았을때직 사각형이모여있는것을볼수있다. Zn에서 Cu가치환되면서모양이바뀌는것과는달리 Cu 의경우 Zn가치환되어있는 CZ90/10은직육면체가그대로유지되고있는것을확인할수 있다. 하지만, CZ70/30의 precursor 를보면거의직육면체의형태가없는것을볼수있다. 이는 Cu자리에 Zn 가치환되면서점점그형태가없어지는것을의미한다. 하지만 Zn에 Cu가 치환되는것과 Cu에 Zn가치환되는것은다른형태를보이는것을의미하며모양이달리변 하는것을확인하였다

228 [ 그림위45] CZ촉매 oxide 상태의 XRD 패턴과 SEM 이미지. [ 그림위43] 의오른쪽그림의 DTG를보면약 400 C에서 DTG peak가끝나기때문에 box furnace 를이용하여소성하였다. 소성을하면촉매의결정구조는 tenorite (CuO), zincite (ZnO) 로된다고알려져있다. 그래서 XRD 분석을진행해보았을때, [ 그림위45] 와 같은결과가나온다. Cu만존재하는 CZ100/0은 CuO 만발견되었다. Zn의비율이높아질수록 XRD peak intensity 가조금씩낮아졌고, CZ70/30에서는조금씩 ZnO의성장이일어나는것 을확인할수있었다. 그리고 CZ30/70에서는 CuO 의형태가많이사라지기시작하였다. Zn의 비율이높은 CZ10/90, CZ0/100에서는 ZnO 만발견되었다. [ 그림위45] 의오른쪽을보면 oxide의 SEM 을분석하였다. 산화된상태의촉매의형태는 precursor 의형태와거의유사한것을볼수있다. 열처리를통한소성단계를거치면표면에 구멍이나게되지만전체적인형태는바뀌지않는다. Cu가많은 malachite 기반의 CZ100/0 은직육면체가모여져있는입자를볼수있다. Zn가치환된 CZ90/10에서도아직전체적인 구조는직육면체를유지하고있지만더많은 Zn가치환된 CZ70/30은그형태가많이사라진

229 것을확인할수있다. Zn가많은 CZ0/100은판형이겹쳐져있는입자이지만 Cu가치환되어 있는 CZ10/90에서는판형의형태를잃어버리는것을 precursor에서보았던것과마찬가지로 확인할수있다. [ 그림위46] CZ촉매 oxide 상태의 HR-TEM 이미지. [ 그림위45] 와같이결정구조와모양변화의원인은 Cu와 Zn 이온이침전제와만나침전 이만들어질때부터나타난다고할수있다. Cu와 Zn 이온이침전되어 precursor 구조를형 성할때, 각각구조를가지는것이아니라, Cu가많은분위기에서는 Zn가치환되어 zincian malachite 를형성하거나, Zn가많은분위기에서는 Cu가치환되어 aurichalcite의형태를가지 게된다. 이는소성과정을거쳐금속산화물형태를가지더라도, 치환되어있는형태로인해입 자의크기가작으며, 서로붙어있는형태를가질것이라생각할수있다. 이를판단하기위해 서는 TEM 분석이필요하였다. [ 그림위46] 은 oxide 상태의 CZ90/10, CZ70/30, CZ30/70, CZ10/90을 HR-TEM 분석

230 을한결과이다. CZ90/10 의이미지를보면, SEM에서본결과와마찬가지로저배율에서볼 때, 구형의입자가뭉쳐서있는것을볼수있다. 이입자를고배율로확대해서보면, Cu의비 율이많지만 CuO 옆에 ZnO가바로붙어있는것을 electron diffraction을통해서확인할수 있었다. Zn의비율이조금더높은 CZ70/30 에서도같은결과가나타난것을볼수있었다. 이는 precursor에서 zincian malachite 가만들어지면서, Cu자리에 Zn가치환된것이산화물 인상태에서도같이붙어있는결과를만든것이라볼수있다. Zn의비율이높은산화물에서 도마찬가지로 CuO와 ZnO가붙어있게된이유는 precursor의상태에서 Zn의자리에 Cu가 치환되면서 aurichalcite 가만들어지고, 소성과정을거쳐서나왔기때문이다. [ 그림위47] CZ촉매의구리표면적과 BET 면적결과및 TPR 곡선. Cu와 Zn 의치환에따른효과는다른곳에서도발견할수있다. 먼저, 촉매의물리적인표 면적에해당하는 BET 분석을하였고, Cu의표면적을확인할수있는 N 2 O titration을실시하 였다. [ 그림위47] 의왼쪽그림을보면두가지의결과를 Zn 의비율에따라표현하였다. BET 면적을보면, CZ100/0의촉매는 12 m 2 /g 의값을가진다. 하지만, Zn의비율이 10% 늘어난 CZ90/10의촉매는 23 m 2 /g의값을가지며거의 2 배정도증가하는것을볼수있었다. 그리 고 Zn의비율이더늘어난 CZ70/30의촉매는 30 m 2 /g으로 CZ100/0보다약 2.5배증가했 다. 이는앞서 [ 그림위45] 에서살펴본결과를통해서이해할수있는데, Cu만존재하는 CZ100/0의경우직육면체가모여있는형태를보이지만 Zn가일부치환되는 CZ90/10의경우 에는이형태가조금씩무너지면서 CZ70/30에서는거의긴막대기가뭉쳐져있는형태를가

231 지게된다. 이런형태의변화가물리적인표면적을나타내는 BET 면적의값을크게증가시킬 수있는원인이되었다. Zn의비율이조금더높은 CZ50/50에서는 32 m 2 /g, CZ30/70에서는30 m 2 /g 그리고 CZ10/90에서는 30 m 2 /g으로측정된것으로보아마찬가지로촉매가가지는형태가긴막대 기형태와크게차이가없어거의비슷한결과를얻을수있었던것으로볼수있다. 하지만, Zn만존재하는 CZ0/100 촉매의경우 SEM의이미지를볼때판이여러장겹쳐있는것으로 볼수있고, Cu가일부치환되어있는 CZ10/90 촉매는긴막대기의형태를가지며표면적이 증가될수있을것이라생각할수있다. 그결과는 CZ0/100 촉매의 BET 표면적은 26 m 2 /g 으로 CZ10/90보다약 4 m 2 /g 정도작은것을확인하였다. 이정도의수치는매우작은차이 를나타내지만형태의변화가 BET 면적에도영향을준것이라볼수있다. Cu의표면적을측정하는 N 2 O titration은 BET 분석과는다른점이 Cu의관점으로측정이 된다는점이다. N 2 O titration을실시하는순서는 CuO으로존재하는촉매를환원처리를통하 여금속상태인 Cu 로만들어주고, 이어서 N 2 O 가스를주입하여 Cu-O-Cu로반응을시키며 나오는가스를확인하여반응할수있는 Cu 를확인하는분석방법이다. Zn가없는순수한 CuO으로구성이되어있는 CZ100/0의경우오히려 0 m 2 /g 의값을가진다. Cu로만구성되어 있으면입자의크기가매우커져서 N 2 O 를분해할수있는활성을가지지못하기때문이다. Zn가 10% 치환되어있는 CZ90/10의경우에도 0 m 2 /g 의값을가진다. 하지만 Zn가 30% 치 환되면매우크게증가하게되어 21.8 m 2 /g 값을가지게된다. 그보다 Zn의비율이높은 CZ50/50은 17.3 m 2 /g 의값을가지며점점줄어들게된다. 이는촉매의구성성분이 Zn의비 율이높아지기때문에입자가아무리작아진다고해도 N 2 O를분해시킬수있는자리의수가 줄어들게되어수치가감소하게된다. CZ30/70은 13.5 m 2 /g 의값을, CZ10/90은 2.1 m 2 /g의 값을가진다. Zn 만존재하는촉매의경우, 분해되지않아수치로표현하지않았다. 이결과를 보면 Zn의일부치환으로인해 CuO의입자사이즈가작아지게되면 N 2 O를분해할수있는 최대값을가지게된다. 그때의 Zn의비율은약 30% 가된다. Zn의비율이점점증가할수록 입자크기가줄어들면서 dispersion은증가할수있지만 N 2 O를분해할수있는절대양은줄 어들어구리표면적이감소하게된다. 이런 volcano 형태의그래프를가지는것은결국 Cu의 관점으로보지만이역시 Cu와 Zn의 synergy effect 로인한것으로볼수있다. Cu자리에 Zn가치환되면서 BET 면적이크게증가되어어느정도크게증가되지않는촉 매가 CZ70/30 이였고, 구리표면적의값이최대값을가진촉매역시 CZ70/30으로 Zn의치환

232 으로만들어진 zincian malachite가소성과정을거쳤음에도촉매의물성이나화학적인특성을 Cu 만존재하는물질에비해많이바꿨다고볼수있다. 산화물상태인촉매를환원능력을평가하기위해 TPR (Temperature-programmed reduction) 분석을실시하였고, [ 그림위47] 의오른쪽그림과같은결과를얻을수있었다. ZnO 는환원되지않는물질이고, CuO가환원가능한물질이라이분석을통해서확인할수있 는것은 CuO가 Cu 로되는온도나환원패턴을분석할수있다. 100% Cu인 CZ100/0의 TPR 곡선은넓은온도범위에걸쳐나타난다. 이는 Cu만존재하 다보니입자의크기가일정하지않아넓은범위에서수소의소모가일어난것으로볼수있다. Zn가일부치환되어있는 CZ90/10의곡선은약간범위가줄어들기는했지만약 200부터 250 C 에걸쳐수소가소모된다. Zn가더치환되어있는 CZ70/30의경우는 Zn가조금치 환되어있는 CZ90/10과는매우다르게어느특정온도에서매우뾰족한피크가나오는것을 볼수있다. 이는특정온도에서수소소모가매우빠르게일어난것을뜻하며, 입자크기가 매우고르다고볼수있다. 이피크의온도가다른촉매보다낮은것은환원이잘일어난다는 것을의미하기도한다. 이현상은 CZ50/50 촉매에서도나타나는것을확인할수있다. 하지 만피크가나타나는온도는조금높아진것으로보아 CuO의환원능력이최대가되는촉매는 CZ70/30 으로판단할수있다. CZ50/50은입자크기가고르게되어있겠지만 Zn의비율이높 아 Cu와 Zn의 synergy 로환원능력은상대적으로낮다고볼수있다. 이어서 Zn의비율이 높은 CZ30/70과 CZ10/90의환원능력은특정한온도에서뾰족한피크형태로보이는것이 아니라입자크기가큰것과같이환원패턴을볼수있었다. 이는 Zn의비율이높아지면서환 원될수있는양이적어지고표면에존재하는입자는주로 CuO보다는 ZnO의비율이많아져 특정온도에서환원이많이되지않는것을의미한다. TPR 분석을통해서살펴보았을때, Cu 와 Zn의 synergy effect에의해 CuO의환원능력이좋아지는것이 CZ70/30에서나타나는 것을확인할수있었다. Cu와 Zn의구성원소로이루어진촉매의특성에 대해이해한결과를정리하여 SCI 저널인 catalysis communication 에제출한상태이다. 마. 고활성촉매합성을위한조촉매 ZrO 2 의역할연구 Cu와 Zn 로만구성되어있는촉매는고활성을가지는데한계가있다. 그래서다른이종금속

233 을이용하여고활성촉매를개발한다. 앞서는 Al 에대해서소개를하였다. Al은상업적으로지 지체의역할을하면서활성을증가시킬수있다고알려져있었다. 하지만최근에 Behrens 연 구진(J. Am. Chem. Sco. 2013, 135, ) 에서는지지체의역할이아니라조촉매의 역할로서 Al 이사용될수있다는결과를보고하였다. Al 3% 의주입으로인해활성이 Al 0% 에비해약 180% 증가하였다. 소량의 Al은고활성을가지는형태의 precursor 결정을유지 하는데이는 zincian malachite라고하여 Zn가치환된 malachite 형태이다. Al이많은상황에 서는 hydrotalcite라고하여 Cu, Zn, Al 이다같이합쳐져있는결정구조를가리키고, 활성을 저하시키게된다. 고활성을가지기위해서는 hydrotalcite 형태가아닌 zincian malachite 형 태를가져야하고, 소량의 Al 주입이이를가능하게하였다. 그리고 Al 뿐만아니라 Ga, Cr등 도같은역할을할수있는것으로보고하였다. Al과마찬가지로많이쓰이는물질이 Zr 이다. Zr은 Al 과달리어떤역할을하는지정확하게보고된것이없고, 어떤연구진은활성을증가 시킬수있는조촉매로서사용할수있다고이야기하는반면, 지지체로서의역할을강조하는 보고도존재하였다. Cu, Zn로구성된촉매에서 Zr의역할이어떤것인지확인하기위해서최근연구가되고 있는기준에맞추어확인해보고자하였다. Zr이조촉매로서역할을한다면 Zn의치환이더일 어나서 2 theta가많이이동된 zincian malachite 의결정구조를확인할수있고, 산화물인상 태에서는 Cu, Zn, Zr 이고르게퍼져있는형태를가지며, 활성은 volcano 형태를가질것으로 예상할수있다. 반면에 Zr이지지체로서역할을한다면 Zn가더치환되는형태는나타나지 않을것이며 Cu, Zn, Zr 이고르게퍼져있지않을것이고, 활성은 volcano 형태를나타날지는 알수없었다. Zr 의주입으로인해나타나는특징을보기위해서다음과같이촉매를준비하였다. Cu/Zn 의비율은 7:3 으로고정하였다. 앞서, Cu/Zn 촉매를연구하였을때, 가장 synergy effect가 높았던비율이기때문에이비율이정했다. 그리고 Zr의비율은 0부터 6까지다양하게준비하 였다. 이론적인구성비는촉매를제조할당시넣어주는원료를통해서계산하였는데, Cu와 Zn 는수화물의계수가정해져있지만 Zr 은정해져있지않았다. 그래서 XRD 분석를하였을때, 금속전구체의물질이 4.7 개의물분자와결합되어있는형태를가진다는것을확인하였고, 이 를근거하여계산하였다. 실제촉매가가지는금속의비율은 SEM-EDS 를이용하여측정하였다. 그수치는크게차이나지않는것을 [ 그림위48] 보면알수있다. 촉매합성은공침법을이용하였는데, 0.1 M NaHCO 3 와 1.2 M Cu 2+, Zn 2+, Zr 4+ 의두용

234 액을준비하였다. Oil bath 안에는침전제인 0.1 M NaHCO 3 용액을넣어온도를약 70 C 로설정하였다. 금속이온이들어있는용액을약 2 cc/min 으로주입하여침전을시켰다. 이어 서 90분간 aging단계를거쳐 filter cake 을얻을수있었고, 이를 105 C 오븐에건조시켜 precursor 를얻었다. 추가적인활성이나분석을위해 Cu:Zn의비율이 1:9, 2:7, 5:5, 9:1이면 서 Zr의비율이 0, 1, 6 인촉매를합성하였다. [ 그림위48] Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의제조방법및구성비. Zr이주입되어 Cu, Zn의촉매에어떤역할을했는지보기위해먼저환원된상태에서어 떤형태를가지는지확인해봐야해서 [ 그림위49] 에나와있는 XRD 분석을실시하였다. 환원 된상태에서는금속상태인 Cu와 ZnO 의형태만확인되었다. 그리고 Cu(111) 이매우뾰족한 형태를가지고있어살펴보면, Zr이들어가있지않은 Zr0의 XRD peak가뾰족하지만 Zr이 들어가는촉매들은점점높이가낮아지는것을볼수있고, 폭도조금씩넓어지는것을관찰할 수있다. 이를재확인하고자 Scherrer equation을통해서 crystal size 를계산했다. Zr0의촉 매는 18.4 nm 이고, Zr0.5는 15.4 nm, Zr1 6은 13.9 nm 로동일한것으로계산되었다. Zr0 과 Zr0.5는매우뾰족한 XRD peak로인해 crystal size 가크게나온것이고, Zr1 6은폭이 크게바뀌지않아 crystal size가같게나왔지만 Zr1이조금더뾰족한것을 XRD 패턴을통 해서확인할수있다

235 [ 표위13] Cu(111) crystal size와 Cu dispersion 비교 Cu(111) crystal size (nm) D Cu (%) Zr Zr Zr Zr Zr [ 그림위49] 환원된 Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의 XRD 패턴. Zr의주입으로입자크기가줄어든다면 Cu dispersion 은증가할것이라생각하여 [ 표위 13] 에나와있는것과같이계산을했다. Cu dispersion의계산은표면적에있는 Cu는 N 2O titration 을이용하여계산하는구리표면적을이용하였고, bulk에존재하는 Cu의양은 TPR profile을적분하여 bulk Cu 의양을계산했다. 그결과 Zr0은 6.5% 로다소낮지만 Zr0.5만 되어도 Cu dispersion은 8.7% 로급격히증가하였다. 이어서 Zr1일때는 10.8% 로 Zr0과비 교하여약 1.5 배이상증가하였다. 하지만 Zr4, Zr6은크게증가하지않은 11.3%, 12.4% 인 것을알수있었다. Zr의양이증가할수록같은비율로증가하지못하는것은 bulk Cu가감소 되는것만큼구리표면적의수치가오히려더많이감소되었기때문이다

236 [ 그림위50] 환원된 Cu/ZnO/ZrO 2 촉매의구리표면적과부탄올생성속도의상관관계. Al 이들어간촉매에서는구리표면적과부탄올생성속도의관계는선형적인상관관계를가 지는특성을확인하였고, Zr 이포함된촉매에서도적용되는지확인하기위해 [ 그림위50] 와 같이상관관계를그려보았다. Cu/Zn의비율이 7:3인촉매에서선형적인관계를가지는것을 확인할수있었고, 다른 Cu/Zn 의비율에서도마찬가지로같은결과를확인할수있었다. Cu/Zn 비율중가장넓은구리표면적을가지고있는촉매는 7:3 비율이고, 활성도가장 높은것으로확인되었다. 이비율에서의구리표면적범위는 m /g이고부탄올생성 속도는 mmol/h/gcat이였다. 가장높은활성을보인촉매는 Zr이포함되어있는촉 매로 Zr1 이였다. Zr 의주입으로인해구리표면적이넓어지고활성도높게된것이다. Zr의 어떤역할에때문에이와같은현상이발생했는지이해하기위해서는그전단계인금속산화 물의상태에서의특징을이해할필요가있다

237 [ 그림위51] 금속산화물상태의 CuO/ZnO/ZrO 2 촉매의 XRD 패턴. [ 그림위51] 을보면금속산화물상태의 XRD 패턴이다. Cu/Zn의비율이 7:3이라주로결 정을가지는형태는 CuO이고 ZnO 는잘보이지않는형태이다. 하지만여기에서도 Zr과관련 된어떤결정의형태는확인할수없다. Zr이많은비율에서는 XRD peak가낮아지고넓어지 는경향을가진다. 그래서 peak가가장뾰족한 CuO(-111) 을앞서 crystal size를계산한방 법과동일하게이용하여계산을하였다. Zr이없는 Zr0은 6.1 nm, Zr0.5는 5.9 nm, Zr1은 5.8 nm, Zr4는 5.8 nm 그리고 Zr6은 5.7 nm 로계산되었다. 이렇게 crystal size가작아진 다는뜻은물리적인입자크기도작을것이라생각할수있고, 입자크기가작을수록보통 BET 면적이증가한다고알려져있어 BET 분석을실시하였다. 그결과 Zr0인촉매는 31 m 2 /g, Zr0.5는 58 m 2 /g, Zr1은 68 m 2 /g로 Zr을소량넣었음에도불구하고면적이거의두 배정도증가하는것을확인하였다. 이어서 Zr4는 102 m 2 /g, Zr6은 100 m 2 /g 의값을가졌다. Zr이매우높은비율에서는 Zr의양의증가가더넓은 BET 면적을유도하지못하는것을보 았을때포화상태가된다고볼수있다. 금속산화물형태에서 XRD, BET 분석을통해 Zr이들어있는촉매의입자크기가작을것 같다는정보를얻을수있지만다른효과에의해왜곡될수있을것같아 SEM 분석을실시하 였다. 그결과 [ 그림위52] 와같은형태를얻을수있었다. 모두같은배율인사진인데 Zr0의

238 사진을보면다른 Zr1과 Zr6 보다크기가큰것을볼수있다. 그리고긴막대기가뭉쳐져있 는형태를가지고있다. Zr이포함되어있는촉매일수록납작하지만구형의작은입자가기본 단위를이루고있는것을볼수있다. Zr6의경우입자의크기가아주작은구의형태를보이 며거의평평한평면을이루고있다. 이렇게크기가차이가나는것은 BET와 XRD 분석결과 와일치하였다. [ 그림위52] 금속산화물상태의 CuO/ZnO/ZrO 2 촉매의 SEM 이미지. 금속산화물상태에서이런특징들이나타난것은결국침전을한후건조시켜얻은 precursor 에서이런특징이나타났을것이라생각할수있다. 공침법은여러변수들에의해서 많은영향을받는촉매제조법이다. 그래서침전당시또는침전을한후처리하는과정에서 약간의변형을가하게되면환원된상태의촉매의특성이나활성까지영향을줄수있다. 이를 chemical memory 라고부른다. 앞서소개한 Behrens 연구진에서는 Zn가치환되는능력이 Al 의추가적인주입에의해향상되었고, 그결과로활성이증가되는것을확인할수있었다고 한다. 본연구진에서 Zr 의주입에의해활성이증가되는결과는얻을수있었으나, Zn의치환 이향상되어서나타나는결과인지알기위해서는 precursor 상태의분석이필요하였다

239 [ 그림위52] Cu/ZnO/ZrO 2 precursor의 XRD 패턴과 DTG 곡선. Zn의치환정도를알기위해서는 XRD 분석을통해서 2 theta 값을확인해야한다. [ 그림위 52] 의왼쪽그림을보면 Zr이포함되지않은촉매와포함되어있는촉매의 d(20-1) 면에해 당하는 XRD 피크는전혀움직이지않았다. Zr이무결정의형태를가지기때문에변화가없을 수있다고생각할수있지만이온이나어떤형태로든지 zincian malachite에들어갔다면 Cu에 의한 Jahn-teller distortion 의효과를줄일수있을것이라생각하였다. 이결과로보았을 때, Jahn-teller distortion의효과는줄어들지않고 crystal size 만작아진것으로보였다. 그 리고 Zr이많이들어간촉매에서는 Zr 과관련된어떤결정형태를볼수없었다. 결정구조의형태로 Zr이미치는효과를볼수없었지만열적안정성이달라질것이라생각 하여 TGA 분석을실시하여 DTG 곡선을 [ 그림위52] 의오른쪽의결과를얻을수있었다. XRD 패턴과는달리약간의 DTG peak의온도변화가있는것같지만크게의미가있을만큼 변화가있다고할수없다. 그리고새로운 peak가생기거나아예없어지는 peak가있는것이 아니라모든 DTG 곡선이전체적으로낮아지는형태를가진다. 이는 Zr0이처음가지는 DTG peak의형태가 Zr 이들어가면서비율만큼낮아지는것을뜻한다. 그렇다면 Zr은결정구조에도 들어가지못하고옆에존재한다면 zincian malachite가분해될때어떤작용하는힘도없는 것으로볼수있다. 혹시나 Cu/Zn의비율이 7:3인경우에만이런결과가나타나는지확인하기위해서다른비 율인 Cu/Zn=3:7 의시리즈에서도같은분석을실시하였다. XRD 분석에서는 2 theta의변화 가없었고, Zr 과관련된어떤결정구조가나타나지않았다. Zr이많이존재하는경우에는 XRD peak intensity 가점점낮아지고넓어지는것을앞선결과와같이알수있었다. DTG

240 곡선역시동일한결과를얻을수있었다. 이는 Zr이미치는효과는 Cu/Zn 비율과는상관없 다는결론을내릴수있었다. [ 그림위53] Cu/(Cu+Zn)=0.3인 precursor의 XRD 패턴과 DTG 곡선. Zr의주입으로활성도증가하고 Cu dispersion 도증가하였지만, 침전으로얻어지는 precursor 에서는결정구조에못들어갔고, 열적안정성도크게변화시켜주지못하는물질로 존재한다는결론을내릴수있었다. 그렇다면어디에 Zr이위치하여이와같은역할을하는지 궁금하였고, Zr 위치를파악하기위해서는 HR-TEM 분석을실시하였다

241 [ 그림위54] CuO/ZnO/ZrO 2 의 HR-TEM 이미지. [ 그림위54] 를보면 Zr이없는 Zr0 은모든입자에서결정이성장한것을확인할수있다. 입자의부분별로 electron diffraction 을확인해보았을때, 점패턴이나타나는것을보았을때 결정성을보인다고할수있다. 하지만 Zr이일부라도있는 Zr0.5의촉매는일부는결정성을 보이지만다른쪽은무결정성이존재한다. 이는 Zr과관련된형태라고의심되어 Zr1 촉매에서 도무결정성을보이는곳에 EDS 분석을실시한결과 Zr 이많은것을확인할수있었고, 결정 성을보이는쪽에는 Zr 이거의없는것을확인할수있었다. 이결과는 Zr이무결정성으로존 재한다는것을의미한다. 그래서 Zr이같이침전이되어 CuO와 ZnO의사이에존재하며 spacer 의역할을하여입자크기가달라진것이다. Zr의비율이높은 Zr4와 Zr6 촉매에서도 마찬가지로무결정성이확인되었고, 결정성을보이는입자역시존재하는데서로감싸는형태 가아닌구형의입자옆에붙어있는형태로존재한다. 이결과를통해 Zr이 zincian malachite에치환하여만들어지지못하여구조바깥에존재 하게되었고, 소성과정에서충분히결정성을가지기에는낮은온도이기때문에무결정상태로 존재할수밖에없었다. 무결정성인 ZrO 2 가치환되어조촉매역할은못해주지만입자의크기조절을통해촉매의특성을조절했다고볼수있다

242 [ 그림위55] Zr의양에따른구리표면적과활성및수소소모량과 Cu dispersion의변화 추이. 입자의크기조절을통해먼저증가된것을 [ 그림위55] 를통해서보면활성과연관성이 큰구리표면적으로 Zr의비율이 0.1 Zr/(Cu+Zn) 에서최댓값을가진다. 활성역시 0.1 Zr/(Cu+Zn) 에서최댓값을가지며작아진입자크기로인해증진효과가나타났다. 많은양의 Zr 은오히려구리표면적을감소하게만들었고, 활성역시감소하였다. 이는전체적인구리의 양이감소하여아무리입자크기를조절한다고해도반응을할수있는양이줄어들었다. 다시 말해그만큼활성을띠는구리입자가존재하지않기때문에구리표면적과활성이급격히줄 었다. [ 그림위55] 의아래그림을보면다른형태의상관관계가나타나있다. 먼저, 수소소모량의 형태를보면 Zr 의양이많아질수록선형적으로감소하는것을볼수있다. 수소소모량은환원 될수있는금속, 즉구리의전체적인함량을가리킨다. Zr 산화물은환원되지않기때문에구 리의함량이줄어드는양만큼수소소모량이감소하였다. 그리고 Cu dispersion은전체적인 구리의함량중구리표면적을계산한것으로구리입자가퍼져있는정도라고생각할수있다

243 상관관계를보면 Langmuir 그래프형태와비슷하게초반에급격히증가하였다가후반부에는 조금증가한것을볼수있다. 수소소모량은선형적으로감소하지만구리표면적은 0.1 Zr/(Cu+Zn) 까지급격히증가하였다가감소하기때문에다음과같은결과가도출되었다. 이와같은결론을토대로 Zr이 Cu, Zn의촉매에작용하는역할은지지체의역할밖에없다 고볼수있다. 결정구조에치환되어조촉매역할을하지못하는것을 XRD, TEM 여러분석 방법을통해확인하였다. 치환되어들어가지못한 Zr은입자크기를조절하여구리표면적의 증가나활성의증진효과를가져왔지만결국분산도를증가시켜주는역할만한것이라볼수 있다. 이와같은결과는정리하여 SCI 저널인 Catalysis Today 에제출하고자한다. 바. 시제품설치 ( 안산 APEC) [ 그림위56] 에스테르화반응기도면및사진. 안산 APEC에설치한시제품중본연구실에서담당한장치는 4 개로, 에스테르화반응기, 알코올생산용촉매제조반응기, 촉매소성로 ( 열처리장비) 그리고알코올생산반응기이다. 첫번째로 [ 그림위56] 을보면에스테르화반응기의도면을볼수있다. 구성은 semi-회분식

244 반응기형태로가운데 20 L 탱크가존재한다. 이는에스테르반응이일어나는부분이다. 반응 중반응물을일정한혼합물로유지시키기위한 stirrer 가뒤쪽에존재한다. 고온의열로부터 보호하기위해 cooling line 인파란선이존재하는데 [ 그림위56] 사진을통해서확인할수 있다. 그리고반응물인부탄올을계속해서공급을해주기위한 feed pump 가있다. 에스테르화 반응시 distillation도같이일어나기때문에 column 이존재한다. 일정한온도로유지하기위해 가열을할수있는장치와온도유지를할수있는단열이되어있다. 반응기높이의끝에 overhead condenser가존재하여액화시켜서 overhead receiver 로받게된다. 이장치에도 cooling line 이필요하여반응기뒤쪽으로선이연결되어있다. 액화된생성물과반응물은다 시 column으로가거나 overhead receiver로갈수있는데이는 valve 를통해서조절된다. 완벽하게액화되지않고일부기화되어있는흐름이 column을통해서들어가게되면압력이 증가될수있는데이를확인하기위해서 tank에 pressure gauge 가설치되어있다. 마지막으 로최종반응물과반응되지않은생성물이 overhead receiver로들어오게되면눈으로확인 할수있는 teflon line 이있고이를통해서액체의양을조절할수있다. [ 그림위57] 알코올생산용촉매제조반응기사진. [ 그림위57] 은알코올즉, 부탄올을생산하기위한촉매를제조하는반응기이다. 앞서, 구 리함유촉매를본반응기를통해서대용량으로제조할수있다. 실험실규모에서는 3g-20g 정도의촉매를얻을수있지만, 본반응기를통해서는 50g-250g로약 15배이상제조할수 있다. 장치는 2 개로크게구분할수있다. 하나는온도, ph, RPM와가스유량을제어할수

245 있는 controller 이다. 여기에는 4개의 masterflex가있어여러가지액체를동시에주입할수 있다. 다른하나는촉매가만들어지는반응기부분이다. 여기에는온도를유지할수있게 water heating jacket 이존재하는데, circulator에서높은온도의물이들어와서내부의용액 의온도를올리게된다. 침전을통해서만들어지는특성상 overhead stirrer를통해서일정한 크기의입자가만들어질수있도록회전을시켜준다. 모든 step을거쳐완성된입자는맨밑 에있는 sampling port 를통해서얻을수있다. 본반응기는발효기의형태를이용하여촉매 를제조하기때문에위쪽에여러가지용액을주입할수있거나장치를설치할수있는구멍 이존재한다. 촉매를제조할때는온도를확인할수있는 thermocouple, 침전이일어나면서 ph가변화하기때문에 ph probe, 촉매를만들기위한전구체용액주입을위한목적으로촉 매제조반응기의포트가사용된다. [ 그림위58] 촉매소성로 ( 열처리장비) 도면

246 [ 그림위58] 은알코올생산용촉매를제조한뒤열처리하기위한장치로촉매소성로이다. 이역시 APEC 에설치되었으며, 약 400 의온도로처리하기위해서설치되었다. 소성로형 태는 box furnace로 static air 로태우는형태이다. 촉매를온도를올려열처리하게되면나오 는공기는이산화탄소와수증기가나오게된다. 많은양이나오지않지만이를제거하기위한 vent line 을추가적으로설치하였다. 마찬가지로공기가계속해서소비되므로공급되기위해서 는 line 이설치되어야할것으로판단하여소성로뒤쪽아래에제작하였다. 소성로아래쪽에는 온도를제어할수있는 controller 가있고, PID 제어를통해서온도가조절된다. [ 그림위59] 은부탄올을생산하는반응기장치의도면및사진이다. 구리함유촉매를충진 하여부틸부티레이트를수첨분해반응을통하여부탄올로생산한다. 반응기의형태는 fixed bed reactor 이며반응기가운데층은촉매로충진하며, 그외에는반응이일어나지않는 silica bead 를넣어부피를메운다. 부틸부티레이트를부탄올로수첨분해반응하기위해서는수소가 필요하기때문에수소실린더를통해서저장탱크로수소를채운다. 이탱크에있는수소를 MFC(mass flow controller) 를통해서촉매반응기로흘려준다. 반응기층으로들어가기전 부틸부티레이트는기화되어수소와같이섞이는데이때 mixer & heater라는장치를통해서 일정한비율로섞이면서온도가올라가게된다. 촉매층을통과하며부틸부티레이트는부탄올로 전환되며액화되어미반응된부틸부티레이트와부탄올은 체상태로저장되고, 남은수소는 booster로 storage tank 에저장된다. liquid & gas separator를통해서액 [ 그림위59] 알코올생산용반응기도면및사진

247 사. 시제품을이용한부탄올생산실험수행결과및토의 Scale-up 에스테르화반응기의검증을위하여순수한부티르산과부틸부티레이트를합쳐 에스테르화반응을하였다. 부티르산은 58.91g, 부틸부티레이트는 g을주입하였는데 이는발효후추출공정을통해얻을수있는농도(1.95 wt.%) 로알려져있다. 소량의부티 르산을부틸부티레이트로전환하기위해서평형을오른쪽으로유도해야한다. 그래서앞선실험 에서부탄올을과량으로주입하였는데본실험에서도먼저부탄올/ 부티르산비율이약 39가 되도록주입하였다. 에스테르화반응이일어나기위해서는촉매도필수인데황산을이용하였 고, 약 11.6g 주입하였다. 반응기내부의온도를올리는와중에추가적인부탄올을공급하였다. 부탄올은온도가올라 가면서반응하여물과 azeotrope 을형성하여낮은온도에서도넘어가는현상이있다. 이렇게 되면에스테르화반응기내부에부탄올의농도가낮아져평형이오른쪽으로진행되지못한다. 이를극복하기위해서많은양의부탄올을추가적으로공급하였다. 내부의온도가약 88 일 때부탄올을 g과 g 을펌프를통해서주입하였다. 모두주입후반응기내부의온도를약 140 까지올리는와중에 column의온도도약 12 0 가되도록하였다. 이렇게설정을하는이유는앞서설명한 [ 그림위8] 을참고하면에스테 르화반응이진행되면서 distillation이같이진행되어 junction temperature가약 120 보다 조금높은상태를유지하기때문이다. 이상태로약한시간반정도유지하였다. 시간이지난후온도를낮추고두구역에있는용액을받았다. 에스테르화반응기위쪽은 distillate 라명명하고, 나온총질량은약 g 이였다. 그리고아래쪽에스테르화반응기 탱크는 bottom 이라명명하고, 질량은총 g 이였다. 이두용액을 GC를통해서분석하 였다. 그결과부티르산의전환율은 93.0% 가나온것을확인할수있었다. 생성물의부티르산 / 부틸부티레이트는 0.16 wt.% 로애초에반응물의농도는 1.95 wt.% 에비해현저히낮아진 것을볼수있다. 이후, 모델당화액을발효하고추출공정을거쳐얻은용액을이용하여에스테르반응실험 을두차례진행하였다. 첫번째실험에서는 g의추출물을이용하여에스테르화반응을 실시하였다. 앞서설명한내용과같이부탄올을 g 먼저주입하였다. 황산은 3.51g을 주입하였다. 반응물의양이매우적었기때문에펌프를통해서주입한부탄올의양은약 g 으로평형을오른쪽으로유도하였다. 약 140 로끓인후 distillate와 bottom을회수

248 하였다. 회수한생성물의비율을 GC 를통해서계산을해보니, 부티르산/ 부틸부티레이트의비 율이약 0.33 wt.% 로합성한반응물을통해서얻은결과에비해부티르산의전환이많이일 어나지않았다. 하지만애초에발효를통해서얻은부티르산의비율이 wt.% 정도로 매우낮아추출이모두일어났다고가정을하더라도전환될양의부티르산이없었다. 추가적으로한번더실험을진행하였는데, 마찬가지로발효의농도가매우높지않았다. 부티르산의초기농도가높지않고추출역시농축을시켜줄수없었기때문에에스테르반응을통해얻을수있는부티르산/ 부틸부티레이트의비율은약 0.41 wt.% 로낮은값을얻었다. 두번의실험을통해실험실에서진행한실험및인공반응물을이용한경우와차이나는 결과를얻을수있었다. 이는두가지때문이라볼수있다. 하나는초기부티르산의농도가 높지않아전환될수있는양이매우낮았던점이있다. 그리고추출공정에서부틸부티레이트 를이용하여부티르산을추출하지만완벽히층분리를통해서추출되는것이아닌약간의수 분을포함하는용액을에스테르화반응기로가져와바로실험하여약간의수분이반응을방해 했던것으로볼수있다. 이는인공반응물의경우 0.16 wt.% 까지부티르산의비율을낮출 수있는것과비교하여두번의실험의경우, 0.33, 0.41 wt.% 로두배정도높았던점을보 아조금더부티르산을전환할수있는여지가있어보인다. 수분을제거하기위해다음실험에 서는전처리형태로 100 이상의온도에서끓이는작업이우선되거나수분을제거할수있 는컬럼을설치해야할것으로보인다. 마지막으로과제의본목적인폐목재유래당화액으로에스테르반응실험을하기전추출 물의전처리를실시하였다. 추출물은부틸부티레이트를통해서부티르산을추출하지만추출하 는과정의온도가낮아공기중의수분이얼수있다. 이는수분을함유하게만들어에스테르 화반응의평형을제한할수있다. 이런이유로 30분간약 130 의온도로유지시키며추출 물내의수분을제거하였다. 수분제거전부티르산/ 부틸부티레이트의비율은 0.7 wt.% 이였지 만수분제거후이비율은 0.8 wt.% 로증가하였다. 추출물 2694 g에부탄올 1546 g을주 입하고촉매인황산 5.19 g 을에스테르화반응기에추가적으로주입하였다. 온도를올리며에 스테르화반응을시키며, 높은온도로인해부탄올이 distillate로넘어가는것을보충하기위 해추가적인 848 g 의부탄올을펌프로주입하였다. 약한시간후온도를낮추고 bottom과 distillate 를회수하여분석하였다. 그결과부티르산의농도는 0.15 wt.% 까지낮아졌으며전 환율은 86% 로실험실결과와상당히비슷한값을얻을수있었다

249 [ 그림위60] 알코올생산용촉매제조반응기의최적화실험중시간에따른 ph 와온도. 알코올생산용촉매는공침법을통해서제조되는데이때의 ph와온도는매우중요한변 수로시간에따라서어떤형태를가지는지확인이필요하다. 특히변하는형태나최종값이어 떤특정한값으로가지않는다면원하는형태의물질을얻을수없다. [ 그림위60] 을보면시 간에따른 ph 와온도의변화곡선을볼수있다. 왼쪽의그림은 ph의그림인데 4 번의실험을수행하였는데, 첫번째실험에서는높은 ph로 인해서원하는형태의촉매를얻을수없었다. 하지만두번째에서네번째에해당하는실험은 어느정도비슷한 ph 를가지는것을확인하였고, 최종 ph도약 6.5 근처로최적의값으로도 달하였다. 오른쪽그림을보면온도의변화곡선을볼수있다. 첫번째실험은과량의용액의 주입으로인해서거의 10 만큼의온도가감소한것을확인하였다. 두번째에서네번째실 험은약 3 의온도감소가존재하여첫번째실험에비해온도격차를줄일수있었다. 알코올생산용반응기는부틸부티레이트를수첨분해하여부탄올로생산할수있는장치이 다. 두번의실험을진행하였고, 첫번째는순수한부틸부티레이트를반응물을이용하였다. 촉 매는 2g 충진하였고, 부틸부티레이트의유량은 13 g/h 이고, 수소의유량은 1 L/min 이며, 압력 은수소분위기로 40 bar 에서반응을하였다. 촉매층의온도는 278, preheat하는구간의 온도는 157 이였다. 전처리과정으로촉매를환원온도는 350 에서 3시간동안수소처리 를하였다. 생성물은 [ 그림위61] 과같이얻을수있었으며, GC를통해생성물의구성비를살 펴보았을때, 최소 50% 이상이부탄올로구성되어있는것을확인하였다. 실험실에서얻은결 과보다낮은수치지만촉매의양을매우적은양만큼주입하였기때문에더많은양의촉매를 충진하게되면더많은부탄올을얻을수있다

250 추가적으로두번째에스테르화반응을통해서얻은 bottom에해당하는반응물을이용하 여진행하였다. 반응물의부틸부티레이트의몰비율은 32% 로나머지는부탄올이다. 부탄올이 상당히많은비율이지만수첨분해반응을통해서부탄올의비율을 72% 까지올릴수있다. 부 틸부티레이트전환율로보면약 27% 로낮은수치지만이는반응후 distillation 공정을통해 부탄올과부틸부티레이트를분리하게되면최종적으로순수한부탄올을생산하게된다. [ 그림위61] 부틸부티레이트수첨분해반응을통해얻은생성물사진. 실제폐목제당화액유래추출물을에스테르반응하여얻은생성물을이용하여마찬가지로 수첨분해반응을실시하였다. 이반응은부틸부티레이트를부탄올로생산하기에생성물인부탄 올의비율이높으면평형의제한을받게된다. 반응에사용된반응물은앞서에스테르반응을 통해얻은 bottom 에해당하는물질이다. Bottom의구성을보면부틸부티레이트는무게비율 79.1%, 몰비율 66.1% 이다. 이전실험보다높은온도에서에스테르반응을통해부탄올의비 율을줄일수있었다. 반응조건은촉매 15g 을충진하였고, 액체의유량속도는 0.4 g/min, 기 체인수소의유량은 10 L/min 으로하였다. 촉매의환원은수소분위기 40 bar에서 3시간동안 350 를유지하였다. 전처리과정이끝나면촉매층온도를약 300 로낮추고액체의반응 물을주입하였다. 생성물분석을통해부틸부티레이트의전환율은 % 수준인것을 알수있었다. 이결과와에스테르화반응의전환율을합쳐부티르산으로부터부탄올을생성하 는수율을계산하면 75.5% 의값을얻을수있다. 추가적으로수첨분해반응을실시하였다. 촉매 CZA421R 27g을충진하고 350 에서 3시 간동안환원을실시하여활성을가지게만들었다. 그후, 액체주입유속 0.16 g/min, 기체인 수소 10 L/min 으로반응실험을실시하였다. 그결과부틸부티레이트전환율 92% 라는것을 확인하였다. 부티르산으로부터전환율은 79% 로실험실대비 95% 에해당하는결과이다

251 제4 절연구개발결과요약 ( 위탁과제 ) 발효추출물인부티르산을부탄올로전환하기위한반응경로로직접부티르산을수소화반응 하지않고부티르산과부탄올을에스테르화반응을통해부틸부티레이트를합성한후부탄 올을생산할수있는반응경로수립. 저농도의부티르산을부탄올과반응시켜부틸부티레이트로전환시킬수있는 semi-회분식 반응기제작및에스테르화반응변수최적화. 부탄올생산을위한촉매의구성성분으로활성금속은 Cu, 조촉매는 Zn 그리고지지체로는 Al과 Zr 을선정및함량최적화수행. 촉매의구성성분에따른물성라이브러리구축을하였고활성과관련이깊은핵심지표 리표면적과 HT-CO 3 ) 를선정. ( 구 부탄올수율을극대화하기위해공정변수인온도, 압력, 수소양, 반응물주입속도에따른 영향을평가하였고, 최적조건 ( 촉매층온도 C, 압력 40 bar, H2/BB 비율 20, WHSV 2 9 h -1 ) 을결정. 부틸부티레이트수첨분해반응을이해하기위해반응물농도와온도에따른기초데이터를 확보하고 kinetic을평가하기위해 empirical power law equation과 Langmuir Hinshelwood 모델을이용하여상수값과활성화에너지를도출. 고활성촉매개발을위해신규합성법을고안하거나조촉매의도입하여활성을더증진시 킬수있는방안고안

252 제5절연구개발결과기반경제성검토 다음은본과제의연구개발결과를기반으로하여각단위공정에서실제발생하는결과를 기준으로세운물질수지를토대로한경제성평가임. 경제성평가를위한주요인자로, 원료비는크게두가지로나누어계산하였음. 탄소원으로는수도권매립지공사의 건설폐기물연료화시설경제성검토 에서제시된 비성형우드칩의판매가격 (32,000 원/ 톤) 에근거하였으며, 폐글리세롤의경우시장가격 (400 달러/ 톤) 으로책정하였음. 질소원으로사용한 CSP 도시장가격 (840 원/kg) 으로 책정하였음. 1 kg 의폐목재로부터강산전처리/ 당화를통해당으로전환되는당화수율 (47%; 0.47 kg 당/1 kg 우드칩) 은 KIST 의연구결과를토대로작성되었음. 부티르산 발효효율은폐목재당화액과폐글리세롤첨가한경우, 실제 C. tyrobutyricum ATCC 의발효수율(45%) 을채택하였음. 부티르산회수율은 1회 batch에서 배양액으로부터부틸부티레이트로추출되는추출율 (47%) 을기반으로작성하였고, 본 과제에서달성한나노촉매를이용한부탄올전환율을기반으로기입한것임. 추출및촉매 공정에서사용되는부틸부티레이트와부탄올의단가는시장가격 ( 부틸부티레이트; 3,500 달러/ 톤, 부탄올; 1,200 달러/ 톤) 으로책정하였음. 바이오매스전처리후고형분및 발효폐액과같은폐기물처리비용은실제아팩에서처리하고있는단가 (70 천원/ 톤) 를 기준으로책정하였고냉각수는공업용수가격 (100 원/ 톤) 를이용하여계산하였음. 실제 공정운전시처리온도를맞추기위한보일러는 아팩에서아크릴제조에사용한잔열을 이용하므로계산에서제외하였음. 상기적용값에의한본통합형과제를통한 1 kg의폐목재를이용하여부탄올생산시 이윤을창출하기위해서는공정운전에투입되는비용이생산물가격의 발생하여야함. 34% 미만으로 1 톤의바이오매스를처리하였을때, 투입되는비용은바이오매스 32,000 원, 폐글리세롤 14,000 원, CSP 42,000원으로총 88,000 원이투입됨. 추가적으로발생하는운영비를 보았을때, 폐발효액 (0.5 톤) 3,5000 원냉각수 (0.47 톤) 47원으로 35,047원의비용이 투입되므로총투입비용은 123,047 원임. 생산되는산물인부틸부티레이트와부탄올의유가공정생산시수익는 134,000원이며 연속공정이용시수익은 241,200원으로 1톤의바이오매스기반연속공정을통한

253 부틸부티레이트와부탄올생산의수익은 118,153 원임. 실험결과기반발효를통한생산속도가 2.08 g/l/h 로보았을때, 1톤의기질의소모를 위해 3.8 일이소모되며 ( 추출및촉매공정은동시에운전됨), 1년기준으로보았을때 11,342,688 원의이윤이창출됨. 상기경제성평가는바이오매스 1톤을기준으로연간의평가이며목표치인 40톤을 이용하여공정운전시, 연간 453,707,520 원이상의수익을얻을수있음. [ 그림 105] 연구개발결과기반 1kg의바이오매스를이용하여공정운전시물질수지