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1 저작자표시 - 비영리 - 변경금지 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 변경금지. 귀하는이저작물을개작, 변형또는가공할수없습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 의학박사학위논문 고농도방사선조사후발생하는 생쥐소장운동성의변화연구 High-Dose Radiation Induced Changes in Murine Small Intestinal Motility 2017 년 02 월 서울대학교대학원 의학과외과학전공 유승범 i

3 ii

4 고농도방사선조사후발생하는 생쥐소장운동성의변화연구 지도교수 박규주 이논문을의학박사학위논문으로제출함 2016 년 10 월 서울대학교대학원 의학과외과학전공 유승범 유승범의의학박사학위논문을인준함 2016 년 12 월 위원장 ( 인 ) 부위원장 ( 인 ) 위원 ( 인 ) 위원 ( 인 ) iii

5 위원 ( 인 ) iv

6 High-Dose Radiation-Induced Changes in Murine Small Intestinal Motility by Seung-Bum Ryoo, MD. A Thesis Submitted to the Department of Surgery in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Philosophy of Science in Medicine (Surgery) at the Seoul National University College of Medicine December, 2016 Approved by thesis committee: Professor Professor Chairman Vice chairman Professor Professor v

7 Professor 국문초록 ( 목적 ) 방사선장염의급성증상은주로장관내점막의염증과정상 점막의소실에기인하지만, 방사선조사후발생하는위장관운동의변화 역시원인이될수있다. 위장관의운동은내인성신경지배 (enteric nervous system) 에의한이동성위장관복합운동 (migrating motor complex, MMC) 과 Cajal 기질세포 (interstitial cells of Cajal, ICC) 에서 vi

8 기원하는서파 (slow wave) 에의한위상성수축 (phasic contraction) 으로 구성된다. 고농도의방사선에노출되어위장관점막의염증이발생하면 여러신경전달물질의변화가생겨장관의운동성을변화시킬것으로 생각되어왔다. 위장관의자발적운동에중요한역할을하는 Cajal 기질세포 (ICC) 는여러병태생리학적환경에서평활근의표현형으로 변환되었다가, 병적인상태가호전되면다시회복되는가소성 (plasticity) 의 특성을가지고있는데이러한 ICC 가고농도방사선에가소성을보일수 있는지에대한연구는현재까지찾아볼수없다. 따라서, 본연구에서는 고농도방사선을조사한생쥐의소장에서전기및운동생리학적인 실험을통해소장의운동성의변화를관찰하고, ICC 의변화양상을 확인하며, 다양한신경전달물질의영향을분석하여, 고농도방사선조사 후발생하는생쥐소장의운동성변화의원인을밝히고자하였다. ( 대상 및방법 ) 고농도방사선 (13Gy) 을 8-10 주령의수컷, C3H/HeN 생쥐의 전신에조사하고, 일정시간후에복강수술을통해소장을적출한후, vii

9 생리적인환경과유사한수조에서운동성의변화를관찰하였다. 방사선 조사후 0, 1, 3, 5 일째의실험군과 sham 대조군에서소장분절의수축 장력을측정하였고, 평활근세포내막전압의변화를측정하였다. 각각의 군에서점막층과평활근내세포의손상을평가하기위해 Hematoxilin and Eosin(H&E) 염색과 TUNEL 분석을시행하였고, ICC 의조직학적 변화를확인하기위해 c-kit 면역조직화학염색및 c-kit mrna 에대한 quantitative real-time polymerase chain reaction(qpcr) 을시행하였다. 또한, 각각의실험군과대조군에서신경전달물질과관련된약물을수조에 투여하여, 소장운동성의변화를관찰하였다. ( 결과 ) Phasic contractions 은방사선조사후 0, 1, 2, 5 일째에 sham 대조군과 비교하여차이가없었다. Slow wave 역시방사선조사후에도잘 유지되었다. 그러나, MMC 의진동수가방사선조사후 0, 1 일째에 대조군과 비교하여의미있게증가하였으며, 진폭및 area under the curve(auc) 가 3 일째에줄어드는것을확인할수있었다. 이러한 MMC 는 viii

10 방사선조사후 5 일째다시회복되는것을관찰할수있었다. H&E 염색에서방사선조사후 3 일째장관내점막의염증이가장심하였고, 5 일째는회복되는것을확인할수있었다. TUNEL 분석에서 세포자멸사 (apoptosis) 는점막내에국한되어있음를확인하였다. 면역조직화학염색에서 c-kit(+) ICC 가실험군과대조군에서차이없이 관찰되었으며, c-kit mrna 에대한 qpcr 에서도역시차이가없었다. Acetylcholine 은방사선조사후 0, 1 일째수축장력을크게 증가시켰으나, 대조군과의통계적인차이는없었다. N w -oxide-l-arginine (L-NA) 를방사선조사후 3 일째에투여하였을때, 감소되었던 MMC 의 진폭과 AUC, 진동수모두재건되는것을확인할수있었고이것은 대조군에서보이는 MMC 와차이가없었다. 방사선조사후 5 일째에 회복된 MMC 는 tetrodotoxin 과 sodium nitroprusside 에의해감소되었고, 이역시대조군과차이가없었다. ( 결론 ) 고농도방사선조사후생쥐의 소장에서 phasic contraction 과 slow wave 는변화가없으며, ICC 의 ix

11 기능은유지되는것으로생각된다. 방사선조사후발생하는장관 운동성의변화는 MMC 가변화되어발생하며, 이는염증에의해유발된 신경전달물질의변화에기인하는것으로생각된다 중심단어 : 소장, 운동성, Cajal 기질세포, 방사선, 생쥐 학번 : x

12 목차 국문초록...i 목차...v 도표목록 List of Tables...vi List of Figures...ii 서론...1 대상및방법...4 결과...14 고찰...21 결론...30 참고문헌...31 영문초록...41 xi

13 List of Tables Table 1. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation... Table 2. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Acetylcholine Treatment... Table 3. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Tetrodotoxin Treatment... Table 4. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and N w -oxide-l-arginine Treatment... Table 5. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Sodium Nitroprusside Treatment... xii

14 List of Figures Figure 1. Recording for mechanical tension of contractions. Small intestinal contractions were recorded at four sites (proximal, distal and two middle) with stainless steel clips and silk strings connected to a force transducer... Figure 2. Recording for electrophysiological changes of intracellular membrane potential. The tissue was pinned down on the dish, with the circular muscle side facing upward. Conventional intracellular microelectrode recording was performed by impaling the tissue with a sharp glass microelectrode filled with 3 mol/l KCl... Figure 3. Mechanical tension of contractions. Phasic contractions (PCs) were detected with no differences between sham and irradiated mice. xiii

15 Migrating motor complexes (MMCs) were observed with propagations from the proximal (Prox) to middle (Mid) and distal (Dist) small intestine, and they markedly decreased on day 3 after irradiation... Figure 4. Electrophysiological changes of intracellular membrane potential. Slow waves were sustained with no differences between sham and irradiated mice... Figure 5. Hematoxylin and eosin staining for evaluation of mucosal damage. Mucosal damage with inflammation was observed after irradiation. The most severe changes were on day 3, and the mucosal damage recovered slightly by day 5 after irradiation (scale bar = 200 µm)... xiv

16 Figure 6. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end-labeling (TUNEL) assay for the detection of apoptosis. Apoptosis was detected only in the mucosa, at day 0, 1, and 3 after irradiation (black arrow), and was not detected in the smooth muscle tissue or myenteric region (scale bar = 40 µm)... Figure 7. Immunohistochemistry for detection of c-kit(+) ICCs. c-kit(+) ICCs were detected in the myenteric region in both sham and irradiated mice (black arrow) (scale bar = 40 µm)... Figure 8. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qpcr) for c- kit. Expression levels of c-kit mrna in the smooth muscle tissues were not significantly different between sham and irradiated mice... xv

17 Figure 9. Changes in motility after treatment with acetylcholine (ACh). ACh (10 µm) (black arrow) increased the contractile activities of MMCs in sham and irradiated mice. The amplitude and AUC of MMCs after ACh treatment at day 1 were slightly higher and those at day 3 were significantly lower than those in sham mice (p=0.021, 0.043)... Figure 10. Changes in motility after treatment with tetrodotoxin (TTX). TTX (1 µm) (black arrow) decreased the MMCs in sham and irradiated mice. Recovered MMCs were also reduced after TTX treatment at day 5 after irradiation... Figure 11. Changes in motility after treatment with N w -oxide-l-arginine (L-NA). L-NA (100 µm) (black arrow) increased the MMCs in sham and irradiated mice. MMCs were recovered after L-NA treatment at day 3 xvi

18 after irradiation... Figure 12. Changes of motility after treatment with sodium nitroprusside (SNP). SNP (100 µm) (black arrow) decreased the MMCs in sham and irradiated mice. Recovered MMCs were also reduced after SNP treatment at day 5 after irradiation... xvii

19 서론 방사선장염은악성종양의치료를위한방사선조사후발생할수 있는부작용이다. 위장관에미치는독성은복통, 메스꺼움, 구토, 설사, 및흡수장애의급성증상을유발할수있으며, 만성적으로는허혈성 궤양또는섬유화로인한장관폐쇄를초래할수있다. 이러한방사선 장염의급성증상은주로장관내점막의염증과정상점막의소실에 기인하지만, 방사선조사후발생하는위장관운동의변화역시원인이 될수있다 (Zimmerer et al. 2008, Rodriguez et al. 2010, MacNaughton 2000). 위장관의운동은위장관내인성신경지배 (enteric nervous system) 에 의한이동성위장관복합운동 (migrating motor complex, MMC) 과 위장관의기질세포중하나인 Cajal 세포 (interstitial cells of Cajal, ICC) 에서기원하는서파 (slow wave) 에의한위상성수축 (phasic contraction) 으로구성된다. MMC 는크기가큰주기적수축으로, 위장관의 1

20 구강을통해들어온장내용물이근위부에서원위부로이동시키는 역할을 하게되며, 이의조절에많은신경전달물질 (neurotransmitter) 가 관여하게된다. 반면에위상성수축은크기가작은자발적이고율동적인 수축이며, 주로장관내내용믈을혼합하는역할을하게된다 (Sanders et al. 2012, Spencer, Sanders and Smith 2003, Sanders, Koh and Ward 2006, Fiorenza, Yee and Zfass 1987, Bush et al. 2000, Sarna 1985). 고농도의방사선에노출되어위장관점막의염증이발생하면여러 신경전달물질의변화가생겨장관의운동성을변화시킬것으로생각되어 왔다. 소장은위장관중방사선에감수성이매우크며, 10Gy 이상의 고농도방사선을조사하면급성기에단일층으로구성된점막상피세포의 손상과세포분열의지연으로인해, 점막층의궤양화 (ulceration) 와 침식증 (erosion) 이발생하게된다. 이러한소장점막의염증소견은 염증매게물질의다양한변화를일으키고, 이것이동시에 신경전달체계에도영향을미칠수있다. 따라서, 고농도방사선조사는 2

21 설사및흡수장애를유발할수있으며, 골수의기능장애와함께사망에 이르게할수있다. 또한, 소장내평활근이나장내신경은비교적 방사선에저항성이크지만, 50~100Gy 이상의방사선조사에의해근육 단백질의파괴나신경교세포 (glial cells) 의손상이있을수있다고알려져 있어, 고농도의방사선조사가위장관의운동성에도영향을미칠 가능성이있을것으로생각된다 ( 이상석 et al. 2003, 강만식 et al. 1997). 방사선조사에의한위장관운동성변화에대한이전의연구에서는 위장관평활근에서대표적인신경전달물질인아세틸콜린 (acetylcholine, ACh) 에대한민감도가증가하고 Ach 을분해하는효소인 콜린에스테라아제 (cholinesterase) 가감소하여, 크게증가된긴장성수축 운동이보일수있으며, 이러한수축이통증을유발할수있음을 보고하였다 (Otterson et al. 1995, Krantis, Rana and Harding 1996, Summers et al. 1987). 그러나, ICC 가고농도방사선에영향을받을수 있는지에대한연구는현재까지찾아볼수없는데, 위장관의자발적 3

22 운동에중요한역할을하는 ICC 는저산소증, 염증이나 c-kit 신호전달의 차단등의여러병태생리학적환경에서그숫자가감소하고, 평활근의 표현형으로변환되었다가, 신체의병적인상태가호전되면다시회복되는 가소성 (plasticity) 의특성을가지고있다 (Sanders et al. 1999). 이러한 ICC 의가소성에대한방사선의영향역시연구되어진바가없으며, 위장관의운동성에중요하게작용하는아세틸콜린이외에 Nitric oxide (NO) 등다양한신경전달물질에대한고농도방사선조사의영향역시 연구된바가거의없다. 따라서, 본연구에서는고농도방사선을조사한생쥐의소장에서전기 및운동생리학적인실험을통해소장평활근의수축및 ICC 의세포막 전압의변화를측정하여, 소장의운동성의변화를관찰하고, 평활근조직 내에서 ICC 의변화양상을확인하며, 다양한신경전달물질의영향을 분석하여, 고농도방사선조사후발생하는생쥐소장의운동성변화의 원인을밝히고자하였다. 4

23 대상및방법 1. 실험동물 8-10 주령의수컷, C3H/HeN 생쥐를이용하여실험을시행하였고, 이는 Central Lab Animal, Inc (Seoul, Korea) 에서구입하였다. 생쥐의사육 환경은 23 ± 2 의실온과 50 ± 5% 의습도를유지하였고, 오전 8 시부터오후 8 시까지인공조명을밝혀주었으며, 시간당 회의 공기순환을시행하였고, 표준동물사료를공급하였다. 생쥐들은이러한 환경에적응한후에, 무작위로두그룹으로나누었고, 실험군은 55 마리에서방사선조사를시행하였으며 (irradiated group), 대조군은 24 마리에서방사선조사를시행하지않았다 (sham-irradiated group). 실험군은방사선조사를시행한후에시행된실험의시기에따라 방사선조사당일, 1 일째, 3 일째, 5 일째로나누었고, 총 5 개의그룹에서 실험을진행하였다 (sham, day 0, 1, 3, 5). 모든동물실험은기관동물 5

24 관리위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee, IACUC, AEC ) 의승인하에이루어졌다. 2. 방사선조사 각각의생쥐에서 13Gy 의고농도방사선을한차례전신에 조사하였다. 방사선의농도는조사후일주일후에위장관염으로 사망하게되는농도로결정되었다 (Mason et al. 1989, Rotolo, Kolesnick and Fuks 2009, Zhang et al. 2010). 방사선조사를위해생쥐를공기가 통하는 Plexiglas 용기에넣고, 6MV 의 high-energy photon rays (ELEKTA, Stockholm, Sweden) 를이용하여 3.8Gy/min 의속도로방사선 조사를시행하였다. 대조군에서도동일한방법으로 Plexiglas 용기에같은 시간동안방사선조사없이넣어두었다. 3. 조직적출및측정 6

25 생쥐의복강내에 tiletamine/zolazepam(zoletil ; Virbac, Carros, France) 40mg/kg 을주사하여마취를유도하였으며, Hind limb pinch-withdrawal reflex 가사라진것을확인하고수술을시작하였다. 복부의정중절개를 가하여복강내로진입하였으며우선막창자를찾아서회맹판의위치를 확인하였다. 실험을위해회맹판에서부터 8-10cm 의소장을적출하였고, 장관평활근분절만을분리하기위해장간막의지방조직과혈관을 제거하였고, 장관벽의손상을최소화하기위해조심스럽게박리하였다. 이러한소장분절을산소가공급되는 Krebs-Ringer's bicarbonate solution (KRB) 에넣고, 소장내내용물을 KRB 용액을주사기로부드럽게 분사하여제거하였다. KRB 용액의구성성분은 mm/l 단위를기준으로 하였을때 NaCl, 5.9 KCl, 15.5 NaHCO 3, 11.5 glucose, 1.2 Mg Cl 2, 1.2 NaH 2PO 4, 2.5 CaCl 2 와같고, 이용액의 ph 는 37.5 에서 97% O 2~3% CO 2 로가스주입 (bubbling) 시 7.3~7.4 이었다. 7

26 이렇게얻은소장의분절을 cm 크기 (78mL) 의수조에넣고, 직경 1mm 의스테인레스막대에끼워수평이되게고정한후 4 개의 작은클립 (4mm, micro-serrefines: Fine Science Tools, Foster City, CA, USA) 을이용하여 1.5-2cm 간격으로근위부, 중간부두군데, 원위부로 4 군데에고정하였다 (Fig 1). 클립은실크를이용하여 force transducer (TSD125C; Biopac System Inc. Santa Barbara, CA, USA) 에연결하였고, MP150 system (Biopac System Inc., Santa Barbara, CA, USA) 을이용하여 장력을측정하였다. 수조는 37.5 로유지되면서, 산소가공급되는 KRB 용액을 7mL/min 의속도로관류시켰다. 고정후기저장력을 5mN( 약 0.51g) 으로주고, 약 30 분정도안정화시켰다. 기저장력은국소 자극으로인한반사를억제하기위해설정하였다. 진폭 (amplitude, mn), area under the curve (AUC, sec mn/wave), 진동수 (frequency, /min) 를 AcqKnowledge R version (Biopac System Inc. Santa Barbara, CA, 8

27 USA) 을이용해측정후분석하였다. 근육피판의 AUC 는한개의파형을 적분한넓이의합으로정의하였다. 세포내막전압측정을위해채취한조직으로부터 1 1 cm 정도크기의 소장전층으로구성되는조직을얻었다. 점막층과점막하층을조심스럽게 제거하고, 윤상근이위쪽으로올라가게하여 Sylgard R (Dow corning Co., U.S.A) 로도포된페트리접시에놓고, 바늘을이용하여적절한장력으로 펴서고정 (pinning down) 하였고, 이과정에서조직에손상이있는 부위는제외하였다. 이렇게준비된조직은안정화되어평형이이루어질 때까지 2 시간정도그대로두었다. 또한전과정에서온도를 37.5 전후를유지하면서지속적으로산소가공급되는 KRB 용액으로관류를 함으로써생리적인환경을유지하도록하였다. 세포막전압을측정하기 위해서 3M KCl 용액으로채워져저항이 50~80Ω 인 미세전극 (microelectrode) 를사용하여평활근혹은 ICC 세포내로 탐침 (impale) 하였다 (Fig 2). 세포막전압의측정은고입력임피던스 9

28 증폭기 (high input impedance amplifier) 를이용하였으며, 출력 (output) 은 오실로스코프 (oscilloscope) 를이용하여나타내고, 결과는컴퓨터를 이용하여기록하였다. 기록된소장평활근내부세포내막전압의 전기생리학적특성을분석하기위해 pclamp software R (Version 9.0, Axon Instruments), Origin software R (MicroCal Software) 를이용하여 휴지기막전압 (resting membrane potential(rmp), mv), 진폭 (wave amplitude, mv), 가시전압진폭 (spike amplitude, mv), 그리고 진동수 (frequency, /min) 를측정하였다. 4. Hematoxilin and Eosin 염색 소장조직을중성완충포르말린 (10%, v/v) 으로고정하고, Paraplast R 왁스에담구었다. 중복절편 (4 μm) 을사용하여 Hematoxilin and Eosin (H&E) 염색을준비하였다. 점막층의손상을평가하기위해점막내 융모 (villi) 및선와 (crypt) 의형태학적변화를관찰하였다. 10

29 5. TUNEL 분석 고농도방사선조사후 DNA 손상에의한세포자멸사 (apoptosis) 를 확인하기위해 in situ terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end-labeling (TUNEL) (ApopTag R In Situ Apoptosis Detection Kit; Intergen, Purchase, NY) 분석을시행하였다. 6. 면역조직화학염색 고농도방사선조사후 ICC 의변화를확인하기위해 c-kit 면역조직화학 염색을 시행하였고, conventional labeled streptavidin-biotin-peroxidase method (LSAB Kit, Dako, Glostrup, Denmark) 를사용하였다. 일차항체로 anti c-kit (CD117) (A4502, 1:300; Dako) 를 이용하였고, 슬라이드는 biotinylated goat anti-mouse/rabbit immunoglobulin 과 solution of streptavidin-biotin complex 에서 incubation 하였다. 면역반응은 3,3- diaminobenzidine 을이용하여시각화하였다. 11

30 7. Quantitative Real-Time Polymerase Chain Reaction 점막과점막하조직을제거하고남은평활근조직에서 c-kit RNA 의 정량분석을위해 quantitative realtime polymerase chain reaction (qpcr) 를시행하였다. 모든 RNA 는 an RNA 추출키트 (QIAGEN, Hilden, Germany) 를이용하여추출하였다. RNA 는 SuperScriptt II reverse transcriptase (Invitrogene, Carlsbad, CA) 를이용하여역전사하였다. qpcr 은 SYBR Green master mix (Applied Biosystemst, Carlsbad, CA). Human GAPDH 가매실험마다 cdna 의정량의정상화를위한부하 대조군으로사용되었다. 주름유도 (fold induction) 또는억제 (regression) 는 GAPDH Ct 값을이용하여 Ct 값을정상화한후에계산되었다. qpcr 을 위한길잡이 (primer) 염기서열은다음과같았다 : c-kit 전방, 5 -atg aga ggc gct cgc ggc gc-3 그리고후방, 5 -agc ttg gca gga tct cta ac-3, GADPH 전방, 5 -aag gtc atc cct gag ctg aa-3 그리고, 후방, 5 -tga caa agt ggt cgt tga gg-3. 12

31 8. 약물처리 소장분절장력의측정시각각의파형이규칙적이고안정적으로 측정되면내인성신경지배에영향을미치는약물 (Sigma chemical Co., St Louis, MO, USA) 을일정시간동안수조에투여하여, 그변화를 관찰하였다. Acetylcholine (ACh) (10µM), 비선택적신경차단제인 tetrodotoxin (TTX) (1µM), NO 합성저해제인 Nw-oxide-L-arginine (L- NA) (100µM), NO donor 인 sodium nitroprusside (SNP) (100µM) 를 주입하여, 각각의변화를분석하였다. 9. 통계분석 통계분석을위해 SPSS R v.18.0 for Windows (SPSS, Chicago, IL) 가 사용되었고, 평균값과표준편차를이용하여분석을시행하였다. Mann- Whitney U test 와 Wilcoxon s signed rank test 를이용하여평균값 분석을시행하였고, P < 0.05 일때통계적으로유의한차이가있는 13

32 것으로분석하였다. 14

33 결과 1. 소장분절의수축장력측정 방사선실험군과 sham 대조군의소장분절에서각각 MMC 와 phasic contraction 을측정하였다 (Fig 3). Sham 대조군에서측정된 MMC 의주파 수는 0.52 ± 0.09 /min 이었으며, 방사선실험군 0 일째, 1 일째에서각각 0.88 ± 0.24, 0.73 ± 0.14 /min 으로의미있게증가하였다 (P = 0.011, 0.028). Sham 대조군에서측정된 MMC 의진폭과 AUC 는각각 4.31 ± 1.59 mn, ± sec mn/wave 이었다. 방사선실험군 3 일째에 서 MMC 가거의사라지는것을확인할수이었고, 진폭과 AUC 는각각 0.86 ± 0.01 mn 5.89 ± 0.20 sec mn/wave 로 sham 대조군과비교해 서유의하게낮았다 (P = 0.020, 0.020). 이러한 MMC 의변화는방사선 실험군 5 일째에진폭, AUC, 주파수모두에서 sham 대조군과차이가없 게회복되는것을확인할수있었다. Sham 대조군에서측정된 phasic contraction 의진폭, AUC, 주파수는각각 0.47 ± 0.11 mn, 0.25 ±

34 sec mn/wave, ± 5.76 /min 이었으며, 방사선실험군에서도 0, 1, 3, 5 일째에서변화없이측정되었고통계적으로도차이가없었다 (Table 1). 2. 소장평활근세포내막전압측정 Sham 대조군의소장평활근에서측정된세포내막전압의진폭과 가시전압진폭, 휴지기막전압, 그리고진동수는각각 7.87 ± 3.46 mv, ± mv, ± mv and ± 6.92 /min 이었다. 방사선실험군에서도세포내막전압이측정되었고 (Fig 4), sham 대조군과 비교해서차이가없었다 (Table 1). 3. Hematoxilin and Eosin 염색 방사선실험군에서염증에의한점막의손상이관찰되었고, 3 일째에서 가장심한손상을보였다. Sham 대조군과비교하여융모의높이가 16

35 낮았으며, 정상선와의개수도감소하였다. 이러한점막의손상및 염증은방사선실험군 5 일째에서회복되는것을확인할수있었다 (Fig 5). 4. TUNEL 분석, 면역조직화학염색및 qpcr TUNEL 분석을통해관찰된세포자멸사는방사선실험군 0, 1, 3 일째에서관찰되었고, 모두점막층에국한되어있었다. 소장평활근내 혹은근육층사이 (myenteric region) 에서는 apoptosis 를관찰할수 없었다 (Fig 6). 면역조직화학염색을통해 c-kit ICC 의존재를확인할수있었고, 방사선실험군에서도 sham 대조군과비교하여차이가없었다. 근육층 사이의신경절 (Ganglion) 세포역시방사선실험군과 sham 대조군에서 차이없이관찰되었다 (Fig 7). 방사선조사후 ICC 의변화여부를확인하기위해 qpcr 을통해 c-kit mrna 의정량분석을시행하였을때, sham 대조군과비교해서차이가 17

36 없었다 (Fig 8). 5. 약물처리 Sham 대조군과방사선실험군에서 Ach 을투여한후소장분절의수축력 측정에서 MMC 가증가하는것을확인할수있었다 (Fig 9). Sham 대조군에서 Ach 을투여하기전측정된진폭, AUC, 진동수는각각 3.19 ± 0.77 mn, ± sec mn/wave, 0.60 ± 0.17/min 였고, 투여후에는 6.19 ± 1.16 mn, ± sec mn/wave and 0.83 ± 0.17/min 였다. 방사선실험군 1 일째에서 Ach 투여후측정된진폭과 AUC 는각각 8.30 ± 2.99 mn, ± sec mn/wave 으로, sham 대조군과비교하여 약간높았으나, 통계적으로의미는없었다 (P = 0.149, 0.248). 방사선 실험군 3 일째에서 Ach 투여후측정된진폭과 AUC 는각각 3.20 ± 0.83 mn, ± sec mn/wave 로, sham 대조군과비교하여의미있게 작았다 (P = 0.021, 0.043). 그러나, Ach 투여전후의진폭과 AUC 의 18

37 증가된값의차이는 sham 대조군에서 3.00 ± 1.20 mn, ± sec mn/wave 방사선실험군 3 일째에서 2.25 ± 0.80 mn, ± sec mn/wave 로통계적으로차이가없었다 (P = 0.386, 0.248). phasic contraction 은 Ach 투여전후 sham 대조군및방사선실험군모두에서 변화가없었고, 이는통계적으로도차이가없었다 (Table 2). Sham 대조군과방사선실험군에서 TTX 를투여한후소장분절의 수축력측정에서 MMC 가감소하는것을확인할수있었다 (Fig 10). Sham 대조군에서 TTX 를투여하기전측정된진폭, AUC 는각각 3.19 ± 0.95 mn, ± sec mn/wave 였고, 투여후에는 1.17 ± 0.34 mn, 8.22 ± 3.79 sec mn/wave 였다. 방사선실험군에서도진폭과 AUC 가 감소하였고, sham 대조군과차이가없었다. phasic contraction 은 TTX 투여전후 sham 대조군및방사선실험군모두에서변화가없었고, 이는 통계적으로도차이가없었다 (Table 3). Sham 대조군과방사선실험군에서 L-NA 를투여한후소장분절의 19

38 수축력측정에서 MMC 가증가하는것을확인할수있었다 (Fig 11). Sham 대조군에서 L-NA 를투여하기전측정된진폭, AUC, 진동수는각각 2.73 ± 0.82 mn, ± 5.96 sec mn/wave, 0.63 ± 0.14/min 였고, 투여 후에는 3.78 ± 1.44 mn, ± 6.50 sec mn/wave and 0.67 ± 0.16/min 였다. 특히, 방사선실험군 3 일째에도 L-NA 투여후 MMC 의 파형이증가하였고, 측정된진폭과 AUC 는각각 3.00 ± 1.29 mn, ± sec mn/wave 로 sham 대조군과비교하여차이가없었다. phasic contraction 은 L-NA 투여전후 sham 대조군및방사선실험군모두에서 변화가없었고, 이는통계적으로도차이가없었다 (Table 4). Sham 대조군과방사선실험군에서 SNP 를투여한후소장분절의 수축력측정에서 MMC 가감소하는것을확인할수있었다 (Fig 12). Sham 대조군에서 SNP 을투여하기전측정된진폭, AUC 는각각 3.16 ± 1.14 mn, ± 5.93 sec mn/wave 였고, 투여후에는 1.07 ± 0.39 mn, mn, 6.78 ± 2.37 sec mn/wave 였다. 방사선실험군에서도진폭과 AUC 가 20

39 감소하였고, sham 대조군과차이가없었다. phasic contraction 은 SNP 투여전후 sham 대조군및방사선실험군모두에서변화가없었고, 이는 통계적으로도차이가없었다 (Table 5). 21

40 고찰 ICC 에서기원하는 slow wave 및 phasic contraction 은 C3H/HeN 생쥐의 소장에서고농도방사선조사후에도변화가없는것을관찰할수있었 고, ICC 가고농도방사선조사후조직학적으로도변화가없음을면역조 직화학염색이나 c-kit mrna 를이용한 qpcr 에서확인할수있었다. 또 한, TUNEL 분석에서도방사선조사후발생하는 apoptosis 는점막층에만 국한되어있음을확인할수있었고 ICC 세포가분포하는근육층에서는 관찰할수없었다. 그러나, MMC 는고농도방사선조사후 0, 1 일째진 동수가증가하였으며, 3 일째진폭과 AUC 가감소하였다. 이러한 MMC 는 5 일째회복되는것을확인할수있었다. ICC 의 plasticity 는다양한병적인조건하에서사멸하지않고세포의표 현형을변화시키는특성으로환경변화에따른순응의과정이라고볼수 있다 (Sanders et al. 1999). 생후 8 일된생쥐에서 c-kit 중화항체를처리하 여 kit 관련신호전달체계를차단하면, ICC 의개수및평활근수축과관 22

41 련된전기적인율동성은줄어들지만, 세포자체가 apoptosis 되는것이아 니라, 장관내평활근과같은다른형태의세포로분화된다는것이보고 되어있다 (Torihashi et al. 1995, Torihashi et al. 1999). 또한, 장관의허 혈과관련된연구에서는 ICC 의손상이혈액의재관류로인한회복과정에 서동시에회복될수있음을보이고있어 ICC 의 plasticity 를확인할수 있다 (Christensen and Rick 1994, Mei et al. 2009). 이러한 ICC 및 slow wave 의변화는장관의가성폐쇄, 소장운동성저하, 과민성대장증후군, 만성변비등에서보일수있으며, 다양한장관운동성의변화에기인한 질환의병태생리학적원인이될수있음이많은연구에서밝혀지고있으 며 (Huizinga et al. 1997), 장관의염증이 ICC 를손상시킬수있고, ethanol 과 acetic acid 를이용하여점막의염증을유발하면 slow wave 와 phasic contraction 이줄어들수있음이보고되어있다 (Lu et al. 1997). 그러나, 본연구에서는고농도방사선조사후소장평활근내의 ICC 와관련된 전기생리학적인활동성과 phasic contraction 은변화가없음을확인할수 23

42 있었고소장평활근내세포의 apoptosis 는없으며, c-kit(+) ICC 가근육층 사이에서정상적으로확인되었다. 따라서고농도방사선조사는 ICC 세 포에영향을미치지않으며 plasticity 를유발하지않는다는것을확인할 수있었다. 이를통해방사선조사후발생하는장관운동성의변화는 ICC 의 plasticity 와다른기전에의해발생한다고생각할수있다. 방사선은수산화혹은산화자유라디칼에의해 DNA 에직, 간접적으로 손상을가하여, 세포분열과정에서 apoptosis 를발생시키는것으로알려져 있다 (Baskar et al. 2012). 따라서, 빠르게증식하는세포가방사선에의한 손상정도가더심하며, 장관의점막역시쉽게손상될수있다 (Nguyen et al. 2002). 그러나, 장관평활근이나말초신경세포는이미분화가진행 되어세포분열이거의일어나지않아고농도방사선에도손상이심하지 않다고알려져있다 (Hall and Giaccia 2006). 본연구에서 ICC 도기능적으 로나조직학적으로큰변화가없음을확인하였다. 중배엽 (mesoderm) 에서 기원한 ICC 역시분화가이미진행되어세포분열이거의없어방사선손 24

43 상에서덜취약한것으로생각된다. 이전의고농도방사선조사후장관운동성의변화에관한몇몇연구 에서는방사선조사후초기에운동성의급격한증가를보고하였고, 본 연구에서도방사선조사후 0 일째와 1 일째에 MMC 의진동수가증가하는 것을확인할수있었다 (Fraser et al. 1998, Frisby et al. 2007). 방사선조 사후거대이동성운동 (Giant migrating contraction, GMC) 이의미있게 증가하며, 설사및복통을유발할수있다 (Otterson 2007, Otterson, Sarna and Moulder 1988). 이러한초기운동성의증가는방사선에의한콜린성 민감도의증가와관련이있고 (Krantis et al. 1996), 방사선조사후장관 내콜린에스테라아제효소의감소와, ACh 에대한반응의증가가관찰되 었다 (Quastel 1968, Burn, Kordik and Mole 1952). 본연구에서도방사선 실험군의 1 일째에서 ACh 투여후생기는 MMC 의진폭과 AUC 가증가가 sham 대조군에서보다크기가컸는데, 통계적으로는차이가없었다. 이는 아마도실험개체의수가작았기때문으로생각된다. 25

44 본연구에서방사선조사후 3 일째에는 MMC 가거의사라지는것을확 인하였으며, Ach 투여후의반응이 0, 1 일째와반대로크기가감소하였다. 고농도방사선조사후초기에는장관운동성이증가하지만, 이후에는운 동성이감소된다는몇몇연구가있고 (Summers et al. 1987, Kagnoff 1970), 이는장관내점막의염증으로인해내인성신경에영향을미치는신경 전달물질이변화되어발생하는것으로생각된다 (Otterson, Sarna and Lee 1992, Picard et al. 2001). 방사선조사후점막의손상으로인한염증조 직에서신경면역단백인 5-hydroxytryptamine(5-HT) 가증가하여장관의 운동성에영향을미칠수있고, 5-HT 의길항제가이러한장관의운동성 의변화와방사선조사에의한급성증상을완화하는데도움이된다는 연구결과가있으며 (Picard et al. 2002), Mast 세포에서분비되는 Substance P 역시장관의운동성에영향을준다는연구결과도있다 (Wang and Hauer-Jensen 2007, Linard et al. 1997). 본연구에서는방사 선조사후 3 일째억제된 MMC 가 NO 합성저해제인 L-NA 를투여후다 26

45 시재건되는것을보았을때, 이러한고농도방사선조사후장관운동성 의감소에 NO 의역할이중요할것으로생각된다. 염증조직에서 NO 의 증가는기존의연구에서잘알려져있다 (Jung et al. 2008). 이러한 NO 의 증가에영향을미칠수있는염증매개물질로 Prostaglandin(PG) 이있을 수있는데, PG 는손상된점막을보호하는역할을하는동시에장관운동 성에여러가지영향을미치는것으로되어있다 (Frantzides et al. 1992). 특히 PGE 2 는장관평활근의수축을억제하며, 고농도방사선조사에의 해염증세포에서분비가증가하는것으로되어있고, PG 합성저해제를 방사선조사전에투여한생쥐에서장관의운동성이감소되지않는다는 것이알려져있다 (Summers et al. 1991). 장관내염증에서증가된 PGE 2 는 EP2 와 EP4 수용체를활성화하여 inos 를분비하게하며 (Tajima et al. 2012), 이렇게증가된 NO 가장관평활근의수축을억제하는역할을하는 것으로생각된다. 본연구자의이전의다른연구에서고농도방사선조사 에의한장관점막의염증이 3.5 일에가장심한것으로확인되었고 (Kim 27

46 et al. 2012), 본연구에서도방사선조사후 3 일째에염증이가장심했고, 5 일째회복되었다. MMC 역시 3 일째소실되었다가 5 일째회복되는것을 확인할수있었고이는염증의정도에따라장관운동성이변화될수 있음을시사하는결과라고할수있겠다. 방사선조사후 5 일째회복된 MMC 는 TTX 와 SNP 의투여에의해 억제되었고, 이는대조군과차이가없었다. 이러한결과로방사선조사 후회복된 MMC 가장관의운동성에있어정상적으로기능할수있다는 것을확인할수있고, 초기의 MMC 의증가와더불어신경전달물질을 조절할수있는약물을통해고농도방사선조사후장관운동성의 변화를제어할수있다는가능성을제시한다고볼수있다. 그러나 이러한가능성이임상에서이용될수있도록하기위해서는좀더 세분화된실험연구와함께잘설계된대규모임상연구도필요할 것으로생각된다. 방사선조사후발생하는소장점막의염증반응은방사선의조사량에 따라비례하는것으로알려져있다. 대체로 2~6Gy 정도의방사선조사 후에는손상된점막세포가빠르게회복될수있으나, 9-10Gy 이상의 방사선조사후에는회복이어려울수있으며, 임상적으로 2~3 주에걸친 28

47 20-30Gy 의복부분할조사를시행하여도, 설사, 복통, 오심, 식욕부진 등의급성방사선장염의증상이발생할수있다. 방사선의농도가 60Gy 를넘게되면, 급성기를지나만성기에보이는장관폐색이나천공 등이나타날수있다. 방사선치료는직장암이나전립선암, 자궁경부암과 같은골반강내의종양의치료에효과적으로이용될수있고, 직장은 소장보다방사선에대한감수성은낮으나, 역시고농도조사에영향을 받을수있다. 50Gy 이상의조사를받으면약 10% 의환자에서대장협착을 일으킬수있으며, 60Gy 이상의조사에서는 25% 가발생하는것으로되어 있다 ( 강만식 et al. 1997, 이상석 et al. 2003). 이러한고농도방사선에 의한장관내염증반응이인체내에서장관의운동성에어떠한영향을 미치는지에대해서는좀더자세한연구가시행되어야하며, 이는방사선 장관염의증상을효과적으로치료하는데필수적이라고할수있다. 본연구의제한점으로는실험식적연구로서각각의군에서비교적작은 실험개체수로인해통계적인검정력이높지않다는것을들수있다. 그러나, 본연구는생쥐를이용한실험연구로장관운동성의변화의병태 생리및기전을밝힐수있다는점에서의미가있을수있으며, 실제로 고농도방사선조사후 ICC 의변화및염증매개및신경전달물질로써 NO 의역할에대한연구는현재까지없었다. 또한, 현재장관의운동성에 29

48 대한실험연구에서생쥐를이용한연구는매우중요하게생각되며, 유전적으로쉽게변형이가능하여특정유전자를결여되게만든 (knockout) 생쥐에서의연구가활발하게시행되고있다 (Spencer et al. 2003). 본 연구에서는야생형 (wild type) 의정상생쥐를사용하였으나, 본연구의 결과를기초자료로하여향후의연구에서 knock-out 생쥐를이용하여좀 더자세한실험을진행할수있을것으로기대된다. 본연구의또다른 제한점으로는실험에사용된전신적고농도방사선조사는현재 임상에서치료에이용하는방사선조사와는다르다는한계가있다. 방사선치료는복부의한정된부위에저농도로분할하여조사하여 가급적장관의손상을최소화하며, 이러한방법을통해급성방사선 장관염의가능성을줄이도록하고있다. 그러나, 환경적인영향으로 실제로치명적인고농도의방사선이전신에조사되는상황이발생할수 있으며, 이러한상황에서장관의운동성변화를관찰하는것은역시 의미가있다고할수있겠다. 또한, 본연구에서치명적일정도의전신 방사선조사에도 ICC 가가소성보다는저항성을보인다는것을 밝힘으로써, ICC 가방사선조사후장관의운동성변화에서보호적인 역할을할수있다는가능성을보였다는데에의미가있다. 그리고, 본 연구를통해급성방사선장관염에의한증상을조절하기위해서는 30

49 ACh 이나 NO 와같은신경전달물질과관련된약물을통해내인성신경 지배를제어하는것이필요할수있다는것을확인할수있었다. 31

50 결론 고농도방사선조사후생쥐의소장에서 phasic contraction 과 slow wave 는변화가없으며, ICC 의기능은유지되는것으로생각된다. 방사선조사후발생하는장관운동성의변화는염증에의해변화된 신경전달물질로부터발생하는것으로생각되며, 초기에는 ACh 의영향이 있고, 이후에는 NO 의영향이클것으로판단된다. 또한, 염증이 호전되면, 장관의운동성도회복되는 것으로확인되었다. 급성방사선 장관염에의한장관운동성변화로인한증상의치료에있어내인성 신경지배를제어할수있는약물의치료가중요할것으로생각되며, 장관내염증의치료역시중요할것으로생각된다. 32

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59 영문초록 (Introduction) Murine small intestinal motility consists of phasic contraction from interstitial cells of Cajal (ICCs) and migrating motor complexes (MMCs) from the enteric nervous system. The number of ICCs is reduced in various gastrointestinal disorders, and this effect can be reversed once the disorder is resolved through the property of plasticity. High-dose irradiation can induce inflammation and alter intestinal motility. We investigated the changes in murine small intestinal motility after high-dose irradiation and determined whether they are caused by changes in the ICC or enteric nervous system. (Materials and Methods) High-dose irradiation (13 Gy) was administered to 8-10-weekold male C3H/HeN mice. The small intestine was dissected out and stored in oxygenated Krebs-Ringer bicarbonate solution. The tension of contractions and intracellular membrane potentials were recorded at days 0, 1, 3 and 5 after irradiation and compared with those of sham mice. Histological evaluation was performed by immunohistochemistry and apoptosis was evaluated. Quantitative real-time polymerase chain 41

60 reaction (qpcr) for c-kit mrna was also performed. (Results) Phasic contractions were not changed at days 0, 1, 3, and 5 after irradiation and did not significantly differ from those in the sham mice. Slow waves were also sustained after irradiation. However, the frequency of migrating motor complexes (MMCs) was significantly higher at days 0 and 1 after irradiation and the amplitude and area under the curve were significantly lower at day 3 after irradiation when compared with sham mice. MMCs were recovered at day 5 with no difference from those sham mice. ICCs were detected after irradiation by immunohistochemistry for c-kit, and c-kit mrna levels did not differ between sham and irradiated mice. Histological evaluation showed that the most severe inflammation was detected at day 3 after irradiation, and apoptosis were detected only in the mucosa. Acetylcholine increased the contractility after irradiation, and tetrodotoxin decreased the number of MMCs in sham and irradiated mice. N w -oxide-l-arginine (L-NA) increased the number of MMCs. MMCs were recovered after L-NA treatment at day 3 after irradiation. Sodium nitroprusside decreased the MMCs in sham and irradiated mice. 42

61 (Conclusions) High-dose irradiation did not alter phasic contractions and slow waves in the small intestine of mice, which suggests that ICCs and their functions may be sustained after high-dose irradiation. Mucosal inflammation was severe after irradiation and there were some changes in MMCs related to the enteric nervous system Key Words) Small Intestine, Motility, Interstitial Cells of Cajal, Irradiation, Mouse 43

62 Table 1. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation Sham Day 0 Day 1 Day 3 Day 5 p-value MMC (N=6) (N=4) (N=5) (N=3) (N=4) Amplitude (mn) 4.31 ± ± ± ± ± /0.715/*0.020/0.201 AUC (sec mn/wave) ± ± ± ± ± /0.855/*0.020/0.136 Frequency (/min) 0.52 ± ± ± ± ± 0.52 *0.011/*0.028/0.197/0.522 PC (N=6) (N=4) (N=5) (N=3) (N=4) Amplitude (mn) 0.47 ± ± ± ± ± /0.201/0.796/0.831 AUC (sec mn/wave) 0.25 ± ± ± ± ± /0.927/0.439/1.000 Frequency (/min) ± ± ± ± ± /0.100/0.796/0.670 MP (N=5) (N=4) (N=4) (N=5) (N=5) Wave amplitude (mv) 7.87 ± ± ± ± ± /0.142/0.917/0.327 Spike amplitude (mv) ± ± ± ± ± /0.142/0.465/0.624 RMP (mv) ± ± ± ± ± /0.624/0.754/0.221 Frequency (/min) ± ± ± ± ± /1.000/0.347/0.462 MMC, migrating motor complex; AUC, area under the curve; PC, phasic contraction; MP, membrane potential; *p<

63 Table 2. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Acetylcholine Treatment Sham Day 1 Day 3 Day 5 MMC (before drug treatment) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) Amplitude (mn) 3.19 ± ± ± ± 1.61 AUC (sec mn/wave) ± ± ± ± 9.94 Frequency (/min) 0.60 ± ± ± ± 0.15 MMC (after drug treatment) Amplitude (mn) 6.19 ± ± 2.99 *3.20 ± ± 2.18 AUC (sec mn/wave) ± ± *47.11 ± ± Frequency (/min) 0.83 ± ± ± ± 0.07 PC (before drug treatment) (N=4) (N=4) (N=4) (N=4) Amplitude (mn) 0.74 ± ± ± ± 0.13 AUC (sec mn/wave) 0.28 ± ± ± ± 0.09 Frequency (/min) ± ± ± ± 5.58 PC (after drug treatment) Amplitude (mn) 0.63 ± ± ± ± 0.08 AUC (sec mn/wave) 0.32 ± ± ± ± 0.04 Frequency (/min) ± ± ± ± 7.80 MMC, migrating motor complex; AUC, area under the curve; PC, phasic contraction; *p<

64 Table 3. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Tetrodotoxin Treatment Sham Day 1 Day 5 MMC (before drug treatment) (N=5) (N=3) (N=3) Amplitude (mn) 3.19 ± ± ± 0.74 AUC (sec mn/wave) ± ± ± 9.85 Frequency (/min) 0.60 ± ± ± 0.13 MMC (after drug treatment) Amplitude (mn) 1.17 ± ± ± 0.41 AUC (sec mn/wave) 8.22 ± ± ± 4.92 Frequency (/min) 0.69 ± ± ± 0.11 PC (before drug treatment) (N=5) (N=3) (N=3) Amplitude (mn) 0.71 ± ± ± 0.49 AUC (sec mn/wave) 0.27 ± ± ± 0.10 Frequency (/min) ± ± ± 1.10 PC (after drug treatment) Amplitude (mn) 0.56 ± ± ± 0.44 AUC (sec mn/wave) 0.22 ± ± ± 0.09 Frequency (/min) ± ± ± 1.88 MMC, migrating motor complex; AUC, area under the curve; PC, phasic contraction; *p<

65 Table 4. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and N w -oxide-l-arginine Treatment Sham Day 1 Day 3 Day 5 MMC (before drug treatment) (N=4) (N=3) (N=4) (N=3) Amplitude (mn) 2.73 ± ± ± ± 0.93 AUC (sec mn/wave) ± ± ± ± 2.05 Frequency (/min) 0.63 ± ± ± ± 0.07 MMC (after drug treatment) Amplitude (mn) 3.78 ± ± ± ± 3.63 AUC (sec mn/wave) ± ± ± ± Frequency (/min) 0.67 ± ± ± ± 0.08 PC (before drug treatment) (N=4) (N=3) (N=4) (N=3) Amplitude (mn) 0.63 ± ± ± ± 0.07 AUC (sec mn/wave) 0.27 ± ± ± ± 0.10 Frequency (/min) ± ± ± ± 4.47 PC (after drug treatment) Amplitude (mn) 0.62 ± ± ± ± 0.11 AUC (sec mn/wave) 0.29 ± ± ± ± 0.11 Frequency (/min) ± ± ± ± 4.69 MMC, migrating motor complex; AUC, area under the curve; PC, phasic contraction; *p<0. 47

66 Table 5. Changes in Small Bowel Motility after High-Dose Irradiation and Sodium Nitroprusside Treatment Sham Day 1 Day 5 MMC (before drug treatment) (N=5) (N=4) (N=3) Amplitude (mn) 3.16 ± ± ± 1.25 AUC (sec mn/wave) ± ± ± 3.84 Frequency (/min) 0.65 ± ± ± 0.07 MMC (after drug treatment) Amplitude (mn) 1.07 ± ± ± 0.27 AUC (sec mn/wave) 6.78 ± ± ± 6.01 Frequency (/min) 0.72 ± ± ± 0.14 PC (before drug treatment) (N=5) (N=4) (N=3) Amplitude (mn) 0.64 ± ± ± 0.07 AUC (sec mn/wave) 0.27 ± ± ± 0.10 Frequency (/min) ± ± ± 5.68 PC (after drug treatment) Amplitude (mn) 0.42 ± ± ± 0.06 AUC (sec mn/wave) 0.19 ± ± ± 0.04 Frequency (/min) ± ± ± 2.01 MMC, migrating motor complex; AUC, area under the curve; PC, phasic contraction; *p<

67 Figure 1. Recording for mechnical tension of contractions. Small intestinal contractions were recorded at four sites (proximal, distal and two middle) with stainless steel clips and silk strings connected to a force transducer. 49

68 Figure 2. Recording for electrophysiological changes of intracellular membrane potential. The tissue was pinned down on the dish, with the circular muscle side facing upward. Conventional intracellular microelectrode recording was performed by impaling the tissue with a sharp glass microelectrode filled with 3 mol/l KCl. 50

69 Figure 3. Mechanical tension of contractions. Phasic contractions (PCs) were detected with no differences between sham and irradiated mice. Migrating motor complexes (MMCs) were observed with propagations from the proximal (Prox) to middle (Mid) and distal (Dist) small intestine, and they markedly decreased on day 3 after irradiation. 51

70 Figure 4. Electrophysiological changes of intracellular membrane potential. Slow waves were sustained with no differences between sham and irradiated mice. 52

71 Figure 5. Hematoxylin and eosin staining for evaluation of mucosal damage. Mucosal damage with inflammation was observed after irradiation. The most severe changes were on day 3, and the mucosal damage recovered slightly by day 5 after irradiation (scale bar = 200 µm). 53

72 Figure 6. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dutp nick end-labeling (TUNEL) assay for the detection of apoptosis. Apoptosis was detected only in the mucosa, at day 0, 1, and 3 after irradiation (black arrow), and was not detected in the smooth muscle tissue or myenteric region (scale bar = 40 µm). 54

73 Figure 7. Immunohistochemistry for detection of c-kit(+) ICCs. c-kit(+) ICCs were detected in the myenteric region in both sham and irradiated mice (black arrow) (scale bar = 40 µm). 55

74 Figure 8. Quantitative real-time polymerase chain reaction (qpcr) for c- kit. Expression levels of c-kit mrna in the smooth muscle tissues were not significantly different between sham and irradiated mice. 56

75 Figure 9. Changes in motility after treatment with acethycholine (ACh). ACh (10 µm) (black arrow) increased the contractile activities of MMCs in sham and irradiated mice. The amplitude and AUC of MMCs after ACh treatment at day 1 were slightly higher and those at day 3 were significantly lower than those in sham mice (p=0.021, 0.043). 57

76 Figure 10. Changes in motility after treatment with tetrodotoxin (TTX). TTX (1 µm) (black arrow) decreased the MMCs in sham and irradiated mice. Recovered MMCs were also reduced after TTX treatment at day 5 after irradiation. 58

77 Figure 11. Changes in motility after treatment with N w -oxide-l-arginine (L-NA). L-NA (100 µm) (black arrow) increased the MMCs in sham and irradiated mice. MMCs were recovered after L-NA treatment at day 3 after irradiation. 59

78 Figure 12. Changes of motility after treatment with sodium nitroprusside (SNP). SNP (100 µm) (black arrow) decreased the MMCs in sham and irradiated mice. Recovered MMCs were also reduced after SNP treatment at day 5 after irradiation 60