석사학위논문 SPE 와 LC-MS/MS 를 이용한 사람의 혈청 중 PFCs 분석법 개발 지도교수 홍 종 기 경희대학교 대학원 나노의약생명과학과 약학 전공 이 원 웅 2010 년 2 월

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2 석사학위논문 SPE 와 LC-MS/MS 를 이용한 사람의 혈청 중 PFCs 분석법 개발 지도교수 홍 종 기 경희대학교 대학원 나노의약생명과학과 약학 전공 이 원 웅 2010 년 2 월

3 SPE 와 LC-MS/MS 를 이용한 사람의 혈청 중 PFCs 분석법 개발 지도교수 홍 종 기 이 논문을 석사 학위논문으로 제출함 경희대학교 대학원 나노의약생명과학과 약학 전공 이 원 웅 2010 년 2 월

4 이원웅의 약학 석사학위 논문을 인준함 * 주 심 교 수 정 서 영 (인) * 부 심 교 수 표 희 수 (인) * 부 심 교 수 홍 종 기 (인) 경희대학교 대학원 2010 년 2 월

5 차 례 국문요약... 3 List of Figures... 5 List of Tables... 6 제 1 장 서론 연구의 필요성과 목적 과불화 화합물 (Perfluorinated compounds, PFCs) PFCs 의 분석 혈액 및 생체 시료의 분석 기기 분석 제 2 장 실험 방법 측정 장비 및 실험 기구 시약 인공 뇌척수액(Artificial cerebrospinal fluid, ACSF) 제조 시료의 전처리 단백질 침강법 (Protein precipitation) 이온쌍 추출법 (Ion-pairing extraction, IPE) 고체상 추출법 (Solid phase extraction, SPE) LC-ESI(-)-MS/MS 를 이용한 PFCs 의 분석

6 제 3 장 결과 및 고찰 Perfluorinated compounds(pfcs)의 background 오염조사 실험 기구로 인한 영향 실험 용매로 인한 영향 HPLC 부품에 의한 영향 시료의 추출 및 정제 시료 전처리 방법 비교 LC-ESI(-)-MS/MS 를 통한 분석법 확립 Multiple reaction monitoring(mrm) 분석법 확립 Triethylamine 첨가에 의한 PFC 의 감도 향상 분석방법의 타당성 확립 회수율 검량선, 검출한계 및 정량한계 정확성 및 정밀성 (Accuracy & Precision) NIST SRM 실제 혈청 시료에 적용 제 4 장 결론 참고문헌 영문요약 (Abstract)

7 국 문 요 약 SPE와 LC-MS/MS를 이용한 사람의 혈청 중 PFCs 분석법 개발 이 원 웅 지도교수 홍 종 기 과불화 화합물(Perfluorinated compounds; PFCs)은 안정한 화합 물질로써 그 독특하고 활용적인 특징으로 인하여 전세계적으로 다양한 용도로 사용되어 왔다. 그러나 난분해성으로 인하여 환경계에서 잔류성 이 높고 다양한 경로를 통해 인체 내에도 축적되어 급성 또는 만성 독성 을 일으킨다는 결과들이 보고되었다. 따라서 환경매체의 오염정도와 인 체노출에 대한 연구를 위하여 이들 물질에 대한 분석법의 개발이 시급하 게 요구되고 있는 실정이다. 이 과불화 화합물 중 불소와 탄소간의 강력한 결합으로 인하여 자 연계 내에서 잘 분해되지 않고 가장 많이 발견이 되는 화합물이 PFOS, PFOA이다. 이 물질들은 비휘발성이며 강력한 유기 산으로써 GC-MS나 19 F-NMR으로 분석이 용이하지 않아 주로 LC-MS 혹은 LC-MS/MS 를 통해 분석이 이루어지고 있다. 또한 사람의 혈액이나 인체 시료 내에 존재하는 미량의 과불화 화합물의 분석은 체내 다양한 분석방해물질의 존재로 인하여 정확한 분석이 쉽지 않다. 따라서 본 연구에서는 혈청 내에 존재하는 미량의 과불화 화합물 을 분석하기 위한 시료 전처리법과 LC-MS/MS MRM법을 이용한 분석 법을 개발하고자 하였다. 시료 전처리 방법으로는 고체상 추출법, 이온 쌍 추출법 및 단백질 침강법을 비교 검토하였다. 이 중 고체상 추출법이 시료 상 존재하는 시료 내의 분석방해물질 제거에 최상의 결과를 보여 3

8 주었다. PFC의 분리 및 검출에 있어서, 빠른 분리를 위하여 monolithic C18 컬럼 사용으로 4분 이내에 10종의 화합물을 분리할 수 있었으며, 방해물질의 영향을 최소화를 위하여 MRM mode로 검출하였다. 개발된 분석법의 타당성 검증을 위하여 회수율, 직선성, 검출한계, 정량한계, 정확성, 정밀성을 조사하였다. 검증결과 각각 1 ppb와 10 ppb 수준에서 회수율은 ~ %의 범위에서 얻어졌고 상대표준오 차는 4.38 ~ %의 범위에서 얻어졌다. 검량선은 모두 0.5 ~ 50.0 ng/ml의 범위에서 R 2 = 이상의 직선성을 보였으며 검출한계와 정량한계는 각각 0.15 ~ 0.25 ng/ml 및 0.50 ~ 0.84 ng/ml로 나타났 다. 실험 상의 정밀도는 각각 3, 10, 50 ng/ml에서 0.06 ~ %의 범위에서 나타났으며 정확도는 ~ %이내로 나타났다. 질량 분석기에서 얻어지는 결과에 대한 감도 향상을 위하여 이동 상에 triethylamine(tea)을 첨가한 결과 과불화알킬산의 경우는 최대 10배 가까운 감도 향상을 보였으나 과불화설폰산의 경우는 감도의 변화 가 크게 나타나지 않았다. 본 분석법의 타당성을 확인하기 위하여 표준대조물질(SRM NIST 1957)을 사용하여 미량의 PFCs를 분석한 결과 본 결과와 인증값의 차 이가 오차범위에 놓여 있었다. 또한 본 연구에서 개발된 분석법을 사람 혈청에 적용하여 그 결과값을 얻었다. 개발된 분석법은 향후 혈액 내 미 량의 PFCs를 분석하는 데 있어 적합한 분석법으로 이용될 것으로 사료 된다. Keywords: perfluorinated compounds, serum, weak anion exchange, solid-phase extraction, monolithic column, method validation, LC-MS/MS, MRM 4

9 List of Figures Figure 1. Chemical structures of standard compounds of perfluorinated compounds (PFCs) Figure 2. Flow diagrams for sample preparation of PFCs according to (a) protein precipitation, (b) ion-pairing extraction, and (c) solid phase extraction Figure 3. Sorbent structure of Oasis WAX cartridge Figure 4. Comparison of background levels of (a) blank run, (b) TEF vial cap, and (c) PE vial cap 30 Figure 5. Comparison of MRM chromatograms of standard mixture in between (a) conical (Falcon) tube and (b) glass vial Figure 6. Comparison of MRM chromatograms of (a) J.T.Baker MTBE solvent and (b) Burdick & Jackson MTBE solvent Figure 7. Comparison of MRM chromatograms of (a) Teflon solvent tubing and (b) silicone solvent tubing Figure 8. Comparison of extraction methods for recovery rates of spiked plasma at 100 ppb Figure 9. Comparison of MRM chromatograms of sample preparation methods [(a) protein precipitation, (b) ion-pairing extraction and (c) solid-phase extraction (WAX)] Figure 10. ESI-MS/MS spectra of PFCs compounds in negative ion mode Figure 11. MRM chromatograms of standard compounds of PFCs at 1ppb level Figure 12. Response of PFCs according to mobile phase conditions Figure 13. Calibration curves of PFCs generated from spiked ACSF sample Figure 14. MRM chromatograms of PFCs in human serum sample

10 List of Tables Table 1. Instrumental conditions of LC-ESI(-)-MS/MS MRM mode Table 2. Recovery rates of PFCs according to sample preparation methods Table 3. Comparison of LOD according to mobile phase conditions Table 4. Recovery rates of spiked ACSF at 10 ppb Table 5. Calibration curves, linearity, LOD, and LOQ of PFCs Table 6. Intra and inter day test of PFCs by SPE (WAX) Table 7. Comparison of PFCs levels in SRM 1957 with NIST standard values, inter-lab. values and measured values

11 제 1 장 서 론 1.1 연구의 필요성과 목적 20 세기에 들어오면서 산업화와 공업화가 가속화 됨에 따라 인류의 편의를 위한 제품들의 생산이 증가되기 시작하였다. 그리고 지난 수 십 여 년에 걸쳐 인류는 더욱더 안정하고 안전하면서 인류의 쾌적한 생활과 환경에 도움이 되는 제품들을 개발하기 위해 노력해왔다. 그러한 노력 하에 기존의 자연계에는 존재하지 않던 새로운 화학 물질들을 개발하기에 이르렀다. 이러한 새로운 화학 물질들은 일반 자연계 내에서 좀 더 안정한 형태로 변모되어 빠르게 인류의 쾌적한 생활과 환경을 위해 우리 주변의 환경에 자리잡게 되었다. 하지만 아이러니하게도 이러한 안정하고 안전한 화학 물질들이 자연계에서 파괴되거나 분해되지 않고 잔류해 주변 환경에 축적이 되고 결국 인간 스스로에게 노출되어 인류의 안정과 안전을 위협하기에 이르렀다. 따라서 인류 스스로 만들어낸 물질의 오염 정도와 주변 환경의 노출 정도를 파악하여 이에 대한 위해성을 파악하고 대처를 하려는 요구가 점점 시급해지고 있다. 또한 급속한 세계화의 진행에 따라 환경오염 등의 문제는 더 이상 한 지역 및 국가에서 끝나는 것이 아니라 전 세계적으로 진행되고 있어 이러한 문제의 대처에 대한 노력과 요구는 점차 전 세계적으로 증가하고 있다. 불화유기화합물은 이러한 화학 물질 중의 하나로써 탄소와 불소 원자로 이루어져 있으며 인공적으로 만들어진 불화유기화합물은 천연 불화유기화합물보다 더 많은 불소 원자를 포함하고 있다[1-4]. 과불화 화합물(perfluorinated compounds, PFCs)은 열, 기름, 녹, 유지, 물에 7

12 대한 저항성을 가지고 있는 물질을 만드는데 이 십여 년간 쓰여왔다[5]. 현재 이 화합물들의 대부분은 자연계에 존재하는데 그 원인은 인간이 생산한 물질들 때문이다. 환경에서의 불소화합물 노출은 불소화합물로 인한 생산품이 생기는 순간부터 일어난다. 불소화합물이 생산품으로 바뀔 때, 생산품이 소비자로 전달될 때, 소비자에 의해서 생산품이 소비되고 버려질 때 마다 인간은 불소화합물에 노출될 수 있다[2]. PFCs 를 생산하는 곳이 얼마나 많은지 정확하게 알려져 있지는 않지만 미국과 유럽(이탈리아, 스위스, 영국)과 일본에서 대량 생산이 되는 것으로 알려져 있다. 최근 몇 년간 매년 약 4,500 톤의 PFOS (perfluorooctanesulfonic acids) 관련 화합물들이 생산 됐으며 미국 굴지의 화학회사인 3M 이 세계적인 생산회사로 알려져 있다. 그러나 2000 년에 3M 은 향후 오십 년 간 PFOS 화합물의 생산을 단계적으로 감축할 것이라고 발표하였다. 이 발표에 이어서 2000 년 8 월 미국 환경보호청 (Environmental Protection Agency, EPA)에서 88 개의 PFOS 관련 화합물에 관한 새롭고 중대한 법률안을 공고하였다[6]. 이는 PFOS 관련 화합물을 수입하거나 생산하는 경우 생산 90 일전에 EPA 에 그 사실을 통보해야 한다는 것이다. 이 공고기간 동안에 EPA 는 그 화합물을 조사하여, 필요 하다면 그것의 수입과 생산을 금지하거나 제한하겠다는 것이다. PFOS 와 관련 화합물들은 2000 년 이후로 OECD 의 의제로 선정되었다. 결론적으로 OECD 는 PFOS 와 관련 화합물을 금지하기 보다는 각 나라의 정부측에서 PFOS 관련 화합물 생산자와 접촉하여 PFOS 와 관련 화합물을 단계적으로 생산을 중지하도록 하는 계획을 가질 것에 대한 결정을 촉구하였다[7]. 8

13 유럽연합에서는 현재 그들이 PFOS 관련 화합물에 대하여 생산 금지계획을 가지고 있지 않지만, 환경오염물질들에 대해 일반적으로 적용되는 규제 법안을 통해 PFOS 의 노출과 관련될 지도 모르는 환경오염물질도 규제된다고 밝혔다. 이것은 불소와 그 화합물을 포함한, (고정된 방출 제한 용량에 상응하는) 주요 오염물질의 오염방지와 조절에 관한 IPPC Directive 96/61/EC(통합오염관리지침)와 관련된 케이스이다[8]. PFCs 의 분해 산물 대부분이 세계 곳곳에서 발견되지만 특히 PFOS 와 PFOA(perfluorooctanoic acids)가 세계에서 가장 주요하게 발견되는 화합물이다. 그것은 탄소와 불소간의 강한 결합으로 인해 PFOS 와 PFOA 는 잘 분해되지 않고 사람의 혈액, 물, 흙, 퇴적물, 공기, 포유류, 어류, 조류 생물의 체내에 남아있기 때문이다[9]. 따라서 본 연구에서는 PFOS 와 PFOA 그리고 이들 물질을 중심으로 한 관련 화합물들(Fig. 1)에 대한 분석법을 개발하여 실제 생체 시료(혈청) 등에 적용할 수 있는 최적화된 분석법을 제공하고자 하였다. 9

14 Figure 1. Chemical structures of standard compounds of Perfluorinated compounds (PFCs) 10

15 1.2 과불화 화합물 (Perfluorinated compounds, PFCs) 과불화 화합물로 코팅된 표면은 화학적인 공격에 대한 저항성이 매우 크고 이로 인해 전형적인 계면활성제들을 사용하지 못하는 물질의 매개체에도 사용될 수 있다[10]. 그리고 다른 일반적인 화학물질들이 급격하게 분해하는 조건인 열과 산, 염기물질, 산화제, 환원제에도 과불화 화합물은 강한 저항성을 보인다. 이로 인해 제품들의 주요 요소로 사용 되었으며 이와 더불어 물과 기름에 반발하며, 표면장력을 줄이고 다분자화나 고분자화 반응의 촉매로써 사용된다[2]. 이러한 화학적 안정성으로 인해 높은 온도에서 불을 끄는 소방용 발포제로 활용이 가능케 되었다[11-13]. 추가적으로 PFCs 는 살충제, 화장품, 접착제, 기름, 윤활제로 쓰였으며 이러한 물질은 공산품으로 출현하게 되었다. 그런데 불소화 화합물들은 극한 화학적, 물리적 환경에서도 비교적 안정할 뿐 만 아니라 생화학적 분해과정에서도 안정한 것으로 보고되고 있다[14]. 따라서 불화유기화합물은 환경적으로 분해되지 않는 물질일 뿐만 아니라 포유류에서 독성을 보이는 동시에 생체축적물질로 존재하고 있다[15]. 이러한 과불화 화합물은 생산과 사용 후에 공기, 강이나 폐수 등을 통해 다양한 환경매체로 유입되고 있다. 따라서 이들 과불화 화합물과 같은 난 분해성 물질은 하수 침전물로 흡수되기도 하며, 화학물질의 매립을 통해 토양 중 재이동이 야기되기도 한다[14]. 또한, 물과 흙 속에서의 이들의 이동성과 극성은 바다와 지하수로 유입될 수 있는 근원을 만들고 있다. 다양한 환경매체를 통한 이동은 이 화합물을 전 세계적으로 분포할 수 있도록 만든다[14]. 과불화 화합물은 지표수에서 ng-mg/l 의 범위로 발견되었고, 지하수의 경우 μg/l, 폐수와 침전물 11

16 및 하수퇴적물과 혈액에서는 ng-μg/l 의 수준으로 발견되며, 사람의 간에서는 ng/g, 그리고 북극을 포함한 야생동물의 간과 지방에서는 ngμg/g 수준으로 검출되었다[15]. 이 화합물들은 동물의 생체조직에서는 많은 연구가 진행되었지만, 인체 내 PFOS 및 PFOS 관련물질에 대한 약물동력학과 생체대사에 대해서는 제한된 결과만이 존재한다. 일반적으로 이 두 화합물들은 분해되지 않고 생체조직에 축적되는 것으로 알려져 있으며, 이들의 반감기는 생물종마다 차이를 나타낸다. 쥐는 몇 일, 원숭이는 몇 달에 불과하지만 사람의 경우 몇 년으로 알려져 있다[16,17]. 이 화합물들에 대한 합성, 생산, 독성, 환경발생, 분석 측정결과는 최근의 학술지에서 다양하게 재조명되고 있다[5,15]. 현재까지의 기술들 중 가장 널리 사용되고 있는 기술은 LC/MS 또는 LC-MS/MS 를 이용하여 이 화합물들을 측정하는 방법이다. PFOS (perfluorooctanesulfonic acids) 모든 산업적인 PFOS 유도체는 전기화학적 불소화 반응에 의해 얻어진 퍼플루오로옥탄설포닐 플루오라이드에서부터 발생된다. 염기촉매 하에서 불소화합물의 가수분해는 PFOS 와 각각의 염을 만든다. 또한 설폰아마이드 유도체는 플루오라이드로부터 얻는다[10]. PFOS 와 그와 관련된 화합물들은 최근 몇 년 간 세계의 관심을 받아 왔다. 여기서 관련된 화합물들 은 PFOS 와 PFOS 를 생성할 수 있는 물질들을 포함한 일부 또는 대다수의 물질로 규정되는데 이 물질은 21 세기의 PCBs 라고도 불린다[18]. 퍼플루오로알킬레이티드 설포노아미도알콜은 전기화학적 불소화 반응에 의해 생성된다[19]. 이 물질들은 다양한 12

17 표면처리 과정에서 사용되며 포유류와 어류의 체내에서 생체대사된다[20]. PFOA (perfluorooctanoic acids) PFOA 의 암모니아염은 폴리테트라플루오로에틸렌과 폴리비니리딘 플루오라이드같은 플루오로폴리머 합성에 필수적이다. 이것들은 플루오로폴리머의 유화고분자 반응의 유화제로 쓰인다. PFOA 와 그와 관련된 화합물들을 이용해 생산된 중합체들은 일반적으로는 PFOA 를 포함하고 있지 않다. 플루오로텔로머 알코올은 넓은 범위의 상업적 생산품에 쓰인다. 소방 발포제나 흙, 녹과 유지를 방지하기 위한 코팅, 카펫, 타일, 종이, 가죽 등에 광범위하게 이용되고 있으며 이러한 화합물들은 알려지지 않은 과불화 화합물의 전구물질이 될 수 있는 후보물질이다[21]. 일부 연구에서는 FTOHS 가 PFOA 로 분해된다고 보고되고 있다[22-24]. 1.3 PFCs 의 분석 혈액 및 생체 시료의 분석 혈액 플라스마와 생체 시료는 반드시 폴리프로필렌 용기에 준비되고 보관되어야한다. 이는 과불화 화합물이 잠재적으로 다른 물질의 표면에서 시료로 흡수될 수 있기 때문이다[25,26]. PFOS 및 관련 물질은 주로 혈액이나 간, 담즙에 함유되어 있다[26-28]. 일부 연구에 따르면 인체 혈장 단백질은 잠재적으로 분석기기의 다른 금속 부품의 표면으로 흡수될 수 있다. 따라서 이 화합물들은 우선 단백질로부터 13

18 유리되어야만 한다[26]. 아세토니트릴(acetonitrile)과 trichloroacetic acid (TCA)는 단백질을 침전시킬 수 있는 유기용매로 쓰여 왔다[26,27]. TCA 는 종종 소수성 산성물질과 공침하여 질량스펙트럼 상에서 심각한 클러스터의 형성을 보여주는데 이 클러스터는 분석물질과 동일한 질량스펙트럼 영역 대에서 분석에 장애를 유발한다[26]. 그러나 일부 연구에서 시료 전처리 과정의 단순화를 위하여 단백질 침전작업을 제거하고 대신 혈청과 우유의 단백질로 인한 분석대상물질의 상호작용을 제한하기 위하여 formic acid 과 함께 혈청과 우유 시료를 희석시키고 초음파처리를 하였다[28]. 또 다른 연구에서는 아세토니트릴(ACN), TCA, formic acid 를 각각 사용하여 분석대상물질의 회수율을 확인하였다[27]. Formic acid 는 분석물질이 흡착제와 극성 상호작용을 할 수 있도록 만들어주고 SPE 컬럼의 막힘을 방지할 수 있다[27]. 비록 샘플의 직접적인 주입이 보고되었지만, 다른 시료 전처리 과정들은 원심분리와 여과 과정을 포함하고 있거나[29] 혹은 이온쌍 추출 전에 테트라부틸암모니움(TBA)이나 카보네이트(carbonate) 완충용액을 사용하여 ph 를 조절하는 것으로 보고되어 있다[30]. 추출 과정에 있어서 몇 가지 방법들이 적합한 추출 용매의 사용과 추출물의 완전한 건조 후 MTBE 와 같은 유기용매를 사용하는 이온쌍 추출법이 이용되고 있다[19,20]. 그러나 과불화 화합물들의 화학적 물리적 성질을 고려했을 때, 이러한 방법들은 시간과 노력을 많이 요구하고 실험실 기구에 접촉되면서 흡착이 일어나 손실현상이 일어날 수 있다. 최근에 보고된 논문에서는 혈장 내의 과불화 화합물의 분석을 위하여 on-line Oasis HLB 카트리지를 사용하는 추출법을 발표하였다[26,29]. 반면에 짧거나 긴 사슬체인의 과불화산이나 플루오로텔로머산, 플루오로텔로머알콜의 off-line SPE 를 위하여 Sep 14

19 Pak C18, Oasis HLB(hydrophilic-lipophilic balance), WAX(weak anion exchanger)와 같은 다양한 SPE 카트리지를 시험하였다. 이들 중 WAX-SPE 는 가장 좋은 회수율을 보였다[19]. 과불화 화합물은 불소화합물 화학산업에 종사하는 사람, 즉 이 물질에 장기적으로 또는 단기적으로 노출된 사람들의 혈청과 조직 시료에서 상당량의 과불화 화합물들이 검출되었다. 미국과 유럽 아시아에서 구입한 모든 혈청 시료에서 PFOS 가 측정되었다. 과불화 화합물의 산업적인 생산 전에 일어난 한국전쟁 당시에 참전한 미국 군인의 혈액 시료에서만 PFOS 가 검출되지 않았다[15,31]. 단기적으로 과불화 화합물에 노출된 사람의 경우 PFOS 는 6.7~81.5 μg/l, <nd(1.5)~21.4 μg/l 의 PFHxS, <nd~35.2 μg/l PFOA, <nd(1.5)~2.2 μg/l 의 FOSA 그리고 장기적으로 노출된 사람의 경우 250~12,800 μg/l 의 PFOS 와 840~6,400 μg/l 의 PFOA 의 측정치를 보였다[31-34]. 다른 학자들의 경우 북극과 북태평양과 같은 동떨어진 지역과 마찬가지로 산업화된 지역의 야생생물의 조직과 장기에서도 과불화 화합물의 검출을 보고하였다. 일반적으로 이 화합물들의 농도는 오지에 사는 것보다 도시화된 지역에 사는 야생동물의 조직과 장기 시료에서 몇 배 정도 높은 농도의 수준으로 검출되는 것으로 보고되었다[15]. 야생동물의 조직에서 검출된 농도는 ng/g (ppb) 수준이었다[35-37] 기기 분석 자연계 시료의 과불화 표면 활성제 분석은 LC-MS 혹은 다른 LC 검출기(UV 또는 형광검출기), 19 F NMR 이나 GC-MS 같은 장비에 15

20 의해서 수행되었다. 최근 이들 화합물의 분석은 LC-MS 에 의해 수행되는 것이 주류를 이루고 있다[5,15]. 자연계의 물 시료 내에서 과불화 계면활성제는 19 F NMR 에 의해 검출될 수 있다[10,12]. 하지만 시료 내에 CF 2 나 CF 3 같은 물질의 존재도 같이 검출하기 때문에 특수성을 띄지 않는다. 일부 연구에서는 19 F NMR 을 이용하여 물 시료 내의 과불화 화합물의 전체농도를 정량하고 이것을 LC-MS/MS 에 의해서 얻어진 데이터와 비교를 시도하였다[12]. 그 결과 적용 된 두 가지 방법으로 얻어진 결과는 일치하지 않음을 보여주었다. 19 F NMR 에 의해서 측정된 과불화 화합물의 전체양은 LC-ESI-MS/MS 에 의해서 계산된 결과보다 높았다. 이러한 차이는 지표수의 다른 계면 활성제의 19 F NMR 스펙트럼과 퍼플루오로알칸설포네이트(perfluoroalkanesulfonates)나 퍼플루오로카보실레이트(perfluorocarboxylates)의 스펙트럼이 유사하기 때문이라고 설명된다. GC 는 높은 기압에서 설폰아마이드나 플루오로텔로머알코올같은, 직접적인 과불화 화합물 중 휘발성 물질과 중성 물질에 대한 검출에 이용될 수 있다[5,22,38]. 유도체화 기술의 적용은 GC-MS 에 의한 과불화 화합물의 분석에 이용될 수 있다[11,25,39]. 지하수 중에서 퍼플루오로카르복실레이트를 분석하기 위하여 메틸에스터를 유도체화하고 에스터 유도체를 전자이온화법 (EI) GC-MS 또는 전자포획음이온 화학이온화법 (NCI)의 GC-MS 에서 검출함으로써 정량적인 검출을 수행할 수 있다[11,40]. 그러나 PFOS 와 같은 물질은 위와 같은 방법을 적용하더라도 GC-MS 에 의해서 검출되지 않는다[40]. 유도체화 과정에서 퍼플루오로알칸설포네이트의 에스터가 형성이 되는데 퍼플루오로알칸설포네이트가 에스터기로부터 쉽게 잘 16

21 떨어지는 성질 때문에 불안정하기 때문이다[41,42]. 따라서 GC-MS 에 의하여 행해진 몇 가지 과불화 화합물(설폰아마이드)의 분석에도 불구하고 이 기술은 반복적인 환경 시료의 모니터링에 적용할 수 없을 것으로 판단된다[43]. 위에서 언급한 19 F NMR 과 GC-MS 의 기술의 한계와 약점은 LC 에 의해 이점(유도체화 과정이 필요없고, 모든 종류의 과불화 화합물에 대해 적용이 가능하다는 점, 그리고 고감도 및 고 선택성)으로 제공되어 특히 질량분석기와 연결되어 과불화 화합물의 분석법으로 가장 널리 사용된다. LC 검출기의 사용에서, 대부분의 과불화 화합물의 경우 발색단을 포함하고 있지 않기 때문에 UV 검출기는 미량물질에 대한 적절한 선택성과 감도를 보여줄 수 없다[26]. 따라서 대부분의 연구결과들에서 LC-MS 나 LC-MS/MS 를 사용한 분석이 지배적이다. 17

22 제 2 장 실험 방법 2.1 측정 장비 및 실험 기구 본 연구의 시료분석을 위해서 사용된 분리분석장비는 시료 자동주입기(Agilent 1200 Series G1367B Autosampler)가 장착된 Agilent (Palo Alto, CA, USA)사의 Agilent 1200 Series HPLC 를 사용했으며 HPLC 에서 분리된 각 물질들의 분자량 및 그 특징이온들의 확인을 위해 triple quadrupole mass spectrometer (API 3200, MDS sciex, Concord, ON, Canada)를 사용하였다. 이 때 사용한 이온화 법은 electrospray ionization 법으로 negative ion mode 에서 사용하였다. Column 은 Merck (Darmstadt, Germany)사의 Monolithic type 의 Chromolith Performance RP-18e column (3mm I.D x 100mm Length)을 사용하였다. 시료 전처리를 위하여 Waters (Milford, MA, USA)사의 Oasis WAX cartridge (1cc, 30mg)를 사용하여 SPE (Solid Phase Extraction) 하였다. 원심분리기는 Andreas Hettich (Tuttlingen, Germany)사의 MIKRO 200 제품을 사용하였다. 18

23 2.2 시약 본 연구에 사용된 시약 중 PFOA(Perfluorooctanoic acid, 96%)를 비롯한 PFPA(Perfluoropentanoic acid, 97%), PFHxA(Undecafluorohexanoic acid, 97.0%), PFHpA(Perfluoroheptanoic acid, 99%), PFNA(Perfluornonanoic acid, 97%), PFDA(Perfluorodecaonic acid, 98%), PFHxS(Tridecafluorohexane-1-sulfonic acid potassium salt, 98.0%)는 Aldrich 사로부터 구매하였고 PFOS(Heptadecafluorooctanesulfonic acid, >98.0%)는 Tokyo Chemical Industry (Tokyo, Japan)사로부터 구매하였고 PFHpS(L- PFHpS, sodium perfluoro-1-decane sulfonate) 및 PFNS(ip-PFNS, Sodium perfluoro-7-methyl octane sulfonate) 와 각각 perfluorinated carboxylic acids 의 내부표준물질과 perfluorinated sulfonic acids 의 내부표준물질인 13 C-labelled PFOA(MPFOA, Perfluoro-n-[1,2,3,4-13 C4]octanoic acid)와 13 C-labelled PFOS(MPFOS, Sodium perfluoro-1-[1,2,3,4-13 C4]octane sulfonate)는 Wellington 사로부터 메탄올에 녹여있는 50ppm, 1.2mL 을 구매하여 사용하였다. Artificial cerebrospinal fluid(acsf) 제조를 위한 시약인 KCl, NaCl, dextrose anhydrous, CaCl 2, NaHCO 3, urea, MgSO 4 및 NaH 2 PO 4 을 사용하였으며, 이들은 Showa (Tokyo, Japan), Junsei (Tokyo, Japan), Kanto chemical (Tokyo, Japan) 및 Daejung (Kyonggi, Korea)사로부터 각각 구입하였다. 시료 전처리 과정 중 단백질 제거를 위해 사용된 acetonitrile 은 Fisher Scientific (NYSE, TMO)사로부터 구매하여 사용하였고 19

24 SPE 과정 중에 사용된 용매는 각각 methanol, ammonium hydroxide 는 J.T.Baker (Phillipsburg, NJ, USA)사로부터 그리고 methyl-tertbutyl ether(mtbe)는 Burdick & Jackson (Muskegon, MI, USA), formic acid 는 Junsei (Chuo-ku, Tokyo, Japan)사로부터 구매하여 2% formic acid in water solution 과 2% ammonium hydroxide in methanol:mtbe (10:90) 혼합 용액을 만들어 사용하였다. HPLC 에서 이동상으로 사용되는 acetonitrile 은 HPLC 등급으로 Fisher 사로부터 구매하여 사용하였고 이동상에 첨가한 ammonium acetate 와 triethyl amine 은 각각 Sigma-Aldrich (Steinheim, Germany)사와 Acros organics (Geel, Belgium)사로부터 구매하여 사용하였고 증류수는 J.T. Baker 사로부터 구매하여 사용하였다. 2.3 인공 뇌척수액(Artificial cerebrospinal fluid, ACSF) 제조[44] PFCs 가 불검출 되는 혈액 시료를 얻기가 사실상 불가능하므로 혈액 시료를 통한 검출 한계 및 정량 한계의 도출 등 역시 불가능 하다. 따라서 바탕시료로써 이용하기 위해 인공 뇌척수액을 만들어 사용하였다. 사람의 체강에 있는 모든 체액과 마찬가지로 뇌척수액은 혈액이 여과되어 나온 액체이다. 인공 뇌척수액은 NaCl 126.0mM, KCl 5.3mM, NaH 2 PO 4 2H2O 1.0mM, NaHCO mM, MgSO 4 7H2O 0.8mM, Urea 13.3mM, d-glucose 24.6mM, CaCl 2 1.8mM 을 증류수 1L 에 녹여 사용하였다. 20

25 2.4 시료의 전처리 현재 세계적으로 다양한 PFCs 의 시료 전처리 법이 개발되고 이에 따라 실험이 진행되고 있으나 인체의 혈액 (전혈 및 혈장, 혈청) 시료에 도입되어 논문으로 보고된 추출 및 정제법으로는 혈액 내의 단백질을 제거하여 분석을 진행하는 단백질 침강법 (protein precipitation)과 강산성을 띄고 있는 PFOA, PFOS 류에 ammmonium ion 을 ionpairing 하여 유기용매로 추출하는 액체-액체 추출법 (liquid-liquid extraction, LLE)의 일종인 이온쌍 추출법 (ion-pairing extraction, IPE)과 column chromatography 의 원리를 이용한 고체상 추출법 (solid phase extraction, SPE)이 있다[45]. 실험에서 진행한 각 시료전처리 방법은 Fig. 2 에 나타내었고 본 연구에서는 이러한 세 가지 방법에 대한 비교 검토를 통하여 본 실험에 적합한 최적의 시료 전 처리법을 개발하고자 하였다. 21

26 Figure 2. Flow diagrams for sample preparation of PFCs according to (a) protein precipitation, (b) ion-pairing extraction, and (c) solid phase extraction 22

27 2.4.1 단백질 침강법 (Protein precipitation) 단백질 침강법은 혈액 내에 존재하는 분석 방해 물질 중 단백질만을 제거하여 분석 장비를 통하여 분석하는 방법이다. 본 실험에서 진행한 단백질 침강법은 혈장 시료 0.5mL 를 폴리프로필렌 재질의 원심 분리용 튜브에 취한 후 내부 표준물질인 MPFOA, MPFOS (150ng/mL) 용액을 각각 5μL 씩 첨가한 후 acetonitrile 을 0.49mL 첨가하여 총 부피를 1mL 로 한 후 약 10 초간 교반하여 혈액 내의 단백질을 변성시킨 후 13,000rpm 에서 10 분간 원심분리(centrifugation)하여 단백질을 모두 침강시켜 상등액을 취하여 LC-MS/MS 로 분석을 하였다 이온쌍 추출법 (Ion-pairing extraction, IPE) 이온쌍 추출법은 일종의 액체-액체 추출법 (liquid-liquid extraction)으로써 해당 분석 물질의 pka 및 친유성 정도에 따라 적절한 추출 용매를 사용하여 이를 기저 시료로부터 추출해내는 방법이다. 본 실험에서 진행한 이온쌍 추출법은 혈장 시료 0.5mL 를 폴리프로필렌 재질의 conical tube 에 취한 후 내부 표준물질인 MPFOA, MPFOS (150ng/mL) 용액을 각각 5μL 씩 첨가한 후 tetrabutyl ammonium 완충 용액을 1mL 첨가하여 시료의 ph 를 10 으로 맞춘 다음 다시 0.25M 의 sodium carbonate 완충 용액을 2mL 첨가한다. 그 다음 methyl-tert-butyl ether (MTBE)를 5mL 가하여 20 분 동안 shaking 한다. 그 후 MTBE 4mL 를 다른 폴리프로필렌 튜브에 분취한 다음 MTBE 5mL 를 다시 원래의 튜브에 가하여 20 분간 교반한 뒤에 다시 4mL 를 분취한다. 그 다음 분취한 MTBE 용액을 질소 가스 23

28 하에서 건조시키고 liquid chromatography 상에서 이동상의 시작 조건과 유사한 10% acetonitrile in water 용매에 녹인 후 LC- MS/MS 로 분석을 하였다 고체상 추출법 (Solid phase extraction, SPE) 고체상 추출법은 chromatography 의 원리를 이용한 시료 전처리 방법 중 하나로 본 실험에서 사용된 Oasis WAX(weak anion exchanger) cartridge 는 일반적으로 강산성을 띄는 물질을 충진제 내에서 이온 결합으로써 붙잡고 있다가 용리액을 첨가할 경우에 그 결합이 깨지고 용리가 되어 나온다. 본 실험에 사용한 Oasis WAX cartridge 의 충진제의 구조는 Fig. 3 에 나타내었다. WAX sorbent structure 에서 보듯이 산성조건 하에서 양성자화(protonation)되어 탈양성자화(deprotonation)된 산성 물질을 이온 결합상태로 용리 전까지 카트리지 내의 충진물에 머물러 있게 한다. 본 실험에서 진행한 고체상 추출법은 혈청 시료 0.5mL 에 내부 표준물질인 MPFOA, MPFOS (150ng/mL) 용액을 각각 5μL 씩 첨가한 후 acetonitrile 을 0.5mL 첨가한 후 약 10 초간 교반하여 혈청 내의 단백질을 모두 변성(denaturation)시킨 후 2% formic acid 용액을 300μL 첨가하여 혈청 시료를 산성화한 후 13,000rpm 에서 10 분간 원심분리 시킨 후, 상등액만 취하여 미리 컨디셔닝된 SPE cartridge 에 주입하여 분석물질을 추출한다. 원심분리 후 상등액을 SPE cartridge 에 주입하기 전에 먼저 cartridge 의 컨디셔닝을 위하여 2% ammonium hydroxide in methanol:mtbe (10:90) 용액을 Oasis WAX cartridge 에 2mL 가하고 cartridge 의 세척을 위하여 2% formic acid 24

29 용액을 2mL 가한 후 원심분리한 혈청 시료의 상등액을 SPE cartridge 에 넣는다. 그 후 분석 장애물질을 제거하기 위하여 2% formic acid 와 methanol 로 각각 2mL 씩 cartridge 에 가하여 중성 및 염기성을 띄는 불순물들을 제거한 다음 추출 용액인 2% ammonium hydroxide in methanol:mtbe (10:90) 2mL 를 가하여 분석물질을 추출한다. 추출한 물질은 질소 가스로 완전히 건조시킨 후 10% acetonitrile in water solution 을 0.5mL 첨가하여 최종 부피를 0.5mL 로 한 후 이 중 10μL 를 LC-MS/MS 에 주입하여 분석하였다. O N N N H H N N H H Figure 3. Sorbent structure of Oasis WAX cartridge 25

30 2.5 LC-ESI(-)-MS/MS 를 이용한 PFCs 의 분석 혈청시료에서 PFCs 의 분석을 위하여 Fig. 1 에서 나타낸 바와 같이 전처리한 후에 10mM Ammonium acetate 와 0.05% TEA 가 첨가된 3 차 증류수와 acetonitrile 을 이동상으로 하여 HPLC 로 분리한 후 ESI(-)-MS/MS 의 MRM (Multiple Reaction Monitoring) 방법을 통하여 검출하였다. 본 연구에 사용된 기기 분석 조건을 Table 1 에 수록하였다. 26

31 Table 1. Instrumental conditions of LC-ESI(-)-MS/MS MRM mode Liquid chromatograph Mobile phase : A - 10mM ammonium acetate % TEA in water B - 100% Acetonitrile Gradient : 0.0~0.5min (10% B) 0.5~0.6min (10% 40% B) 0.6~1.5min (40% 56% B) 1.5~1.8min (56% 90% B) 1.8~3.1min (90% B) 3.1~5.0min (90 10% B) Flow rate : 600μL Column : Chromolith Performance RP-18e (100mm-3mm I.D) Sample injection : 10μL Mass spectrometer Ionization source : ESI (electrospray ionization) Polarity : Negative ion mode Analyzer type : Triple quadrupole type Scan type : Multiple reaction monitoring (MRM) CUR (curtain gas ; dissolvation gas) : 20 psi IS (electron valtage) : TEM (temperature) : 600 GS 1 (nebulizing gas) : 60 psi GS 2 (heating gas) : 60 psi ihe (interface heater) : ON CAD (collison-activated dissociation) : 3.0 MRM condition Compounds MRM transition Declustering potential Collision cell energy dwell time (msec) PFPA 263> PFHxA 313> PFHpA 363> PFOA 413> PFNA 463> PFDA 513> PFHxS 399> PFHpS 449> PFOS 499> PFNS 549> MPFOA 417> MPFOS 503>

32 제 3 장 결과 및 고찰 3.1 Perfluorinated compounds(pfcs)의 background 오염조사 과불화 화합물 분석과 관련된 문제 중의 하나는 바탕시료 분석의 오염문제이다. 실험실에서 과불화 화합물 오염 원인이 아직 정확하게 규명되어있지는 않았지만 두 개의 주요한 원인이 의심되고 있는데 실제 분석기기적 오염과 시료 전처리 상에서 발생되는 오염이다. 하나의 알려진 절차상의 오염은 이를 테면 테프론과 같은 폴리테트라플루오로에틸렌이나 퍼플루오로알콕시화합물같은 플루오로폴리머를 포함하고 있는 실험기구들의 사용이다. 따라서 과불화 화합물의 분석에서는 시료나 추출물이 불소화 고분자로 구성된 실험기구와 접촉해서는 안 된다. 뿐만 아니라 본 실험 시 사용하게 되는 실험 도구 및 시약, 장비에 대한 background level test 가 선행되어 공시험 오염 정도를 조절할 수 있어야 성공적으로 정량적인 분석이 진행될 수 있다 실험 기구로 인한 영향 PFCs 는 일반적으로 화학시약과 쉽게 반응하지 않아 실험실 내에 다양한 초자 및 도구에 코팅제 등으로 널리 사용되고 있다. 일반적으로 실험실에서 많이 쓰이는 종류의 teflon tape 과 rubber type 의 vial cap 등에서 사용되며 이들이 background 오염원으로써 작용할 수 있다. 28

33 또한 PFCs 는 유리류에 흡착하는 성질이 있으므로 유리 바이알에 보관하거나 다른 유리 초자류에 시약 및 혈청 시료가 닿을 경우 그 농도에 대한 결과 값이 감소하여 negative interference effect 를 나타낸다. (Fig. 4, Fig. 5) 29

34 Figure 4. Comparison of background levels of (a) blank run, (b) TEF vial cap, and (c) PE vial cap 30

35 Figure 5. Comparison of MRM chromatograms of standard mixture in between (a) conical (Falcon) tube and (b) glass vial 31

36 3.1.2 실험 용매로 인한 영향 PFCs 는 실험실 내에서 사용되는 일반적인 실험 도구 및 사용하는 실험 용매에서도 검출이 되는데 이는 실험 용매의 종류뿐만이 아니라 제조회사에 따라 오염의 차이가 나타나므로 사용하는 시약을 선정하게 되면 반드시 사용 용매에서 PFCs 의 background level 을 확인하여야 한다. 본 실험의 이온쌍 추출법에서 용리 용매로 사용되었던 용매인 methyl-tert-butyl ether (MTBE)의 경우 제조회사 별 background level 에 있어서 상당한 차이를 나타내었다. (Fig. 6) 크로마토그램에서 보듯이 J.T.Baker 사 MTBE 의 경우, 상당한 양의 PFOS 가 나타나는 것으로 보여 주었고, Burdick & Jackson 사의 MTBE 의 경우도 미량의 PFOS 가 검출되었으나 이는 정량 분석에 큰 영향을 미칠 정도는 아니었다. 따라서 본 연구에서는 Burdick & Jackson 사의 MTBE 를 용리액으로 사용하였다. 32

37 Figure 6. Comparison of MRM chromatograms of (a) J.T.Baker MTBE solvent and (b) Burdick & Jackson MTBE solvent 33

38 3.1.3 HPLC 부품에 의한 영향 PFCs 의 분석은 일반적인 PFCs 의 비휘발성으로 인하여 liquid chromatography (LC)로 분리 분석되고 있다. 하지만 LC 법으로 분석 시 사용되는 HPLC 의 펌프의 피스톤 헤드, 용매튜브, 용매 주입필터 등 내부 주요 부품들도 과불화 폴리머로 이루어져 있어 분석 시 상당한 PFCs 오염을 직면하게 된다. 따라서 본 연구에서는 LC 상의 용매의 주요 통로 중 가장 큰 면적을 차지하는 용매튜브를 teflon 재질의 튜브에서 silicone 재질의 튜브로 교체하여 실험을 진행하였다. 이에 대한 실험 결과는 Fig. 7 에 나타내었다. Fig. 7 에서 보듯이 teflon 재질의 용매튜프를 사용하였을 경우에는 11 종의 PFCs 물질이 높은 농도로 검출이 되어 실제 시료 분석 시 장애 요인으로 예상되었는데 이를 silicone 재질의 용매튜브로 교체하여 사용하였을 경우에는 대부분의 PFCs 물질의 검출이 상당히 많은 농도로 줄어들거나 사라졌다. 이를 통하여 HPLC 의 부품 중 용매튜브를 교체하여 사용하는 것이 미량의 PFCs 를 검출하는 데 더 효과적이라는 것을 확인할 수 있었다. 34

39 Figure 7. Comparison of MRM chromatograms of (a) Teflon solvent tubing and (b) silicone solvent tubing 35

40 3.2 시료의 추출 및 정제 시료 전처리 방법 비교 본 실험에서 plasma 시료에 100ppb 의 표준품을 첨가하여 이들 각각의 실험 방법을 통한 추출 효율을 나타낸 결과를 각각 Table 2 에 나타내었고 Fig. 8 에 도식화하여 나타내었다. Table 2 와 Fig. 8 에서 보듯이 시료 전처리 방법 중 단백질 침강법과 고체상 추출법이 추출 효율과 재현성 면에서 가장 우수한 것으로 나타났으며 이온쌍 추출법의 경우에는 액체-액체 추출법의 특성상 개별 실험 간의 차이가 큰 것으로 나타났다. 또한 이들 시료 전처리 과정을 통하여 추출 및 정제된 시료를 LC-MS/MS 의 MRM 법으로 분석한 chromatogram 을 Fig. 9 에 나타내었다. 여기에서는 각각의 MRM chromatogram 에 분리되어 나타나는 각 물질의 머무름 시간이나 peak 의 모양과 형태를 통하여 시료의 matrix 상에 존재하는 다양한 분석 방해물질을 각각의 시료 전처리 법을 통하여 얼마나 효과적으로 제거하여 LC 상의 분리분석에 영향을 미치는 지를 확인할 수 있다. MRM chromatogram 상에서 보듯이 protein precipitation 은 그 실험 과정상 농도가 1/2 로 감소하여 그에 대한 감도 역시 감소하는 것(이는 LOD, LOQ 와 같은 검출한계의 증가를 야기한다.)을 다른 시료 전처리 법에 대한 크로마토그램과의 비교를 통하여 알 수 있었다. 또한 각각의 MRM chromatogram 들이 서로 많은 부분 겹치거나 peak 가 길게 늘어져 LC 의 분리 상에서 방해 요인으로 작용하는 물질의 제거가 잘 되지 않는 것을 확인할 수 있었으며 이는 질량분석기의 검출에서도 좋지 않은 영향을 미치게 되므로 단백질 침강법을 본 실험에서 제외하도록 하였다. 그리고 이온쌍 36

41 추출법에서도 마찬가지로 일부 peak 에서 분리 효율이 떨어지는 등의 결과가 보여져 이온쌍 추출법도 본 실험에서 제외하였다. 따라서 본 연구에서는 추출 효율과 정제 효율이 가장 뛰어난 것으로 나타난 고체상 추출법을 시료 전처리 방법으로써 선정하게 되었다. 37

42 Table 2. Comparison of recovery rates for sample preparation methods Compound name Recovery rate ± RSD (%) (a) protein precipitation (b) ion-pairing extraction (c) SPE (WAX) PFPA 90.93± ± ,23±0.74 PFHxA ± ± ±0.89 PFHpA 76.42± ± ±1.15 PFOA 90.10± ± ±2.71 PFNA ± ± ±1.86 PFDA 95.14± ± ±1.84 PFHxS 66.60± ± ±7.30 PFHpS 82.93± ± ±7.52 PFOS 86.32± ± ±5.04 PFNS 81.92± ± ±

43 Figure 8. Comparison of extraction methods for recovery rates of spiked plasma at 100 ppb 39

44 Figure 9. Comparison of MRM chromatograms of sample preparation methods [(a) protein precipitation, (b) ion-pairing extraction, and (c) solid-phase extraction (WAX)] 40

45 3.3 LC-ESI(-)-MS/MS 를 통한 분석법 확립 Multiple reaction monitoring (MRM) 분석법 확립 PFCs 의 분석은 일반적으로 LC-ESI-MS 로 분석 하는 경우 negative ion mode 에서 진행되는데 이는 PFCs 의 구조적 특징으로 인하여 이온화 시에 탈수소화(dehydrogenation)되어 쉽게 negative charged ion 으로 변환이 되므로 ESI negative ion mode 에서 쉽게 검출이 되기 때문이다. 이에 대한 MS/MS spectra 를 Fig. 10 에 나타내었다. Fig. 10 에 나타낸 PFCs 의 대표적인 물질인 PFOA 와 PFOS 각각의 MS/MS spectrum 에서 보듯이 product ion 중 가장 이온 세기가 강한 이온을 MRM transition 으로 선정하였다. 과불화 카르복실산의 경우 전구이온으로부터 CO 2 분자가 떨어져나간 [M-H] - [M-H-CO 2 ] - 를 질량 대 전하 비율(m/z) 값으로 산정하여 MRM transition 으로 선정하였고 과불화 설폰산의 경우 전구이온으로부터 떨어져 나온 안정한 설포네이트 기를 ([M-H] - [SO 3 ] - ) 질량 대 전하 비율(m/z) 값인 80 으로 하여 MRM transition 으로 선정하였다. 각각의 PFCs 에 대하여 선정한 MRM transition 자료를 Table 1 에 나타내었다. 또한 MRM 법은 triple quadrupole type 의 질량 분석관(mass analyzer)을 갖는 질량분석기에서 진행할 수 있는 분석 방법으로 첫 번째 quadrupole 에서는 이온원에서 생성된 전구 이온(precursor ion)을 통과시키고 두 번째 quadrupole cell 에서 이 전구 이온을 불활성 기체와 충돌시켜 조각 이온을 생성하고 그 중 특징적인 조각 이온을 세 번째 quadrupole 에서 검출하는 방식이다. 이러한 MRM 방식은 메트릭스(matrix)에 존재하는 다양한 분석 방해물질의 영향을 41

46 최소화하면서 대상 분석물질을 특징적이고 선택적으로 정량할 수 있게 하는 분석법으로 혈청 내에 잔류하고 있는 미량의 PFCs 를 분석하는 데 있어서 매우 적합한 방법이다. 본 연구에 사용된 기기 분석 조건은 Table 1 에 수록되었고 이에 따라 분리분석된 MRM chromatograms 을 Fig. 11 에 수록하였다. Figure 10. ESI-MS/MS spectra of PFCs compounds in negative ion mode 42

47 Figure 11. MRM chromatograms of standard compounds of PFCs at 1ppb level 43

48 3.3.1 Triethylamine 첨가에 의한 PFC 의 감도 향상 본 연구에서는 혈액 중 극미량의 과불화 화합물의 검출 및 감도향상을 위하여 이온화과정 중 음이온 모드에서 [M-H] - 이온의 생성을 높이기 위하여 이동상에 triethylamine (TEA) 염기를 첨가하였다. Triethylamine 은 산성의 과불화 화합물이 이온화과정 중 수소이온을 수용할 수 있는 역할을 하여 과불화 화합물의 탈용매화과정을 도와 감도를 향상시켜 줄 수 있다. 본 연구에서는 triethylamine 의 첨가와 그에 따른 감도의 변화를 조사하였다. (Fig. 12, Table 3) 그림에 나타난 결과를 보면 ammonium acetate 만을 이동상으로 하여 얻은 결과보다 TEA 를 첨가하여 얻은 결과의 감도가 훨씬 좋은 것을 확인할 수가 있었다. 이 결과에 따라 얻어진 검출한계를 조사하여 Table 3 에 비교하여 나타내었다. 표에서 보는 결과와 같이 바탕 피이크의 존재로 인하여 높아진 검출한계를 TEA 첨가를 통해 분석 물질의 감도를 향상시켜 개선할 수 있는 것을 확인할 수 있었다. PFNA 를 제외한 과불화 알킬산 물질의 감도는 약 10 배 정도의 감도 향상을 보여주었다. 또한, 화합물에 따른 검출감도의 차이는 과불화 화합물의 구조적 특징으로 인하여 달라질 수 있다. 이는 전기음성도가 큰 불소원자의 개수에 따라 생성된 [M-H] - 이온의 안정성이 크게 달라질 수 있기 때문이다. 일반적으로 불소원자의 개수가 증가함에 따라 [M-H] - 이온의 안정성은 증가되는 현상을 나타날 것으로 예상되지만 실제 감도 실험결과에서는 이 법칙을 따르지 않는 것으로 나타났다. 또한 TEA 첨가로 인하여 과불화 알킬산 화합물의 경우 감도가 크게 향상되는 44

49 것으로 나타나지만, 과불화 설폰산 화합물의 경우 감도 증가는 나타나지 않는 것을 보여주었다. 이는 과불화 설폰산 화합물의 pka 값이 과불화 카르복실산 화합물의 pka 값보다 훨씬 낮기 때문에 ESI 이온화 과정에서 탈양성자화 반응이 충분히 일어난 상태로 이온화되기 때문이라고 판단된다. 따라서, TEA 첨가로 인해 과불화 설폰산의 이온화 효율이 크게 향상되지 않은 것으로 보여진다. 45

50 Figure 12. Response of PFCs according to mobile phase conditions 46

51 Table 3. Comparison of LOD according to mobile phase conditions Compounds without addition LOD (ng/ml) 0.05% TEA addition PFPA PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFHxS PFHpS PFOS PFNS

52 3.4 분석방법의 타당성 확립 회수율 앞에서 언급한 실험방법의 비교 검토를 통하여 선정한 WAX-solid phase extraction 에 대한 유효성을 점검하기 위하여 회수율과 그에 대한 재현성을 확인하고자 하였다. 이에 대한 실험 결과는 Table 4 에 나타내었다. Table 4 에서 보듯이 회수율은 ~ % 사이로 양호한 결과를 보였으나 재현성은 최고 PFNS 에서 RSD 16.58%를 보여주었다. 하지만 이는 미량에 대한 변동 값이고 그 오차 또한 1~2 ppb 이내에 대한 결과 값이므로 정량 분석을 하는데 큰 영향을 주지 않음을 보여준다. 48

53 Table 4. Recovery rates of spiked ACSF at 1 and 10 ppb (n=3) Compounds Spiked level (ng/ml) Recovery rate (%) RSD (%) PFPA PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFHxS PFHpS PFOS PFNS

54 3.4.2 검량선, 검출한계 및 정량한계 시료의 정량을 위하여 PFCs 표준 용액을 인공뇌척수액에 0.5 ~ 50 ng/ml 의 범위가 되게 첨가하여 혼합용액을 만든 다음 검량선을 작성하여 그 결과와 수식 값을 각각 Fig. 13 과 Table 5 에 나타내었다. 안정한 정량을 위하여 0.5 ~ 50 ng/ml 의 범위에서 6 개의 검량농도로 하여 검량선 작성을 수행하였으며 PFCs 모든 물질의 검량선의 직선상관계수인 R 2 value 가 이상으로 뛰어난 직선성을 보여주었다. 이는 시료 중 PFCs 의 정량 분석 시 정확한 결과를 보여 줄 것으로 예상된다. 검출한계의 경우 인공 뇌척수액을 제조하여 사용하였는데 검출한계(LOD)는 신호(signal)대 잡음(noise) 비율 S/N > 3 을 기준으로 검량한계(LOQ)는 S/N > 10 을 기준으로 하였다. 잡음은 공시험에서 바탕 피이크가 나타나는 경우에 해당 피이크의 높이로 잡았다. 대상화합물의 LOD 및 LOQ 는 각각 0.15 ~ 0.25 ng/ml 및 0.50 ~ 0.84 ng/ml 로 나타났다. 50

55 Figure 13. Calibration curves of PFCs generated from spiked ACSF sample 51

56 Table 5. Calibration curves, linearity, LOD and LOQ of PFCs Compound name Slope Intercept R 2 LOD (ng/ml) LOQ (ng/ml) PFPA PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFHxS PFHpS PFOS PFNS

57 3.4.3 정확성 및 정밀성 (Accuracy & Precision) 본 분석방법에 대한 정확성 및 정밀성을 검토하기 위하여 Intra- (일내) 및 inter-day(일간) 시험을 수행하였으며 이에 대한 결과는 Table 6 에 실었다. 본 연구에서 사용한 10 종의 PFCs 에 대하여 실제 혈액에서 존재할 수 있는 고중저 3 가지 농도 (3, 10, 50 ng/ml)에서 수행하였다. 일간 일내 실험은 각각 3 회씩 수행하여 얻어진 결과에 대하여 정확성 및 정밀성을 검토하였다. Table 6 에서 보듯이 대부분의 PFCs 에 대하여 정확성의 경우 80.87~117.16%이내, 정밀성의 경우 13.27% 이내로 나타났다. 이는 본 연구에서 개발된 분석방법이 우수한 정확성과 정밀성을 가짐을 보여주었다. 그러나 일부 PFCs 물질(PFPA, PFHxA, PFHpA, PFNS)의 저농도 3 ng/ml 에서는 일간 실험 정밀성이 조금 떨어지는 결과를 보였으나 극히 미량이고 본 연구의 정량 분석의 수행 시에 큰 영향을 미칠 정도는 아니라고 판단된다. 따라서 본 분석법에서 개발된 시료 전처리 방법 및 검출방법으로 실제 혈청 중 PFCs 의 정량분석함에 있어 타당하다고 판단된다. 53

58 Table 6. Intra- and inter- day test of PFCs by SPE (WAX) Compound name Conc. (ng/ml) Intra (n=3) Inter (n=3) accuracy (%) precision (%) accuracy (%) precision (%) PFPA PFHxA PFHpA PFOA PFNA PFDA PFHxS PFHpS PFOS PFNS

59 3.4.4 NIST SRM 1957 본 연구에서 개발한 분석방법에 대한 타당성에 대한 검증하기 위해 국제 표준 기술 협회인 미국 NIST (National Institute of Standards and Technology)에서 구매한 표준 혈청 시료를 통해 각 PFC 류의 물질에 대한 인증 실험결과 값과 비교하였다. SRM 혈청시료는 원심분리 및 WAX-SPE 전처리과정을 거친 후 LC-ESI-MS/MS MRM mode 로 분석하였으며, 얻어진 결과는 Table 7 에 나타내었다. Table 7 에서 보듯이 본 분석방법에 의해 얻어진 결과 값은 SRM 인증결과 값과 비교하였을 때, 정확성에서 ± 23% 내외의 결과를 보여주었다. 하지만 NIST 에서 제공한 변동 값에 대한 결과 또한 inter-lab. test 결과 값[46]과 비교하여 볼 때 정확히 일치하지 않음을 알 수 있고 오히려 일부 연구에서는 PFCs 의 농도는 확정된 표준품이 없다고 봐야하므로 오히려 inter-lab. test 의 결과 값과 비교하는 것이 더 타당하다고 주장하는 경우도 있다[45]. 따라서 inter-lab. Test 의 결과의 변동 범위 이내에 존재하고 NIST 가 제공하는 인증 값과 큰 차이가 나지 않으므로 본 연구에서 개발된 분석방법을 혈액 중 미량의 PFCs 의 분석에 적용하여 얻어진 정량값은 높은 신뢰성을 가질 것으로 판단된다. 55

60 Table 7. Comparison of PFCs levels in SRM 1957 with NIST standard values, inter-lab. values and measured values Compound name NIST standards values (S.D.) Inter Lab. observed values (S.D.) Inter Lab. consensus values (S.D.) Measured values (S.D.) Rec. (%) PFPA - N/A PFHxA - N/A PFHpA (0.036) 0.23 (0.003) PFOA 5.00 (0.40) 6.03 (4.10) 5.01 (1.05) 5.47 (0.04) PFNA (0.068) 0.90 (0.27) 0.83 (0.17) 1.08 (0.08) PFDA 0.39 (0.10) 0.64 (0.09) PFHxS 4.00 (0.75) 5.09 (2.70) 4.50 (1.62) 3.11 (0.37) PFHpS - N/A PFOS 21.1 (1.2) 22.9 (4.58) 23.6 (3.78) (1.19) PFNS - N/A 56

61 3.4.5 혈청 시료의 적용 실제 사람의 혈청 시료에 적용하였을 때의 분석 결과로써, 각 PFCs 의 MRM chromatograms 을 Fig. 14 에 나타내었다. 이 그림에서 보면 1ng/mL level 의 표준품 시료를 이용한 분석 결과로써 나타내었던 Fig. 11 과 비교하였을 때 분석 방해 물질로 인한 MRM chromatogram 상의 문제점이 발생되지 않음을 확인할 수 있었다. 따라서 본 분석법을 통해 실제 사람의 혈청 시료 내의 과불화 화합물질을 분석함에 있어 문제없이 정량 분석을 수행할 수 있음을 확인할 수 있었다. 57

62 Figure 14. MRM chromatograms of PFCs in human serum sample 58

63 제 4 장 결 론 본 연구에서는 혈액 내에 미량으로 잔류하는 PFCs 를 WAX- SPE 와 LC-MS/MS 의 MRM 법을 이용한 분석 방법에 대하여 연구하였다. 총 10 종의 PFCs 를 검출하기 위하여 LC-MS/MS 를 이용하였고 각 물질 별로 확인된 질량/질량 스펙트럼 결과를 통하여 precursor ion 과 product ion 을 선정하여 MRM transition 을 결정하였고 이를 토대로 장비를 MRM mode 로 하여 분석하였다. LC-MS/MS 를 통한 분석 시에 PFCs 의 background level 을 낮추기 위하여 solvent tubing 을 teflon 재질의 용매관에서 실리콘 재질의 용매관으로 변경하였으며 이를 통하여 PFCs 의 background level 을 크게 낮출 수 있었다. 또한 PFCs 의 감도를 증가시키고자 이동상의 염으로 사용한 ammonium acetate 에 TEA 를 첨가하여 해당 분석 물질인 PFCs 의 감도를 크게 향상시켜 검출한계를 크게 낮출 수 있었다. 혈액시료(혈청)는 고체상 추출법(SPE)을 이용하여 추출하였으며 이 때 사용한 SPE cartridge 는 Oasis WAX cartridge 를 사용하였다. 최종 elution solvent 는 일반적으로 사용하는 2% ammonium hydroxide 에 MeOH 와 MTBE 를 10:90 으로 섞은 용매를 사용하여 elution 후에 용매 휘발 시간을 단축시키고자 하였다. 59

64 본 실험에서 얻어진 최적의 실험 조건으로 method validation 을 한 결과 PFCs 의 회수율은 각각 1 ng/ml 와 10ng/mL 에서 ~ %의 범위에서 얻어졌으며 상대표준오차는 4.37 ~ %의 범위 내에서 확인되었다. 검량선은 모두 0.5 ~ 50.0 ng/ml 의 범위에서 R 2 = 이상의 직선성을 보였으며 검출한계와 정량한계는 각각 0.15~0.25 ng/ml 및 0.50 ~ 0.84 ng/ml 로 나타났다. 정밀도는 변동계수가 일부 PFCs 물질(PFPA, PFHxA, PFHpA, PFNS)의 저농도(3ng/mL)에서 일간 실험 정밀성이 조금 떨어졌으나 그 이외의 모든 PFCs 에서는 3, 10, 50 ng/ml 농도 범위에서 일내-일간 실험 시 실험 정밀성이 10%이내의 결과 값을 얻을 수 있었다. 또한 정확도는 모든 물질이 3, 10, 50 ng/ml 농도 범위에서 ~ %이내로 나타났다. 본 연구에서 사용한 분석법은 혈액 내에 잔류하는 미량의 과불화 화합물을 다른 과불화 화합물의 오염 영향을 크게 줄이면서 LC- MS/MS 를 이용하여 안정적으로 동시분석이 가능하게 하였다. 또한 LC-MS/MS 상에서의 빠른 분석과 시료 전처리 상의 방법 등은 많은 양의 시료를 안정적이고 가능한 실험 과정으로 생기는 오염을 막으면서 빠르게 분석할 수 있도록 도와줄 것이다. 뿐만 아니라 본 분석법의 개발 과정 중에 얻어진 소중한 많은 배경 실험 등은 추후에 진행될 과불화 화합물 관련 연구들에서 중요한 자료로써 활용될 수 있을 것이다. 60

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70 Abstract Rapid determination of PFCs in human serum by SPE & LC-MS/MS Won-Woong Lee Director. Prof. Jongki Hong An analytical method for the determination of perfluorinated compounds (PFCs) in human serum involves centrifugation, weak anion exchange solid-phase extraction (WAX-SPE), liquid chromatography (LC)/ tandem mass spectrometry using single ion reaction monitoring (SRM) mode. PFCs were successfully separated within 5 min on C18 monolithic column. WAX-SPE, ion-pairing extraction, and protein precipitation were evaluated as means of preliminary purification. Among them, WAX-SPE cartridge successfully removed major contaminants such as non-polar hydrocarbons and cationic compounds when eluted with 2% ammonia water in methanol-methyl-tert-butylether (MTBE) mixture (1:9, v/v). After purification, the PFCs in extract were successfully separated by LCmonolithic column and quantified using electrospray ionization (ESI) MRM mode. Overall sensitivity of perfluorocarboxylic acids can be greatly improved but that of perfluorosulfonic acids was not significantly improved by the addition of triethylamine in mobile phase. The percentage recovery of samples spiked with 1 ng/g or 10 ng/g PFCs ranged from 86.4 to 118.7% with a relative standard deviation of 4.37 to %. Limits of quantification ranged from 0.50 to

71 ng/g for LC-MS/MS-MRM mode. The linear dynamic range extended from 0.5 to 50 ng/g, with a correlation coefficient (R 2 ) greater than The method was validated using a standard reference material (SRM 1957) and spiked serum samples. Serum samples collected from human living near a Korean industrial area exhibited relatively high levels of several PFCs when analyzed using this method. Keywords: perfluorinated compounds, serum, weak anion exchange, solid-phase extraction, monolithic column, method validation, LC-MS/MS, MRM 67