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2 석사학위논문 간이진단법을활용한개매개체 전염병의진단 제주대학교대학원 수의학과 정상언 2019 년 8 월

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4 ABSTRACT Diagnosis of Canine Vecter-borne Diseases using commercial rapid detection kit Sang un Jung (supervised by Professor YoungMin Yun) Department of Veterinary Medicine Graduate School, Jeju National University, Jeju, Korea Vector-borne diseases are caused by viruses, bacteria, protozoa, and parasites that are transmitted by arthropods such as mosquitoes, ticks, fleas and the like. This causes clinically significant diseases such as heartworm disease through mosquitoes and anaplasmosis ehrlichiosis, Lyme borreliosis, babesiosis through ticks. Globally, the incidence of vector-borne disease is also affected by accelerated global warming, increased temperature and precipitation, increased arthropod survival rate, laying rate, activity rate and increased arthropod populations. This vector-borne disease has confirmed that the rate of incidence has not been well researched in Korea, especially in Jeju Island. In this study, I ve investigated prevalence of vector-borne diseases in dogs and estimate the sensitivity and specificity of the new developed Cani-V4 Ab test kit(bionote). In total 281 dogs(stray dogs; 205, patient dogs; 76), blood samples were collected from jugular vein from August 2018 to March The blood samples

5 were performed with general blood test (CBC), blood smear test, acute phase reaction protein (CRP), and Bionote cani-v4 kit. The genes were isolated and the real time PCR was performed together. In 281 blood samples, only positive of babesia, heartworm, anaplasma, borellia and ehrlichia are 81(28.8%), 41(14.6%), 4(1.4%), 0, 0, respectively. Coinfected dogs of babesia and heartworm, babesia and anaplasma, babesia and borellia, babesia and ehrlichia, babesia and anaplasma and ehrlichia, babesia and anaplasma and borellia and ehrlichia are 11(3.9%), 22(7.8%), 2(0.7%), 1(0.35%), 1(0.35%), 1(0.35%), respectively. The sensitivity and specificity of Anigen rapid anaplasma Ab test kit are 60.0% and 77.6%. The sensitivity and specificity of Anigen rapid ehrlichia Ab test kit are 15.4% and 100%. The results of antibody and antigen test were inconsistent. Concomitant testing of antibodies and antigens may be necessary in clinical practice. Key words: Heartworm, Anaplasmosis, Ehrlichiosis, Borreliosis,, antibody test kit, dog, Jeju

6 목 차 영문초록 I. 서론 1 II. 재료및방법 4 III. 결과 8 IV. 고찰 18 V. 결론 23 VI. 참고문헌 25

7 I. 서론 매개체전염성질병은모기, 진드기, 벼룩과같은절지동물매개체의흡혈에의해서바이러스, 세균, 원충및기생충감염으로발생한다. 개에서대표적인매개체전염성질병으로모기에의한심장사상충, 진드기에의한바베시아감염증, 아나플라즈마감염증, 에를리키아감염증, 보렐리아감염증 ( 라임병 ) 등이있다. 심장사상충 (Heartworm disease) 의원인체인 Dirofiaria immitis는열대, 아열대및온대지역에서모기에의해서전파되는혈액내기생충질병이다 (Soulsby EJL, 1982). 국내에서는 1962년진주지역조사에서최초로 21.0% 감염율이보고된이래 ( 박과이, 1962), 2003년대구에서 23.6%(Lim et al, 2003), 2007년광주에서 12.4%(Koh et al, 2007), 2010년울산에서 7.2%(Park, 2010), 2016년제주에서 17.9%( 박, 2016) 감염율을보고한바있다. 심장사상충감염은임상증상을근거로내원한개체에대해서혈액중의성충특이항원이나항체검사혹은미세사상충 (microfilaria) 검사를통해서주로진단하지만, 감염된모기에흡혈되고 5-6개월이후에혈중진단 ( 잠복기 ) 이가능하다. 방사선검사복배상에서후엽폐혈관이늑골과교차하는지점에서 9번째늑골보다두꺼운지를외측에서는앞쪽폐동맥이같이주행하는폐정맥과굵기가비슷한지를평가하고, 심초음파검사에서폐동맥, 우심실과우심방, 후대정맥내성충을확인하여진단할수있으나감염성충수가적가나폐동맥말단부위에존재하는경우가대부분이기때문에심초음파만으로성충의존재를확인하기어렵다. 심전도상에서는심장내성충의정도에따라우심실종대에의한깊은 S파형, 평균전기축의우측변위, 우심방비대에의한 P파증가 (P pulmonale) 소견을보이지만심장사상충이외질병과감별은어렵다. 진드기매개질병인바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아, 보렐리아감염증의원 - 1 -

8 인체는공통적으로 Ixodes spp. 진드기에의해전파되는데, 국내에서는작은소참진드기 (Haemaphysalis longicolnis) 가주로전파하고질병을매개한다 ( 한, 1997). 매개하는질병은진드기약충및성충이왕성하게활동하는봄부터가을철까지다발하고있다 (Heo et al, 2002; Lee et al, 2016). 개바베시아감염증은진드기매개주혈원충에의해발생하는질병으로서 B. gibsoni, B. canis supsp. canis, B. canis supsp. vogeli, B. canis supsp. rossi, B. microti, B. equi, B. conradae, 그리고 B. vitalii가그원인체로알려져있으나 (Boozer and Macintire, 2003), 국내에서는모두가 B. gobsoni 이다. 아나플라즈마감염증은흡혈성절지동물인진드기, 이파리, 모기등에매개되는인수공통전염병으로, anaplasmataceae과의속하는절대세포내기생성진드기매개세균 (obligate intracellular tick-borne bacterium) 에의해발생된다. Anaplasmataceae과는 Ehrlichia, Anaplasma, Neorickettsia, Wolbachia로총 4개의속으로나누어지고, Anaplasma 속은 A. phagocytophilum, A. bovis, A. centrale, A. marginale, A. ovis, A. platys 등의 6개의종으로구분된다 (Dumler et al, 2001). 개에서는 A. phagocytophilum과 A. platys가감염성을가지며그람음성형의리케치아성세균이다. 전형적인숙주인소, 양, 사슴, 염소, 말, 설치류이외에도개, 고양이, 사람등여러동물에감염되는것으로알려져있다 (Dumler et al, 2001). Anaplasma phagocytophilum은개과립세포친화성아나플라즈마감염증의원인이되고 (Greig et al, 1996) A. phagocytophilum은사람에서과립구성아나플라즈마증 (Human granulocytic anaplasmosis, HGA) 의원인체로도알려져있다 (Chen et al, 1994). 에를리키아감염증은진드기매개질병으로 Rhipicephalus sanguineus, Dermacentor variabilis 그리고몇몇의 Ixodes 진드기가매개체로, 원인체는 Ehrlichia canis, E. chaffeensis, E. ewingii이며, 그람음성형의리케치아성세균으로, 개의단핵구, 과립구, 그리고혈소판에기생한다. E. chaffeensis는사람의단핵구성에를리키아감염증 (Human monocytic ehrlichosis,hme) 의원인이다 (Olano and Walker, 2002). 흰꼬리사슴, 들쥐, 코요테, 주머니쥐등이주요숙주로알려져있다

9 보렐리아감염증은진드기유래나선균인 Borrelia burgdorferi complex에의한감염으로발생한다 (Breitschwerdt et al, 1996). 사슴진드기가매개체이며, 진드기중 Ixodes속 (I. scapularis, I. pacificus) 이이나선균을전파시키며진드기가최소 50시간접촉해야전파가이루어진다 (Petzke and Schwartz, 2015). 국내에서 1993 년진드기로부터 Lyme borreliosis 병원체가처음분리되었으며, B. burgdorferi는사람에서라임병 (Lyme disease) 을유발하고개를포함한일부국내포유류를감염시키기때문에사람공통감염병원균으로 2010년 12월제4군법정감염병으로지정되었다 (Sul and Kim, 2017). 2006년 Borrelia burgdorferi 백신이출시되어 9-12주령에시작할수있고 2-4주간격으로 2회접종으로예방가능하나백신에대한장단점을고려하여노출의위험이높은개에서만백신을고려하고있다 (Littman et al, 2006). 개바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아, 보렐리아감염증은병력, 임상증상, 신체검사소견, 혈액도말검사, ELISA Antibody kit 검사, 혈액및혈청생화학적검사, 분자생물학적진단법 (Polymerase chain reaction, PCR), 간접면역형광법 (Indirect immunofluorescence assay, IFA) 등으로진단한다. 본연구는 2018년 8월과 2019년 3월사이제주도내병원내원한반려견 83두와제주시유기동물보호센테에입소한유기견 198두총 281두를대상으로하였다. 매개체전염성질병을진단하기위해서바이오노트사의 4종진단키트 (Cani V-4 kit) 와개바베시아항체진단키트 (Anigen rapid Babesia Ab test kit) 를사용하여심장사상충, 바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아, 보렐리아감염증에대한감염율을조사하였으며, 실제임상에서사용하기위해개발된키트를, 상품화되어적용중인 IFA 방법과비교하여항체진단키트의민감도 (sensitivity) 와특이도 (specificity) 을평가하였다

10 Ⅱ. 재료및방법 1. 대상동물본실험은 2018년 8월부터 2019년 3월사이제주시와서귀포시동물병원에내원한 83두와제주시유기동물보호센테에입소한유기견 198두, 총 281두를대상으로하였다. 해당기간동안동물병원에내원하여채혈된 EDTA-3K 항응고처리된혈액과헤파린처리된혈액을해당동물병원에서각각제공받았다. 실험동물에대한선정및실험방법은제주대학교동물실험윤리위원회로부터승인받아진행하였다 ( 승인번호 ). 2. 시료채취혈액은요측피정맥 (cephalic vein) 또는경정맥 (jugular vein) 을통해서 1.5 ml씩채취하였으며, 채취된혈액은완전혈구계산 (CBC) 및심장사상충, 바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아그리고보렐리아의검사를위해서 EDTA-3K 항응고튜브에, 급성기반응단백질 (CRP) 및면역형광항체법 (IFA) 측정을위해서헤파린튜브에분주한후 3000rpm에 15분간원심하고혈청을분리하여각각의튜브를실험전까지 4 냉장보관하였다. 3. 혈액검사및혈액단백검사 EDTA-3K 처리한혈액은 ADVIA 2120i (SIEMENS) 을이용하여완전혈구계산 (complete blood cell count, CBC) 을실시하였다. CBC 검사에서감염과빈혈과관련되는지표인 RBC (red blood cell), Hb (hemoglobin), HCT (hematocrit), MCV (mean corpuscular volume), MCHC (mean corpuscular hemoglobin concentration) 와혈소판 (Platelet) 및 WBC (white blood cell) 그리고백혈구감별계산으로 NE (Neutrophil), LY (Lymphocyte), MO (Monocyte) 와 EO (Eosinophil) 를측정하였다. 급성기반응단백질 (C reactive protein(crp)) 은 Vcheck canine CRP 2.0 kit (BioNote, Inc, Korea) 을사용하여혈중농도를측정하였다. 혈청 5 μl를검사용희석액 (4 ml) 에넣고키트에포함된스포이드내시약이녹을때까지피펫팅하였 - 4 -

11 다. 흡광도측정장비 (BIONOTE Vcheck analyzer) 에 CRP 카트리지를넣고셋팅한 후에혈청과시약을반응한용액 100 μl를카트리지위에점적하고흡광도를 5 분후읽어농도를측정하였다. 4. 간이항원 항체키트검사 One step canine Bionote cani V-4 test kit (BioNote, Inc, Korea) 와 canine Babesia Antibody test kit (BioNote, Inc, Korea) 를사용하여심장사상충혈중항원과바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아그리고보렐리아의혈중항체유무로감염여부를평가하였다. 검사전키트와완충액을실온에방치하고검사카트리지를평평하고건조한테이블위에놓는다. 시료홀에전혈 10 μl를점적하고흡수를확인한후희석완충액 3방울을떨어뜨리고 1분후대조선 (C) 과검사선 (T) 의밴드를확인하였다. 결과는최대 15분이내에판독하였다 (Figure 1, Figure 2). Figure 1. Heartwrom antigen, Ehrlichia canis antibody, borellia antibody and anaplasma antibody test kit (BioNote, Inc, Korea). Figure 2. Cartrige for Canine Babesia antibody(bionote, Inc, Korea)

12 5. IFA(Indirect immunofluorescence assay) 검사아나플라즈마감염증과에를리키아감염증을간접면역형광염색방법 (IFA) 인 MegaFLUO Ehrlichia canis test kit(diagnostic MEGASCOR, AUSTRIA), MegaFLUO Anaplasma ph test kit(diagnostic MEGASCOR, AUSTRIA) 를사용하여측정하였다. 시료희석액을각각 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64, 1/128, 1/256으로배열하여각각의슬라이드에 20 μl의샘플 ( 혈청 ) 을떨어뜨리고, 37 에서 30분간예열하였다. 이후각슬라이드를세척한후 FLUO FITC anti-dog IgG conjugate 1 방울을넣고, 다시 37 에서 30분간예열한후세척하고각슬라이드에 mounting medium을 1방울떨어뜨리고형광현미경 x400로슬라이드를확인하면서아나플라즈마와에를리키아는 1:40 에서형광물질이발현한경우양성으로판정하였다. 6. Bionote cani V-4 kit의민감도와특이도평가새로개발된개 Bionote Rapid cani V-4 Test kit의민감도 (Sensitivity) 와특이도 (specificity) 평가는 IFA 검사상에서양성이면서키트양성을진양성 (true positive; TP), IFA 양성이면서키트음성을가음성 (false negative; FN) 으로하였다. IFA음성이면서키트음성을진음성 (true negative; TN), IFA 음성이면서키트양성을가양성 (false positive; FP) 로하여진단키트의민감도와특이도를계산하였다. 키트의양성예측수치 (positive predictive value) 는키트양성으로확인된시료에대해서 IFA 양성 (TP) 과음성 (FP) 으로계산하였고, 키트음성예측수치 (negative predictive value) 는키트음성으로확인된시료에대해서 IFA 양성 (FN) 과음성 (TN) 으로계산하였다 (Figure 3)

13 IFA IFA Positive Negative Ab kit Positive TP FP Positive predictive value =(TPx100)/(TP+FP) Ab kit Negative FN TN Negative predictive value =(TNx100)/(FN+TN) Sensitivity(%)= Specificity(%)= (TPx100)/(TP+FN) (TNx100)/(FP+TN) Figure 3. Sensitivity and Specificity of Bionote V-4 antibody test kit based on IFA results.(tp; true positive, FP; false positive, FN; false negative, TN; true negative) 7. 통계분석 혈액검사에서자료는 SPSS 통계프로그램 (ver 22, SPSS Inc. IBM Corp, Chicago, USA) 으로 ANOVA 분석하여각군별통계적유의성을검증하였다 (p<0.05)

14 Ⅲ. 결과 1. 일반혈액검사대상동물중단독감염으로확인된바베시아감염견 81두, 심장사상충감염견 41 두와아나플라즈마감염견 4 두및음성견 115두를분리하여혈액변화를확인하였다 (Table 1). 바베시아단독감염견을대상으로한혈액검사에서 CRP의평균수치가높게측정되었으며 RBC, HCT, MCHC, PLT의평균수치는소폭하락됨을확인하였다. 심장사상충단독감염견에서의혈액검사결과는 WBC와 CRP의평균수치는높게측정되었으며, EOS는정상수치를보였다. 아나플라즈마단독감염견대상으로한혈액검사에서 WBC, CRP의평균수치는높게측정되었으며, MCHC, PLT가소폭하락을보였으며 RBC, Hb, HCT, MCV는정상으로나타났다. Table 1. The CBC (complete blood cell count) & CRP (C reactive protein) results of single infection by Heartworm, Babesia and Anaplasma in dogs (n=241) WBC (109/L) Eosin (103/uL) RBC (1012/L) Hemoglobi n (g/dl) Hematocrit (%) Heartworm Ag kitbabesia Ab kit Anaplasma Ab kit Positive (n=41) Positive (n=81) Positive (n=4) ± ± ±5.00 Negative (n=115) ± 9.92 Reference range ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± MCV (fl) 63.77± ± ± ± MCHC (g/dl) Platelet (109/L) 30.43± ± ± ± ± ± ± ± CRP(mg/L) 57.47± ± ± ±

15 중복감염에서바베시아와심장사상충중복감염견 11두, 바베시아와아나플라즈마중복감염견 20두를대상으로혈액검사결과를확인하였다 ( Table 2). 바베시아와심장사상충중복감염에서의혈액검사결과는 CRP 소폭상승과 RBC, HCT, Hb, MCHC의평균수치는소폭하락을보였다. 바베시아와아나플라즈마중복감염견혈액검사상에서 CRP, WBC 상승을보였으며빈혈과관련된항목들인 RBC, HCT, Hb, MCHC, PLT의평균수치하락을확인할수있었다. Table 2. The CBC (complete blood cell count) & CRP (C reactive protein) results of coinfection by Heartworm, Babesia and Anaplasma in dogs (n=146). Babesia + Heartworm kit Positive (n=11) Babesia + Anaplasma kit Positive (n=20) Negative (n=115) Reference range WBC (109/L) ± ± ± Eosin (103/uL) 0.55± ± ± RBC (1012/L) 5.47± ± ± Hemoglobin (g/dl) 10.39± ± ± Hematocrit (%) 34.41± ± ± MCV (fl) 65.80± ± ± MCHC (g/dl) 30.44± ± ± Platelet (109/L) ± ± ± CRP(mg/L) 27.40± ± ± Bionote 4종키트와바베시아항체키트대상동물 281두의심장사상충, 바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아그리고보렐리아감염증에대한스크리닝검사로, 바이오노트 4종키트 (BioNote, Inc., Korea) 및바베시아항체키트 (BioNote) 를사용하여 Dirofilaria immitis의항원및 Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, A. platys, Ehrlichia canis와 Borrelia burgdorferi의항체존재여부를확인한결과, 전체감염률은 281두중음성 115두 - 9 -

16 (40.9%), 심장사상충 57 두 (20.3%), 바베시아 121 두 (43.1%), 아나플라즈마 32 두 (11.4%), 에를리키아 2 두 (0.7%), 보렐리아 5 두 (1.8%) 가확인되었다 (Table 3). Table 3. Seroprevalence of Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, A. platys, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of 281 dogs Dog examined Di Ag Bg Ab Ap Ab Ec Ab Bb Ab Negative The number of positive dog (20.3%) (43.1%) (11.4%) (0.7%) (1.8%) (40.9%) (%) * Di Ag, Dirofilaria immitis antigen; Bg Ab, Babesia gibsoni; Ap Ab, Anaplasma phagocytophilum antibody; Ec Ab, Ehrlichia canis antibody; Bb Ab, Borrelia burgdorferi antibody 질병감염별단독감염률을확인한결과, 대상동물 281 두에서심장사상충 41 두 (18.5%), 바베시아 81 두 (28.8%), 아나플라즈마 4 두 (1.4%) 의감염률을보였으며에 를리키아와보렐리아단독감염은확인되지않았다.( Table 4). Table 4. Single infection rate of Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, A. platys, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of 281 dogs Dog examined Di Ag Bg Ab Ap Ab Ec Ab Bb Ab The number of positive dog(%) (18.5%) (28.8%) (1.4%) (0%) (0%) * Di Ag, Dirofilaria immitis antigen; Bg Ab, Babesia gibsoni; Ap Ab, Anaplasma phagocytophilum antibody; Ec Ab, Ehrlichia canis antibody; Bb Ab, Borrelia burgdorferi antibody

17 단독감염에서유기견 198두와내원견 83두를분리하여감염율을확인한결과, 유기견 198두에서심장사상충 40두 (20.2%), 바베시아 45두 (22.7%), 아나플라즈마 4두 (2.0%) 의감염률을보였으며내원견 83두에서는심장사상충 1두 (1.2%), 바베시아 36두 (43.4%) 의감염율을보였으나아나플라즈마단독감염은확인되지않았다 (Table 5). Table 5. Single infection rate of Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni and Anaplasma phagocytophilum, A. platys investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of Stray 198 dogs and Patient 83 dogs. Dog examined NE NP Di Bg Ap Ec Bb PR PR PR PR PR NP NP NP NP (%) (%) (%) (%) (%) Stray dogs Patient dogs Total * Di :Dirofilaria immitis ; Bg: Babesia gibsoni ; Ap: Anaplasma phagocytophilum ; NE: No. of examined, NP: No. of positive, PR: Positive rate*p < 0.05; 질병감염별중복감염률에대한결과로는, 대상동물 281마리중에서바베시아와심장사상충 11두 (3.9%), 바베시아와아나플라즈마 20두 (7.1%), 바베시아와보렐리아 1두 (0.4%), 바베시아와에를리키아 1(0.4%), 바베시아와아나플라즈마및심장사상충 4두 (1.4%), 바베시아와아나플라즈마및보렐리아 2두 (0.7%), 바베시아와아나플라즈마와보렐리아및심장사상충 1두 (0.4%), 바베시아와아나플라즈마와보렐리아및에를리키아 1두 (0.4%) 의감염률을보였다 (Table 6)

18 Table 6. Duplicate infection rate of Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, A. platys, Ehrlichia canis, and Borrelia burgdorferi investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of 281 dogs Dog examined Bg Ab Di Ag Bg Ab Ap Ab Bg Ab Bb Ab Bg Ab Ec Ab Bg Ab Ap Ab Di Ag Bg Ab Ap Ab Bb Ab Bg Ab Ap Ab Bb Ab Di Ag Bg Ab Ap Ab Bb Ab Ec Ab The number of positive dog (%) 11 (3.9%) 20 (7.1%) 1 (0.4%) 1 (0.4%) 4 (1.4%) 2 (0.7%) 1 (0.4%) 1 (0.4%) * Di Ag, Dirofilaria immitis antigen; Bg Ab, Babesia gibsoni; Ap Ab, Anaplasma phagocytophilum antibody; Ec Ab, Ehrlichia canis antibody; Bb Ab, Borrelia burgdorferi antibody 제주도내동물병원내원견 83두와유기견 198두의감염률을구분하여조사한결과, 병원내원견 83두중에서심장사상충 6두 (7.2%), 바베시아 58두 (69.9%), 아나플라즈마 17두 (20.5%), 에를리키아 1두 (1.2%), 보렐리아 3두 (3.6%) 의감염률을보였으며, 유기견 198두에서는심장사상충 51두 (25.8%), 바베시아 63두 (31.8%), 아나플라즈마 15두 (7.6%), 에를리키아 1두 (0.5%), 보렐리아 2두 (1.0%) 의감염률을보였다 (Table 7)

19 Table 7. Seroprevalence of dogs with Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilium, A. platys, Ehrlichia canis and Borrelia burgdorferi investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of Stray 198 dogs and Patient 83 dogs. Dog examined NE NP Di Bg Ap Ec Bb PR PR PR PR PR (%) NP (%) NP (%) NP (%) NP (%) Stray dogs Patient dogs Total * Di :Dirofilaria immitis ; Bg: Babesia gibsoni ; Ap: Anaplasma phagocytophilum ; Ec: Ehrlichia canis ; Bb: Borrelia burgdorferi ; NE: No. of examined, NP: No. of positive, PR: Positive rate*p < 0.05; 대상동물의월별감염률을조사한결과, 2018년 8월 49두에서심장사상충 12두 (24.5%), 바베시아 15두 (30.6%), 아나플라즈마 6두 (12.2%), 보렐리아 2두 (4.1%) 를보였으며, 2018년 9월 96두에서심장사상충 25두 (26.0%) 바베시아 34두 (35.4%), 아나플라즈마 10두 (10.4%) 를보였으며, 2018년 10월 115두에서심장사상충 25두 (21.7%), 바베시아 61두 (53.0%), 아나플라즈마 11두 (9.6%), 에를리키아 1두 (0.9%), 보렐리아 1두 (0.9%) 를보였으며, 2018년 11월 12두에서바베시아 7두 (58.3%), 아나플라즈마 4두 (33.3%), 엘를리키아 1두 (8.3%), 보렐리아 2두 (16.7%) 를보였으며, 2019년 1월 3두에서바베시아 1두 (33.3%), 2019년 2월 1두에서바베시아와아나플라즈마중복감염을보였으며, 2019년 3월 5두에서심장사상충 1두 (20%), 바베시아 2두 (40%) 의감염률을보였다 (Table 8)

20 Table 8. Seroprevalence of dogs with Dirofilaria immitis, Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilium, A. platys, Ehrlichia canis and Borrelia burgdorferi investigated by Bionote Rapid V-4 Test Kit and Babesia antibody kit of Monthly. Monthly Dog examined NE Di Bg Ap Ec Bb NP PR (%) NP PR (%) NP PR (%) NP PR (%) NP PR (%) Total * Di :Dirofilaria immitis ; Bg: Babesia gibsoni ; Ap: Anaplasma phagocytophilum ; Ec: Ehrlichia canis ; Bb: Borrelia burgdorferi ; NE: No. of examined, NP: No. of positive, PR: Positive rate*p < 0.05; 3. IFA 검사대상동물 281두에서 IFA 검사에대한결과 (Figure 4,5,6,7) 로바베시아감염견이내원견 83두중바베시아 52두 (62.7%), 아나플라즈마 13두 (15.7%), 에를리키아 1 두 (1.2%) 의감염률을보였으며유기견 198두중바베시아 61두 (30.8%), 아나플라즈마 22두 (11.1%), 에를리키아 1두 (0.5%) 의감염률을보였다. 총 281두에서의감염률은바베시아 113두 (40.2%), 아나플라즈마 35두 (12.5%), 에를리키아 2두 ( 0.7%) 로확인되었다 (Table 9)

21 Table 9. Seroprevalence of Babesia gibsoni, Anaplasma phagocytophilum, A. platys, Ehrlichia canis infection by IFA of Stray 198 dogs and Patient 83 dogs. Dog examined NE NP Bg Ap Ec PR PR (%) NP (%) NP PR (%) Stray dogs Patient dogs Total * Bg: Babesia gibsoni ; Ap: Anaplasma phagocytophilum ; Ec: Ehrlichia canis ; NE: No. of examined, NP: No. of positive, PR: Positive rate*p < 0.05; Figure 4. Positive results of immunofluorescence assay test according to dilution factor for sample (3912). Anaplasma negative sample A: 1:2(x1), B: 1:4(x1), C: 1:8(x1), D: 1:16(x1), E: 1:32(x1), F: 1:64(x1), G: 1:128(x1), H: 1:256(x1)

22 Figure 5. Positive results of immunofluorescence assay test according to dilution factor for sample ( si). Anaplasma positive sample A: 1:2(x1), B: 1:4(x1), C: 1:8(x1), D: 1:16(x1), E: 1:32(x1), F: 1:64(x1), G: 1:128(x1), H: 1:256(x1) Figure 6. Positive results of immunofluorescence assay test according to dilution factor for sample (3997). Ehrlichia negative sample A: 1:2(x1), B: 1:4(x1), C: 1:8(x1), D: 1:16(x1), E: 1:32(x1), F: 1:64(x1), G: 1:128(x1), H: 1:256(x1)

23 Figure 7. Positive results of immunofluorescence assay test according to dilution factor for sample (4692, 4435). Ehrlichia positive sample 4692 A: 1:32(x1), B: 1:64(x1), C: 1:128(x1), 4435 D: 1:32(x1), E: 1:64(x1), F: 1:128(x1) 4. Bionote cani V-4 kit 에서 Anaplasma & Ehrlichia 의민감도와특이도평가 One step canine Anaplasma Ab test kit (BioNote, Inc, Republic of Korea) 의민 감도 (Sensitivity) 는 (21x100)/(21+14)=60.0% 로, 특이도 (Specificity) 는 (38x100)/ (38+11)=77.6% 로나타났다 (Figure 8)

24 IFA Positive Negative AB kit Positive TP=21 FP= % Positive predictive V 32 Negative FN=14 TN= % Negative predictive V % 77.6% Sensitivity Specificity Figure 8. Sensitivity and specificity of canine anaplasma antibody test kit based on IFA One step canine Ehrlichia Ab test kit (BioNote, Inc, Republic of Korea) 의민 감도 (Sensitivity) 는 (2x100)/(2+11)=15.4% 로, 특이도 (Specificity) 는 (249x100)/(249+0)= 100% 로나타났다 (Figure 9)

25 IFA Positive Negative AB kit Positive TP=2 FP=0 65.6% Positive predictive V 2 Negative FN=11 TN= % Negative predictive V % 100% Sensitivity Specificity Figure 9. Sensitivity and specificity of canine ehrlichia antibody test kit based on IFA

26 Ⅳ. 고찰 세계적으로지구온난화가가속화되며기온및강수량의증가되고, 절지동물의생존률과산란률및활동을증가시키고모기와진드기같은절지동물의개체수가증가하면서절지동물매개질병의발생빈도및전파빈도가증가하게된다 (Beugnet and Marié, 2009). 기후변화에따른기온의상승은병원체가절지동물의매개체내에서증식기간을단축시켜서단시간내에대량증식이가능해져분포지역및전염시킬수있는활동기간을연장시키면서동물과사람에게전파가능기간이길어질수밖에없다. 동물이진드기혹은모기등에동시노출된경우단일혹은다수병원체에중복감염이일어날수있고 (Víchová et al, Kordick et al, 1999), 한종의진드기가서로다른감염성병원체에중복감염되어여러병원체를동시에매개할수도있다 (Víchová et al, Breitschwerdt et al, 1998). 이러한변화는높은기온에서감염성 L3유충으로의성숙기간이비례적으로짧아지는것으로나타났으며 (Kalluri et al, 2007), 이로인한심장사상충증과같은모기매개성질병의전파와유행기간에도영향을미치고있다 (Genchi et al, 2011). 심장사상충은인수공통전염병이아니지만감염성유충은우발적감염으로사람에게서 Human pulmonary dirofilariasis와같은임상적질병을일으킬수있다 (Lee et al, 2000). 기존과달라진생태환경으로인하여새로운질병이유입되었을시토착화가능성이증대되며, 질병발생양상은지역적으로각기다른패턴으로변화될것으로예측된다. 제주도는우리나라최남단에위치하고있으며, 국내어느지역보다기후변화에따른온도상승에민감한지역으로모기매개성질병의변화를감시하는연구가필요하다. 혈액검사상, 심장사상충감염견에서 WBC, CRP등의염증과관련된수치가상승되고바베시아, 아나플라즈마, 에를리키아그리고보렐리아의진드기매개질병에서빈혈과관련된평균수치들의하락을확인할수있으나, 정상수치에서크게벗어나지않는결과를보였으며, 검사상의음성균으로분리되어진군에서감염균

27 에서보여지는혈액상태를보이고있어, 이는혈액검사결과로질병을예측, 판 단하는데는유의성이부족한것으로나타났다. 제주지역유기견을대상으로심장사상충항원키트를이용하여조사된심장사상충감염율을보면, 2013년 9.53%, 2014년 12.8%, 2015년 12.7%, 2016년 17.9% 을보였으며 ( 박, 2016). 본연구에서 20.3% 의감염률로증가추이를볼수있다. 이러한연구결과는제주도에서의심장사상충의임상적중요성이기후변화와함께증가하고있음을암시하는것으로보여지며, 예방프로그램에대한좀더적극적 인검토가매우중요하다고볼수있다. 심장사상충항원키트검사를통해확인 된심장사상충감염에대한한국지역별조사에서 2000년전국평균 28.3%(Song, 2000), 제주지역 38.6%(Song, 2000), 부산지역실내견 2.8%(Byeon et al, 2007), 2003년대구지역 23.6%(Lim et al, 2003), 2007년광주지역 12.4%(Koh et al, 2007), 2010년울산지역 7.2%(Park et al, 2010), 2010년광주광양순천아산지역사냥견에서 22.3%(Lim et al, 2010), 2010년광주지역 14.6%(Lim et al, 2010), 2016년서울지역 7.0%( 서, 2018), 제주지역 17.9%( 박, 2016), 2017년서울지역 6.5%( 서, 2018), 2018년서울지역 5.2%( 서, 2018) 로감소추이를보이고있지만, 2009년미국에서의감염률은 1.4% 로더낮은감염률을보였다 (Bowman et al, 2009). 이는한국보다미국에서실시된더좋은예방프로그램과대중의이해및적극적인예방때문으로보여진다. 그러나제주도에서 2019년내원견및유기견 281두를대상으로한본조사에서제주 20.3% 의감염률을보인것은아직도제주도에서예방프로그램및수의사와보호자의적극적인예방에대한대처자세가부족하다고볼수있으며이를개선하기위한서로의인식개선과노력이요구된다. 진드기매개질병또한이런시대적변화속에서많은변화가발생하고있다. 국내의경우개의진드기매개질병중 babesiosis, anaplasmosis, ehrlichiosis, lyme borreliosis가개에서의감염사례가있으며 (Choi et al, 2009.,Oh and Woo, Yu et al, 2008), 제주지역에서발견된 Haemaphysalis longicolnis에서 Anaplasma phagocytophilum과 Ehrlichia chaffeensis가검출되었으나 (Oh and Woo, 2009), 당

28 시개에서는검출이되지않았다 년제주지역실외견및유기견을대상으로 한진드기매개질병연구결과에도 babesiosis 는확인되었으나 anaplasmosis, ehrlichiosis, lyme borreliosis 는개에서감염사례는아직없는것으로보고되었다 ( 문, 2015). 바베시아의경우 2009년제주도서귀포에서 173두중 9두 (5.2%) 의감염률 (Oh and Woo, 2009) 을보인반면, 2018년제주도서귀포에서 211두중 99두 (46.9%) 로높은감염률 (Yang, 2018) 을보였으며이번연구에서도 281두중 121두 (43.1%) 의높은감염률을보였다. 특히내원견의경우 83두중 58두 (69.9%) 의높은감염률은임상증상을보이는견을대상으로진행하여이와같은결과가초래된것으로사료되며유기견에서 198두중 63두 (31.8%) 의감염률이확인된것으로보아지금도매우높은감염률을보이고있다고할수있다. Anaplasmosis, ehrlichiosis, lyme borreliosis의경우 babesiosis와같이계절적인영향을많이받기때문에 (Dumler et al, 2001) 약충및성충시기의진드기가왕성히활동하는늦봄부터가을까지다발하는것으로알려져있다. 2010년대전 강원지역에서유기견 252두를대상으로 4종키트검사를이용하여감염여부를확인한결과아나플라즈마증 7.93%, 에를리키아증 9.51% 그리고보렐리아증 2.38% 를보였으며 (Kim et al, 2010), 광주 광양 순천 아산지역에서사냥견 229두를대상으로한보고에서는아나플라즈마증 18.8%, 에를리키아증 6.1% 그리고보렐리아증 2.2% 의비교적높은감염률이보고되었다 (Lim et al, 2010) 년서울지역에서유기견 754두를대상으로한감염보고를보면아나플라즈마증 0.2% 의감염률을보인반면, 에를리키아증과보렐리아증은감염보고가되어있지않았다. 그러나서울지역에서 2018년 788두의유기견을대상으로한감염률에서는아나플라즈마증 0.89%, 에를리키아증 0.25% 그리고보렐리아증 0.25% 로감염보고를보였다 ( 서, 2018). 이번연구에서도나타나듯이아나플라즈마증 11.4%, 에를리키아증 0.7%, 보렐리아증 1.8% 의감열률을확인할수있었다. 단독감염률이총 281두중바베시아 81 두 (28.8%), 심장사상충 41두 (14.6%) 그리고아나플라즈마 4두 (1.4%) 를확인할수

29 있었으며, 이들단독감염에서유기견 198두와내원견 83두를분리하여단독감염율을확인한결과심장사상충의경우유기견에서압도적인감염율을확인할수있었으며바베시아의경우유기견 45두 (22.7%) 와내원견 36두 (43.4%) 의감염율을보였으며아나플라즈마의경우 4두모두유기견에서확인되었다. 이는심장사상충의경우질병에대한예방프로그램을적용하고있는데서차이가있는것으로사료되며. 바베시아의경우오히려내원견에서감염율이높은것은임상증상이보이는환견을대상으로한검사의결과로보여진다. 중복감염에서바베시아와심장사상충 11두 (3.9%), 바베시아와아나플라즈마 20 두 (7.1%), 바베시아와보렐리아 1두 (0.35%), 바베시아와에를리키아 1(0.35%), 바베시아와아나플라즈마및심장사상충 4두 (1.4%), 바베시아와아나플라즈마및보렐리아 2두 (0.7%), 바베시아와아나플라즈마와보렐리아와심장사상충 1두 (0.35%), 바베시아와아나플라즈마와보렐리아및에를리키아 1두 (0.35%) 가확인되었다. 계절별감염률에서도나타나듯이진드기가주로활동하는시기를벗어난 10월에도감염률이 115두중바베시아 61두 (53.0%), 아나플라즈마 11두 (9.6%), 에를리키아 1두 (0.9%) 그리고보렐리아 1두 (0.9%) 를보이고있음을알수있다. 이는기후변화로인한진드기의생존률, 활동률, 산란률이증가되면서고온다습한환경이지속됨에따라감염률또한증가되고있음을보여주고있다. 또한단독감염에서벗어나, 이중삼중사중의중복감염으로인한개체의질병발생이다양화되고있음을알수있다. 이러한변화는사람에서도매해아나플라즈마증, 에를리키아증및라임병의발생빈도가여러보고서확인되어인수공통전염병으로등록하여관리하고있음에도환자수는꾸준히늘어나고있음을확인할수있다. 면역형광항체기법을이용한항체검사에서유기견 198두에서바베시아 61두 (30.8%), 아나플라즈마 22두 (11.1%) 그리고에를리키아 1두 (0.5%) 를보였으며, 내원견 83두에서는바베시아 52두 (62.7%), 아나플라즈마 13두 (15.7%) 그리고에를리키아 1두 (1.2%) 를보여간이항체키트검사의결과와유사하게나타남을알수있었다. 바베시아의경우간이항체키트와 IFA결과에서바베시아 2두 (1%), 아나플라즈마 7두 (3.5%) 의차이를보인반면에를리키아결과는서로일치하는것으로

30 나타났다. 내원견 83두에서는바베시아 6두 (7.2%), 아나플라즈마 4두 (4.8%) 의차이를보였으며에를리키아는유기견에서와같이일치함을알수있었다. 간이항체키트와면역형광항체기법간의결과가한쪽이양성이면다른한쪽이음성으로나타나거나혹은그반대의결과를보이는서로상반되는불일치의결과도몇두에서확인할수있었다. 그러나바베시아의경우두검사의결과가높게일치함을알수있으며, 아나플라즈마와에를리키아의경우는적은감염두수를고려하여결과의신뢰성이높다고는할수없는것으로보여진다. 면역형광항체기법은 1:32이상의희석에서형광물질발현확인시양성군에서는형광발현을확인하고음성군에서는그러지않음을확인하였으나, 그경계선이보는시각에따라서로다른결과를초래할수있는뚜렷하지않은부분도확인이되었다. 이는희석, 세정등의불충분한과정또한고려할수있을것이다. IFA기법을이용한항체검사시좀더명확하고명료한기준이마련되어정확한결과로이어질수있도록기술적조건을충족시켜야될것으로보여진다. 아나플라즈마민감도특이도검사에서 FN(14), TP(21), TN(36), FP(11) 을나타냈으며에를리키아의민감도특이도검사에서 FN(11), TP(2), TN(249), FP(2) 의결과가나타났다. 이에따른아나플라즈마의민감도 60.0%, 특이도 77.6% 의결과를보였으며, 에를리키아의민감도는 15.4%, 특이도 100% 를보였는데이는검체수의부족에서오는일차적오류와 IFA 검사진행과정에서발생될수있는오류등의결과로측정값의민감도와특이도의정확성이떨어짐을알수있으며향후실험실적검사에서좀더정확한데이터모니터링이필요하다. 이와같이혈액검사에서도심장사상충에서의염증수치의변화와진드기매개질병에서빈혈과관련된수치의변화가확인되었으나, 감염견과음성견의차이성이뚜렷하지않았다. 심장사상충감염증, 바베시아감염증, 아나플라즈마감염증, 에를리키아감염증그리고보렐리아감염증의단독감염과중복감염이확인되었으며, 제주지역에서아나플라즈마, 에를리키아그리고보렐리아의감염을확인하였다. 동물병원내원견에서유기견에서보다진드기매개질병의감염율이높게확인된것은임상증상을기초로선택적인검사진행에의한결과로보여지며, 간

31 이항체키트에서면역형광항체기법과비교하여질병별높은항체검출을확인할수있었으나, 간이항체키트는잠복기때진단이어려우며이로인한민감도감소와회복이후에도항체지속에따른특이도감소를보인다. 질병들을진단하기위해실험실검사혹은고난이도의테크닉적검사가필요하나동물병원현장에서빠른진단과치료를위해비용과시간의절약, 간편하고정확도가높은간이키트검사의활용은반드시필요한상황이다. 하지만단독으로사용하기에는민감도와특이도에서완벽하지않기때문에환자의상태를정확히진단하고평가하기위해서는임상증상, 일반혈액검사, CRP, 간이항원 항체키트검사및유전자검사를병행실시하여진단율을높여야할것으로보인다

32 Ⅴ. 결론 2018년 8월부터 2019년 3월사이제주도내지역동물병원에내원한 83두와유기견 198두, 총 281두의개를대상으로심자사상충감염, 바베시아감염, 아나플라즈마감염, 에를리키아감염그리고보렐리아감염의정도를조사하고국내에서새로개발된 4종키트 (Bionote cani V-4 kit) 를기존 IFA와비교하여민감도와특이도를평가하여다음과같은결과를얻었다. 1. 대상동물총 281 두중심장사상충감염은 57 두 (20.3%), 바베시아감염은 121 두 (43.1%), 아나플라즈마감염은 32 두 (11.4%), 에를리키아감염은 2 두 (0.7%) 그리고 보렐리아감염은 5 두 (1.8%) 로확인되었다. 2. 전체 281 두중단독감염으로심장사상충단독감염은 41 두 (14.6%), 바베시아단 독감염은 81 두 (28.8%), 아나플라즈마단독감염은 4 두 (1.4%) 를보였으며, 에를리키 아와보렐리아는단독감염은나타나지않았다. 3. 심장사상충과바베시아혼합감염이 11두 (3.9%), 바베시아와아나플라즈마혼합감염이 20두 (7.1%), 바베시아와보렐리아혼합감염이 1두 (0.35%), 바베시아와에를리키아혼합감염이 1두 (0.35%), 심장사상충과바베시아그리고아나플라즈마혼합감염이 4두 (1.4%), 바베시아와아나플라즈마그리고보렐리아혼합감염이 2두 (0.7%), 심장사상충과바베시아와아나플라즈마그리고보렐리아혼합감염이 1두 (0.35%), 바베시아와아나플라즈마와보렐리아그리고에를리키아혼합감염이 1 두 (0.35%) 가확인되었다. 4. 동물병원내원견 83두중심장사상충 6두 (7.2%), 바베시아 58두 (69.9%), 아나플라즈마 17두 (20.5%), 에를리키아 1두 (1.2%) 그리고보렐리아 3두 (3.6%) 의감염률을보였으며, 유기견 198두에서는심장사상충 51두 (25.8%), 바베시아 63두 (31.8%), 아나플라즈마 15두 (7.6%), 에를리키아 1두 (0.5%) 그리고보렐리아 2두 (1.0%) 의감염

33 률을보였다. 5. 새로개발된아나플라즈마항체키트의기존 IFA 항체키트와비교했을때, 민 감도는 60.0% 였으며, 특이도는 77.6% 로나타났다. 6. 새로개발된에를리키아항체키트의기존 IFA 항체키트와비교했을때, 에를 리키아항체키트의민감도는 15.4% 였으며, 특이도는 100% 로나타났다. 이상의결과에서아나플라즈마감염증, 에를리키아감염증그리고보렐리아감염증의항체가형성되어있는개를제주도에서확인되었으며, 감염견에서단독감염이대부분을차지하지만, 혼합감염도다수확인되었다. 질병들의진단을위해간이항원 항체키트검사혹은혈액검사의단일검사로질병을진단할수는없으므로실제임상에서는임상증상, 혈액검사, 항체키트검사와유전자검사 ( 항원검사 ) 의병행검사가필요할것으로사료된다

34 Ⅵ. 참고문헌 1. 문미래. 제주도내개에서진드기매개질병과 Babesia gibsoni cytochrome b 유 전자의 SNP. 제주대학교대학원. 제주 박응복, 이희성. 진주지방축견의사상충조사. 진주농대연구보고 1962; 1: 박정훈. 제주도내심장사상충에감염된유기견의혈액에서울바키아검출. 제 주대학교대학원. 제주 서울특별시보건환경연구원, 서울시내반려동물모니터링검사결과 한국동물분류학회. 한국동물명집. 서울 : 고려과학 Beugnet F, Marié JL. Emerging arthropod-borne diseases of companion animals in Europe. Vet Parasitol. 2009; 163(4): Boozer AL, Macintire DK. Canine babesiosis. Vet Clin North Am Small Anim Pract 2003; 33(4): Bowman D, Little SE, Lorentzen L, Shields J, Sullivan MP, Carlin EP. Prevalence and geographic distribution of Dirofilaria immitis, Borrelia burgdorferi, Ehrlichia canis, and Anaplasma phagocytophilum in dogs in the United States: Results of a national clinic-based serologic survey. Vet Parasitol 2009; 160(1-2): Breitschwerdt EB, Hegarty BC, Hancock SI. Sequential evaluation of dogs naturally infected with Ehrlichia canis, Ehrlichia chaffeensis, Ehrlichia equi,

35 Ehrlichia ewingii, or Bartonella vinsonii. J Clin Microbiol 1998; 36: Byeon KH, Kim BJ, Kim SM, Yu HS, Jeong HJ, Ock MS: A serological survey of Dirofilaria immitis infection in pet dogs of Busan, Korea, and effects of chemoprophylaxis. Korean J Parasitol 2007; 45: Chen SM, Dumler JS, Bakken JS, Walker DH. Identification of a granulocytotropic Ehrlichia species as the etiologic agent of human disease. J Clin Microbiol 1994; 32(3): Choi US, Kim HW, You SE, Youn HJ. A suspected case of Lyme borreliosis in a hunting dog in Korea. J Vet Sci 2009; 10: Dumler JS, Barbet AF, Bekker CP, Dasch GA, Palmer GH, Ray SC. Reorganization of genera in the families Rickettsiaceae and Anaplasmataceae in the order Rickettsiales: unification of some species of Ehrlichia with Anaplasma, Cowdria with Ehrlichia and Ehrlichia with Neorickettsia, descriptions of six new species combinations and designation of Ehrlichia equi and HGE agent as subjective synonyms of Ehrlichia phagocytophila. Int J Syst Evol Microbiol 2001; 51(6): PMid: Genchi C, Mortarino M, Rinaldi L, Cringoli G, Traldi G, Genchi M. Changing climate and changing vector-borne disease distribution the example of Dirofi laria in Europe. Vet Parasitol 2011; 176: Greig B, Asanovich KM, Armstrong PJ, Dumler JS. Geographic, clinical, serologic and molecular evidence of granulocytic ehrlichiosis, a likely zoonotic disease in Minnesota and Wisconsin dogs. J. Clin. Microbiol 1996; 34:

36 16. Heo EJ, Park JH, Koo JR, Park MS, Park MY, Dumler JS, Chae JS. Serologic and molecular detection of Ehrlichia chaffensis and Anaplasma phagocytophila(human granulocytic ehrlichiosis agent) in korean patients. J Clin Microbiol 2002; 40(8): Kalluri S, Gilruth P, Rogers D, Szczur M. Surveillance of arthropod vector-borne infectious diseases using remote sensing techniques: a review. PLoS Pathog 2007; 26: Kim TH, Kim YH, JChoi JH, Park HJ, Chung DW, Kim DH, Song KH. Seroprevalence of Dogs with Dirofilaria immitis, Anaplasma phagocytophilum, Borrelia burgdorferi and Ehrlichia canis Infection in the Daejeon City and Kangwon Province 2010; 27: Koh BRD, Na HM, Jang MS, Kim JY, Park SD. Investigation of canine dirofilariasis and brucellosis in free roaming dogs from public animal shelters in Gwangju area. Korean J Vet Serv 2007; 30: Kordick SK, Breitschwerdt EB, Hegarty BC, Southwick KL, Colitz CM, Hancock SI, Bradley JM, Rumbough R, Mcpherson JT, MacCormack JN. Coinfection with multiple tick-borne pathogens in a Walker Hound kennel in North Carolina. J Clin Microbiol 1999; 37(8): Lee KJ, Park GM, Yong TS, Im K, Jung SH, Jeong NY, Lee WY, Young SJ, Shin KC. The first Korean case of human pulmonary dirofilariasis. Yonsei Med J 2000; 41: Lee SH, Lee YS,, Hwang SD. Center for Laboratory Control of Infectious Diseases, KCDC Laboratory-based diagnosis test results of Human

37 Granulocytic Anaplasmosis 2016; 12: Lim HS, Cho YJ, Suh DK, Song DJ, Lee CS, Bae YC. A survey of the infection rate of Dirofilaria immitis of dogs in Daegu area. Korean J Vet Serv 2003; 26: Lim S, Irwin PJ, Lee SR, Oh MH, Ahn KS, Myung BY, Shin SS. Comparison of selected canine vector-borne diseases between urban animal shelter and rural hunting dogs in Korea. Parasites & Vectors 2010; 3: Littman MP, Goldstein RE, Labato MA, Lappin MR, Moore GE. ACVIM small animal consensus statement on Lyme disease in dogs: diagnosis, treatment, and prevention, J Vet Intern Med 2006; 20(2): Oh ST, Woo HC. Prevalence of Babesia spp. in dogs of Seogwipo-si, Jeju-do, South Korea. Korean J Vet Serv 2009; 32: Olano JP, Walker DH. Human ehrlichioses. Med Clin North Am 2002; 86(2): Park CE. Epidemiological survey on prevalence of Dirofilaria immitis infection in dogs of Ulsan area. Korean J Vet Serv 2010; 33: Petzke M, Schwartz I. Borrelia burgdorferi Pathogenesis and the Immune Response. Clin Lab Med 2015; 35(4): Song BS. Survey of canine heartworm(dirofilaria immitis) infection on Jeju Island, Korea. Jeju National University Graduate school

38 31. Soulsby EJL. Dirofilaria immitis In Helminths, Arthropods and Protozoa of Domesticated Animals, 7th ed. London: Bailliere Tindall 1982: Sul H, Kim DM. Present state and future of tick-borne infectious diseases in Korea. J Korean Med Assoc 2017; 60(6): Víchová B, Miterpáková M, Iglódyová A. Molecular detection of co-infections with Anaplasma phagocytophilum and/or Babesia canis canis in Dirofilaria positive dogs from Slovakia. Vet Parasitol 2014; 203(1-2): Yang YS : Evalution of simple babesia antibody test kit and real-time quick PCR for detection of babesia gibsoni in canine blood samples 2018; 12: Yu DH, Li YH, Yoon JS, Lee JH, Lee MJ, Yu IJ, Chae JS, Park JH. Ehrlichia chaffeensis infection in dogs in South Korea. Vector Borne Zoonotic Dis 2008; 8:

39 감사의글 논문을작성하고나니너무도많은감사한분들의도움이있었다는걸새삼느끼게됩니다. 누군가에게감사함을표현한다는게이렇게낯설은거였나하는생각이들면서죄송스러우면서도감사의마음을담아그래도짧게나마그마음을전하고자합니다. 졸업하고임상을하면서나름열심히한다고했는데도항상부족하고또모자란모습에서지쳐갈때대학원이라는새로운활력의장소에입성하면서꽤괜찮은새로운경험을하게되었습니다. 힘들기도했지만그생활이삶의활력이되어주고 해보자 라는생각을다시갖게되는시기였던것같습니다. 시간을쪼개서일과학업을병행한다는게생각처럼그리쉽지만은않아서수료로만족해보기도하고어떻게준비를해야하나걱정도하고갈등을반복하는과정에주위에서의도움과그래도아직까지도저를포기하지않고관심과애착을갖고품어주신윤영민교수님이계셨기에지금의이시간도가능했습니다. 저의부족함과상황의어려움을이해하고감싸주시면서조금이라도더많은부분을채워주실려고관심의끈을놓지않고하나부터열까지지도해준지도교수님이신윤영민교수님께너무나감사드립니다. 바쁘신와중에도제학위논문의심사위원을맡아주시고조언을아끼지않으셨던두분의교수님께도감사드립니다논문을작성하면서디테일한부분까지신경써주시고몇번에걸쳐서조금이라도더나은논문이되도록관심갖어주신이경갑교수님께제자로서무한한감동과감사를드립니다. 편안하지만말씀한마디한마디에날카로운지적으로방향과정의를내리고마무리할수있도록신경써주신손원근교수님정말감사드립니다. 그리고자주찾아가뵙지도못하고못난제자이지만항상웃음으로저를맞아주시고힘이되어주시는이영재교수님께도감사의말씀을드립니다. 논문발표자리에서미흡한부분에대해말씀을주신여러교수님들께도진심으로감사드리며, 4년간의학부시절과 2년간의석사시절동안많은가르침을주신수의학과모든교수님들께도감사의마음을전합니다. 교수님들의지도, 철학을잘새겨들어훌륭한제자가되진못하드라도덜못난제

40 자가되도록노력하겠습니다. 실험을진행하는데바쁜와중에도도움을주신윤영민교수님이하수의내과학교실학부생여러분에게도뭐라표현하기힘들정도로고맙고미안하고감사합니다. 논문쓰고발표하고심사받으면서자주자리를비워도싫은내색없이흔쾌히이해해준동료이자삶의벗인병국형님과용성이, 논문을찾는데어려움이있어헤매고있을때내부탁을주저없이들어주고몇번에걸쳐서논문을찾아주는데도움을준형석이, 떨리는가슴진정시켜준제욱이, 논문준비하면서뒤늦게알게되었지만큰힘과의지가되어준수의학박사진호, 논문신청부터제작까지모든과정을웃으면서설명해준김보라조교그리고한분한분감사의말씀드리지못해죄송스럽고주위에서저를응원해주고기억해주시는모든분들게진심으로감사의마음을전합니다. 당신몸이아픈와중에도밥잘챙겨먹고다니라고자식걱정으로하루를보내시는 어머니, 무릎이좋지않아도매일밭일하시느라고생하시는아버지 그리고언제 나든든한빽이되어주는형들과형수님, 동생과제수씨모두감사드립니다그리고표현이서툴고모자라지만이해해주고이쁘게봐주시고가족이라는이름으로많은사랑을주시는장인어른, 장모님께도죄송스러우면서도감사한마음을전합니다. 정말너무너무감사드립니다. 자신만의삶을잠시접어두고나의아내이자이솔, 휘람, 수혁의엄마로서최선을다하고있는고은지라는이름을갖은그대. 학비대줄테니열심히해보라고물심양면으로응원하고뒷바라지해주면서기대하고기다려준그대가있어지금의내가있습니다. 곁에있어도항상그립습니다. 고맙습니다그리고사랑합니다. 제가알고있는혹은저를아는모든분들이계시기에저도있음을새삼느끼면서곁에서힘이되어드릴수있도록노력하며살아가겠습니다. 모든분들께감사드립니다 년 06 월 24 일 정상언올림