약학석사학위논문 섬괴불나무의화학성분 Chemical Constituents from Lonicera insularis 2017 년 2 월 서울대학교대학원 약학과생약학전공 김미송

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2 약학석사학위논문 섬괴불나무의화학성분 Chemical Constituents from Lonicera insularis 2017 년 2 월 서울대학교대학원 약학과생약학전공 김미송

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4 국문초록 섬괴불나무 (Lonicera insularis Nakai) 는인동과 (Caprifoliaceae) 식물로서울릉도, 독도지역에분포하는한국특산식물이다. 인동속 (Lonicera) 의많은식물들에서 organic acid, iridoid, secoiridoid, flavonoid, saponin 등의물질들이보고되었다. 이에본연구에서는인동속에서상대적으로연구되지않은한국특산식물인섬괴불나무에서 phenylpropanoid와 secoiridoid 계열의화학성분을찾고자하였다. 섬괴불나무뿌리의 EtOAc 분획과 n-buoh 분획에서다양한 chromatography 기법을이용하여 15종의화합물을분리하였으며, 그구조는각종이화학적특성및분광학적데이터를종합하여동정하였다. 분리된화합물중화합물 1은특징적으로 β-d-apiofuranosyl (1 6)-β-Dglucose기가붙은 phenylpropanoid 계열화합물이며, 화합물 16은특징적으로 guanidine 구조를포함한 secoiridoid glycoside 계열화합물로천연에서처음분리보고되는물질이다. 이외에도분리된화합물들은 salidroside I (2), p-coumaryl alcohol-4-o-glucoside (3), loganic acid (4), 7- deoxyloganic acid (5), loganin (6), periclymenoside (7), 7-O-E-feruloylloganic acid (8), sweroside (9), secologanin (10), secologanol (11), (E)-aldosecologanin (12), kinginoside (13), threninosecologanin (14), 5α-carboxystrictosidine (15) 으로동정하였으며, 화합물 1-3은 phenylpropanoid 계열, 4-8은 iridoid 계열, 9-16은 secoiridoid 계열물질이었다. 화합물 2, 3, 8, 11은이속에서처음보고된물질이었다. 또한국내에자생하는인동속 (Lonicera) 식물중섬괴불나무, 홍괴불나무, 괴불나무, 인동덩굴, 구슬댕댕이, 올괴불나무등 6종을대상으로이차대사산물의특성을비교분석을통해화학적분류를시도하였다. UPLC-DAD/ESI-qTOF-MS를이용한대사체프로파일링과다변량분석기법을활용하여진행한결과, 통계적으로유의미한화학적분류가능성을확인하기어려웠다. 다만, 섬괴불나무의특징적인이차대사물질로 i

5 kinginoside (13) 의가능성을확인할수있었다. 이상의결과로부터섬괴불나무의화학적특성을규명하였을뿐아니라, 신규화합물을포함하는아미노산이결합된특징적인 secoiridoid 화합물 (14-16) 의존재를확인함으로써, secoiridoid 화합물의화학적다양성을확인할수있었다. 주요어 : 섬괴불나무 (Lonicera insularis Nakai), 인동과 (Caprifoliaceae), iridoid, secoiridoid, phenylpropanoid, UPLC-qTOF-MS, HT22 세포주 학번 : ii

6 Contents 국문초록... i Contents... iii List of Tables... vi List of Figures... vii List of Abbreviations... ix Ⅰ. 서론... 1 Ⅱ. 섬괴불나무뿌리로부터화합물의분리... 3 A. 실험재료및방법 실험재료 시약및기기 시약 기기 실험방법 섬괴불나무뿌리의추출및분획 섬괴불나무 n-buoh 분획으로부터화합물의분리 섬괴불나무 EtOAc 분획으로부터화합물의분리 당분석 HT22 세포주에서 neuroprotection 활성검색 HT22 세포주배양및 glutamate 에의한독성저해활성검색용시약 HT22 세포주의배양 Glutamate 에의한신경독성유도 MTT assay iii

7 4.5. 통계처리 B. 결과및고찰 섬괴불나무뿌리에서의물질분리 화합물 1 의구조분석 화합물 2 의구조분석 화합물 3 의구조분석 화합물 4 의구조분석 화합물 5 의구조분석 화합물 6 의구조분석 화합물 7 의구조분석 화합물 8 의구조분석 화합물 9 의구조분석 화합물 10 의구조분석 화합물 11 의구조분석 화합물 12 의구조분석 화합물 13 의구조분석 화합물 14 의구조분석 화합물 15 의구조분석 화합물 16 의구조분석 HT22 세포주에서의신경세포보호활성 Ⅲ. UPLC/MS 를이용한인동속식물의이차대사체분석 A. 실험재료및방법 실험재료 시약및기기 iv

8 2.1. 시약 기기 시료의제조 기기분석방법 UPLC/MS 측정과분석 다변량분석방법 B. 결과및고찰 UPLC/MS 를이용한섬괴불나무의이차대사체분석 대사산물의동정 섬괴불나무의이차대사체 MS profiling 인동속식물에서의비교분석연구 UPLC/MS 를이용한 TIC peak area 비교분석 다변량분석 IV. 결론 Ⅴ. 참고문헌 Abstract v

9 List of Tables Table 1. 1 H NMR spectral data of compounds Table C NMR spectral data of compounds Table 3. 1 H NMR spectral data of compounds Table C NMR spectral data of compounds Table 5. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds Table 6. 1 H NMR spectral data of compounds Table C NMR spectral data of compounds Table 8. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds Table 9. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds Table H, 13 C NMR spectral data of compounds Table H, 13 C NMR spectral data of compounds Table H, 13 C NMR spectral data of compounds Table 13. Neuroprotective activities of compounds from L. insularis on HT22 cells injured by glutamate Table 14. Components that were identified from L. insularis Table 15. Sample numbers of Six Lonicera species Table 16. Statistical comparison on the normalized TIC areas of the peaks from Lonicera vi

10 List of Figures Figure 1. Roots of Lonicera insularis Nakai... 3 Figure 2. 1 H, 13 C NMR spectra of compound Figure 3. HMBC spectrum of compound Figure 4. Sugar analysis of compound Figure 5. 1 H, 13 C NMR spectra of compound Figure 6. 1 H, 13 C NMR spectra of compound Figure 7. HMBC spectrum of compound Figure 8. 1 H, 13 C NMR spectra of compound Figure 9. 1 H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure 12. HMBC spectrum of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H- 1 H COSY spectrum of compound Figure 21. ROESY spectrum of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H- 1 H COSY spectrum of compound Figure 24. HSQC spectrum of compound Figure H, 13 C NMR spectra of compound Figure H- 1 H COSY spectrum of compound vii

11 Figure 27. HMBC spectrum of compound Figure H- 15 N HSQC spectrum of 4-Guanidinobutyric acid Figure H- 15 N HSQC spectrum of compound Figure 30. Structures of the compounds isolated from L.insularis roots Figure 31. Samples of Lonicera species Figure 32. MS spectral data and fragmentation patterns of salidroside I Figure 33. MS spectral data and fragmentation patterns of di-caffeoyl quinic acid Figure 34. MS spectral data and fragmentation patterns of secologanin Figure 35. MS spectral data and fragmentation patterns of loganin Figure 36. Representative BPI chromatograms of L.insularis A: root, B: stem Figure 37. Mass spectrum of Lonicera species Figure 38. PCA score plots of Lonicera species Figure 39. S-plot of OPLS-DA from Lonicera insularis viii

12 List of Abbreviations [ ] D: specific rotation ACN: acetonitrile C.C.: column chromatography CHCl 3: chloroform COSY: correlation spectroscopy d: doublet D 2O: deuterium oxide dd: doublet of doublet DMSO: dimethylsulfoxide EtOAc: ethyl acetate HMBC: heteronuclear multi-bond correlation HPLC: high performance liquid chromatography HRESIMS: high-resolution electron spray ionization mass spectrometry HSQC: heteronuclear single quantum coherence Hz: hertz IC 50: the half maximal inhibitory concentration IR: infrared spectroscopy m: multiplet MeOD: methanol-d4 MeOH: methanol MS: mass spectrometry MTT: 3-(4,5-dimethylthiozol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide n-buoh: n-butanol NMR: nuclear magnetic resonance NP: normal phase OPLS-DA: orthogonal projections to latent structure-discriminant analysis PCA: principal component analysis ix

13 qtof: quadrupole-time of flight RDA: Retro-Diels Alder reaction R f: migration distance relative to solvent front in TLC ROESY: rotating-frame nuclear overhauser enhancement spectroscopy R t: retention time s: singlet t: triplet TLC: thin layer chromatography t R: retention time (RT) UPLC: ultra high performance liquid chromatography UV: ultraviolet absorption spectroscopy x

14 Ⅰ. 서론 섬괴불나무 (Lonicera insularis Nakai) 는인동과 (Caprifoliacea) 인동속 (Lonicera) 에속하는관목으로울릉도와독도의해안가지역에분포하는한국특산식물이다. 섬괴불나무는소지가비어있고, 꽃은백색에서황색으로변하고잎겨드랑이에 2 송이씩달린다. 열매는장과이며서로떨어져있고둥근모양이며붉게익는다. 식물체표면의맥에만털이있고, 뒷면에융모가있는것이특징이다 ( 한반도고유종총람, 2011). 섬괴불나무에대한연구는울릉도민속식물추출물의항염증효과 (Kim et al., 2013) 과섬괴불나무줄기를이용한분리논문 (Lee et al., 2001) 이보고되었다. 섬괴불나무가속한인동속 (Lonicera) 은약 200 여종이전세계에 분포하고있으며, 중국 ( 약 100 여종 ), 일본 ( 약 25 여종 ), 한국 ( 약 30 여종 ) 을중심으로동아시아지역이주요분포지로알려져있다 (Jeong et al., 2014). 중국에는대표적인인동속식물인인동덩굴의꽃을관절염, 당뇨병, 종기, 수포, 항바이러스등의질병예방에이용하고있으며 500 가지이상의처방에금은화가쓰이고있다. 이전의많은연구를통해 iridoid glycosides, caffeoyl quinic acids, flavonoids, saponins, cerebrosides 등이보고되었고, 그중 iridoid, secoiridoid glycoside 가대표적인화학적성분으로알려져있다 (Liu et al., 2015). Iridoid 로부터에폭시화, 산화, 수소화그리고에스터화를거쳐합성되는 secoiridoid 는 7,8-seco-cyclopenta[c]-pyranoid skeleton 을골격으로 한 monoterpenoids 이다 (Dinda et al., 2007). Secologanin 은 indole, cinchona, ipecacuanha alkaloid 그리고 pyrroloquinoline alkaloid 의생합성의핵심 중간체이다. Nitrogen 을함유하게하는아미노산이나아민과의결합 반응은생물학적활성을더욱증대시키는반응이며 1000 개이상의 alkaloids 는천연물내에서 secologanin 으로부터생성된다. 이전 연구에서 secoiridoid 계열많은화합물이항알러지, 항관절염, 항염증등의 1

15 뛰어난생물학적활성을나타내었다 (Dinda et al., 2007). 가장잘알려진 의약품으로써급성백혈병의치료에쓰이는 dimeric indole alkaloid leurocristine (vincristine) 가개발되어있다 (Tietze et al., 1988). 인동속 식물에서 secoiridoid 계열물질로는간단한 secologanin, secoxyloganin, kingiside, secologanoside 등과 alkaloid 계열의 pyridinium alkaloid 가결합한 secoiridoids (lonijaposides), L-phenylalaninosecologanin 등보고되었으며이는 동속식물에서다양한 secoiridoid 유도체의존재가능성을시사하였다 (Shang et al., 2011). UPLC-qTOF-MS 를 이용한 추출물에서의 화합물 분석은 복잡한 matrix 에서도정확한분석과선택성을높이고감도높은분석을 가능하게한다는것에특이적인장점이있다. 이장점은 extracted ion chromatograms (XICs) 를이용하여낮은정량값, 낮은함유량의성분이라도명백한확인을가능하게한다 (Ren et al., 2008). 이에본연구에서는더욱이차대사체의분석을용이하게하기위해 sep-pak C18 필터를사용하여시료를제작하였다. 그리고 UPLC/MS 를기반한섬괴불나무에서이차대사체프로파일링을수행하였다. 이를토대로다변량분석 (multivariate analysis) 을실시하여대사체에따라인동속식물간에구분이있는지확인하고섬괴불나무의구분에크게영향을주는마커를발굴하였다. 그리고이전연구에서인동덩굴꽃인금은화의쥐의뇌세포에서 glutamate 독성에대한보호작용 Weon et al., 2011) 과산수유에서분리한 iridoid 의뇌종양세포에서의보호작용 (Wang et al., 2009) 이보고되었다. 그리고인동속식물의다양한항산화활성이보고되었다 (Choi et al., 2007, Wu et al., 2015). 이를근거로인동속에서실험되지않았던 HT22 세포의신경세포보호활성을확인해보았다. 2

16 Ⅱ. 섬괴불나무뿌리로부터화합물의분리 A. 실험재료및방법 1. 실험재료 본연구에사용된섬괴불나무 (Lonicera insularis Nakai) 의뿌리 ( 건조 중량 1988 g) 는 2015 년 7 월에서울대학교약학대학약초원에서 채집하였다. Figure 1. Roots of Lonicera insularis Nakai 2. 시약및기기 2.1. 시약 분석용시약컬럼크로마토그래피용 silica gel Kiesgel 60 (40-60 μm, mesh, Art. 9385, Merck, Germany) 컬럼크로마토그래피용 Sephadex LH-20 Sephadex LH-20 (bead size μm, Pharmacia, Sweden) 3

17 박층크로마토그래피용 precoated plates Kiesgel 60 F 254 (Art. 5715, Merck, Germany) RP-18F 254 (Art , Merck, Germany) 발색시약 Anisaldehyde-H 2SO 추출용매및기타시약추출, 분획, 분리에사용된용매 First grade 용매 - Dae Jung Pure chemical Eng. Co. Ltd., Korea HPLC 용용매 - J.T. Baker, Avantor Performance Materials. Inc., USA 2.2. 기기 Analytical balance: Mettler AE 50, Switzerland Autoclave: Sanyo MLS 3000, Japan Centrifuge: Effendroff centrifuge 5810, Germany Elisa reader: Molecular Devices E max, USA Evaporator: EYELANE, Japan Sonicator: Branson 8510, USA Analytical HPLC system - Dionex 3000 Ultimate RLSC system, Thermo Dionex, St Albans, UK - Column: YMC triart C18 column, 4.6 x 250mm, 5 μm, YMC Co. Ltd., Japan Preparative HPLC system - Waters Delta Prep coupled with Waters 2489 UV/vis detector, USA - Gilson 321 Pump and UV/Vis-151 detector, USA - Waters 600 pump coupled with Waters 486 tunable absorbance detector and Hitachi D-2500 chromato-integrator - Column: 1) YMC triart C18 column, 20 x 250mm, 5 μm, YMC Co. Ltd., 4

18 Japan 2) Phenomenex column, 20 x 250mm, 5 μm, Sungmoon Systech Co. Ltd., Seoul, Korea UPLC-QTOF MS system - Waters Acquity UPLC system, Waters Co., Milford, MA, USA - Column: Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 mm x 100 mm, 1.7 μm - Waters Xevo G2 QTOF mass spectrometer, Waters MS Technologies, Manchester, UK Drying oven: CO-2D-1S, Wooju Sci. Co., Korea Hot plate: Corning PC-400, USA NMR: Jeol JMN-LA300 Spectrometer 300 (300 MHz), Japan Bruker AVANCE digital Spectrometer 300 (300 MHz), Germany Bruker AVANCE digital Spectrometer 500 (500 MHz), Germany Bruker AVANCE digital Spectrometer 600 (600 MHz), Germany Bruker AVANCE III HD spectrometer with a 5-mm TCI CryoProbe (800 MHz), Germany Polarimeter: JASCO P-2000, Japan Infared spectrometer: JASCO FT/IR-4200, USA UV lamp: UVP UVGL-58, USA MPLC: Reveleris, Grace Davision, USA MPLC column: Reveleris C 18 Reversed-phase, 120 g, ml/min, USA 5

19 3. 실험방법 3.1. 섬괴불나무뿌리의추출및분획건조된섬괴불나무뿌리 1988 g 을 80% MeOH 로 3 시간씩초음파추출기를사용하여 4 회추출하였고, 그추출액을감압농축하여총추출물 40 g 을얻었다. 이를증류수에현탁시킨후 CHCl 3, EtOAc, n- BuOH 로순차적으로극성을높여가며분획하고, 이들분획물을각각감압농축하여 CHCl 3 분획 (3.7 g), EtOAc 분획 (4.5 g), n-buoh 분획 (23.0 g) 을얻었다 (Scheme 1). Scheme 1. Extraction and fractionation of L.insularis root 6

20 3.2. 섬괴불나무 n-buoh 분획으로부터화합물의분리 n-buoh 분획을 HP-20 Diaion C.C. (MeOH 10% 100%) 를사용하여 5 개의분획 (B1 ~ B5) 으로나누어소분획 B2 를 MPLC NP (CHCl 3 : MeOH = 9:1 1:1) 를시행하여 14 개의분획으로나누고소분획 B2-11 에서화합물 4 을얻었다. 소분획 B3 를 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 을얻었다. B3-2, B3-3, B3-6, B3-10, B3-12, B3-14, B3-59 에서화합물 1-3, 5-7, 9, 11-12, 을얻었다. 소분획 B4 (4.02 g) 를 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 10:5:1) 을시행하여 10 개의분획으로나누고소분획 B4-1 (85 mg) 에서화합물 10 을얻었다 (Scheme 3). Scheme 3. Isolation of the compounds from the n-buoh fractions of L.insularis 7

21 화합물 1 의분리 n-buoh 분획을 HP-20 Diaion C.C. (MeOH 10% 100%) 를사용하여 5 개의분획 (B1 ~ B5) 으로나누어 5 개의분획 (B1 ~ B5) 중소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 을얻었다. 이중소분획 E3-14 (100 mg) 로부터 HPLC (22% MeOH) 를수행하여노란색결정의화합물 1 (0.9 mg) 을분리하였다. 화합물 1 은 UV 가 263 nm 에서최대흡광을보였다. pale yellowish needles C 20H 28O [α] D (c 0.1, MeOH) HRESIMS m/z: Found , Calcd for C 20H 27O 11 1 H NMR (MeOD, 600 MHz): See table 1 13 C NMR (MeOD, 150 MHz): See table 화합물 2 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중소분획 E3-6 (136 mg) 로부터 HPLC (22% MeOH) 를수행하여흰색무정형분말형태의화합물 2 (14.8 mg) 을분리하였다. 화합물 2 는 UV 256 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 15H 20O 7 25 [α] D 16.5 (c 0.1, MeOH) IR (KBr) ν max (OH), 2933, 2878 (CH 2), 1883, 1615, 1518 (benzene ring) HRESIMS m/z: Found , Calcd for C 15H 20O 7Na 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 1 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz): See table 2 8

22 화합물 3 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중소분획 B3-6 (136 mg) 로부터 HPLC (22% MeOH) 를수행하여무색의결정의화합물 3 (8 mg) 을분리하였다. 화합물 3 은 UV 262 nm 에서최대흡광을보였다. A Colorless needles C 15H 20O 7 17 [α] D 57.4 (c 0.94, MeOH) IR (KBr) ν max 3440(OH), 1603, 1518, 964 HRESIMS m/z: Found , Calcd for C 15H 20O 7Na 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz): See table 1 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz): See table 화합물 4 의분리 n-buoh 분획을 HP-20 Diaion C.C. (MeOH 10% 100%) 를사용하여 5 개의분획 (B1 ~ B5) 으로나누어소분획 B2 를 MPLC NP (CHCl 3 : MeOH = 9:1 1:1) 를시행하여 14 개의분획으로나누고소분획 B2-11 에서 HPLC 를이용하여 (ACN 9%) 무색의결정형태인화합물 4 (2 mg) 를얻었다. 화합물 4 는 UV 237 nm 에서최대흡광을보였다. Colourless needles C 16H 24O [α] D 75.8 (c 1.3, MeOH) IR (KBr) ν max 3421, 1706, 1685, 1636, 1376, 1077 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 16H 23O 10 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 3 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 4 9

23 화합물 5 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-9 에서 HPLC (ACN 25%) 를이용하여흰색의무정형분말의화합물 5 (1.6 mg) 을분리하였다. 화합물 5 는 UV 238 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 16H 24O 9 17 [α] D (c 0.25, MeOH) IR (KBr) ν max 3426 (br), 2945, 2877, 1687, 1631, 1074, HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 16H 23O 9 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 3 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz): See table 화합물 6 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-3 에서흰색의무정형분말의화합물 6 (63.2 mg) 을분리하였다. 화합물 6 는 UV 237 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 17H 26O [α] D 82.7 (c 0.015, MeOH) IR (KBr) ν max 3421, 1706, 1685, 1636, 1376, 1077 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 17H 25O 10 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 3 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 4 10

24 화합물 7 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-12 에서흰색의무정형분말의화합물 7 (3.8 mg) 을분리하였다. 화합물 7 는 UV 220, 234, 293, 318 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 33H 44O [α] D 54.2 (c 0.71, MeOH) IR (KBr) ν max 3420(br, OH), 1700(conj. ester), (C=C), 1510(arom.ring). HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 33H 43O 18 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz): See table 5 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz): See table 화합물 9 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-2 에서 HPLC 정제를통해흰색의무정형분말의화합물 9 (36 mg) 을분리하였다. 화합물 9 는 UV 244 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 16H 22O 9 20 [α] D 237 (c 0.020, H 2O) HRESIMS, m/z: Found Calcd for C 16H 21O 9 IR (KBr) ν max (OH), 1700 (C=O), 1615, 1280, 1070, H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 6 13 C NMR (CD 3OD,100 MHz): See table 7 11

25 화합물 10 의분리소분획 B4 (4 g) 를 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 10:5:1) 을시행하여 10 개의분획으로나누고소분획 B4-1 (85 mg) 에서 HPLC (40% MeOH) 을이용하여흰색무정형분말형태인화합물 10 (5.0 mg) 를얻었다. 화합물 10 의 UV 는 237 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 17H 24O [α] D (c 0.1, MeOH) IR (KBr) ν max 3430 (OH), 1704 (C-G), 1630 (C-C) HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 18H 25O 12 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 6 13 C NMR (D 2O, 125 MHz): See table 화합물 11 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-2 에서 HPLC (30% MeOH) 을이용하여노란색시럽형태의화합물 11 (8 mg) 을분리하였다. 화합물 11 는 UV 239 nm 에서최대흡광을보였다. A yellowish syrup C 17H 26O 10 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 17H 25O 10 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 6 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 7 12

26 화합물 12 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-10 에서 HPLC (MeOH 40%) 를이용하여흰색의무정형분말의화합물 12 (3.0 mg) 을분리하였다. 화합물 12 는 UV 256 nm 에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 34H 46O [α] D (c 0.295, MeOH) IR (KBr) ν max 3393(OH), 1691, 1635, 1439, 1299, 1078, 1025 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 34H 45O 19 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz): See table 8 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 화합물 14 의분리소분획 B3을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-18로부터 Sephadex LH-20 (MeOH 100%) 를수행하여 8개의분획 (B ~ B3-18-8) 을얻었다. 그중 B3-18-2번분획을 HPLC (MeOH 35%) 를이용하여정제하여흰색의무정형분말의화합물 14 (1.1 mg) 을분리하였다. 화합물 14는 UV 240 nm에서최대흡광을보였다. A white amorphous powder C 20H 27NO [α] D (c 0.37, H 2O) IR (KBr) ν max 3326, 1720 (C=O), 1657, 1584 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 20H 26NO 11 1 H NMR (D 2O, 800 MHz): See table C NMR (D 2O, 200 MHz): See table 10 13

27 화합물 15 의분리소분획 B3 을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20 개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-12 에서 HPLC (ACN 15%) 를이용하여노란색분말의화합물 15 (0.9 mg) 을분리하였다. 화합물 15 는 UV 251 nm 에서최대흡광을보였다. A yellow powder C 28H 35N 2O [α] D -280 (c 0.95, MeOH) IR (KBr) ν max 3400(OH), 1734(C=O), 1650(C=O) HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 28H 35N 2O 11 1 H NMR (CD 3OD, 600 MHz): See table C NMR (CD 3OD, 150 MHz): See table 화합물 16 의분리소분획 B3을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 6:5:1) 를실시하여 20개의분획 (B3-1 ~ B3-20) 중 B3-18로부터 Sephadex LH-20 (MeOH 100%) 를수행하여 8개의분획 (B ~ B3-18-8) 을얻었다. 그중 B3-18-3번분획을 HPLC (ACN 9%) 를이용하여정제하여노란색분말의화합물 16 (6.5 mg) 을분리하였다. 화합물 16는 UV 239 nm에서최대흡광을보였다. A yellow powder C 22H 33N 3O 10 IR (KBr) ν max 3694, 3680, 2971, 2921, 2864, 1748, 1679, 1054, 1032, 1013 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 22H 34N 3O 10 1 H NMR (CD 3OD, 600 MHz): See table C NMR (CD 3OD, 150 MHz): See table 12 14

28 3.3. 섬괴불나무 EtOAc 분획으로부터화합물의분리섬괴불나무뿌리의 EtOAc분획을 NP C.C. (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 10:5:1) 로진행하여 11개의분획 (E1 ~ E11) 으로나누고소분획 E3 (350 mg), E5 (164 mg) 에서각각화합물 8, 13를얻었다 (Scheme 2). Scheme 2. Isolation of the compounds from the EtOAc fractions of L.insularis 화합물 13 의분리섬괴불나무뿌리의 EtOAc 분획을 NP C.C (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 10:5:1) 를실시하여 11 개의분획 (E1 ~ E11) 으로나누었다. 그리고소분획 E3 (350 mg) 로부터 sephadex LH-20 (MeOH) 을실시하여 6 개의분획 (E3-1 ~ E3-6) 으로나누었다. E3-1 에서 HPLC 를이용하여정제를하였다. 화합물 13 (8 mg) 은무정형분말형태로 UV 226, 230, 280, 308(sh) 에서최대흡광을보였다. A colorless amorphous powder C 32H 40O [α] D (c 0.1, MeOH) IR (KBr) ν max (OH), 1710, 1695(C=O), 1620(C=C), 1515 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 32H 39O 16 1 H NMR (CD 3OD, 800 MHz): See table 9 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 9 15

29 화합물 8 의분리섬괴불나무뿌리의 EtOAc 분획을 NP C.C (CHCl 3 : MeOH : H 2O = 50:5:1 10:5:1) 를실시하여 11 개의분획 (E1 ~ E11) 으로나누었다. 그리고소분획 E5 (164 mg) 로부터 sephadex LH-20 (MeOH) 을실시하여 4 개의분획 (E5-1 ~ E5-4) 로나누었다. E5-3 에서 HPLC 를이용하여정제를하였다. 화합물 12 (3 mg) 은무정형분말형태로 UV 222(sh), 235, 305, 325 에서최대흡광을보였다. A colorless amorphous powder C 26H 32O [α] D 30.5 (c 0.85, MeOH) IR (KBr) ν max 3300(OH), 1670, 1625, 1590, 1425, 1590, 1510, 1270, 1150, 1075 HRESIMS, m/z: Found , Calcd for C 26H 31O 13 1 H NMR (CD 3OD, 800 MHz): See table 5 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz): See table 5 16

30 3.4. 당분석화합물 1 (0.5 mg) 을 0.1N HCl (1 ml) 을넣어 100 C 로 2 시간중탕시켜가수분해한후포화 Na 2CO 3 수용액을이용하여중화시켰다. 또한, silica gel TLC 를이용해이동상 (n-buoh : acetone : pyridine : water = 10 : 10 : 5 : 5) 조건으로화합물의가수분해결과를확인하였다. 이어서 HPLC 분석을위해 thiocarbamoyl thiazolidine 유도체를합성하였다. 가수분해시킨화합물 1 과 D-glucose (2 mg), D-apiose (2 mg) 각각을 L-cysteine methyl ester hydrochloride (2 mg) 을 pyridine (100 μl) 에녹인후오븐 60 C 에서 1 시간동안반응시켰다. 그다음, o-tolyl isothiocyanate (100 μl) 를첨가하여오븐 60 C 에서 1 시간동안반응시켰다 (Tanaka et al., 2007). HPLC 분석은 Thermo Dionex Ultimate 3000 HPLC system 에서컬럼 YMC triart C18 column, 4.6 x 250 mm i.d. (YMC Co. Ltd., Japan) 을이용하였고액체크로마토그래피의이동상은 0.1% 포름산을포함한물 (A) 과 ACN (B) 를사용하여 1 ml/min 으로흘려주었고컬럼온도 25 C 에서분석을 시행하였다. 각시료는 10 μl 씩주입하였다. 이동상의 gradient 조건은 다음과같다 분 %B, 이후컬럼의 washing 을위하여 100% B 로 5 분간흘려주었다. 각시료로부터얻어진크로마토그램은 Chromeleon (version 6.8, Dionex Co., UK) 소프트웨어를이용하여 UV 피크의 retention time 과 UV spectrum 을비교하였다. 17

31 Table 1. 1 H NMR spectral data of compounds δ H in ppm (J in Hz) d (8.4) 7.25 d (8.5) 7.34 d (8.6) POSITION d (8.4) 6.72 d (8.5) 7.04 d (8.6) d (8.4) 6.72 d (8.5) 7.04 d (8.6) d (8.4) 7.25 d (8.5) 7.34 d (8.6) d (15.8) 6.56 d (15.8) 6.54 d (15.9) dt (15.8, 6.15 dt (15.8, 6.24 dt (15.9) 6.4) 6.4) , 4.28 dd (5.8, 4.48, 4.26 dd (7.0, 4.19 d (5.0) 12.2) 12.5) 1' 4.35 dd (7.8) 4.35 dd 4.91 dd 2' 3.21 m m m 3' 3.35 m m m 4' 3.28 m m m 5' 3.4 m m m 6' 4.00, 3.63 dd 3.87, 3.65 dd 3.88, 3.68 dd 1'' 5.04 d (2.0) 2'' 3.93 d 4'' 3.78, 3.99 d 5'' 3.6 s 18

32 Table C NMR spectral data of compounds POSITION δ c ' ' ' ' ' ' '' '' '' '' ''

33 Table 3. 1 H NMR spectral data of compounds 4-6 POSITION δ H in ppm (J in Hz) d, (4.3) 5.2 d, (5.7) 5.26 d s 7.38 s 7.39 s m m , 1.66 m 2.19, , 1.60 m t 1.87, t m m m m d, (6.9) 1.08 d, (6.7) 1.08 d CH3COO 3.64 s 1' 4.62 d, (7.9) 4.66 d, (7.9) 4.65 d 2' 3.15 m 3.19 m 3.19 m 3' m m m 4' m m m 5' m m m 6' 3.87, 3.63 m 3.89, 3.66 m 3.89, 3.64 m 20

34 Table C NMR spectral data of compounds POSITION δ c CH3COO ' ' ' ' ' '

35 Table 5. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c d (4.9) 5.3 d (5.2) s 7.36 s m 3.16 m , 1.88 m 2.34, 1.97 m m 5.25 m m 2.08 m m 2.18 m d (6.8) 1.02 d CH 3COO 3.69 s ' 4.66 d (6.3) 4.66 d (7.8) ' m m ' m m ' m m ' m m ' 3.86, 3.66 m 3.96, 3.66 m '' '' 7.28 s 7.2 s '' '' '' 7.17 s 6.79 d (8.2) '' 7.17 s 7.08 d (8.2) '' 6.46 d (15.9) 6.37 d (15.9) '' 7.63 d (15.9) 7.6 d (15.9) '' ArOCH s 3.85 s

36 1''' 4.96 d, (7.4) ''' m ''' m ''' m ''' m ''' , m

37 Table 6. 1 H NMR spectral data of compounds POSITION δ H in ppm (J in Hz) d 5.49 d 5.52 d d 7.41 d 7.45 d m m 2.96, 2.62 m 1.89, 1.66 m m 9.66 s 3.53 m m 5.72 m 5.75 m dd 2.7 m 2.62 m dt 5.26 dt 5.24 m CH 3COO 3.68 s 3.69 s 1' 4.67 d 4.66 d 4.67 d 2' 3.15 m m m 3' m m m 4' m m m 5' m m m 6' 3.88, 3.65 dd 3.88, 3.65 dd 3.89, 3.65 dd 24

38 Table C NMR spectral data of compounds POSITION δ c CH 3COO ' ' ' ' ' '

39 Table 8. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds 12 H C POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c d s m , 3.09 m dd m m , 5.37 d CH3COO 3.71 s ' 4.69 d ' 3.21 dd ' 3.33 m ' 3.33 m ' 3.33 m ' 3.63, 3.89 dd '' 5.48 d '' 7.46 s '' '' 4.05 m '' '' 9.21 s '' 5.56 m '' 2.59 m '' 5.03, 5.08 d '' CH3COO 3.58 s ''' 4.67 d ''' 3.21 dd ''' ''' 3.33 m ''' ''' 3.85 dd

40 Table 9. 1 H, 13 C NMR spectral data of compounds 13 H C POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c d (1.7) s m m , 4.27 m m m m ' 4.69 d (7.9) ' m ' 3.47 m ' m ' m ' 3.98, 3.72 m '' 4.78 d (1.5) '' 72 3'' m '' 5.02 dt (15.0, 9.7) '' 3.94 dq (9.9, 6.3) '' 1.15 d (6.3) ''' ''' 7.19 d (1.9) ''' ''' ''' 6.81 d (8.1) ''' 7.08 dd (8.2, 1.8) ''' 7.64 d (15.9) ''' 6.39 d (15.9) ''' ArOCH s

41 Table H, 13 C NMR spectral data of compounds 14 H C POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c s s , 4.83 d ddd , 2.26 m dd (3.7, 9.8) m m d (16.5) ' ' 3.28 m ' 3.5 dt (5.73, 18.53) ' 3.4 t (9.49, 9.49) ' 3.92, 3.72 dd (1.98, 12.34), dd(6.02,12.38) '' '' 3.95 d (8.06) '' 4.16 dq (12.4, 6.1) '' 1.48 d (6.0)

42 Table H, 13 C NMR spectral data of compounds 15 H C POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c d (15.3) dd (12.2, 5.0) , 3.02 m d (8.2) m dd (11.2, 4.2) d (7.9) , 2.22 m s , m m d (9.2) ' 4.79 d ' m ' m ' m ' m ' 4.00, 3.66 m CH 3COO 3.78 s

43 Table H, 13 C NMR spectral data of compounds 16 H C POSITION δ H in ppm (J in Hz) δ c s s m m m t (7.3) m m m CH 3COO 3.7 s ' 4.68 d (7.9) '' 9.41 s 197 2' '' ' 3.36 d '' 2.51 m ' 3.25 d '' 3.21 m ' d (11.0) ' dd 3.66 ( ) Guanidine

44 4. HT22 세포주에서 neuroprotection 활성검색 4.1. HT22 세포주배양및 glutamate 에의한독성저해활성검색용시약 Dulbecco s Modified Eagle s Medium (DMEM), Fetal bovine serum (FBS) Hyclone, UT, USA Penicillin and Streptomycin, trypsin Sigma, St.Louis, USA Sulfanilamide, N-1-naphylethylenediammine dihydrochloride and phosphoric aicd Sigma, St.Louis, USA 4.2. HT22 세포주의배양 HT22 세포주는건국대학교병원노인성뇌신경질환연구센터에서공급받아 10% FBS, 100 μg/ml penicillin and 100mg/mL streptomycin 을포함하는 DMEM 을배양액으로하여 37 배양기에서공기 (95%) 와 CO2 (5%) 의혼합기체를지속적으로공급해주며배양하였다. 세포가일정하게자라면 trypsin 을이용하여세포를배양용기에서분리한후 5.0 x 10 3 cells/well 로희석하여배양용기에이식하였다. 세포주는 2 일에한번씩계대배양하여사용하였다 Glutamate 에의한신경독성유도 HT22 세포를 5.0 x 10 3 cells/well 로희석하여 96 well plate 에 100 ml 씩 seeding 후 24 시간후시료를농도별로배양세포에처리하였다. 1 시간 후에 4 mm (final concentration) 의 glutamate 를처리하여세포독성을 유도하였으며, 15 시간후 MTT assay 로세포생존율을측정하였다 MTT assay 배양중인 HT22 세포의배양액에 MTT (5 mg/ml) 를배양액의 10% 가되도록가하고계속하여 1 시간더배양한후생성된 formazan 을 DMSO 로녹여낸다음 540nm 에서흡광도를측정하여세포의생존율을 측정하였다 31

45 4.5. 통계처리 통계적유의성을검토하기위해 Control 로부터의변동을 ANOVA test 에 의해판정하였다. P 값이 5% 미만일때통계적으로유의성이있다고 판정하였다. 32

46 B. 결과및고찰 1. 섬괴불나무뿌리에서의물질분리 1.1. 화합물 1 의구조분석화합물 1 은노란색결정으로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 20 개로나타나분자식 C 20H 28O 11 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.27 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-2,6), δ 6.74 (2H, d, J = 8.4 Hz, H-3,5) 에서 2 개의 doublet 을통해 para di-substituted benzene ring 의존재를확인하였고 δ 6.60 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7), δ 6.18 (1H, dt, J = 15.8, 6.4 Hz, H-8) 을통해이중결합이 trans - olefinic proton 을확인하여 p-coumaryl group 을확인할수있었다. 또한, anomeric proton 1 6 O-glycosidic linkage 를형성하여 5ppm 부근으로 down-field 된 δ 5.05 (1H, d, J = 2.2 Hz, H-1 ) 와 C-9 의영향으로 downfield 된 chemical shift δ 4.36 (1H, d, J = 7.8 Hz, H-1 ) 을통해당 2 개의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-1 ), δ (C-1 ) 을통해두개의 anomeric carbon 의존재와 quaternary carbon δ (C-3 ) 및이들의 HMBC correlation 을통해 apiose 가말단당으로결합된이당체의존재를유추하였다 (Prasad et al., 2000). 이당체의구성당을확인하기위해산가수분해로당분석을진행하였다. TLC (n-buoh : acetone : pyridine : water = 10 : 10 : 5 : 5) 상에서 D-apiose (R f: 0.7), D-glucose (R f: 0.4) 의존재를확인하였다. 그리고 HPLC 상의 UV spectrum 을비교하여 D-apiose (R t: min), D-glucose (R t: min) (ACN %, 30 min) 에서동일한 UV 피크를확인할수있었다. HMBC spectrum 으로 apiosyl group 의 δ 5.04 (H-1 ) 이 δ (C-6 ) 으로 correlation 을형성하였고 H-1 의 coupling constant (J = 2 Hz) 로부터 β-configuration 임을확인하였다. glucosyl group 의 H-1 이 p- coumaryl group 의 C-9 (δ 71.29) 와 HMBC correlation 을확인하였으며, H-1 의 coupling constant (J = 7.8 Hz) 로부터 glucose 의배열을 β-configuration 로결정하였다 (Prasad et al., 2000). 33

47 이상의결과를종합하여화합물 1 을 p-coumaryl 9-O-[β-Dapiofuranosyl(1 6)]-O-β-D-glucopyranoside 로동정하였다. < 1 H NMR (CD 3OD, 600 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 150 MHz)> Figure 2. 1 H, 13 C NMR spectra of compound 1 34

48 Figure 3. HMBC spectrum of compound 1 Figure 4. Sugar analysis of compound 1 35

49 1.2. 화합물 2 의구조분석화합물 2 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M+Na] + peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 15 개로나타나분자식 C 15H 20O 7 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.25 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-2), δ 6.73 (2H, d, J = 8.5 Hz, H-3) 에서 2 개의 doublet 을통해 para di-substituted benzene ring 의존재를확인하였고 δ 6.56 (1H, d, J = 15.8 Hz, H-7), δ 6.15 (1H, dt, J = 6.4, 15.8 Hz, H-8) 을통해이중결합이 trans-configured olefinic proton 을확인하여 p- coumaryl group 을확인할수있었다. 또한, anomeric proton δ 4.35 (H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. δ 4.48 (1H, dd, J = 7.0, 12.5 Hz, H-9), 4.26 (1H, dd, J = 7.0, 12.5 Hz, H-9) 로부터 9 번위치에당이연결된것으로 유추하였다. 이상의결과와 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와비교하여 화합물 2 를 salidroside I 로동정하였다 (Mizuno et al, 1991). 36

50 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz)> Figure 5. 1 H, 13 C NMR spectra of compound 2 37

51 1.3. 화합물 3 의구조분석화합물 3 은무색의결정으로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M+Na] + peak 를확인하고, 13 C NMR spectrum 에서탄소가 15 개로나타나분자식 C 15H 20O 7 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.34 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-2), δ 7.04 (2H, d, J = 8.6 Hz, H-3) 에서 2 개의 doublet 을통해 para di-substituted benzene ring 의존재를확인하였고 δ 6.54 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7), δ 6.24 (1H, dt, J = 15.8, 5.8 Hz, H-8) 을통해이중결합이 trans-configured olefinic proton 을확인하여 p-coumaryl group 을확인할수있었다. δ 4.19 (H-9) 의 split pattern 이화합물 2 와다른것으로확인되어, 화합물 3 의당의결합위치가다를것으로추론하였다. HMBC spectrum 에서 δ (C-4) 와 δ 4.88 (H-1 ) 의 glucose anomeric proton 과의 correlation 을확인하여 glucose 의연결부위를결정하였다. HMBC spectrum 에서 δ (C-4) 와 δ 4.88 (H-1 ) 의 glucose anomeric proton 과의 correlation 을확인하여 glucose 의연결부위를결정하였다. 이상의결과와문헌치를비교하여화합물 3 을 p-glucocoumaryl alcohol 로동정하였다 (Terashima et al., 1996). 38

52 < 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz)> Figure 6. 1 H, 13 C NMR spectra of compound 3 39

53 Figure 7. HMBC spectrum of compound 3 40

54 1.4. 화합물 4 의구조분석 화합물 4 는무색의결정으로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M- H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 16 개로나타나분자식 C 16H 24O 10 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.29 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton, δ 1.07 (3H, d, J = 6.9 Hz, H-10) 의 doublet 피크와 δ 5.24 (1H, d, J = 4.3 Hz. H-1) 의 acetal proton 을통해화합물 4 가 iridoid 골격의화합물임을유추하였다. 또한, δ 4.02 (1H, t, H-7) 로 hydroxyl 기와 anomeric proton δ 4.62 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 의 carboxylic acid 및 δ (C-7) 의 hydroxyl carbon 존재를 확인하였다. 또한 δ (C-3), δ (C-4) 의 olefinic carbon 을확인하였고 δ (C-1) 의 acetal carbon 을확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 4 를 loganic acid 로동정하였다 (Zhang et al., 2003). 41

55 < 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz)> Figure 8. 1 H, 13 C NMR spectra of compound 4 42

56 1.5. 화합물 5 의구조분석화합물 5 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 16 개로나타나분자식 C 16H 24O 9 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.38 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton, δ 1.08 (3H, d, J = 6.7 Hz, H-10) 의 doublet 피크와 δ 5.2 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-1) 의 acetal proton 을통해화합물 5 가 iridoid 골격의화합물임을유추하였다. 또한, 화합물 4 와비교하였을때 δ 1.19, 1.87 (H-7) 로 7 번위치에 hydroxy 치환기가부재함을확인하였다. Anomeric proton δ 4.66 (1H, d, J = 7.9 Hz, H- 1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ170.1 (C-11) 의 carboxylic acid 존재를확인하였다. 또한 δ (C-3), δ (C-4) 의 olefinic carbon 을확인하였고 δ (C-1) 의 acetal carbon 을확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 5 를 7-deoxy loganic acid 로동정하였다 (Teng et al., 2005). 43

57 < 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz)> Figure 9. 1 H, 13 C NMR spectra of compound 5 44

58 1.6. 화합물 6 의구조분석화합물 6 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 17 개로나타나분자식 C 17H 26O 10 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.39 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton, δ 1.08 (3H, d, H-10) 의 doublet 피크와 δ 5.26 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 을통해화합물 6 이 iridoid 골격의화합물임을유추하였다. 또한, δ 4.03 (1H, t, H- 7) 로 hydroxyl 기와 anomeric proton δ 4.65 (1H, d, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 의 carboxyl carbon 과 δ (CH 3COO) 의 methoxy carbon 을확인하였다. 또한, δ (C-3), δ (C-4) 의 olefinic carbon 을확인하였고 δ (C-1) 의 acetal carbon 을확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 6 을 loganin 으로동정하였다 (Prasad et al., 2000). 45

59 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 6 46

60 1.7. 화합물 7 의구조분석화합물 7 은흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 33 개로나타나분자식 C 33H 44O 18 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.44 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton, δ 1.1 (3H, d, J = 6.8 Hz, H-10) 의 doublet 피크와 δ 5.3 (1H, d, J = 4.9 Hz, H-1) 의 acetal proton 을통해화합물 7 이 iridoid 골격의화합물임을유추하였다. 그리고 anomeric proton δ 4.66 (1H, d, J = 6.3 Hz, H-1 ), δ 4.96 (1H, d, J = 7.4 Hz, H-1 ) 을통해두개의당의존재를확인하였다. δ 6.46 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7 ), δ 7.63 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8 ) 을통해 trans-olefinic proton 을확인하였고, δ 7.28 (1H, s, H-2 ), δ 7.17 (2H, s, H-5, 6 ) 의두 broad singlet peak 를통해 1,3,4-tri-substituted benzene ring 을확인하였다. δ 3.90 (3H, s, CH 3OAr) 로부터 benzene ring 에치환된 methoxy 그룹의존재를확인하였고 trans-feruloyl group 을결정하였다. 13 C NMR spectrum 에서는 δ (C-7) 으로부터화합물 4 와비교하여 7 번위치에치환된 acyloxy 그룹의영향임을유추하였다. HMBC spectrum 에서 δ 3.90 (3H, s, ArOCH 3) 와 δ (C-3 ) 의 correlation 을, δ 3.70 (CH 3COO) 는 δ (C-11), δ7.44 (H-3) 의 correlation 을확인하여 4 번위치에연결된 methylester 를확인하였다. 또한, δ 7.63 (H- 8 ) 은 δ (C-9 ) 의 acyl-co 와결합하고 δ 5.3 (H-7) 와 ester bond 로연결됨을확인하였다. 당의연결은 δ (C-4 ) 와 δ 4.97 (H-1 ) 의 correlation 으로 4 번위치에 glucose 의연결을확인하였고 δ (C-1) 와 δ 4.68 (H-1 ) 의 correlation 으로 iridoid 배당체를결정하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 7 을 periclymenoside 로동정하였다 (Calis et al., 1984). 47

61 < 1 H NMR (CD 3OD, 400 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 7 48

62 Figure 12. HMBC spectrum of compound 7 49

63 1.8. 화합물 8 의구조분석화합물 8 는무색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 26 개로나타나분자식 C 26H 32O 13 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.36 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton, δ 1.02 (3H, d, H-10) 의 doublet 피크와 δ 5.3 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 을통해화합물 8 이 iridoid 골격의화합물임을유추하였다. 그리고 anomeric proton δ 4.66 (1H, d, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. δ 6.37 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7 ), δ 7.6 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8 ) 을통해 trans-olefinic proton 을확인하였고, δ 7.2 (1H, s, H-2 ), δ 6.79 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-5 ), δ 7.08 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-6 ) 을통해 1,3,4-tri-substituted benzene ring 을확인하였다. δ 3.85 (3H, s, CH 3OAr) 로부터 benzene ring 에치환된 methoxy 그룹의존재를확인하였고 trans-feruloyl group 을결정하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 의 carboxylic acid 및 δ (C- 7) 으로 7 번위치에 carboxyl 기의연결을확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 8 을 7-O-E-feruloylloganic acid 로동정하였다 (Otsuka et al., 1996). 50

64 < 1 H NMR (CD 3OD, 800 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 8 51

65 1.9. 화합물 9 의구조분석화합물 9 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 16 개로나타나분자식 C 16H 22O 9 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.59 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.54 (1H, m, H-8) 의 methine, δ 5.28 (2H, dt, H-10) 의 exomethylene 및 δ 5.54 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 으로부터화합물 9 가 secoiridoid 골격임을확인하였다. 그리고 δ 1.71 (2H, m, H-6) 의 methylene 와 δ 4.36 (2H, m, H-7) 의 oxymethylene 의존재로부터환을형성한 secoiridoid 임을확인하였으며, anomeric proton δ 4.67 (1H, d, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 으로 11 번위치의 carboxyl 기를확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 9 를 sweroside 로동정하였다 (Prasad et al., 2000). 52

66 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 100 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 9 53

67 1.10. 화합물 10 의구조분석화합물 10 은흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M+HCOO] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 17 개로나타나분자식 C 17H 24O 10 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.41 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.72 (1H, m, H-8) 의 methine, δ 5.26 (2H, dt, H-10) 의 exomethylene 및 δ 5.49 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 으로부터화합물 10 이 secoiridoid 골격임을확인하였다. 그리고 δ 2.62 (1H, m, H-6b), 2.96 (1H, m, H-6a) 의 methylene 과 δ 9.66 (s, H-7) 로부터 aldehyde proton 을확인하였다. 또한, anomeric proton δ 4.66 (1H, d, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ169.4 (C-11) 의 carboxyl carbon 과 δ (CH 3COO) 의 methoxy carbon 을확인하여 11 번위치의 methylester 기를확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 10 을 secologanin 으로동정하였다 (Tietze et al., 1988). 54

68 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (D 2O, 125 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 10 55

69 1.11. 화합물 11 의구조분석화합물 11 은노란색시럽으로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 17 개로나타나분자식 C 17H 26O 10 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.45 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.75 (1H, m, H-8) 의 methine, δ 5.24 (2H, dt, H-10) 의 exomethylene 및 δ 5.52 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 으로부터화합물 11 이 secoiridoid 골격임을확인하였다. 그리고 δ 1.89 (1H, m, H-6a), δ 1.66 (1H, m, H-6b) 의 methylene 과 δ 3.53 (2H, m, H-7) 로부터 hydroxyl 기가연결된 oxymethylene 을확인하였다. 또한, anomeric proton δ 4.67 (1H, d, H-1 ) 을통해당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 의 carboxyl carbon 과 δ (CH 3COO) 의 methoxy carbon 을확인하여 11 번위치의 methylester 기를확인하였다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 11 을 secologanol 로동정하였다 (Mpondo et al., 1989). 56

70 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 125 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 11 57

71 1.12. 화합물 12 의구조분석화합물 12 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 34 개로나타나분자식 C 34H 46O 19 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서특징적으로쌍을이루어피크들이존재함을보였다. δ 7.53 (H-3), 7.46 (H-3 ) 의 tri-substituted olefinic proton 과 δ 5.75 (H-8), δ 5.56 (H-8 ), δ 5.30, 5.37 (H-10), δ5.03, 5.08 (H-10 ) 의 olefinic proton, δ 5.56 (1H, d, H-1), δ 5.48 (1H, d, H-1 ) 의 acetal proton, δ 3.71 (3H, s, H-11), δ 3.58 (3H, s, H-11 ) 의 methoxy 를확인하여화합물 12 가 secologanin dimer 골격을이루고있음을확인하였다. 또한, tri-substituted olefin proton 의 δ 6.71 (H-7) 를확인하고 δ 9.21 (1H, s, C-7 ) 의 aldehyde 를문헌에보고된 (Z)- aldosecologanin 의 aldehyde δ 10.2 와 (E)-aldosecologanin 의 aldehyde δ 9.22 를비교하여 E-form 으로존재함을결정하였다. 그리고 anomeric proton δ 4.69 (1H, d, H-1 ), δ 4.67 (1H, d, H-1 ) 을통해두개의당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11), δ (C-11 ) 의 carboxyl carbon 과 δ 52.8 (CH 3COO), δ (CH 3COO ) 의 methoxy carbon 을확인하여 2 개의 methylester 기를확인할수있었다. 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 12 를 (E)-Aldosecologanin 로동정하였다 (Machida et al., 2002). 58

72 < 1 H NMR (CD 3OD, 300 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 12 59

73 1.13. 화합물 13 의구조분석화합물 13 은무색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 32 개로나타나분자식 C 32H 40O 16 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.58 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.52 (1H, m, H-8) 의 methine, δ (2H, m, H-10) 의 exomethylene 및 δ 5.43 (1H, d, H-1) 의 acetal proton 으로부터화합물 13 이 secoiridoid 골격임을확인하였다. 그리고 δ (2H, m, H-6) 의 methylene 과 δ 4.34 (1H, m, H-7), δ 4.27 (1H, m, H-7) 의 oxymethylene 의존재로부터환을형성한 sweroside moiety 를확인하였다. 또한, anomeric proton δ 4.69 (1H, d, H-1 ), δ 4.78 (1H, d, H-1 ) 을통해당 2 개의존재를확인하였다. δ 1.15 (3H, d, J = 6.3 Hz, H-6 ) 의당내특징적인한개의 methyl 기를확인하여이당체의구성당으로 rhamnose 와 glucose 를유추하였다. 또한, δ 7.19 (1H, d, J = 1.9 Hz, H-2 ), δ 6.81 (1H, d, J = 8.1 Hz, H- 5 ), δ 7.08 (1H, dd, J = 8.2, 1.6 Hz, H-6 ) 으로부터 1,3,4-tri-substituted benzene ring 을확인하였고, δ 3.86 (ArOCH 3) 의 benzene ring 에치환된 methoxy 를확인하였다. 그리고 δ 7.64 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-7 ), δ 6.39 (1H, d, J = 15.9 Hz, H-8 ) 을통해 trans-configured olefinic proton 을확인하여 feruloyl 기를확인할수있었다. 13 C NMR spectrum 에서 δ (C-11) 의 carboxyl carbon 을확인하였다. Glucose 의 δ (C-6 ) 로부터 rhamnose 와의연결을 (C-6 in glucose: δ 63.5), rhamnose 의 δ 76.3 (C-4 ) 로부터 feruloyl 기와의연결을확인하였다. (C-4 in methyl α-rhamnoside: δ 73.9) 이상의결과를종합하여 1 H NMR, 13 C NMR spectrum 을문헌치와 비교하여화합물 13 을 kinginoside 로동정하였다 (Norio et al., 1993). 60

74 < 1 H NMR (CD 3OD, 800 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 75 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 13 61

75 1.14. 화합물 14 의구조분석화합물 14 는흰색의무정형분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 20 개로나타나분자식 C 20H 27NO 11 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.41 (1H, brs, H-3) 에서 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.54 (1H, d, H-1) 와 δ 5.16 (1H, dd, J = 3.7, 9.8 Hz, H- 7) 에서 2 개의 acetal proton 을확인하고, δ (1H, m, H-8), δ 5.36 (1H, d, J = 16.5 Hz, H-10a), δ 5.29 (1H, d, J = 11.5 Hz, H-10b) 로부터 mono-substituted vinyl 그룹을확인하여화합물 14 가 secoiridoid 골격임을확인하였다. 그리고 δ (1H, m, H-5), δ (1H, m, H-9) 의두 methine 과 δ (1H, m, H-6a), δ (1H, m, H-6b) 로 methylene 을확인하였고, anomeric proton 인 δ 4.83 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-1 ) 로당의존재를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서는 δ (C-1 ) 과 δ (C-11) 의 2 개의 carbonyl carbon 을확인하였으며, δ (C-4) 에서 quaternary olefinic carbon 을확인하였다. 또한, tri-substituted carbon 인 δ (C-7) 에서 threonine 기의아민기와말단의산소원자와 secoiridoid 골격에연결됨을유추하였다. 이화합물은특이적으로 threonine unit 이붙은 secoiridoid glycoside 로서 2D NMR data 로추가확인하였다. 1 H 1 H COSY spectrum 에서 δ 3.95 (H-2 ) 와 δ 4.16 (H-3 ) 의 correlation 을, δ 4.16 (H-3 ) 과 δ 1.48 (H-4 ) 의 correlation 으로 threonine 기의구조를확인하였다. ROESY spectrum 을통해 H-2 는 H-4 와 correlation 을이루었다. 또한, H-7 은 H-3, 5, 6 와의공명을증가시키는 correlation 을이루었다. 이상의결과를종합하여문헌치와비교하여화합물 14 를 L-threonine 이 secologanin 에결합한 threoninosecologanin 임을동정하였다 (Song et al., 2014). 62

76 < 1 H NMR (D 2 O, 800 MHz)> < 13 C NMR (D 2 O, 200 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 14 63

77 Figure H- 1 H COSY spectrum of compound 14 64

78 Figure 21. ROESY spectrum of compound 14 65

79 1.15. 화합물 15 의구조분석화합물 15 는노란색분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M-H] - peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 28 개로나타나분자식 C 28H 35N 2O 11 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.80 (1H, s, H-17) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.83 (1H, m, H-19) 의 methine, δ 5.36 (1H, m, H-18a), δ (1H, m, H-18b) 의 exomethylene 및 δ 5.89 (1H, d, H-21) 의 acetal proton 그리고 δ 3.78 (CH 3COO) 으로부터화합물 15 가 secologanin 골격임을확인하였다. 그리고 δ 2.42 (1H, m, H-14a), δ 1.22 (1H, m, H-14b) 의 methylene 과 δ 4.62 (1H, d, J = 15.3 Hz, H-3) 의 tri-substituted proton 을확인하고 δ 4.79 (1H, d, H-1 ) 의 anomeric proton 을통해당의존재를확인하였다. δ 7.79 (1H, d, J = 13.2 Hz, H-12), δ 7.46 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-9), δ 7.28 (1H, d, J = 8.2 Hz, H-10), δ 7.02 (1H, dd, J = 11.2, 4.2 Hz, H-11) 에서 1,2-di-substituted benzene ring 구조를확인할수있었다. 13 C NMR spectrum 에서는 δ (C-22) 의 carboxylic acid 을확인하였으며, δ (C-23) 의 carboxyl carbon 과 δ (CH 3COO) 의 methoxy carbon 을확인하였다. Tri-substituted carbon δ (C-3) 로부터 secologanin 3 번위치에질소원자와의연결을유추하였다. 또한, 앞서확인한 benzene ring 과함께 HSQC spectrum 으로확인한 quaternary carbon 인 δ (C-13), δ (C-2), δ (C-8), δ (C-7) 을통해 indole ring 구조를확인하였다. 1 H 1 H COSY spectrum 에서 δ 3.94 (1H, dd, H-5) 와 δ 3.45, 3.02 (m, H-6) 의 correlation 을확인하였다. 이상의결과를종합하여문헌치와비교하여화합물 15 를 tryptamine 이 secologanin 에결합한 5α-carboxystrictosidine 임을동정하였다 (Norio et al., 1992). 66

80 < 13 H NMR (CD 3OD, 600 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 150 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 15 67

81 Figure H- 1 H COSY spectrum of compound Figure 24. HSQC spectrum of compound 15 68

82 1.16. 화합물 16 의구조분석화합물 16 는노란색분말로 ESI-qTOF-MS 에서 m/z 의 [M+H] + peak 를확인하고 13 C NMR spectrum 에서탄소가 22 개로나타나분자식 C 22H 33N 3O 10 로예상하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 7.55 (1H, s, H-3) 의 tri-substituted olefinic proton 을확인하였고, δ 5.74 (1H, m, H-8) 의 methine, δ 5.28 (2H, m, H-10) 의 exomethylene 및 δ 5.57 (1H, s, H-1) 의 acetal proton 그리고 δ 3.7 (3H, s, CH 3COO) 으로부터화합물 16 이 secologanin 골격임을확인하였다. 그리고 δ 3.07 (1H, m, H-6a), δ 2.51 (1H, m, H-6b) 의 methylene 과 δ 6.84 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-7) 의 tri-substituted proton 을확인하였고, δ 4.68 (1H, d, J = 7.9 Hz, H- 1 ) 의 anomeric proton 을통해당의존재를확인하였다. δ 9.41 (1H, s, H- 1 ) 의 aldehyde proton 과 downfield 된 δ 6.84 (1H, t, J = 7.3Hz, H-7) 의 olefinic proton 의존재로 olefin-aldehyde 구조를확인하였다. 13 C NMR spectrum 에서는 δ 197 (C-1 ) 로 aldehyde carbon 을확인하였으며, δ 169 (C-11) 의 carboxyl carbon 과 δ (CH 3COO) 의 methoxy carbon 을확인하였다. 특징적인 δ 의 quaternary carbon 과 3 분자의 nitrogen 으로부터 guanidine 구조의존재를유추하였다 (Li et al., 2011). 1 H 1 H COSY spectrum 에서 δ 2.51 (H-3 ) 와 δ 3.21 (H-4 ) 의 correlation 을, δ 3.07, 2.51 (H-6ab) 과 δ 6.84 (H-7) 의 correlation 을확인하였다. HMBC spectrum 으로 C-3 에서 H-4, H-7 및 aldehyde proton 과의 correlation 을통해 aldehyde 기가 2 위치의 olefin carbon 에연결됨을확인하였고, H- 4 만이유일하게 guanidine carbon 골격과의 correlation 을이루는것을확인하였다. 1 H- 15 N HSQC spectrum 으로 guanidine 구조를확인하였다. 그결과, δ 7.52 ppm 의 proton 과 δ ppm 의 nitrogen 원소간의유일한 correlation 을 확인하였다. 표준품 4-guanidinobutyric acid 을동일한조건에서 1 H- 15 N HSQC spectrum 을측정하였을때도유사한위치 (δ 6.58 과 δ ppm) 에서 correlation 을확인할수있었다. 기존연구에따르면, dihydrofolate reductase 와 methotrexate 복합체의 1 H- 15 N HSQC spectrum 에서 69

83 arginine 곁가지의 amide proto 의 15 N chemical shifts 는 79.2 ppm 과 75 ppm 에서관찰되었다 (Gargaro et al., 1996). 또한, arginine 유도체인 herdmanine A 를 DMSO 에녹여측정한결과, guanidine 구조의 proton signal 은 9.29 ppm (s, NH) 과 7.20 ppm (brs, NH 2) 이보고되었지만 (Li et al., 2011), 화합물 16 의경우 9 ppm 의 proton signal 이관찰되지않아, terminal amine 가 2 개로치환된 guanidine 구조로함유하는것으로결정하였다. 이모든결과를종합하여화합물 16 을 argininosecologanin 으로 동정하였다. 70

84 < 1 H NMR (CD 3OD, 600 MHz)> < 13 C NMR (CD 3OD, 125 MHz)> Figure H, 13 C NMR spectra of compound 16 71

85 Figure 24. Figure H- 1 H COSY spectrum of compound 16 Figure 27. HMBC spectrum of compound 16 72

86 < 1 H- 15 N HSQC spectrum (DMSO, 800 MHz)> (6.58, 80.90) Figure H- 15 N HSQC spectrum of 4-Guanidinobutyric acid < 1 H- 15 N HSQC spectrum (DMSO, 800 MHz)> (7.52, 77.50) Figure H- 15 N HSQC spectrum of compound 16 73

87 Figure 30. Structures of the compounds isolated from L.insularis roots 74

88 2. HT22 세포주에서의신경세포보호활성섬괴불나무뿌리로부터분리한총 12 종의화합물을대상으로뇌신경세포보호활성을 mouse hippocampus 에서유래된 HT22 cell 을이용하여 glutamate 로세포사멸의유도를통해알아보았다. 3 종 (1, 5, 15) 은활성검색하기에양이충분하지않았기때문에실험을시행하지못하였다. 배양중인 HT22 세포에분리한화합물을각각 1, 10, 100 M 로전처리한후 1 시간뒤에 glutamate 를투여하여독성을유발한후, 18 시간뒤에 MTT assay 를통하여활성을평가하였다. Control 과비교하였을때모든화합물에서큰활성은없었지만화합물 3 과 10 이 20% 정도의 HT22 세포주에서뇌신경세포보호활성을나타내었다. 75

89 Table 13. Neuroprotective activities of compounds from L. insularis on HT22 cells injured by glutamate. cell viability (%) Compound 1 μm 10μM 100μM Control 100±1.29 Glutamate 33.84± ± ± 3.18* ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 3.30* ± ± ± ± ± ± 0.39 cell viability (%) compound 1 μm 10μM 100μM Control 100±1.20 Glutamate 36.61± ± ± ± ± ± 5.06* ± 6.71* ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± 1.01 HT22 cells were treated with samples at the concentration of 1,10 and 100 μm respectively. Samples were pretreated with 1, 10 and 100 μm 1hr before exposure to 4mM glutamate. Control was incubated with a vehicle alone. The cell viability was measured by MTT assay. Results are expressed as the mean ± S.D. of three independent experiments, each performed using triplicate wells. * p<0.05, ** p<0.005 and *** p<0.001 compared with control 76

90 Ⅲ. UPLC/MS 를이용한인동속식물의이차대사체분석 A. 실험재료및방법 1. 실험재료본연구에사용된섬괴불나무 (Lonicera insularis Nakai), 홍괴불나무 (Lonicera sachalinensis (F.Schmidt) Nakai), 괴불나무 (Lonicera maackii (Rupr.) Maxim.), 올괴불나무 (Lonicera praeflorens Batalin), 인동덩굴 (Lonicera japonica Thunb.), 구슬댕댕이 (Lonicera vesicaria Kom.) 의총 6 종의인동속식물의지상부, 지하부는 2015 년 7 월에서울대학교약학대학약초원에서채집하였다. Figure 31. Samples of Lonicera species 77

91 2. 시약및기기 2.1. 시약 실험재료의추출과시료제조시메탄올은 Dae Jung Pure chemical Eng. Co. Ltd., Korea 을사용하였고물은증류수를이용하였다. UPLC 분석에 사용한아세토나이트릴, 메탄올과물은 J.T. Baker 의 HPLC grade 용매 (Avantor Performance Materials. Inc., USA) 를사용하였고질량분석용 포름산은 Sigma Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서구입한것을사용하였다 기기 Centrifuge: Micro 17TR micro high speed centrifuge, Hanil, Korea Sonicator: Branson 8510, USA UPLC-QTOF MS system - Waters Acquity UPLC system, Waters Co., Milford, MA, USA - Column : Waters Acquity UPLC BEH C18, 2.1 mm x 100 mm, 1.7 μm - Waters Xevo G2 QTOF mass spectrometer, Waters MS Technologies, Manchester, UK Analytical balance: Mettler AE 50, Switzerland 3. 시료의제조시료의지하부, 지상부를나누어시료의건조중량의 10 배의 solvent 를넣어 80% MeOH 수용액으로만든후 90 분씩 3 회초음파추출하였다. 추출후에원심분리하여그상층액을 Sep-pak filter (Sep-pak plus C18 cartridges, waters, Ireland) 을이용하여 HPLC 용물을이용하여포화시킨후 HPLC 용물을사용해 6 번여과시킨후 HPLC 용 MeOH 로 6 번여과하여제조하였다. Sep-pak filter MeOH 여과물을최종농도 1mg/ml 로 UPLC/MS 측정용시료를제작하였다. 78

92 4. 기기분석방법 4.1. UPLC/MS 측정과분석액체크로마토그래피의이동상은 0.1% 포름산을포함한물 (A) 과 AcCN (B) 을사용하여유속 0.3 ml/min 로흘려주었고, 칼럼온도 40, 시료온도 20 에서분석을시행하였으며각시료는 2 μl 씩주입하였다. 이동상의 gradient 조건은다음과같다. 0-5 분 gradinet 5-12%B, 5-16 분 gradient 12-25% B, 분 gradient 25-45%B, 분 gradient 45-90% B, 분 isocratic 100% B, 이후분석시작상태이자칼럼평형상태를위하여 5% B 를 2 분간흘려주었다. 질량분석은 ESI source 로 negative mode 에서진행되었다. 분무기와보조가스로고순도질소가스, 충돌가스로아르곤가스를사용하였다. 질량분석범위는 m/z 로모세관전압은 2.0 kv, 샘플 cone 전압은 50 V 로조절하였으며, source 와 desolvation 온도는각각 120, 350 로정하였다. cone 가스와 desolvation 가스유속은각각 50 L/hour, 800 L/hour, 이온획득속도는 0.2 초로정하였다. 대사체규명단계를위하여 CID(collision-induced dissociation) 용조건으로 MS E 모드를사용하였고, 전구체이온을얻기위한낮은충돌에너지는 3V, MS/MS 조각정보를위한강한충돌에너지의 ramp 값은 40 에서 45 V 로설정하였다 (Zheng et al., 2009). 정확성확보를위한 calibration 물질로 sodium formate 를 사용하였으며, lock-mass 로 leucine enkephalin 을 5 μl/min 로흘려주며검출된값을동시적이면서도독립적으로보정하였다. 각시료로부터얻어진크로마토그램과질량분석데이터는 MassLynx (version 4.1, Waters Co., Milford, MA, USA) 소프트웨어를이용하여 in-house library 를제작하는데활용되었다. MarkerLynx XS (version 4.1, Waters Co., Milford, MA, USA) 로이용할피크를수집하였다. 시료표본의피크들은머무름시간, 질량대전하비 (RT-m/z) 로표시하고이온강도는면적값으로나타내었다. 머무름시간의범위는 3-24 분, 질량범위는 Da, XIC Window 는 0.01 Da 로설정하였고, 마커강도역치 10 으로시료간에같은머무름시간 ( 허용오차 0.20 분 ) 과질량대전하비 ( 허용오차 79

93 0.05 Da) 인피크는동일한이온으로수집되었다. 5% 높이에서의피크폭, 피크 - 피크 baseline noise 는피크의적분값에따라자동으로계산되도록 하였고, noise 제거수치는 50 으로설정하였다. 수집된각피크의 이온강도값은각분석내모든피크의이온강도합으로 normalize 하였다 다변량분석방법데이터와 NMR 데이터모두에대하여시행한주성분분석 (PCA, Principal Component Analysis) 는가장대표적이고기본적인다변량통계분석법으로, 차원을축소하여주성분을찾아내는 unsupervised 분석법으로경향성을파악하는데유용한방법이다 (Suberu et al., 2016). 본연구에서는 MassLynx 로프로세싱한데이터와 ID 된성분만을 변수로정한데이터로 PCA 를수행하여비교해본결과, 군집이 이루어지는경향의차이가없었다. PCA 결과군집을이루는지의여부를 확인한후, 섬괴불나무만의변인에서는 OPLS-DA (Orthogonal Partial Least Squares-Discriminant Analysis) 를추가로시행해다른군간의명확한 판별을재평가하였다. OPLS-DA 는종속변수로서각그룹의정보를 부여하여판별에기여하는변수의영향력을높이는 supervised 분석법이다 (Kim et al., 2014). OPLS-DA 의 loading S-plot 로부터각그룹간가장확연하게차이나는대상을추출하고자 cut off 수치를 covariance p[1] 0.1 이면서 correlation 의 p(corr)[1] 0.5 로정하였다. 이로부터확보한대사체는보다신뢰성있는검출을위하여 VIP (Variable Importance on Projection) 값이 1.2 이상임을확인하였다. 80

94 B. 결과및고찰 1. UPLC/MS 를이용한섬괴불나무의이차대사체분석 1.1. 대사산물의동정 UPLC-QTOF MS 로측정하여얻어진고해상도분자량, 머무름시간, MS/MS fragmentation 정보를바탕으로대사체를동정하였다. Elemental composition 을통해 tolerance 10 ppm 이내에서분자식후보를얻고화합물데이터베이스인 SciFinder 로부터인동속 (Lonicera) 에서해당분자식의물질이발견되는지확인하였다. Figure 에서대표적으로보여지는 MS/MS fragmentation 패턴과같이화합물을추정할수있었다. phenylpropanoid, phenolic acid, secoiridoid, iridoid 계열의 MS/MS fragmentation 패턴을보면 phenylpropanoid 계열은 MS 상 positive mode 에서 [M+Na] + 의형태검출되며, 당이떨어진매스값이확인되었다. Phenolic acid 계열은특이한 UV spectrum 236, 325 nm 에서봉우리가발견되며, caffeoyl 기와 caffeic acid 가떨어지는매스값이확인되었다. 이정보는본연구에서 LC-MS 을이용하여이계열을제외시키고분리실험을진행하는것에근거가되었다. Secoiridoid 계열은 formic acid 가붙은형태가주된 peak 로검출되었고, RDA 반응과당이떨어지는 fragmentation 을보였다. Iridoid 계열은 formic acid 가붙은형태가주된 peak 로검출되었고당이 떨어지는 fragementaiton 을보였다. 이러한방법과함께해당문헌을 참조하여동정되었고, 동일한분자식을가지면서유사한 fragment 패턴을 보이는성분들은문헌의용출순서와비교하여동정할수있었다 (Qi et al., 2009, Ren et al., 2008). 81

95 Figure 32. MS spectral data and fragmentation patterns of salidroside I Figure 33. MS spectral data and fragmentation patterns of di-caffeoyl quinic acid 82

96 Figure 34. MS spectral data and fragmentation patterns of secologanin Figure 35. MS spectral data and fragmentation patterns of loganin 83

97 1.2. 섬괴불나무의이차대사체 MS profiling 섬괴불나무추출물의대표적인 UPLC/MS 크로마토그램을 figure 36 에 나타내었다. 그결과 35 개성분이확인되었고 9 개의성분은이번 연구에서분리동정되었다. 섬괴불나무추출물에서 identification 된 대사체는 table 14 에나타내었다. 84

98 B A Figure 36. Representative BPI chromatograms of L.insularis A: root, B: stem 85

99 Table 14. Components that were identified from L. insularis No. Identity Classification t R, min Observed MS Calculated MS Error Molecular [M-H]- [M-H]- (ppm) formular 1 Loganic acid Iridoid C 16 H 24 O 10 2 Quinic acid derivative organic acid C 7 H 12 O 6 3 Loganic acid derivative Iridoid C 16 H 24 O 10 4 unknown unknown C 25 H 26 O 9 5 secologanic acid Iridoid C 16 H 22 O 10 6 Loganin Iridoid C 19 H 18 O 9 7 Sweroside Iridoid C 16 H 22 O 9 8 unknown unknown C 24 H 40 O '-O-β-D-Apiofuranosylsweroside Iridoid C 21 H 30 O Luteolin-7-O-β-D-glucopyranosyl- flavonoid C 27 H 30 O 16 (1 6)-glucopyranoside 11 unknown Iridoid C 18 H 28 O Secologanol Iridoid C 17 H 26 O 10 86

100 13 secologanin Iridoid C 17 H 24 O unknown phenyl propanoid C 22 H 32 O Kingiside iridoid C 17 H 24 O secologanin isomer Iridoid C 17 H 24 O Miscanthoside flavonoid C 21 H 22 O luteolin-7-o-glucoside flavonoid C 21 H 20 O unknown unknown C 33 H 44 O ,5-di-O-caffeoylquinic acid organic acid C 25 H 24 O ,4-di-O-caffeoylquinic acid organic acid C 25 H 24 O Miscanthoside isomer flavonoid C 21 H 20 O Cosmociin flavonoid C 21 H 20 O ,5-di-O-Caffeoylquinic acid organic acid C 25 H 24 O E-Aldosecologanin iridoid C 34 H 46 O grandifloroside iridoid C 25 H 30 O Hesperetin flavonoid C 16 H 14 O 6 28 Periclymenoside iridoid C 33 H 44 O O-E-Feruloylloganic acid iridoid C 26 H 32 O 13 87

101 30 luteolin flavonoid C 15 H 10 O 6 31 Lonitoside terpenoid C 21 H 34 O unknown unknown C 31 H 38 O unknown unknown C 25 H 32 O Kinginoside Iridoid C 32 H 40 O unknown Iridoid C 27 H 34 O Onjixanthone I Xanthone C 16 H 14 O 6 37 Diflavonoid Flavonoid C 30 H 18 O unknown unknown C 18 H 34 O 5 39 Diflavonoid Flavonoid C 30 H 18 O 10 88

102 2. 인동속식물에서의비교분석연구 2.1. UPLC/MS 를이용한 TIC peak area 비교분석섬괴불나무에서다른인동속식물들과구별되는특징적으로많은함량의 marker 화합물을파악하기위해 MarkerLynx XS (version 4.1, Waters Co., Milford, MA, USA) 로앞서 MS profiling 으로 identified 된주요성분들의피크를수집하였다. 인동속식물시료표본의 numbering 과이름을 table 15 에기재하였다. 시료표본의피크들은이온강도는면적값으로나타내고수집된각피크의이온강도값은분석내모든피크의이온강도합으로 normalize 되었다. 그결과, 동속식물의피크면적값으로비교분석을진행하였다. 시료표본들의각화합물의이온강도값의평균치를구하고그에대한백분율값으로나타낸후이온강도가 0 일때는 0, 1~50% 일때 --, 51~100% 일때 -, 100~200% 일때 +, 200~300% 일때 ++, 300% 초과일때 +++ 으로나타내었다. 결과적으로섬괴불나무에서 secoiridoid 계열이다른성분보다많음을파악하였다. Table 15. Sample numbers of Six Lonicera species No. Name No. Name 1 섬괴불나무지하부 7 올괴불나무지하부 2 섬괴불나무지상부 8 올괴불나무지상부 3 홍괴불나무지하부 9 인동덩굴지하부 4 홍괴불나무지상부 10 인동덩굴지상부 5 괴불나무지하부 11 구슬댕댕이지하부 6 괴불나무지상부 12 구슬댕댕이지상부 89

103 Figure 37. Mass spectrum of Lonicera species 90