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기화 국
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1 전문교육과정 ( 축산물잔류물질검사반 ) 농약검사 (LC 정량법 ) 국립수의과학검역원특수독성과가축위생연구사윤선종 ysj@nvrqs.go.kr 1. HPLC 가. 원리 나. 구성 2. 식육중잔류농약분석법 가. 카바메이트계

2 1. HPLC 가. 원리 혼합된성분이이동상과고정상사이를흐르면서흡착, 분배, 이온교환또는분자크기배재작용등에의해각각의단일성분으로분리되는것을말한다. 분리, 정성, 정량등의분석목적과분리, 정제, 분취목적에이용된다. LC 는이동상으로액체 ( 용매 ) 를사용하며이때시료는이동상에잘용해되면되므로분석시시료의분자량에상한선이없어고분자분석시에도사용된다. 또한상온근처에서분석되므로열에불안정한물질도분석이가능하며이온분석도가능하다. 분리는컬럼내고정상과흡착 / 분배 / 이온교환 / 분자크기배제등의과정을통해일어나며이동상도분리정도에영향을미친다. 분리모드가흡착 / 분배 / 이온교환일경우분자량 2000 까지분석이가능하고분자량이큰고분자인경우겔침투크로마토그래피를이용하여 10e7~10e8 정도의분자량까지분석이가능하다. 나. 구성 (1) HPLC Syste m의구성 HPLC System 을구성하는기본성분은다음과같다. l Pump 용매저장용기에서용매를끌어서시료주입기로밀어주는역할을한다 2 Inje ctor 분석하고자하는시료를주입하는곳이며또한컬럼으로보내기위한부분이다. 3 Column 다양한재질의용기내에충진제가채워져있으며시료성분들을각각의단일성분으로분리시켜주는곳이다.

3 4 De te ctor 컬럼에서분리되어나온시료성분의양에비례하게전기적인신호로바꾸어준다. 5 Data Syste m 검출기에서나온신호값을 Y축에, 시간을 X축으로하여크로마토그램을그려낸다. 6 Fraction Colle ctor 분리된성분을순수하게얻고자할때이용된다. ( 가 ) Solve nt De live ry Syste m(pump) Pump 의주요기능은이동상으로사용되는용매들을원하는비율로잘혼합하여균일하게섞이게한뒤시료주입기로밀어주는역할을한다. 이때펌프의성능이좋을수록즉일정한유속과압력이유지되어야실험결과의재현성을얻을수있다. 또한다양한용매를사용할수있어야그에따른다양한시료분석도가능하게된다. Pump의요건 일정한압력과유속유지 가동이쉽고다양한용매를사용할수있어야함 Pulse 방지를위한 syste m Isocratic에서 Gradient까지사용 내구성이우수 분석시이동상조성에따른분류 일정용매조성법 Isocratic mode로분석시간동안일정한조성을갖는이동상이흐르게된다. 구매용매조성법 Gradient mode 로분석시간동안용매의조성을여러가지형태로바꾸어줄수있다. - Low pressure gradient mode : 용매의조성을변화하기위해 2개

4 내지그이상의용매를섞는 mixer 가펌프앞부분에있으며이때용매는 low pressure 상태에서섞이게된다. - High pressure gradient mode : 분석시사용되는용매가각각의다른 high pressure pump 에연결되어있으며컬럼앞부분에연결된 mixer 에서즉 high pressure 상태에서용매는섞이게된다. ( 나 ) Inje ctor R heodyne inje ctor(valve inje ctor) 장점 : 신속하고 재현성 있는 결과를 얻을 수 있으며 주입시 분석자의 주입기술에따라발생하는주입량의오차를최소화할수있다 단점 : 다시료 주입량이 변할 때 마다 그 양에 맞는 loop 를 선택하여 설치하여야 한다. A utomatic inje ctor Free injecton 으로 실험실 생산성 향상 주입량에따른 오차가 거의 없음 - 재현성 우수 다양한기능을 자동화 - 온도조절, 희석, 시료전처리등 ( 다 ) Column 컬럼이란? 혼합성분을각각의단일성분으로분리시키는곳 시료성분들을효과적으로분리시키기위해서는시료와컬럼내고정상의화학적친화력을고려하여컬럼을선정해야한다. 충전제의재질 1 Silica HPLC 충전제로서가장많이사용한다. 물리적강도가높고 bonded phase 형태의충전물제작이용이함 극성에서비극성까지다양한용매사용가능 알카리용액에서 stability 가떨어짐, 일반적인 ph 범위는 2~8

5 2 Alumina silica 와물리적성질이유사함 분자량 Recommended pore size < ~10,000 > 10,000 ve ry large molecule 60A ~ ~10,000 non- porous 다양한 bonded phase 를만드는것이어려움 넓은 ph range 사용가능 3 Polymer(resin) 가교결합형의 styren-divinybenzene, bonded 또는 methacrylate 사용 Bonded phase 란? 실리카표면과유기실란을화학반응을시킴으로써얻어지는고정상 충전제의입자크기 입자크기는분석시컬럼에걸리는 back pressure 에영향을미치며 back pressure 는입자직경의제곱에반비례하게증가한다. 5μm : 높은분리효율과적합한작동압력을제공, 분석용컬럼으로가장많이사용됨 충전제의 Pore Size Small pore = high efficiency = less band boadening Non-Porous Paking : pore 내에서분자의확산이어려운분자량이아주큰화합물들을분리시사용됨 분리기작에따른분류 1 흡착작용 Functional group 의 polarity 에의한분리이다. 일반적으로 non-aqueous, non-polar solvent 를사용한다. polarity 가큰물질일수록용출되는속도가느려진다. 용출속도 : naphthalene < phenol 일반적으로 polar 한물질분석시 tailing 현상이크다.

6 2 분배작용 Bonded compound(c 18, C 8, CN, ph) 와분석물질간의상호작용에의한분리 비극성이큰 물질이 가장 나중에 용출된다. 현재가장 많이 이용되는 컬럼의 형태이다. 이온교환작용 이온화도의차이에 의해 분리가 일어난다. 고정상의 충전물 표면에 존재하는 + 전하 ( 또는 -전하 ) 와 반대의 전 하를 띠는 이온성 시료사이의 정전기적 인력에 의해 분리되는데 이동상의 이온성분과 경쟁적으로 충전제 표면에 부착되었다가 떨 어지므로 부착과 분리가 교대로 일어난다. ( 라 ) De te ctor 구비요건 Signal to noise ratio(s/n ratio) 가 높을 것 Noise, Drift가 적을 것 De tection limit 가 낮을 것 Flow rate, tempe rature, pre ssure 에 안정할 것 G rad ie nt 가가능할 것 사용목적에따라 선택성이 있을 것 De tector의 종류 Optical De tector - UV/Visible Detector UV-VIS 광의 흡수에 기본을 두고 있으며 이때 각 성분은 그들이 갖는 작용기의 종류나 주변환경에 따라 특정파장에 광선을 흡수하며 흡수정도는 시료농도의 양에 비례한다. - Fluorescence Detector 형광성을 갖는 시료에 대해 매우 선택적으로 또한 높은 감도로 분석이 가능케 하는 검출기이며 응용범위는 유도체화된 아미노산, carbamate, PAH, Vitamine(E), Riboflavin 등이며 UV-VIS 검출기에 비해 100배정도 감도가 뛰어나다.

7 - Refraceive Index Detector 이동상과시료 / 이동상과의굴절율의차이를측정하는것으로거의모든물질에사용할수있으나주로고분자, 당등의분석에사용되며 UV-VIS 검출기에비해 100배정도감도가떨어지며이동상의조성변화및온도그리고유속에매우민감하므로분석시온도및유속을일정하게유지해야하며또한분석시이동상조성이변하는 gradient mode 는사용이불가하다. Ele ctroch e mical De tector - Conductivity Detector 다른검출기에비해높은선택성과감도를제공한다. 이는주어진전극 / 전압의조합에의해단지좁은범위의화합물만이산화 / 환원반응을하기때문이다. 응용범위는 catecholamine, 뇌조직내신경전달물질의산화, phenolic compound 와쉽게산화되는무기착화합물등 - Electrochemical Detector 이온농도증가에따른전기전도도값을측정하는것으로양이온및음이온등의이온시료분석에사용된다. 전도도값은온도에매우민감하므로시료분석시온도를일정하게유지하여야안정한 baseline 을얻을수있다. 여러가지 De tector 의특징 구분 R I U V /V IS Fluorescence Electrochemical Conductivity Response universal selective selective selective selective Sensitivity (typical) Flow sensitivity T e m p e r a t u r e sensitivity M icrogram nanogram picogram picogram nanogram Yes No No Yes Yes Yes No No Yes Yes

8 2. 식육중잔류농약분석법 가. 카바메이트계 식육에 잔류하는 농약성분을 ace tonitril 로 추출한 다음 헥산으로 지방을 제 거하고 농축 건조하는 액상추출법 또는 식육과 C 18 (octade cylsilyl- de rivative d silica) 분말 2g 을 넣고 균질화한 뒤 활성화된 Florisil 이 들어있는 유리컬럼에 채우고 acetonitril 로 용출하는 시료고체상 분산처리법으로 전처리하여 post-column 유도체화시스템이 있는 액체크로마토그라프 / 형광검출기로 분 석한다. 이 방법은 식육중 잔류하는 카바메이트계 농약 (Carbaryl, carbof uran, Aldicarb, Bendiocarb, Ethiofencarb, Methiocarb, Methomyl, Propoxur) 의 잔 류검사에 이용할 수 있다. (1) 시약및기구 ( 가 ) Liquid-liquid extraction method( 액상추출법 ) n-he xane (HPLC 급 ), 무수황산나트륨, n-propanol( 시약특급 ) 분액여두 (125 ml, 500ml ), 원심분리기, 파스퇴르피펫 ( 나 ) M SPD me th od ( 시료고체상분산처리법 ) Florisil R ( Mesh, activated) C 18 pre p LC Packing(4 0 um) Glass mortar and pestle, glass syringe (10ml), Filter pape r(wh atman N o.1) ( 다 ) 공통 Carbamate 계농약표준품 (Accustandard Inc. 또는 Chemservice Inc) Methanol, NaOH( 시약특급 ), Acetonitrile(HPLC 급 ) O- Ph th alalde hyde (O PA, Pickering Lab. N o.o120 ) Thiofluor(Pickering Lab. No )

9 2-Mercaptoethanol(Merk) Sodium tetraborate decahydrate OPA diluent(pickering CB910) Hydrolysis reagent(pickering CB 130 또는 0.2% NaOH) Volumetric flask(10 ml, 100ml ), 원심관 (15 ml, 50ml ) 0.45 μm유기용매용주사기용필터, 둥근바닥플라스크 (125ml) 호모게나이저, 감압농축기 또는 N - E vap Column : Pickerring carbamate analysis C 18 (25m x 4.5mm, 5μm ) p/n HPLC with Post column reaction system and Fluorescence detector (2) 표준용액, 유도체화, 이동상시약제조 ( 가 ) 표준원용액 (10 0 μg / ml ) Accustandard Inc. 또는 Chemservice Inc 에서제조 생산된액상제품을사용하거나분말표준품을각각 10mg( 순도보정후 ) 취해 100 ml volumetric flask 에넣고 acetonitril 또는 methanol 10 ml를넣고완전히용해시킨다음 100ml가되게채운후 -20 에서보관한다. ( 나 ) 표준사용용액 표준원용액을원하는농도에맞게취해 acetonitril 또는 methanol 로최종용량을맞춘후에사용한다. ( 다 ) 유도체화시약 가수분해용 0.05N NaOH 3차증류수 25 ml가들어있는 500ml용병에 NaOH 1g 을넣는다. 잘흔들어서완전히용해시킨다음증류수로 500ml가되도록맞춘다. 0.45μm filterpaper 로여과, 탈기시킨후갈색병에보관하며사용한다. 제품화된시약 (Pickering CB 130) 을사용할수도있다.

10 유도체화용 OPA 용액 저장용완충액 19.1g의 sodium tetraborate decahydrate를 1l 의증류수에녹인다. 밀봉하여보관하면오랫동안사용할수있다. OPA 시약 50 mg의 O-Phthaldialdehyde 를 5 ml메탄올에천천히녹인후 500 ml병에옮긴다. 저장용완충액을사용하여 500ml까지채운다. 0.45μm필터페이퍼로진공여과, 탈기시킨다음 2-mercatoethanol 25 μl를첨가한다. 빛에노출되지않도록갈색병에넣거나병을알루미늄은박지로둘러싼다. ( 라 ) 이동상준비 Acetonitrile 을 0.5 μm filterpaper 로진공여과, 탈기시킨다. 3 차증류수는 0.45μm filterpaper 로진공여과, 탈기시킨다. 모든이동상병을 HPLC 에연결후분석하기전에이동상들을 100μl /min 의헬륨으로최소 30분동안탈기시킨다. (3 ) 검사방법 ( 가 ) 시료전처리 액상추출법 (Liquid-liquid extraction method) 1 근육시료 5±0.1g 취해 50ml원심분리관에담는다 2 50ml원심분리관에 acetonitrile 25 ml과무수황산나트륨 10g 을넣어균질화한다 rpm, 5분간원심분리 4 추출액을 125 ml분액여두에옮긴후 50ml원심분리관에다시 acetonitrile 25 ml을넣고잘흔들어서재추출한다음 3000rpm, 10 분간원심분리한다. 5 추출액이담긴 125 ml분액여두에 acetonitrile 포화헥산 25 ml를넣고진탕분배한다. 6 하층액을둥근바닥프라스크또는원심관으로옮긴다.

11 7 4 과정후재추출액을앞의 acetonitrile포화헥산이담긴 125ml분액여두에옮긴후진탕분배한다. 8 하층액을 6과정의하층액과합한다. 9 n-propanol 5ml을넣고감압건조한다. 10 acetonitrile과증류수를각각 1ml씩넣은다음 acetonitrile포화헥산 1ml을넣고진탕후 15 ml원심관에옮긴다 rpm, 5분간원심분리한다 12 하층을 0.45μm유기용매용 filter를주사기에넣어여과후 vial에담는다. 13 HPLC- 형광검출기-post-column 유도체화장치로분석한다. Fortif ie d sample s f or re cove ry Blank sample 5g을칭량하여 50ml원심관에넣은다음표준사용용액을첨가하여 2과정부터수행한다. 시료고체상분산처리법 (Matrix Solid Phase Dispersion Method) 1 식육 ( 근육 ) 0.5g을정밀히칭량하여활성화된 C 18 분말 2g 이있는유리유발에놓은다음 C 18 과근육을유발에서균질화될때까지잘간다 (30초-1분간, 2-3 회 ). 2 10ml 유리주사기맨밑에유리주사기직경과맞는디스크 2장을깔고그위로활성화된 Florisil 2.0g 을넣고다시디스크 2장을덮은다음그위에균질화시킨시료를넣은후위에같은크기의디스크 2장을다시올려놓는다. 3 주사기를이용해전체부피가 7.5ml 가되게압축시킨다. 4 주사기를컬럼걸이에걸고마개가있는 15ml 용 Test tube 를아래에위치시키고 acetonitrile, 8ml 를주사기에넣어주면서용출시킨다 ( 용출액약 5-6ml), 5 용출액을감압증발건조기 (Speed Vap ESC 2000, Savant, ) 에서거의완전건조시킨후 acetonitrile 1ml로용해시키고 0.45 μm acrodisc 로여과하여시료용액으로사용한다.

12 ( 나 ) 분석조건 칼럼 : Pickerring carbamate analysis C 18 (25m x4.5mm, 5μm ) 검출기 : 형광검출기 - AT : 16 - Gain : 10 - Excitation wavelength : 339nm - Emission wavelength : 445nm 용매 구배조건 시간 ( 분 ) Flow ( ml / min) %A ( 물 ) %B (ace tonitrile) Initial N NaOH flow rate = 0.5ml /min - OPA 시약 flow rate = 0.5ml /min - 용매헬륨 purge = 50~100ml /min - Post column reaction 온도 : 80 - column 온도 : 40 (4 ) 결과판정및계산 ( 가 ) 정성분석 시료를추출 정제한다음위의조건으로분석하여표준용액의분석결과와비교, 정체시간이일치할경우동일한물질로본다. ( 나 ) 정량분석 3~5개수준농도의표준용액을만들어분석하여농도와면적값으로 linear regression curve( 표준회귀곡선 ) 를작성한다.

13 y= mx + b y : 면적값 x : 표준용액의 농도 m : 검량선의 기울기 b : y 절편 fortified sample 을분석하여해당면적값표준회귀곡선에대입, 농도를산출하여첨가한농도에대비하여회수율을구한다. 시료를분석하여해당면적값을표준회귀곡선에대입하여농도를산출한다음회수율과희석배수등을보정하여최종농도를계산한다. 최종농도계산식 시료중검량선에서얻은잔류량 X 최종용액량 ( ml ) X 100 농도 (ppm) = 회수율 (%) X 시료량 (g) 간이계산식 : 한농도의표준용액을이용정량하는방법 시료중물질의면적값 X 표준물질의농도 ( μg / ml ) X 최종용액량 ( ml ) X 100 농도 (PPM) = 표준물질의면적값 X 시료량 (g) X 회수율 (%)

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Microsoft PowerPoint - d ppt [호환 모드] HPLC BASICS Chromatography 란? 혼합된시료성분이이동상과고정상사이를흐르면서흡착, 분배, 이온교환또는분자크기배재작용등에의해각각의단일성분으로분리되는것을말한다. 분리, 정성, 정량등의분석목적과분리, 정제, 분취목적에이용된다. Injection Interaction Elution a abacbc aabcbc HPLC System Mobile Phase