CHEMISTRY TOPICS 3 핵자기공명분광학 (NMR Spectroscopy) 의화학소재에의응용 고체 NMR 을이용한화합물의구조분석 (Solid-state NMR Structural Analysis of Chemicals) 김용애 한국외국어대학교화학과, yakim@hufs.ac.kr 서론 고체 NMR 의소개액체 NMR 스펙트럼은아주빠른등방성 (isotropic) 인공중제비 (tumbling) 에의해비등방성의 NMR 상호작용들 (anisotropic NMR interactions) 이모두평균화되기때문에아주좁은선들로나타나게된다. 그러나고체 NMR 스펙트럼의선들은아주넓은폭을가지게되는데이는배향에의존하는상호작용들즉, 화학적이동의비등방성 (Chemical shift anisotropy, CSA), 쌍극자커플링 (Dipolar Coupling), 사중극자커플링 (Quadrupolar Coupling) 등이모두스펙트럼에서나타나기때문이다. 고분해능의고체 NMR 스펙트럼은액체 NMR 스펙트럼에서와같은종류의정보를제공해줄수있다 [ 그림 1]. 그러나매직각스피닝 (magic-angle spinning), 교차편극 (cross polarization), 특별히고안된 2D실험, 보강된전자공학프로브 (probe electronics) 등과같은많은기법과장비가필요하다. 넓은폭을가지는 NMR 선모양은특정자리에대한공명선들의고분해능을방해하여단점이된다고생각될수도있지만실제는고체상에서의화학, 구조그리고동역학에관한많은정보를포함하고있다. 특히 CSA 와사중극자상호작용은주변전자구조와결합에대한통찰력을주기도하고쌍극자커플링은핵간의거리를직접잴수있게한다. 핵스핀값 (I), I=1/2 인핵들의경우에는화학적가리움상호작용의비등방성과두개나그이상의핵스핀쌍극자 Solution C NMR Solid State C NMR 150 100 50 0 ppm 그림 1. C 액체 NMR spectrum 과고체 NMR spectrum 의선폭비교. 1) 사이에커플링등두개의중요한비등방성상호작용이있다. 주로유기재료에존재하는 1 H, C, 15 N, 19 F등이있으며 29 Si, 31 P등은무기재료에서존재하나이영역에속하는핵종들이다. I 1인핵들은사중극자모멘트를갖기때문에이들의스펙트럼은핵에서의전기장기울기와사중극자와의상호작용에의해지배된다. 무기재료에서주로많이존재하는 6 Li, 7 Li, 11 B, 17 O, 23 Na, 27 Al 등의핵종은이영역에속한다. 고체 NMR 에서측정가능한시료는결정을이루지않은무정형의파우더시료뿐만아니라결정을포함하는배향된시료, 즉고분자 fiber, 액정 (LC), 유리질, 배향된지방질이분자층에서의세포막단백질등거의모든범위의시료가가능하다는것이장점이다. 24 화학세계 2015. 03
고체 NMR 을이용한화합물의구조분석 본론 1. 고분해능고체 NMR 스펙트럼 C이나 15 N같은농도가적고희박한핵스핀의고체 NMR 스펙트럼에서핵사이에비교적큰비등방성의 NMR 상호작용을최소화하고신호대잡음비 (S/N) 를증가시키기위해다양한방법들이개발되었다. 매직각스피닝 (Magic-angle spinning, MAS): 로터 (rotor) 를자장 B 0 에대해매직각도인상태에서빠르게스피닝함. 1 H과 19 F 같이쌍극접합상수 (dipolar coupling constant) 가 100 khz 가넘는 감마 (γ) 값이큰핵종들 에서는여전히제한이있기는하다. 현재, MAS 프로브는 70 khz 와 110 khz 의최고속도로스피닝할수있다. 희석도 (Dilution): 이런희박현상은 NMR 활성인동위원소들이자연에존재하는양이적고 ( C의경우자연에 1.108% 존재함.) 쌍극자상호작용은 r -3 에비례하기때문에주기율표에있는많은핵종에서자연적으로나타나게된다. 그러나, 1 H이나 19 F과의이핵종간쌍극자상호작용이없을때만고분해능스펙트럼이나타날수있다. 큰비등방성의화학적가리움효과 (anisotropic chemical shielding effects) 는또한심각하게넓은폭의스펙트럼에원인이된다. 다중펄스 (Multiple-Pulse Sequences): 펄스시퀀스로스핀연산자는그대로두면서가공의움직임을부과할수있다. 다중펄스시퀀스는아주흔한이핵종간디커플링 (decoupling) 과덜흔한동종핵종간디커플링둘다에사용할수있다. 1H NMR 스펙트럼의경우, CRAMPS(combined rotation and multiple pulse spectroscopy) 와같은아주복잡하고전자적으로요구되는펄스시퀀스를사용한다. 중요한 2D NMR 실험들도마찬가지다. 교차편극 (Cross Polarization): MAS 와함께 1 H, 19 F, 31 P 와같은농도가크고풍부한핵종들의편극 (polarization) 는 S/N 을증가시키고연이은실험사이에기다리는시간을줄이기위해서 C, 15 N, 29 Si 같은희박하거나드문핵종들로옮겨줄수있다. 2. Magic-Angle Spinning 쌍극자상호작용 (dipolar interaction) 과화학적가리움상호작용 (chemical shielding interactions) 은둘다 (3cos 2 θ-1) 항을포함한다. 용액상에서, 빠른등방성의공중제비는이공간인자를 0으로평균화한다.(sinθdθ) 로적분 ). 매직각스피닝은시료용기인로터의축을자장 B 0 대해매직각도 (54.74 ) 로놓아가공의운동이생기게한다. 이항은아래식이만족할때 0이된다. (3cos 2 θ-1)=0, θ=54.74 MAS 속도는반드시비등방성상호작용의크기가평균화되어 0이되는값과같거나커야만한다. 그림 2. 자장 B 0 의방향과시료가담긴로터의 magic angle. 1) 시료는아주미세하게가루로빻아로터안에잘다져넣고로터의크기와종류및원하는실험의종류와프로브의사양에따라 70 khz 까지스핀할수있다. 만일시료가비등방성상호작용의크기보다적은속도로스핀하면스피닝속도 (Hz 단위 ) 로분리된다수의스피닝사이드밴드 (spinning sidebands, SSB) 가나타난다. 그림 3. 200MHz NMR 에서다양한스피닝속도로측정한 31 P NMR 스펙트라. 등방성 (isotropic) 의중심선은스피닝속도가달라도같은위치에남아있어쉽게알수있다. 해당자장에서비등방성상호작용은 40,000 Hz 임. 1) 2015. 03 화학세계 25
비등방성상호작용의선폭보다낮은 MAS 속도에서도신호는정적 (static) NMR 스펙트럼에서처럼전체선폭에넓게퍼져있지않고스피닝사이드밴드에위치하게된다. MAS 스펙트럼에서신호대잡음비는더많은스캔수에도불구하고정적스펙트럼에서보다아주훌륭함에주목해야한다. 3. 교차편극 (Cross Polarization) 교차편극은고체 NMR 에서가장중요한기법중의하나이다. 이기법에서 1 H이나 19 F같은풍부한핵스핀으로부터편극을 C나 15 N같은희박한핵스핀으로옮길수있다. 전체적인효과는신호대잡음비 (S/N) 를증가시키는것이다. 다. 그래서약어로 CPMAS NMR(Cross Polarization Magic-Angle spinning NMR) 이라부른다. 4. CP MAS NMR 실험고체 NMR 실험에서가장중요한주제는고분해능이다. C CP MAS NMR 실험의경우, 다양한펄스기법을사용해 1 H 디커플링의효율을높이면고분해능의스펙트럼을얻을수있다. 가. 교차편극은잠재적으로 γ I /γ S 요소로희박한스핀의신호를증가시킨다.(I 는풍부한핵스핀이고 S는희박한핵스핀이다.) 나. 풍부한스핀은강하게쌍극자결합을하기때문에움직임의결과로크게출렁이는자기장하에놓이게된다. 이는풍부한핵에서빠른스핀-격자이완을유도하게된다. 마지막결과는느리게이완하는희박한핵종이이완하도록기다릴필요가없는결과를가져오고오히려펄스간반복시간은프로톤 (proton) 이나플루오린 (fluorine) 의 T 1 에의존하게된다. 그림 5. 사이클로스포린 (Cyclosporin) A 파우더의 C CP MAS 스펙트럼으로 500 MHz NMR 에서 TPPM 디커플링 (decoupling) 을사용하고 u r =33.3 khz 임. 3) 복잡한 C CP MAS 스펙트럼을규명 (assignment) 하기위해서는 CH 3,CH 2,CH, 그리고 quaternary carbons 을구별할수있는 spectral editing methods 을쓰면많은도움이된다. 그림 4. 교차편극 (Cross Polarization) 펄스시퀀스로편극 (polarization) 는스핀잠금기간 (spin locking period, the contact time) 동안옮겨지고 π/2 펄스는프로톤 (proton) 에만가한다. 1) 교차편극은서로짝지은쌍극자들을필요로하고시료가매직각도에서빠르게스피닝하고있는동안에도잘일어난 그림 6. L-Histidine.HCl 의 1D 스펙트럼으로 SS-APT 펄스를사용해 CH 3,CH 2,CH 등을구분하였음. * 는 spinning sidebands 임. 4) 26 화학세계 2015. 03
고체 NMR 을이용한화합물의구조분석 1D C CP MAS 는고체 NMR 에서아주다양한응용범위의시료에흔히사용하는실험으로몇가지예로는석탄, 콜크, 다당류, 의약, 블렌딩된고분자, 토양등이있다. 고체 NMR 스펙트라에서화학이동 (chemical shift) 은액체 NMR 에서처럼화학구조 (chemical structure) 에의존하기도하지만입체구조 (conformation) 와형태 (morphology) 에도의존하기때문에스펙트럼을해석하는데어려운점이있다. 반결정성 (Semicrystalline) 고분자의경우결정질 (crystalline) 과비결정질 (amorphous), 그리고계면상 (interfacial phases) 로부터의시그널 (signal) 을분리하기위해 안 MAS 와 high-powered decoupling 을사용하였다. CP 스펙트럼에서가장큰피크 (peak) 는전트렌스형태 (alltrans conformation) 에서결정질폴리에틸렌 (crystalline polyethylene) 에귀속된 33.6 ppm 이고 2.5 ppm 더높은 field 쪽에있는 broad shoulder 는비결정질재료 (amorphous material) 에귀속된다. CP실험에서시료는결정질상이우세함을나타내고직접편극스펙트럼에서는스펙트럼강도 (spectral intensity) 의절반이상이비결정질로아주다른결과가관측된다. 고체 NMR 스펙트라 (spectra) 에서피크강도의아주간단한비교는스펙트라를분석하는데아주주의를기울여야함을보여준다. 고체상에서일부고분자 (polymers) 의긴 T 1 은반전회복펄스시컨스 (inversion-recovery pulse sequence) 를이용해서측정하기는어렵다. T 1 값은 [ 그림 8] 에서보듯이교차편극에기반을둔실험을사용해서가장효율적으로측정할수있다. 6) 서는각상에서분자동역학 (molecular dynamics) 과완화시간 (relaxation times) 이다르다는점을이용하는게필요하다. 고체 NMR 스펙트럼에서사슬형태 (chain conformation) 의효과는교차편극 (cross polarization, CP) 과직접편극 (direct-polarization, DP) 실험으로얻은폴리에틸렌 (polyethylene) 의탄소스펙트럼 (carbon spectrum) 으로 [ 그림 7] 에나타내었다. 그림 8. Dipolar dephasing 을위한펼스시퀀스그림 5) 고분자사슬형태가고체 NMR 에서의화학이동에큰영 향을끼치긴하지만또다른요인도탄소화학이동 (car- (b) c a bon chemical shifts) 에영향을줄수있다. [ 그림 9] 는폴리프로필렌 (polypropylene) 의 7) α와 β결정형 (crystalline forms) 에대한탄소스펙트라 (carbon spectra) 를비교해서보여준다. 두개결정형은 tgtgtg (a) 형태를가지므로탄소프펙트럼 (carbon spectrum) 에서의 60 50 40 30 20 10 0 Carbon Chemical Shift (ppm) 그림 7. 교차편극 (Cross polarization) 를하지않고 (a), 하고 (b) 얻은폴리에틸렌의 C 탄소고체 NMR 스펙트라 5) (a) 두경우에 line narrowing 을위해 acquisition 하는동 (b) 30 20 10 0 Carbon Chemical Shift (ppm) 그림 9. 폴리프로필렌 (Polypropylene) 의 αform(a) 과 βform(b) 의 CP/MAS 스펙트라 5) 2015. 03 화학세계 27
차이는 chain packing effects 로부터발생한다. 메틸 (Methyl) 과메틴탄소 (methine carbons) 에서 2:1 의강도비율은 α형결정구조 (α-form crystal structure) 에서동등하지않은 sites 의수와일치한다. 탄소 NMR이준결정성고분자 (semicrystalline polymers) 를연구하는데주로사용되긴하지만많은다른핵종들도사용될수있다. 실리콘 (Silicon) 은탄소와감도가비슷하고넓은화학이동분포를가진다. [ 그림 10] 은곁사슬 (side-chain) 의길이가다른 di-nalkyl silane 의실리콘 NMR 스펙트럼을보여준다. 실란 (Silane) 의두가지결정형이주로관측되고이는잘배열된 Form I과더높은온도에서무질서곁사슬 (disordered sidechain) 을가지는 Form II 이다. 5) 모든경우에 disordered Form II 시그날은 -23-24 ppm 근처에서나타난다. 결정질고분자 (Crystalline polymer) 에서실리콘의완화시간은아주길어서스펙트라는종종 CP/MAS 를이용해서가장효과적으로얻을수있다. 비결정질고분자 (Amorphous polymers) 의고체 NMR 스펙트라는자기환경 (magnetic environments) 이더헤테로지니어스 (heterogeneous) 하기때문에, 일반적으로결정질고분자만큼잘분리되어얻을수없다. 비정질상 (Amorphous phase) 에서고분자는 NMR timescale 에서빠르게전환가능하지않은다양한형태로존재한다. 그래 (a) (b) (c) Ⅰ Ⅱ Ⅱ Si Si Ⅱ R R Poly (dialky silane) -15-25 -35 Slicon Chemical Shift (ppm) 그림 10. Poly(di-n-hexyl silane) (a) 과 poly(di-n-pentyl silane) (b) 그리고 poly(di-n-butyl silane) 의실리콘고체 NMR 스펙트라 5) Ⅰ Ⅰ R R 서γ-비대칭의효과 (gauche effect) 로인해화학이동에서분포를가지게되고탄소스펙트럼에서상대적으로확장된선 (broad lines) 을가지게된다. 이브로드닝 (broadening) 은고자장이나고온에서실험을수행해도많이줄어들지않는다. 분자동역학은유리질상태 (glassy state) 에서제한되고시그날은 CP/MAS 를사용해서가장효과적으로관측할수있다. * d * 200 150 100 50 0-50 Slicon Chemical Shift (ppm) 그림 11. Poly(n-butyl methacrylate) 의탄소 CP/MAS 고체 NMR 스펙트럼 5) [ 그림 11] 은 poly(n-butyl methacrylate) 의탄소 NMR 스펙트럼을나타내고적당한분해능을보여준다. 176 ppm 에서카보닐피크 (carbonyl peak) 는모든다른주사슬과곁사슬의피크들로부터잘분리되어나타난다. 주사슬메틸렌피크 (methylene peak) 는다른시그날보다더브로드해서연쇄역학 (chain dynamics) 가적절하지않음을나타낸다. 곁사슬의메틸렌탄소 (methylene carbon) 들의라인들은주사슬의것보다선명 (sharp) 하여모든피크들이잘분리되었다. 5) C 보다는덜하지만 15 N, 29 Si은재료과학과지구과학재료에많이사용한다. 31 P는유리재료를연구하는데많이사용한다. 또한 C T 1 과 1 H T 1ρ 같은스핀- 격자이완시간의측정도간단한실험이지만많은정보를제공해줄수있다. 빠른이완시간은분자운동성이증가하기때문이다. e b a f,g h c 28 화학세계 2015. 03
고체 NMR 을이용한화합물의구조분석 오늘날, 고체 NMR 자장의세기는 900 MHz(21.2 Tesla) 까지가능하며 Hz 단위의좁은선폭의공명선을얻는게가능해졌다. 공명선의분해능은더높은 B0의자장에서더높아진다. 5. 동종핵종간 2D 고체 NMR 실험고체 NMR 에서도 2D NMR 스펙트럼은많은의미를포함하고있다. 유기분자에서골격의연결 (backbone connectivity) 을찾아가는것은직접결합된탄소들사이에서 2D peaks 들이관측되는동종핵종간 C- C 2D 연계 (correlation) 실험으로공간에서가까이있는 C 핵종들사이에통일성트랜스퍼 (coherence transfer) 가일어나게하는게가능하다. 이실험은주로완전히또는부분적으로 C으로농축시킨시료에서가능하다. 나는 1 H- C WISE(wideline separation) 실험이다. 2D C- 1 H WISE 실험은단단하고 (hard) 부드러운 (soft) 성분들이섞여있는 multiphase 의구조와이질적역학 (heterogeneous dynamics) 를갖는폴리머를연구하는데널리사용된다. [ 그림 ] 은약물이나유전자전달, 치료, 의학적이미징에서널리사용되는 Chitosan-based NP(nanoparticle) 의 2D WISE 스펙트럼이다. 효과적인생물학적적용을위한나노구조의크기와계면, 내부구조, 동역학 (dynamics) 을연구하기위해고체 NMR 실험을진행한다. A B C 그림. Chitosan-based NP 의합성과정과상온에서 400 MHz 고체 NMR 로 25 KHz MAS 하여얻은 2D C- 1 H WISE contour 스펙트럼 10,11) 그림 12. C 과 15 N 로표지된 YadA-M 의고체단백질시료를 275K 온도에서 900 MHz 고체 NMR 로얻은 2D C- C 연계 (correlation) 스펙트럼 9) (a) aliphatic 영역 (b) 카보닐 (carbonyl) 영역으로 YadA-M 의화학이동 (chemical shift) 규명이가능하다. 6. 이핵종간 2D 고체 NMR 실험가장간단한 2D 이핵종간연계실험 (HETCOR) 중의하 각성분들은 F 1 축에서측정된 1 H wide-line 스펙트럼에의해구분이된다. rigid 한성분들은확장된 (broad) 선폭을갖고, mobile 한성분들은축소된 (narrow) 선폭을나타낸다. F 2 축에서의 C 화학이동들은각화학적조성들을나타내고스펙트럼상에서가장넓은선폭을갖는 PAPBA 가매우 rigid 한성분이라는것을알수있다. 또한, 지방질이분자층에존재하는세포막단백질의 3차구조를고체 NMR 로연구하는것은회절연구로는불가능하기때문에큰관심거리이다. 배향된시료로서세포막단백질의고체 NMR 스펙트럼 2015. 03 화학세계 29
은파우더시료보다훨씬더간단해진다. 완전히배향되면모든구조적으로동일한핵들은 B 0 에대해모두같은배향을가지게되고, 같은비등방성공명선을보이게된다. 이런현상은 PISEMA(polarization inversion with spin exchange at the magic angle) 실험에서관측된다. a b 200 150 200 150 15N shift (ppm) 그림 14. (a) 배향된지방질이분자층에서균일하게 15 N 로표지된폴리펩타이드의 2D PISEMA 스펙트럼 (b) 12 기울어진 helix 에해당하는모사스펙트럼 12~) 15 N 화학이동축에서각각의 15 N은해당하는 15 N- 1 H 쌍극커플링 (dipolar coupling) 값을가지고두값은특정 N 의배향각도에의존하므로지방질이분자층수직면에대한폴리펩티드헬릭스 (polypeptide helix) 의기울어진각도 8 6 1H-15N coupling (khz) 를구할수있다. 이실험은배향된액정시료와세포막의특성을연구하는데도사용할수있다. 결론고체 NMR 은수 mg정도의소량의파우더시료만있으면다양한실험을수행할수있고, 전처리과정이없어온전하게시료회수가가능한비파괴적인시험분석법이다. 14~20) 회절기법에서와같이결정시료를만들필요가없지만분자의국지적인환경정보를얻을수있고, 핵종간의거리를측정할수있고 (dipolar recoupling 기법 ) 동역학적인과정을연구하는데도사용되며이형동질체제형 (polymorphic forms) 을관찰할수도있다. 특히최근에는 NMR Hardware 와새로운펄스기법의발달로 1 H 고체상 NMR 도측정이가능해졌다. 주기율표에서 NMR 활성인대부분의핵종들은더높은자장과혁신적인펄스시퀀스들그리고향상된일렉트로닉스 (electronics) 와컴퓨터그리고더나은프로브의개발로인해고체 NMR 의녹지않는다양한화학소재에의응용이더욱다양해졌다. 참고문헌 1. Schurko, R. In Introductoty Solid State NMR Notes, from Rob Schurko s Website, http://mutuslab.cs.uwindsor.ca/schurko/ssnmr/ssnmr_schurko.pdf 2. Mirau P. A.; in A Practical Guide to Understanding the NMR of Polymers, Mirau P. A. ed., John Wiley & Sons Inc., 2005, Chapter 4 3. Frey, M. H.; Opella, S. J.; Rockwell, A. L.; Gierasch, L. M. J. Am. Chem. Soc., 1985, 107, 1946 4. Gomez, M. A.; Tanaka, H.; Tonelli, A. E. Polymer (British), 1987, 28, 2227. 5. Mirau P. A. in A Practical Guide to Understanding the NMR of Polymers, Mirau P. A. ed., John Wiley & Sons Inc., 2005, Chapter 4 6. Frey, M. H.; Opella, S. J.; Rockwell, A. L.; Gierasch, L. M. J. Am. Chem. Soc., 1985, 107, 1946 7. Gomez, M. A.; Tanaka, H.; Tonelli, A. E. Polymer (British), 1987, 28, 2227. 8. Bovey, F. A.; Schilling, F. C. In Solid State NMR of Polymers, Mathias, L. J., ed., Plenum Press, New York, 1991, 295 pp 9. Shahid, S. A.; Markovic, S.; Linke, D.; Rossum, B-J. Scientific Reports, 2012, 2, 803. 10. Wang, F.; Zhang, R.; Wu, Q.; Chen, T.; Sun, P.; Shi, A-C. ACS Appl. Mater. Interfaces, 2014, 6, 297. 11. Martínez, J. M. L.; Chattah, A. K.; Sánchez, R. M. T.; Buldain, G. Y.; Dall Orto, V. C. Polymer 2012, 53, 1288. 12. Marassi F. M.; Opella S. J. J. Magn. Reson., 2000, 144, 150.. Kim Y.; Valentine K.; Opella S. J.; Shendel S.L.; Cramer W. A. Prot. Sci., 1998, 7, 342. 14. Li, G. H.; Kim, S. H.; Cho, C. G.; Park, T. J.; Kim, Y. Macromolecular Research, 2006, 14, 504. 15. Park, J. J.; Kim, K. W.; Park, T. J.; Park, E. W.; Kim, Y. Analytical Science, 2006, 22, 64.5 16. Park, T. J.; Kim, S. H.; Li, G. H.; Cho, C. G.; Kim, Y. Macromolular Symposia, 2007, 249, 466. 17. Park, T. J.; Kim, J.; Kim, T. K.; Park, H.; Choi, S. S.; Kim, Y. Bull. Korean Chem. Soc., 2008, 28, 2459 14. 18. Park, T. J.; Choi, S. S.; Kim, Y. Bull. Korean Chem. Soc., 2009, 30, 149. 19. Park, T. J.; Ko, D. H.; Kim, Y. J.; Kim, Y. Bull. Korean Chem. Soc., 2009, 30, 2007. 20. Park, T. J.; Kim, J. S.; Um, S. H.; Kim, Y. Bull. Korean Chem. Soc., 2010, 31, 118. 30 화학세계 2015. 03