(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) A01H 4/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2007-0053803 (22) 출원일자 2007 년 06 월 01 일 심사청구일자 (56) 선행기술조사문헌 2007 년 06 월 01 일 논문 :The journal of horticultural science&biotechnology* 논문 : 식물생명공학회지 논문 :Plant cell, tissue and organ culture KR100270574 B1 * 는심사관에의하여인용된문헌 (45) 공고일자 2008년10월29일 (11) 등록번호 10-0865680 (24) 등록일자 2008년10월22일 (73) 특허권자 재단법인제주하이테크산업진흥원 제주제주시아라 1 동 4-8 번지 (72) 발명자 김경문 제주제주시노형동 756 부영아파트 501 동 806 호 윤필용 제주제주시아라 1 동 4-8 제주하이테크산업진흥원 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 김형준 전체청구항수 : 총 3 항심사관 : 이충호 (54) 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법 (57) 요약 본발명은무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법에관한것이다. 본발명은무화과유전자원중우수한품종을선발하고, 선발된액아를기내배양한다음, 무화과끝눈에서발달된무화과엽을절단하고, 이무화과엽절편에침을이용하여상처를유도한후, 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 과옥신류 / 사이토키닌류조합처리액이포함된배지에상처처리된엽절편을치상하고배양하여다신초를유도한다음, 이렇게생산된다신초를뿌리유도배지에옮겨뿌리를유도하여재분화식물체를생산하고, 이재분화식물체를토양에이식하고순화하여무화과식물체를대량생산하는것으로구성된다. 본발명에의해무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법이제공된다. 대표도 - 도 1-1 -
(72) 발명자 이효연 제주제주시노형동 2583-1 뜨란채 203 동 1504 호 송필순 제주제주시연동 268 도원아미스 1301 호 - 2 -
특허청구의범위청구항 1 삭제청구항 2 식물체의대량생산방법에있어서, 무화과유전자원중액아에서식물체로의발달정도가우수한품종을선발하는제1공정, 제1공정에서선발된품종의무화과액아를기내배양하는제2공정, 기내배양된무화과끝눈에서발달된무화과엽을절단하는제3공정, 제3공정의무화과엽절편에핀셋또는침을이용하여상처를유도하는제4공정, 0.5 mm 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 과식물생장조절제로써옥신류 / 사이토키닌류인 2 mgl -1 인돌뷰트릭에시드 (IdoleButyric Acid, IBA)/0.5 mgl -1 티지아주론 (ThiDiaZuron, TDZ), 2 mgl -1 인돌뷰트릭에시드 (IBA)/1 mg l -1 티지아주론 (TDZ) 중선택된 1 종의조합처리액이포함된무화과조직배양용배지를제조하는제5공정, 제4공정의상처처리된무화과엽절편을제5공정에서준비한배지에치상하고이를다공질테이프 (porous tape) 로밀봉한후, 배양하여다신초를유도하고생산하는제6공정, 제6공정에서생산된다신초를뿌리유도배지에옮겨뿌리를유도하여재분화식물체를생산하는제7공정, 제7공정의재분화식물체를토양에이식하고, 순화한후, 온실에옮겨생장시키는제8공정을거쳐무화과식물체를대량생산하는것으로구성된, 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법. 청구항 3 제2항에있어서, 제6공정의다신초유도공정중배양은, 무화과엽절편을암조건에서 1 주일간배양후, 16 시간명조건으로옮겨 27±2 에서배양하며, 2 ~ 4 주간격으로계대배양하면서 10 ~ 14 주동안배양하는것이특징인, 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법. 청구항 4 제2항에있어서, 제8공정의순화공정시, 28, 포화습도, 16 시간광조건에서 1 ~ 2 개월간순화과정을거치는것이특징인, 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법. 청구항 5 삭제 명세서 발명의상세한설명 발명의목적 <15> 발명이속하는기술및그분야의종래기술 본발명은무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법에관한것이다. - 3 -
<16> <17> <18> <19> <20> <21> <22> <23> <24> <25> <26> <27> <28> <29> <30> <31> 무화과 (Ficus carica L.) 는뽕나무과 (Moraceae) 의무화과속 (Ficus Linn) 에속하는아열대성식물로서지중해연안이원산지로우리나라에서는전남을비롯한제주도, 경남등지에분포하고있다. 무화과는형태학적으로착과에매우유리하고다른과수에비하여결과연령이빠른속성과수이며, 무화과의재배는노동력경합이비교적적은편이고병충해방제의노력이거의필요없는과수다. 무화과는과실의단위생산량이많고비타민과무기질, 단백질분해효소인 ficin을다량함유하고있어서영양학적가치가높으며, 특히섬유질과탄수화물함량이높아변비해소및미용식, 약용식으로쓰이고있으며, 또한과실의무기질은산성체질을중화시키는알카리성식품으로가치가높은것으로알려져있다. 따라서이들다양한용도에부응하기위하여저장성개선, 내재해성, 내병성등새로운형질의도입이절실히요구되고있는실정이다. 무화과는무화과말벌류 (Fig wasp) 의매개로수분 (pollination) 이가능하며, 육종이가능하나, 이러한전통적인육종기법으로무화과의신품종을육성하는것은많은시간과노력이필요한문제가있다. 또한, 일반적으로무화과는삽목이나접목에의해증식되고있으며, 삽목방식은품종의균질성을유지할수있으나증식속도가제한되고발근에문제가있는것으로알려져있다. 근래에는짧은시간에식물체의신품종을육성하기위해조직배양기술이사용되고있으며, 기내대량증식 (micropropagation) 기술의획기적인발달로인해많은종류의과수가대량증식이가능하게되었다. 또한, 식물체재분화기술은유전공학기술을적용하여임목및과수를개량하는데있어가장중요한요인중하나로써많은연구가이루어지고있다. 한국등록특허공보제10-0270574호 ( 조직배양기술을이용한고추의재분화식물체의대량생산방법및재분화된고추식물체 ) 에는, 조직배양기술을이용하여고추의유조직으로부터완전한고추식물체를효과적으로재분화시키는방법및재분화된고추식물체에관한것이공개되어있다. 상기와같이식물체재분화를위해조직배양기술이많이이용되고있으나, 본발명에서제공될무화과의식물체재분화는통상의조직배양기술로는다른식물체보다식물체재분화가어려운것으로알려져있다. 즉, 무화과는액아 (shoot tips) 또는정아 (apical bud) 를배양하여식물체를재분화하는것에관한보고가있으나, 이는기관 (organ) 으로부터식물체를얻는것에불과하다. 최근에는무화과엽조직으로부터기관발생과정을거쳐얻는재분화식물체가보고되었으나엽절편으로부터분화된식물체의빈도가매우낮은문제가있었다. 또한, 무화과기내배양에서발생되는또하나의중요한문제점은무화과절편의절개 ( 상처 ) 부위로부터분비되는페놀화합물이배지에집적되어무화과조직을갈변시켜조직의기관발생또는배발생을억제하는문제가있었다. 일반적으로식물의상처부위에서분비되는페놀화합물이산화되어반응성이높은퀴논류 (quinones) 를형성하는데, 이물질은식물조직에독성을나타내는것으로알려져있다. 무화과의경우상처부위에서특히많은양의페놀화합물이분비됨으로무화과절편에서분비되는페놀화합물의분비억제또는완화는기내배양의성공에중요한관건이다. 상기와같이무화과는교잡육종법으로신품종을육성하기어려운대표적인과수로서새로운품종을육성하기위해서는유전공학기술의적용이절실한과수이며, 이를위해서는효율적인기내재분화기술의개발이매우필요하고시급한실정이다. <32> <33> 발명이이루고자하는기술적과제본발명은상기의문제를해결하기위해무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법을제공하는데목적이있다. 또한, 무화과로부터재분화시페놀화합물의분비를억제또는지연시켜다신초의재분화능을향상시키고, 이로인한무화과식물체의생산효율을증대시키는데그목적이있다. 발명의구성및작용 - 4 -
<34> <35> <36> <37> <38> <39> <40> <41> <42> <43> <44> <45> <46> <47> <48> <49> <50> <51> 본발명은무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법에관한것이다. 본발명은, 무화과유전자원중액아에서식물체로의발달정도가우수한품종을선발하는제1공정, 선발된품종의무화과액아를기내배양하는제2공정, 기내배양된무화과끝눈에서발달된무화과엽을절단하는제3공정, 제3공정의무화과엽절편에침을이용하여상처를유도하는제4공정, 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 과옥신류 / 사이토키닌류조합처리액이포함된무화과조직배양용배지를제조하는제5공정, 제4공정의상처처리된무화과엽절편을제5공정에서준비한배지에치상하고배양하여다신초를유도하고생산하는제6공정, 제6공정에서생산된다신초를뿌리유도배지에옮겨뿌리를유도하여재분화식물체를생산하는제7공정, 제7공정의재분화식물체를토양에이식하고순화하여무화과식물체를생산하는제8공정을거쳐대량생산하는것으로구성된다. 본발명의발명자들은신품종육종이어렵고, 조직배양을통해재조합식물체를생산하기어려운무화과에대하여재분화율을높이면서대량생산까지가능한방법을찾기위해오랜시간수많은시행착오를겪으며본발명을완성하게되었다. 먼저, 조직배양에적합한무화과유전자원을찾는것이선결과제이다. 본발명의발명자들은종래의무화과유전자원중조직배양용으로적합한품종을선발하기위하여 7종의수집무화과유전자원인승정도후인, 봉래시, 바나네, 브룬스윅, 비오레도후인, 브라운터키, 더킹을온실에서재배하여액아를기내배양하여이들액아로부터식물체로의발달정도를비교하였다. 승정도후인품종의경우타유전자원에비해비교적짧은기간에액아 (bud) 에서식물체로발달하는경향을보였으며, 이승정도후인은국내에서 70 % 이상재배되고있는우수품종으로서재분화를위한적합한품종으로선발하여사용하였다. 무화과엽절편 (leaf segment) 으로부터식물체재분화를유도하는데있어서가장큰문제점은엽절편의상처부위에서분비되는페놀화합물과탄닌성분등에의한조직의갈변현상이었다. 이조직의갈변현상으로엽조직이형태형성 (morphogenesis) 을저해하여식물체재분화에어려움이있었다. 또한, 식물체로발달하는기간이길어질수록무화과액아의절개부위로부터페놀화합물과탄닌성분등이분비되어식물체로의발달을저해하였다. 따라서, 본발명의발명자들은조직의갈변현상을제거또는완화시키기위한방법을찾던중플로로글루시놀 (phloroglucinol) 을첨가하여제조한배지에엽절편을치상하여배양하면갈변현상이제거또는완화된다는사실을알게되었다. 즉, 무화과엽절편을 0.5 mm 플로로글루시놀이첨가된배지에배양하였을때조직의갈변현상상당히완화되어매우효과적이었다 ( 표 2). 또한, 무화과엽절편을상기의배지에서배양할때 2 ~ 3 주간격으로계대배양하는경우에갈변현상완화에매우효과적이었다 ( 도 1). 플로로글루시놀을첨가하면절개부위에서발생되는페놀화합물과탄닌성분등을중화시키고, 치상후다공질테이프 (porous tape) 로밀봉하여배양을하면이들물질을배지밖으로배출시켜배양엽절편의갈변현상을개선할수있었다. 그러나, 무화과엽절편을상기와같이처리한배지에배양하면갈변현상은해결이되나신초의분화율이높지않은문제가있었다. 이를해결하기위하여무화과엽절편에핀셋또는침으로상처를유도한후배양한결과무화과엽절편에서다신초발생율을획기적으로높일수있었다. 즉, 기내배양한무화과액아에서발달된무화과엽을약 1 cm 2 크기로절단한무화과엽절편을예리한핀셋또는뭉친침 (8 ~ 10 개의한방침다발 ) 으로상처를유도한후, 플로로글루시놀이포함된배지에치상하고다공질테이프 (porous tape) 로밀봉하여배양한결과다신초의재분화율이월등히높아졌다. 상처유도과정없이무화과엽절편을배양한경우에는엽절편당평균 1 ~ 2 개의재분화식물체를생산하였으나, 상처유도후엽절편을배양한경우에는식물체생산이 6 ~ 10 배정도증가하였다. 또한, 본발명에서이용한무화과조직배양용배지는 MS 기본배지 (Murashige and Skoog 1962) 에옥신류 / 사이토 - 5 -
키닌류조합처리액, 0.5 mm 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 를첨가하여제조한배지이다. <52> <53> <54> <55> <56> <57> 먼저, 무화과엽절편에상처를처리하지않고조합처리액의종류및농도를다양하게사용하여배양해보았다. 이때, 옥신류는 2,4-디클로로페녹시아세트산 (2,4-Dichlorophenoxyacetic acid, 2,4-D), 나프탈렌아세틱에시드 (Naphtalene Acetic Acid, NAA), 인돌뷰트릭에시드 (IdoleButyric Acid, IBA) 를사용하고, 사이토키닌류인벤질 1 아미노퓨린 (Benzy1 Amino Purine, BAP), 티지아주론 (ThiDiaZuron, TDZ) 를사용하였다. 그결과, 모든 2,4-D 농도 /0.1 mgl -1 BAP에서캘러스가유도되었으며, 특히, 1 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 BAP 조 합에서캘러스형성이우수하였다. NAA/BAP 조합에엽절편을배양한경우, 엽절편조직의가장자리에서캘러스가유도되었으며, 엽절편조직의갈 변현상을동반하여더이상형태형성을하지못하였다. 2 mgl -1 2,4-D/ 낮은농도의 TDZ (0.1, 0.5 mgl -1 ) 의조합에서캘러스의발생이비교적우수하였으며, 0.5 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 TDZ 조합에처리한엽절편으로부터식물체가재분화되었으나, 그빈도는매우낮았다 ( 도 3B). 이조합이외의옥신류 / 사이토키닌류 (2,4-D, NAA/BAP, TDZ) 조합을포함하는배지에치상한엽절편으로부터재분화식물체를얻지못하였다. <58> 또한, IBA/TDZ 조합에서는캘러스발생율은 42.9 ~ 78.8 % 였으며, 캘러스유도는 0.5 mg l -1 IBA 농도에치상한 엽절편에서높았다. 0.5 mg l -1 IBA/0.5 mg l -1 TDZ 또는 0.5 mg l -1 IBA/1.0 mg l -1 TDZ 조합에치상한엽절편으 로부터캘러스발생율은각각 78.6 %, 82.1 % 였다. <59> <60> <61> 또한, 이들조합에서유도된식물체재분화율은각각 78.6 %, 67.9 % 였다. 반응을보인엽절편당평균적으로 3.1 ~ 3.9 개재분화식물체가생산되었다 ( 도 3C, 3D). 1 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합에서치상한엽절편에서재분화식물체를얻었으나, 그빈도는 28.9 % 였으며, 반응을보인엽절편에서유도된식물체는평균적으로 1 개체였다. <62> 본실험결과 0.5 mg l -1 였다 ( 도 3C). IBA/0.5 mg l -1 TDZ 처리조합에치상한엽절편에서가장양호한식물체재분화율을보 <63> <64> <65> <66> <67> <68> <69> <70> 또한, 무화과엽절편에상처를처리한후조합처리액의종류및농도를다양하게사용하여배양해보았다. 그결과, TDZ 농도에관계없이낮은농도의 IBA(0.5, 1 mgl -1 ) 가포함된배지에치상한엽절편으로부터비교적 높은빈도의캘러스 (67.9 ~ 89.3 %) 가유도되었나, 이들캘리스는식물체로분화하지못하였다. 2 mgl -1 IBA/ 처리한 TDZ 조합을포함하는배지에치상한엽절편은캘러스형성율 (7.1 ~ 17.9 %) 은매우낮았으 나, 재분화식물체의발생율은 TDZ 농도에따라 28.6 ~ 92.95 % 의변이를보였다. 또한, 2 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합및 2 mgl -1 IBA/ 1 mgl -1 TDZ 조합을포함하는배지에치상한엽절편 으로부터재분화식물체유도율은각각 89.3 %, 92.9 % 로우수하였으며, 각각의조합에서배양엽절편당평균적 으로 8.1 개와 10.8 개의다신초가생산되었다 ( 도 4). 비교적농도가높은 IBA(5 mgl -1 ) 조건에치상한엽절편에서는 TDZ 농도에관계없이캘러스발생은중간정도였 으며 (39.2 ~ 42.3 %), 캘러스또는엽절편으로터식물체분화는일어나지않았다. 따라서, 2 mgl -1 IBA/0.5 또는 1 mgl -1 TDZ 조합에치상한상처처리엽절편으로부터다신초발생이가장우수 하였다 ( 도 4). 또한, IBA/TDZ 조합처리액을이용한경우에는 2 mgl -1 IBA/0.5, 1 mgl -1 TDZ 조합처리액을사용하는경우가가 장재분화효율이뛰어났다. 즉, TDZ 농도에관계없이낮은농도의 IBA(0.5, 1 mgl -1 ) 가포함된배지에치상한엽절편으로부터비교적높은 - 6 -
빈도의캘러스 (67.9 ~ 89.3 %) 가유도되었으나, 이들캘러스는식물체로분화하지못하였다. <71> <72> <73> <74> <75> <76> <77> <78> <79> <80> <81> <82> <83> <84> <85> <86> <87> <88> <89> <90> <91> <92> <93> <94> 2 mgl -1 IBA/TDZ 조합처리액을포함하는배지에치상한엽절편은캘러스형성율이 7.1 ~ 17.9 % 로매우낮았으나, 재분화식물체의발생율은 TDZ 농도에따라 28.6 ~ 92.95 % 의변이를보였다. 또한, 2 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합처리액및 2 mgl -1 IBA/ 1 mgl -1 TDZ 조합처리액을포함하는배지에치상한엽절편으로부터재분화식물체유도율은각각 89.3 %, 92.9 % 로우수하였으며, 각각의조합에서엽절편당평균적으로 8.1 개와 10.8 개의재분화식물체가생산되었다 ( 도 4). 그러나, 0.5 mgl -1 IBA/0.5 또는 1 mgl -1 TDZ 조합처리액이포함된배지에치상한경우에도캘러스형성율은높았으나재분화식물체발생은일어나지않았다. 또한, 비교적농도가높은 IBA(5 mgl -1 ) 조건에치상한엽절편에서는 TDZ 농도에관계없이캘러스발생은중간정도였으며 (39.2 ~ 42.3 %), 캘러스또는엽절편으로부터식물체재분화는일어나지않았다. 따라서, IBA/TDZ 조합처리액중에서는 2 mgl -1 IBA/0.5 또는 1 mgl -1 TDZ 조합에치상한상처처리된엽절편으로부터재분화식물체발생이가장우수하였다 ( 도 4). 한편, 본발명의상처처리된무화과엽절편을배양하는배양액에는 MES, 수크로스 (sucrose), 식물한천 (plant agar), 생장촉진용보조재료등을첨가할수도있다. 이렇게상처처리된무화과엽절편을상기와같은본발명의배양액에치상하고배양하여다신초를유도한다. 이때, 배양은암조건에서 1 주일간배양후, 16 시간명조건으로옮겨 27±2 에서배양하며, 2 ~ 4 주간격으로계대배양하면서 10 ~ 14주동안배양하는것이가장바람직하다. 상기와같은방법으로생산한다신초를뿌리유도배지에옮겨뿌리를유도하여재분화식물체를생산한다 ( 도 5A, 5B). 이때, 뿌리유도배지는 3 % 수크로스와 0.8 % Gellixr 식물한천이포함된 MS 배지를사용한다. 이재분화식물체를토양에이식하고, 28, 포화습도, 16 시간광조건으로 1 ~ 2 개월동안순화과정을거친후온실로옮겨생장시켜본발명의무화과식물체를대량생산하게된다 ( 도 5C). 이때, 순화과정에서이용한토양은버미큘라이트와펄라이트를 1 : 1로혼합한상토가바람직하며, 토양에이식한후에는수분유지를위하여플라스틱비닐로 2 ~ 3 주간화분을감싼후유지하는것이좋다. 이들엽절편으로부터재분화한식물체는삽목한개체와비교하여생장습성이나형태적인특징의차이를보이지않았다. 상기와같은본발명의무화과식물체대량생산방법을이용하면무화과의형질개량및품질개량연구에효율성및경제성을높여해당기술분야에크게이바지할수있을것이다. 이하, 본발명의무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법에대해상세히설명하면다음과같다. < 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산공정 > 1. 제1공정 : 품종선발무화과유전자원별액아에서식물체로의발달정도가우수한품종을선발한다. 액아에서식물체로발달 (budbreak) 하는기간이길어질수록무화과액아의절개에의한상처부위로부터페놀화합물과탄닌성분등이분비되어배지에집적되고, budbreak 이후완전한식물체로의발달을저해한다. 따라서, budbreak 기간이비교적짧고, 그효율이우수한품종을조직배양용품종으로선발한다. 2. 제2공정 : 기내배양제1공정에서선발된품종의무화과액아를기내배양한다. 3. 제3공정 : 무화과엽절단제2공정의기내배양된무화과끝눈에서발달된무화과엽을 1 cm2크기로절단한다. - 7 -
<95> <96> <97> <98> <99> <100> <101> <102> <103> <104> <105> <106> <107> <108> <109> <110> <111> <112> <113> <114> <115> <116> <117> <118> 4. 제4공정 : 엽절편상처유도제3공정의무화과엽절편에핀셋또는뭉친침 (8 ~ 10 개의한방침다발 ) 을이용하여 10 회정도상처를유도한다. 5. 제5공정 : 무화과조직배양용배지제조 MS 기본배지에 0.5 mm 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 과식물생장조절제로써옥신류 / 사이토키닌류조합처리액을넣고무화과조직배양용배지를제조한다. 이때, 식물생장조절제인옥신류 / 사이토키닌류조합처리액은 1 또는 2 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 BAP의조합처리액, 2 mgl -1 2,4-D/0.1 또는 0.5 mgl -1 TDZ의조합처리액, 0.5 또는 2 mgl -1 IBA/0.5 또는 1 mgl -1 TDZ 조합처리액을사용하는경우에식물체의재분화효율이높다. 한편, 상기의배지에는 MES, 수크로스, 식물한천 (plant agar), 생장촉진용보조재료등을더첨가할수있다. 6. 제6공정 : 다신초유도제4공정의상처처리된무화과엽절편을제5공정에서준비한배지에치상하고 2 ~ 4 주간격으로계대배양하며다신초를유도한다. 이때, 배양은암조건에서 1 주일간배양후, 16 시간명조건으로옮겨 27±2 에서배양하며, 2 ~ 4 주간격으로계대배양하면서 10 ~ 14 주동안배양하는것이가장바람직하다. 7. 제7공정 : 재분화식물체생산제6공정에서생산된다신초를뿌리유도배지에옮겨뿌리를유도하여재분화식물체를생산한다. 이때, 뿌리유도배지는 3 % 수크로스와 0.8 % GellixrPlant agar가포함된 MS 배지를사용한다. 8. 제8공정 : 무화과식물체생산제7공정의재분화식물체를토양으로이식한후, 28, 포화습도, 16 시간광조건에서 1 ~ 2 개월간순화과정을거친후온실에옮겨생장시켜본발명의무화과식물체를생산한다. 이때, 순화과정에서이용한토양은버미큘라이트와펄라이트를 1 : 1로혼합한상토가바람직하며, 토양에이식한후에는수분유지를위하여플라스틱비닐로 2 ~ 3 주간화분을감싼후유지하는것이좋다. 이하, 본발명의무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법에대하여실시예및실험예를통하여보다상세히설명하나, 이들이본발명의범위를제한하는것은아니다. < 실시예 1> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산1 승정도후인, 봉래시, 바나네, 브룬스윅, 비오레도후인, 브라운터키, 더킹의 7 종의무화과유전자원인을수집하여유전자원별액아에서식물체로의발달정도를비교하여, budbreak 기간이비교적짧고, 그효율이우수한품종인승정도후인을선발하였다. 선발한품종의무화과액아를기내배양하여, 무화과끝눈에서발달된무화과엽을 1 cm2크기로절단하였다. 상기의무화과엽절편에핀셋을이용하여 10 회정도상처를유도하였다. MS 기본배지에 0.5 mm 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 을넣고, 식물생장조절제로써 2 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합처리액을넣고, 3 mm MES, 3% (w/v) 수크로스, 0.8 % Gellixr 식물한천을첨가하여무화과조직배양용배지를제조하였다. 준비한배지에상처처리된무화과엽절편을치상하고암조건에서 1 주일간배양후, 16 시간명조건으로옮겨 25 에서배양하며, 2 주간격으로계대배양하면서 10 주동안배양하여다신초를유도하였다. 이렇게생산된다신초를뿌리유도배지 (3 % 수크로스와 0.8 % GellixrPlant agar가포함된 MS 배지 ) 에이식하여뿌리를유도하여재분화식물체를생산하였다. 상기의재분화식물체를버미큘라이트와펄라이트를 1 : 1로혼합한상토에이식한후, 플라스틱비닐로 2 주간화분을감싸수분을유지하도록하고, 28, 포화습도, 16 시간광조건에서 1 개월간순화과정을거친후온실 - 8 -
에옮겨생장시켜본발명의무화과식물체를생산하였다. <119> <120> < 실시예 2> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 2 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 2 mg l -1 IBA/1 mg l -1 TDZ 조합처리액으로대체하여배양하였다. <121> <122> < 실시예 3> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 3 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 0.5 mg l -1 IBA/0.5 mg l -1 TDZ 조합처리액으로대체하여배양하였다. <123> <124> < 실시예 4> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 4 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 0.5 mg l -1 IBA/1.0 mg l -1 TDZ 조합처리액으로대체하여배양하였다. <125> <126> < 실시예 5> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 5 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 1 mg l -1 2,4-D/0.1 mg l -1 BAP 의조합처리액으로대체하여배양하였다. <127> <128> < 실시예 6> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 6 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 2 mg l -1 2,4-D/0.1 mg l -1 BAP 의조합처리액으로대체하여배양하였다. <129> <130> < 실시예 7> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 7 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 2 mg l -1 2,4-D/0.1 mg l -1 TDZ 의조합처리액으로대체하여배양하였다. <131> <132> < 실시예 8> 무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산 8 본발명의실시예 1 과동일한방법으로무화과식물체를생산하되, 무화과엽절편을배양할때첨가하는식물생 장조절제를 2 mg l -1 2,4-D/0.5 mg l -1 TDZ 의조합처리액으로대체하여배양하였다. <133> <134> <135> <136> <137> <138> <139> < 실험예 1> 무화과의조직배양용품종선발실험무화과기내조직배양및형질전환용품종을선발하기위하여승정도후인, 봉래시, 바나네, 브룬스윅, 비오레도후인, 브라운터키, 더킹의 7 종의무화과유전자원인을수집하여준비하였다. 준비한각각의품종으로부터액아를포함한줄기를절단하여 70 % 알코올에서 10 분간소독한후 0.01%(v/v) Tween 20이포함된상업용락스 (4% 이상차아염소산나트륨 ) 에 30 분간소독후멸균수로 3 ~ 4 회씻어주었다. 준비한재료를멸균페이퍼에옮겨과잉의수분을제거하였다. 줄기의액아부분을무균적으로절단하여 1 mgl -1 BAP, 3%(w/v) 수크로즈, 0.7%(w/v) 식물한천을포함하는 1/2 MS 기본배지에배양하였으며, 25, 16 시간일장조건에서 6 주동안배양하여액아에서식물체로발달하는정도 (budbreak) 를관찰하였다. 그결과를아래의표 1에나타내었다. < 표 1> 무화과유전자원별 budbreak 정도 <140> 유전자원 ( 품종 ) budbreak 정도기간비교 승정도후인 +++ 3 ~ 4 주품종선발 봉래시 ++ 5 주이상 바나네 + 5 주이상 브룬스윅 + 5 주이상 - 9 -
비오레도후인 + 5 주이상 브라운터키 ++ 5 주이상 더킹 + 5 주이상 +: 낮음, ++: 보통, +++: 높음 <141> <142> <143> <144> <145> <146> <147> <148> <149> <150> <151> 상기의표 1에서보는바와같이승정도후인의경우배양 4 주후액아로부터식물체로발달하는 budbreak 효율이가장높았으며, 다음으로봉래시와브라운터키품종이우수하였으며, 나머지품종의액아브레이크정도는불량하였다. 무화과의 budbreak 정도는품종에따라다른반응을보였다. budbreak 기간이길어질수록, 즉식물체로발달하는기간이길어질수록무화과액아의절개에의한상처부위로부터페놀화합물과탄닌성분등이분비되어배지에집적되고결과적으로 budbreak 후완전한식물체로의발달을저해하였다. 따라서, budbreak 기간이비교적짧고또한그효율이우수한승정도후인품종을조직배양용품종으로선발하였다. < 실험예 2> 무화과엽절편에대한배양방법에따른갈변정도확인실험무화과엽절편 (leaf segment) 의상처부위로부터분비되는페놀화합물에의한조직의갈변현상의억제또는완화는무화과기내배양을이용한재분화기술확립의전제조건이므로, 조직의갈변현상을완화시키기위한다양한처리를하여비교실험하였다. 기내배양한액아로부터재분화한무화과식물체의엽절편을 1 cm2크기로절단하여 0.04 mgl -1 IBA, 1 mgl -1 BAP, 3 % 수크로스, 0.7 % 식물한천이포함된 MS 배지에배양하였다. 상처부위에서페놀화합물의분비를조절하기위하여다음과같은방법으로엽절편을배양하였다. (1) 배지위에멸균필터페이퍼를놓고엽절편배양, (2) 엽절편배양후다공질테이프로밀봉처리, (3) 배지에 0.3 % 활성탄을첨가한배지에엽절편배양, (4) 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 0.5 mm 또는 AgNO3(20μ M) 첨가배지에엽절편배양, (5) 항산화제아스파르테이트 (aspartate) 2 gl -1, 시트레이트 (citrate) 500 mg -1 첨가배지에엽절편배양, (6) 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 첨가배지에엽절편을배양후다공질테이프로밀봉처리, (7) 상기 (6) 과동일한조건으로하되, 파라필름으로밀봉처리하여대조군을준비하였다. 식물조직은 25, 16 시간일장조건에서배양하였으며, 2 ~ 4 주간격으로계대배양하여, 배지의갈변정도및식물조직의갈변또는고사정도를비교하였다. < 표 2> 무화과엽절편에대한갈변현상 <152> 처리갈변정도 대조구 +++ 배지위에필터페이퍼처리 +++ 다공질테이프로밀봉 +++ 활성탄첨가 +++ 플로로글루시놀첨가 + AgNO 3 첨가 +++ 시트르산첨가 +++ 아스파라긴산첨가 +++ 갈변정도 : + 낮음 ; ++ 중간 ; +++ 높음 ( 암갈색 ) <153> <154> 상기의표 2에서보는바와같이, 엽절편의상처부위로부터분비되는페놀화합물의효과적인확산을통한조직의갈변현상을완화시키기위하여필터페이터를배지위에올려놓고무화과엽절편을그위에배양하였으나효과가없었다. 또한, 일반적으로배지에첨가하는활성탄은조직배양과정에서분비되는불순물을제거하는효과가있는것으 - 10 -
로알려져있으나, 무화과엽절편의갈변현상완화에는효과가없었다. <155> <156> 또한, 밀봉재료로다공질테이프를사용하였으나이또한조직의갈변현상을완화시키는효과가없었다. 기내배양에서많이이용되는에틸렌억제제인 AgNO 3, 항산화제로이용되는아스파라긴산 (aspartic acid) 와시 트르산 (citric acid) 역시무화과엽절편배양시발생되는조직의갈변현상을완화시키는효과가없었다. <157> <158> <159> <160> <161> <162> <163> <164> <165> <166> <167> <168> <169> <170> <171> 무화과엽절편을 0.5 mm 플로로글루시놀 (phloroglucinol) 이첨가된배지에배양하였을때조직의갈변현상상당히완화되어매우효과적이었으며 ( 표 2), 무화과엽절편을플로로글루시놀이첨가된배지에서 2 ~ 4 주간간격으로계대배양할경우갈변현상완화에매우효과적이었다 ( 도 2). < 실험예 3> 식물생장조절제처리에따른무화과식물체재분화율실험무화과승정도후인품종을선발하고, 선발한품종의무화과액아를기내배양하여엽을채취하였다. 채취한무화과엽을약 1 cm2크기로절단하여엽절편을준비하였다. 무화과엽절편을배양할배지를제조하되, 0.5 mm 플로로글루시놀, 3 mm MES, 3% (w/v) sucrose, 0.8% Gellix r 식물한천이포함된배지를준비하였다. 또한, 상기의배지에식물생장조절제로서옥신류 / 사이토키닌류조합처리액을첨가하되, 종류와농도를다양하게하여그결과를관찰하였다. 즉, 옥신류 [0.1, 1, 3 mgl -1 2,4-D; 0.1, 1, 3 mgl -1 NAA; 0.5, 1 mgl -1 IBA] 와사이토키닌류 [0.1, 1 mgl -1 BAP; 0.5, 1, 2 mgl -1 TDZ] 조합처리액, 또는 IBA(0.5, 1 mgl -1 ) 와 TDZ(0.5, 1, 2, 5 mgl -1 ) 조합처리액을첨가하여배지를제조하였다. 엽절편은 25, 16 시간일장조건에서배양하였으며, 치상엽절편으로부터기관발생즉부정근신초및다신초의발달을비교하였다. 그결과, 2,4-D/BAP 조합의경우, 캘러스형성및엽절편크기의증가가관찰되었으며, 엽절편의크기는치상할때보다 2배이상증가하였다. 모든 2,4-D 농도 /0.1 mgl -1 BAP에서캘러스가유도되었으며, 특히, 1 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 BAP 조합에서캘러스형성이우수하였다. NAA/BAP 조합에엽절편을배양한경우, 엽절편조직의가장자리에서캘러스가유도되었으며, 엽절편조직의갈변현상을동반하여더이상형태형성을하지못하였다. 2 mgl -1 2,4-D/ 낮은농도의 TDZ (0.1, 0.5 mgl -1 ) 의조합에서캘러스의발생이비교적우수하였으며, 0.5 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 TDZ 조합에처리한엽절편으로부터식물체가재분화되었으나, 그빈도는매우낮았다 ( 도 3B). 이조합이외의옥신류 / 사이토키닌류 (2,4-D, NAA/BAP, TDZ) 조합을포함하는배지에치상한엽절편으로부터재분화식물체를얻지못하였다. 또한, IBA/TDZ 조합에치상한엽절편의식물체재분화능을표 3에나타내었다. < 표 3> IBA/TDZ 조합처리종류별캘러스형성및재분화식물체발생율 <172> 식물생장조절제 ( mgl -1 ) 캘러스형성율 (%) 재분화식물체 IBA TDZ 발생율 (%) 0.5 0.5 22 a /28 b (78.6) 22 c /28 b (78.6) 엽절편당 재분화식물체수 0.5 1.0 23/28 (82.1) 19/28 (67.9) 3.1 0.5 2.0 16/28 (57.1) 0 0 0.5 5.0 12/28 (42.9) 0 0 1.0 0.5 12/28 (42.9) 8/28 (28.9) 1.0 1.0 1.0 14/28 (50.0) 0 0 3.9-11 -
1.0 2.0 15/28 (53.6) 0 0 1.0 5.0 12/28 (42.9) 0 0 a 캘러스발생엽절편수 ; b 치상엽절편수 ; c 재분화식물체발생엽절편수 <173> 상기의표 3 에서보는바와같이, IBA/TDZ 조합에서는캘러스발생율은 42.9 ~ 78.8 % 였으며, 캘러스유도는 0.5 mg l -1 IBA 농도에치상한엽절편에서높았다. 0.5 mg l -1 IBA/0.5 mg l -1 TDZ 또는 0.5 mg l -1 IBA/1.0 mg l - 1 TDZ 조합에치상한엽절편으로부터캘러스발생율은각각 78.6 %, 82.1 % 였다. <174> <175> <176> 또한, 이들조합에서유도된식물체재분화율은각각 78.6 %, 67.9 % 였다. 반응을보인엽절편당평균적으로 3.1 ~ 3.9 개재분화식물체가생산되었다 ( 도 3C, 3D). 1 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합에서치상한엽절편에서재분화식물체를얻었으나, 그빈도는 28.9 % 였으며, 반응을보인엽절편에서유도된식물체는평균적으로 1 개체였다. <177> 본실험결과 0.5 mg l -1 였다 ( 도 3C). IBA/0.5 mg l -1 TDZ 처리조합에치상한엽절편에서가장양호한식물체재분화율을보 <178> <179> <180> <181> <182> <183> 또한, 무화엽절편을암조건에서 1 주일간배양후, 16 시간명조건으로옮겨배양하였을때, 엽절편으로부터재분화식물체의발생율이높음을관찰하였다. < 실험예 4> 엽절편의상처처리를통한다신초의재분화능실험기내배양한무화과액아에서발달된무화과엽을 1 cm2정도크기로절단하여날카로운핀셋을이용하여엽절편의단면을 10 회상처를처리하였다. 상처처리한엽절편을 MS 기본배지에 IBA(0.5, 1, 2, 5 mgl -1 ) 와 TDZ(0.5, 1, 2 mgl -1 ) 등을조합처리액, 0.5 mm 플로로글루시놀, 3 mm MES, 3% (w/v) 수크로스, 0.8 % Gellixr 식물한천이포함된배지치상하였다. 이때, 상처를처리한무화과엽절편은향축면이배지에닿도록배지에치상하고, 27, 16 시간일장조건에서배양하였으며, 치상엽절편으로부터기관발생즉신초및다신초의발달을관찰하여아래의표 4에나타내었다. < 표 4> 엽절편의상처처리를통한다신초의재분화능실험결과 <184> 식물생장조절제 (mgl -1 ) 캘러스형성율 (%) 재분화식물체 IBA TDZ 발생율 (%) 0.5 1 2 5 0.5 24 a /28 b (85.7) 반응엽절편당 재분화식물체수 0 0 1 25/28 (89.3) 0 0 2 22/28 (78.9) 0 0 0.5 19/28 (67.9) 0 0 1 19/28 (67.9) 0 0 2 19/28 (67.9) 0 0 0.5 5/28 (17.9) 25 c /28 (89.3) 1 2/28 (7.1) 26/28 (92.9) 10.8 2 2/28 (7.1) 8/28 (28.6) 1.0 0.5 11/28 (39.3) 0 0 1 12/28 (42.3) 0 0 2 12/28(42.3) 0 0 a 캘러스발생엽절편수 ; b 치상엽절편수 ; c 재분화식물체발생엽절편수 8.1 <185> 상기의결과에서보는바와같이, TDZ 농도에관계없이낮은농도의 IBA(0.5, 1 mg l -1 ) 가포함된배지에치상한 엽절편으로부터비교적높은빈도의캘러스 (67.9 ~ 89.3 %) 가유도되었나, 이들캘리스는식물체로분화하지못 - 12 -
하였다. <186> <187> <188> <189> 2 mgl -1 IBA/ 처리한 TDZ 조합을포함하는배지에치상한엽절편은캘러스형성율 (7.1 ~ 17.9 %) 은매우낮았으나, 재분화식물체의발생율은 TDZ 농도에따라 28.6 ~ 92.95 % 의변이를보였다. 또한, 2 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 조합및 2 mgl -1 IBA/ 1 mgl -1 TDZ 조합을포함하는배지에치상한엽절편으로부터재분화식물체유도율은각각 89.3 %, 92.9 % 로우수하였으며, 각각의조합에서배양엽절편당평균적으로 8.1 개와 10.8 개의다신초가생산되었다 ( 도 4). 비교적농도가높은 IBA(5 mgl -1 ) 조건에치상한엽절편에서는 TDZ 농도에관계없이캘러스발생은중간정도였으며 (39.2 ~ 42.3 %), 캘러스또는엽절편으로터식물체분화는일어나지않았다. 따라서, 2 mgl -1 IBA/0.5 또는 1 mgl -1 TDZ 조합에치상한상처처리엽절편으로부터다신초발생이가장우수하였으며 ( 도 4), 이는엽절편에상처처리및최적오옥신과사이토키닌의조합에의해다신초의발생율을높이는것으로추정된다. <190> <191> 발명의효과본발명에의해엽절편에서분비되는페놀화합물에의한갈변현상이완화또는제거되면서다신초의유도율을높여재분화식물체의생산율을높임으로써무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산방법이제공된다. 또한, 본발명에의해무화과의형질개량및품질개량연구에효율성및경제성을높여해당기술분야에크게이바지할수있는무화과식물체의대량생산방법이제공된다. <1> <2> 도면의간단한설명 도 1 은본발명의무화과엽절편으로부터재분화된식물체의대량생산공정도 도 2 는플로로글루시놀처리유무에따른조직의갈변현상확인결과사진 <3> A : 무처리군, B : 처리군 <4> <5> <6> <7> <8> <9> <10> <11> <12> <13> <14> 도 3은식물생장조절에처리에따른무화과엽절편의재분화모습 A : 무화과엽절편, B : 0.5 mgl -1 2,4-D/0.1 mgl -1 TDZ 처리군 C : 0.5 mgl -1 IBA/0.5 mgl -1 TDZ 처리군, D : 0.5 mgl -1 IBA/1 mgl -1 TDZ 처리군도 4는상처처리된무화과엽절편으로부터다신초재분화모습 A : 재분화중인다신초, B : 뿌리유도배지로옮기기전의다신초도 5는본발명의무화과엽절편으로부터재분화된무화과식물체사진 A : 기내에서뿌리유도중인재분화식물체, B : 뿌리가유도된재분화식물체, C : 온실에서생육중인무화과식물체 - 13 -
도면 도면 1 도면 2-14 -
도면 3 도면 4 도면 5-15 -