등록특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0775 ( ) C12N 5/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일

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다윤 영
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0775 ( ) C12N 5/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2010 년 07 월 16 일 심사청구일자 2010 년 07 월 16 일 (65) 공개번호 (43) 공개일자 2012 년 01 월 30 일 (56) 선행기술조사문헌 Lin, T-M., et. al., Stem Cells and Development, Vol.14, pp (2005) (45) 공고일자 2012년12월13일 (11) 등록번호 (24) 등록일자 2012년12월07일 (73) 특허권자 주식회사알앤엘바이오 서울특별시관악구관악로 120 ( 봉천동 ) (72) 발명자 라정찬 경기도수원시장안구만석로 20 번길 25, 626 동 701 호 ( 정자동, 청솔마을 SK 한화아파트 ) 강성근 서울특별시관악구성현동관악드림타운아파트 116 동 504 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이처영전체청구항수 : 총 5 항심사관 : 이효진 (54) 발명의명칭양막유래중간엽줄기세포배양을위한배지조성물및이를이용한양막유래중간엽줄기세포의배양방법 (57) 요약 본발명은중간엽줄기세포배양을위한배양배지에관한것으로, 더욱자세하게는기본배지, L- 아스코르브산 2- 인산, 우태아혈청, 염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 인슐린, N- 아세틸 -L- 시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 칼슘클로라이드및하이드로코티손을함유하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물및이를이용한중간엽줄기세포의배양방법에관한것이다. 본발명에따르면, 줄기세포치료에필요한중간엽줄기세포의개체수를빠른시간에획득할수있으며, 중간엽줄기세포의분화능을향상시켜, 줄기세포를이용한세포치료에유용하다. 대표도 - 도 1-1 -

2 (72) 발명자 서주연 경기도안성시공도읍진건중길 김효은 서울특별시관악구봉천로 23 다길 59-8 ( 봉천동 ) - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 DMEM-HG 및 Defined Keratinocyte-SFM의혼합배지에 L-아스코르브산 2-인산, 우태아혈청, 염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 인슐린, N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 칼슘클로라이드및하이드로코티손을추가로함유하는양막유래중간엽줄기세포배양을위한배지조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 0.05~1 mm의아스코르브산 2-인산, 2~20% 우태아혈청, 1~10ng/ml의염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 1~10μg/ml 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 0.1~100μg/ml의인슐린, 0.2~20mM의 N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 0.01~1mM의칼슘클로라이드및 5ng/ml~1μg/ml의하이드로코티손을함유하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물. 청구항 3 제1항또는제2항에있어서, 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) 은글리신, 알라닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 글루타민산, 프롤린및세린으로구성되는것을특징을하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물. 청구항 4 제3항에있어서, 비필수아미노산 (NEAA;non essential amino acid) 은 750mg/L의글리신, 890mg/L의알라닌, 1,320mg/L의아스파라긴, 1,330mg/L의아스파르트산, 1,470mg/L의글루타민산, 1,150mg/L의프롤린및 1,050mg/L의세린으로구성되는것을특징을하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물. 청구항 5 제1항내지제4항중어느한항의배지에서양막유래중간엽줄기세포를배양하는것을특징으로하는중간엽줄기세포의배양방법. 청구항 6 삭제 명세서 [0001] 기술분야본발명은중간엽줄기세포배양을위한배양배지에관한것으로, 더욱자세하게는기본배지, L-아스코르브산 2-인산, 우태아혈청, 염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 인슐린, N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 칼슘클로라이드및하이드로코티손을함유하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물및이를이용한중간엽줄기세포의배양방법에관한것이다. [0002] 배경기술 줄기세포 (stem cell) 란자기복제능력을가지면서두개이상의세포로분화하는능력을갖는세포를말하며, - 3 -

4 만능줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능줄기세포 (multipotent stem cell) 로분류할수있다. [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] [0008] 성체줄기세포는인체의각종장기에이미존재하는세포를채취, 줄기세포를발전시킨것으로특정조직으로만분화되는특징이있다. 그러나최근에는성체줄기세포를이용, 간세포등각종여러조직으로분화시키는실험이성공을거두고있어주목된다. 다분화능줄기세포는성체골수에서최초로분리되었고 (Y. Jiang et al., Nature, 418:41, 2002), 그후다른여러성체조직에서도확인되었다 (C.M. Verfaillie, Trends Cell Biol., 12:502, 2002). 다시말해, 골수는가장널리알려진줄기세포의소스이지만, 다분화능줄기세포는피부, 혈관, 근육및뇌로부터도확인되었다 (J.G. Toma et al., Nat. Cell Biol., 3:778, 2001; M. Sampaolesi et al., Science, 301:487, 2003; Y. Jiang et al., Exp. Hematol., 30:896, 2002). 그러나, 골수와같은성체조직내에줄기세포는매우드물게존재하고, 이러한세포들은분화유도하지않고배양하기어려워서, 특이적으로스크린된배지들이없으면그세포들을배양하기어렵다. 즉, 줄기세포들은분리하여체외에서보존하기가매우어렵다는단점이있다. 한편, 태아조직 (fetal tissue) 에서중간엽줄기세포의분리를연구한결과, 풍부한중간엽줄기세포가있음이밝혀졌으나, 세포치료제를목적으로태아조직의사용은윤리적으로제한이있기때문에세포치료제로사용하기위한한계가있었다. 태아중간엽줄기세포 (fetal MSC) 에대한소스로서제대혈 (Umbilical cord blood, UCB) 에서도중간엽줄기세포를분리하였지만, 그수가매우작았고, 증식이잘되지않는문제점이있었다. 최근들어, 양막 (amnion, amniotic membrane, 또는 amniotic lining membrane), 즉태반 (placenta) 및발생중인포유류의배아를둘러싸는얇은제일안쪽의막구조에중간엽줄기세포가존재하는것이알려져, 이를분리, 배양하는기술이개발되고있다 (WO 2006/019357, 대한민국등록특허제 호, 대한민국등록특허제 호 ). 그러나, 기존의양막유래줄기세포의배양방법은줄기세포가증식하는데오랜시간이걸리는단점이있었다. 이에, 본발명자들은분화능을유지하면서, 양막유래줄기세포의증식율을향상시킬수있는방법을개발하고자예의노력한결과, DMEM-P 및 KSFM-P를혼합한배지에서양막유래줄기세포를배양하는경우, 분화능을유지하면서도세포증식능을향상시킬수있다는것을확인하고본발명을완성하게되었다. 발명의내용 [0009] [0010] 해결하려는과제본발명의목적은분화능을유지하면서도높은세포증식율을가지는중간엽줄기세포배양용배양배지를제공하는데있다. 본발명의다른목적은상기배양배지를이용하여중간엽줄기세포를배양하는방법을제공하는데있다. [0011] [0012] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은기본배지, L-아스코르브산 2-인산, 우태아혈청, 염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 인슐린, N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 칼슘클로라이드및하이드로코티손을함유하는중간엽줄기세포배양을위한배지조성물을제공한다. 본발명은또한, 상기배지에서양막유래줄기세포를배양하는것을특징으로하는중간엽줄기세포의배양방법을제공한다. [0013] 발명의효과 본발명에따르면, 줄기세포치료에필요한중간엽줄기세포의개체수를빠른시간에획득할수있으며, 중간엽 - 4 -

5 줄기세포의분화능을향상시켜, 줄기세포를이용한세포치료에유용하다. [0014] 도면의간단한설명 도 1 은 DMEM-P, KSFM-P 또는 DMEM-P 와 KSFM-P 혼합배지에서 3 일째배양된양막유래중간엽줄기세포의사진이 다. 도 2는 DMEM-P, KSFM-P 또는 DMEM-P와 KSFM-P 혼합배지에서 4일째배양된양막유래중간엽줄기세포의사진이다. 도 3은 CD31에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 4는 CD34에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 5는 CD45에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 6은 CD29에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 7은 CD44에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 8은 CD73에대한각그룹별유세포분석결과를나타낸것이다. 도 9은 DMEM-P과 KSFM-P 혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양된양막유래중간엽줄기세포의 P1 계대세포를나타낸사진이다. 도 10는 DMEM-P과 KSFM-P 혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양된양막유래중간엽줄기세포의 P2 계대세포를나타낸사진이다. 도 11은 Alizalin red S 염색법을이용하여 DMEM-P 또는혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양된양막유래중간엽줄기세포가골형성세포로분화를각조건별로확인한결과를나타낸것이다. 도 12은 DMEM-P 또는혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양한후각조건별로골세포로분화된양막유래중간엽줄기세포의 Alizalin red S 농도를정량화해서대조군 ( 골분화를유도하지않은군 ) 과비교한그래프이다. [0015] [0016] [0017] [0018] [0019] [0020] [0021] [0022] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명은일관점에서, 기본배지, L-아스코르브산 2-인산, 우태아혈청, 염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 인슐린, N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-Lcysteine), 칼슘클로라이드및하이드로코티손을함유하는양막유래중간엽줄기세포배양을위한배지조성물에관한것이다. 본발명에있어서, 상기기본배지는 DMEM-HG, Defined Keratinocyte-SFM 및이들의혼합물로구성된군에서선택되는것을특징으로할수있다. 본발명에있어서, 상기각배지성분의함유량은 0.05~1 mm의아스코르브산 2-인산, 2~20% 우태아혈청, 10~1ng/ml의염기성섬유아세포성장인자 (b-fgf), 10~1μg/ml비필수아미노산 (NEAA; non essential amino acid) (100X), 0.1~100μg/ml의인슐린, 0.2~20mM의 N-아세틸-L-시스테인 (N-acetyl-L-cysteine), 0.01~1mM의칼슘클로라이드및 5ng/ml~1μg/ml의하이드로코르티손인것을특징으로할수있다. 본발명에있어서, 상기중간엽줄기세포는양막유래의중간엽줄기세포인것을특징으로할수있다. 본발명은다른관점에서, 상기배지에서중간엽줄기세포를배양하는것을특징으로하는중간엽줄기세포의배양방법에관한것이다. 본발명에있어서, 상기중간엽줄기세포는양막유래의중간엽줄기세포인것을특징으로할수있다. 본발명의일양태에서사용되는양막유래중간엽줄기포는태반으로부터분리한양막조직전체에서추출되는여러종류의세포를사용하는것이아니라양막중간엽줄기세포만을추출하여분리하여사용하였다. 본발명의일양태에서, 양막유래중간엽줄기세포를분리하는방법은분만시에수집된태반조직으로부터, 양막조직을분리하고, 분리된양막조직을멸균생리식염수로세척한다음, 수술용가위로최대한세절하였다. 세절 - 5 -

6 된조직에콜라게네이즈용액을투입하여잘혼합한후플라스크에넣고, 플라스크를 37, 5% CO 2 인큐베이터에서 90분간반응시켜조직을용해시켰다. 용해된조직을 Cell strainer에거르고, 원심분리하였다. 원심분리후상층액을제거하고, DMEM-P로세포침전물을현탁하여 T-플라스크에접종후 37, 5% CO 2 인큐베이터에서 3~4일간인큐베이션시켜배양용기에부착된중간엽줄기세포만을수득하였다. [0023] 본발명의일양태에서, 사용된양막유래중간엽줄기세포는 DMEM-P 배지와 KSFM-P 배지를각각단독으로사용하여 배양하였을때보다, DMEM-P 배지와 KSFM-P 배지를혼합한배지에서세포증식율이우수하였으며, 특히, DMEM-P 배지 와 KSFM-P 배지를 66:33 으로혼합한배지에서가장높은증식율을나타내었다. [0024] [0025] 실시예이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을예시하기위한것으로서, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는것은당업계에서통상의지식을가진자에게있어서자명할것이다. [0026] 실시예 1: 양막조직으로부터중간엽줄기세포의분리 [0027] [0028] 실험에필요한양막조직은태반으로부터분리하였으며, 분리된조직은항생제가포함되어있는생리식염수또는 DMEM(Dulbecco modified Eagle medium) 배지에넣어연구실까지옮겼다. 클린벤치내에서양막조직을 5g 정량하여 2회멸균생리식염수로세척하고, 페트리디쉬에세척된양막조직을수술용가위로최대한세절하였다. 세절된조직에콜라게네이즈용액을투입하여잘혼합한후플라스크에넣고, 플라스크를 37, 5% CO 2 인큐베이터에서 90분간반응시켜조직의용해됨을확인하였다. 용해된조직을 50mL 튜브에기준비해둔 Cell strainer 에거르고, 원심분리하였다. 원심분리후상층액을제거하고, DMEM-P 로세포침전물을현탁하여 T- 플라스크에접종후 37, 5% CO 2 인큐베이터에서 3~4 일간인큐베이션시켜배양용기 에부착된중간엽줄기세포만을얻었다. [0029] [0030] 실시예 2: 분리한양막중간엽줄기세포의 DMEM-P 및 KSFM-P 혼합배지에서의배양 상기수득한양막유래중간엽줄기세포를, DMEM-P( 표 1) 및 KSFM-P( 표 3) 배지의혼합배지를표 4 에기재된혼 합비율로혼합한배지를사용하여, T175 플라스크에 1.0x10 6 세포를분주하여 37 에서 4 일동안배양하였으며, 배지는이틀에한번씩교환하였다. 배양 3 일및배양 4 일째의세포사진을각각도 1 및도 2 에나타내었다. [0031] 표 1 DMEM-P 배지의성분 구성성분 입수처 농도 DMEM-HG 웰진 L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma-aldrich 0.2 mm Fetal Bovine Serum Invitrogen 10% b-fgf Invitrogen 10 ng/ ml NEAA(100X) Invitrogen 10 μl / ml [0032] 표 2 NEAA(100X) 의조성 NEAA 구성성분 농도 (mg/l) Glycine

7 L-Alanine 890 L-Asparagine 1,320 L-Aspartic acid 1,330 L-Glutamic Acid 1,470 L-Proline 1,150 L-Serine 1,050 [0033] 표 3 KSFM-P 배지의성분 구성성분 입수처 농도 Defined Keratinocyte-SFM Invitrogen L-ascorbic acid 2-phosphate Sigma-aldrich 0.2 mm Insulin Millipore 5 μg / ml N-acetyl-L-cysteine Sigma-aldrich 2 mm Calcium chloride Sigma-aldrich 0.09 mm Hydrocortisone Sigma-aldrich 74 ng/ ml Fetal Bovine Serum Invitrogen 5% [0034] 표 4 DMEM-P 및 KSFM-P 의혼합비율 그룹 DMEM-P KSFM-P [0035] [0036] [0037] 배양 4일째에, 배양된양막유래중간엽줄기세포를 HBSS버퍼에세척한후 TrypLE-Express(Gibco) 또는 0.25% Trypsin-EDTA를넣고 37 에서 10분간반응시켰다. FBS가함유된배지를넣어트립신을불활성화시킨후수득한양막유래중간엽줄기세포의세포수를측정하였다. 그결과, 표 4, 도 1 및도 2에나타낸바와같이, DMEM-P배지와 KSFM-P배지를단독으로사용한배지에서보다, DMEM-P배지와 KSFM-P배지를혼합한배지에서배양된양막유래줄기세포가훨씬더빨리자라며, 배양 4일째의세포수에있어서도, 현저히많다는것을확인할수있었다. 표 5에나타난바와같이, 그룹 2의 DMEM-P배지와 KSFM-P배지를 66:33으로혼합한배지에서가장높은증식율을나타내어, 상기혼합비의혼합배지를이후계대배양에사용하였다. [0038] 표 5 배지혼합비에따른세포수의변화 그룹 DMEM-P : KSFM-P 세포수 : 0 1.2x : : : : x x x x

8 [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] 실시예 3: 혼합배지에서배양된양막유래중간엽줄기세포의면역학적특성표면항원발현의유세포분석 (Flow cytometry analysis) 실시예 2에서혼합배지로배양된양막유래중간엽줄기세포들을표면 CD 시리즈항원마커들로캐릭터라이제이션하였다. CD29 (mononuclear cell marker), CD31(endothelial cell and stem cell marker), CD34(hematopoietic stem cell marker), CD44, CD45(PTPR, ASV, Leukocyte marker), CD73들을 FACS 분석에적용하였다실시예 1에서수득한양막유래중간엽줄기세포를 PBS로세척하고, 트립신처리한뒤세포를수거하여 5분동안 1500rpm으로원심분리하였다. 상층액을버린후 Blocking buffer 용액 (5% serum(normal goat serum + Normal horse serum) 을넣어서 4 에서 60분간반응시킨후 1500rpm으로 5분동안원심분리하였다. 상층액을버린후세포를 PBS에부유시켜 Negative Control 및 CD 항원마커수만큼 1 x 10 5 cell을분주하였다. 각웰에항체 (R-phycoerythrin(PE)/ FITC(Fluorescein Isothiocyanate)-conjugated mouse anti-human monoclonal antibody) 를넣고, 4 에서 40분동안인큐베이션하였다. 인큐베이션후에 1500rpm으로 3분동안원심분리하였다. 상층액을제거한뒤 PBS로세척하고 1500rpm으로 3분동안원심분리하였다. 그리고, 한번더상기상층액제거후 PBS로세척하고 1500rpm에서 3분동안원심분리하는과정을반복하였다. 상층액을제거한후유세포분석기 ( 플로우사이토미터 ) 를이용해분석하였다. 그결과, 각그룹의양막유래중간엽줄기세포들은모두 CD29, CD44 및 CD73에대하여양성인면역학적특성을나타내고, CD31, CD34 및 CD45에대하여음성의면역학적특성을나타내었다 ( 도 3 내지도 8). [0044] [0045] [0046] [0047] 실시예 4: 혼합배지에서계대배양된양막유래중간엽줄기세포의증식능비교실시예 1에서배양된세포들을각각 1.0x10 6 세포 /T175플라스크농도로계대배양하여, P1 및 P2 세대의증식능을확인하였다. 배양은실시예 1의배양방법과동일한조건에서수행하였다. 그결과, DMEM-P 단독배지에서배양한군 ( 그룹 1) 의 P1은 5일배양후, 세포수를계측하였을때, 5.4x 10 6 세포인반면, DMEM-P와 KSFM-P배지를 66:33으로혼합한군 ( 그룹 2) 의 P1은 4일만배양하고세포수를계측하여도, 1.25x10 7 세포로현저히높은세포증식능을나타내었다 ( 도 9). [0048] P2 의경우는 DMEM-P 단독배지에서배양한군 ( 그룹 1) 은 4 일배양후계측하였을때, 3.4x 10 6 세포로증식된세 포수가 P1 에배하여감소하였으며, DMEM-P 와 KSFM-P 배지를 66:33 으로혼합한군 ( 그룹 2) 의경우는 1.38x10 7 세포 로 P1 에비하여증식능이오히려증가하였다 ( 도 10). [0049] [0050] 실시예 5: 혼합배지에서계대배양된양막유래중간엽줄기세포의면역학적성비교실시예 2와동일한방법으로, DMEM-P 배지를단독으로사용하여계대배양한 P1 및 P2와 DMEM-P와 KSFM-P배지를 66:33으로혼합한배지를이용하여계대배양한 P1 및 P2의면역학적특성을확인한결과, 각그룹의양막유래중간엽줄기세포들은모두 CD29, CD44, CD73, CD90, CD105 및 HLA-ABC에대하여양성인면역학적특성을나타내고, CD31, CD34, CD45 및 HLA-DR에대하여음성의면역학적특성을나타내었다. [0051] [0052] 실시예 6: 혼합배지에서배양된양막유래중간엽줄기세포의골분화정량 실시예 1 에서수득한 DMEM-P 단독배지및 DMEM-P/KSFM-P 혼합배지에서배양된양막유래중간엽줄기세포를골 형성유도배지 (Nonhematopoietic OsteoDiff Medium, Miltenyi Biotec) 에서 18 일동안배양 (37, 5% CO 2, 배 지교환주기 : 3~4 일 ) 하여중간엽줄기세포를골세포로분화유도시켰으며, 2 일마다분화배지를새로이교환하였 다. 골세포로의분화는정상산소상태및저산소상태 (1-5%) 로나누어실시하였으며, 각분화조건을표 6 에나 - 8 -

타내었다. [0053] 배양시작후 18일째에, Alizalin red S 염색법을이용하여양막유래중간엽줄기세포가골형성세포로분화되었음을확인하였으며, DMEM-P 단독배지에서배양된세포보다, 혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양된세포가높은골세포분화율을나타내었으며, 배양시에과산소상태에서배양된세포 (M-H-N)) 가더높은분화능을나타내었다 (

9 타내었다. [0053] 배양시작후 18일째에, Alizalin red S 염색법을이용하여양막유래중간엽줄기세포가골형성세포로분화되었음을확인하였으며, DMEM-P 단독배지에서배양된세포보다, 혼합배지 ( 그룹 2) 에서배양된세포가높은골세포분화율을나타내었으며, 배양시에과산소상태에서배양된세포 (M-H-N)) 가더높은분화능을나타내었다 ( 도 11 및도 12). 표 6 [0054] [0055] 이상으로본발명의내용을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서, 이러한구체적기술은단지바람직한실시양태일뿐이며, 이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할것이다. 따라서본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의등가물에의하여정의된다고할것이다. 도면 도면 1-9 -

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목차 1. 서론 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 간세포분화능평가시험법 분

목차 1. 서론 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 간세포분화능평가시험법 분 세포치료제시험정보집 7 줄기세포치료제의 간세포분화능평가시험 2015. 4. 30. 식품의약품안전평가원 차세대줄기세포기반제제평가연구사업단 목차 1. 서론 --------------------------------------------- 1 2. 줄기세포의간세포분화능평가시고려사항 --------------- 2 3. 간세포분화능평가시험법 -----------------------------