(2) 발명자 코모리케이이치로 일본 도쿄코토쿠후요키 18-4 가부시키가이샤림포텍내 쉬미츠, 노리오 일본 야마나시카이시우츠야

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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (1) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N /08 ( ) C12N /083 ( ) A1K 3/14 (200.01) A1P 31/00 (200.01) A1P 3/00 (200.01) A1P 3/00 (200.01) (21) 출원번호 (22) 출원일자 ( 국제 ) 2013 년 04 월 09 일 심사청구일자 2014 년 10 월 0 일 (8) 번역문제출일자 2014 년 10 월 0 일 (8) 국제출원번호 PCT/JP2013/00240 (8) 국제공개번호 WO 2013/13800 국제공개일자 (30) 우선권주장 2013 년 10 월 1 일 JP-P 년 04 월 10 일일본 (JP) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2014년12월23일 (1) 출원인 가부시키가이샤림포텍 일본국도쿄도고토쿠후유키 18 반 4 고 (2) 발명자 세키네테루아키 일본 도쿄코토쿠후요키 18-4 가부시키가이샤림포텍내 오수미카즈오키 일본 도쿄코토쿠후요키 18-4 가부시키가이샤림포텍내 ( 뒷면에계속 ) (4) 대리인 권오식, 김종관, 박창희 전체청구항수 : 총 13 항 (4) 발명의명칭메모리 T 세포를주성분으로하는림프구세포군의제조방법 () 요약 말초혈유래림프구세포는, 활성화배양을실시하기전에는약 0% 를미경험 T 세포가차지하지만, 활성화배양에의해그비율이저하된다. 한편, 배양시작전에는반수이하였던기억 T 세포의점유율은, 활성화배양으로인해증가하여 9% 에이르지만, 다시배양을계속하면점차감소한다. 본발명은, 항체등을사용하지않고간편하면서신속하게 CD4RO 양성의기억 T 세포군을대량으로조제하는방법, 상기방법에따라제작한기억 T 세포군을주성분으로하는의약용조성물등을제공하는것을과제로한다. 본발명은, 채취된림프구세포를활성화배양하고, 배양중의림프구세포군세포밀도가일정한임계값을초과한것을지표로하여, 림프구세포군에서의기억 T 세포의점유율이바람직한값에이른것을검지하고, 상기세포군을수확하여동결보존하며, 상기동결보존세포를해동하여배양하고증식시킴으로써, 기억 T 세포를주성분으로하는대량의림프구세포군을제조하는것을특징으로한다

2 (2) 발명자 코모리케이이치로 일본 도쿄코토쿠후요키 18-4 가부시키가이샤림포텍내 쉬미츠, 노리오 일본 야마나시카이시우츠야

3 특허청구의범위청구항 1 이하의공정 (a)~(c) 를순차적으로포함하는고증식배양법에따른, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조방법. (a) 채취된림프구세포를활성화배양하는공정 ; (b) 기억 T세포군의점유율상승을림프구세포밀도를바탕으로검지하여, 공정 (a) 의림프구세포를동결보존하는공정 ; 및 (c) 동결된림프구세포를해동하여활성화배양하는공정. 청구항 2 제 1항에있어서, 공정 (b) 의림프구세포밀도를바탕으로한기억 T세포군의점유율상승의검지는, 배양액내에부유하는림프구세포수를지표로하는것을특징으로하는제조방법. 청구항 3 제 1 또는 2항에있어서, 공정 (b) 의림프구세포밀도는, 배양액내에부유하는림프구세포수가 4 10 세포 /ml 이상인것을특징으로하는제조방법. 청구항 4 제 1 내지 3의어느한항에있어서, 활성화배양은 IL-2 및고상화항 CD3 항체의존재하에서배양하는것을특징으로하는제조방법. 청구항 제 1 내지 4의어느한항에있어서, 공정 (c) 는해동후 2주간이내에완료하는것을특징으로하는제조방법. 청구항 제 1 내지 의어느한항에있어서, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군은, 림프구세포군의기억 T세포의점유율이 % 이상인림프구세포군인것을특징으로하는제조방법. 청구항 제 1 내지 의어느한항에있어서, 기억 T세포는, 중심기억 T세포를림프구세포군의 0% 이상포함하는것을특징으로하는제조방법. 청구항 8 제 1 내지 의어느한항에있어서, 분리된림프구세포가사람말초혈유래인것을특징으로하는제조방법. 청구항 9 제 1 내지 8의어느한항에있어서, 림프구세포군이제3자에게투여하기위한것인것을특징으로하는제조방법

4 청구항 10 림프구세포군의 % 이상의기억 T세포를포함하는것을특징으로하는림프구세포군. 청구항 11 제 10항에있어서, 림프구세포군의 0% 이상의중심기억 T세포를포함하는것을특징으로하는림프구세포군. 청구항 12 제 10 또는 11항에따른림프구세포군을유효성분으로하는의약조성물. 청구항 13 이하의 (A)~(D) 의수단을구비하는, 고증식배양법에따른기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템. (A) 림프구세포의활성화배양수단 ; (B) 림프구세포밀도를바탕으로하는기억 T세포군의점유율상승검지수단 ; (C) 림프구세포의동결보존수단 ; 및 (D) 동결된림프구세포의해동수단. 명세서 [0001] 기술분야본발명은, T세포를함유하는말초혈유래의 CD4RO 양성이면서 CD2L 양성인 T세포군, 또는 CD4RO 양성이면서 CD2L 음성인 T세포군을간편하게대량으로수득하기위한메모리 T세포를주성분으로하는림프구세포군의대량제조방법, 이러한림프구세포군을함유하는의약조성물및상기림프구세포군의제조시스템 ( 장치등의수단의조합 ) 등에관한것이다. [0002] [0003] 배경기술림프구세포는생체방어를위한면역계를담당하는중요한수단으로서최근많은주목을받고있다. 림프구세포의표면에는분화항원이라불리는항원형이발현하고있으며, 림프구세포는이항원형에따라다양한서브세트 (subset) 로분류되고있다. 예를들면, 림프구세포는 CD3(CD는 cluster of differentiation의약자임 ) 발현유무를단일클론항체의반응성에따라검출함으로써, 세포성면역에관여하는 T림프구세포 (CD3 양성, CD3 +로도나타냄, 이하양성을 +, 음성을 -로도기재함 ) 와체액성면역에관여하는 B림프구세포등 (CD3 음성, CD3-로도나타냄 ) 으로구별된다. 그리고, 이들림프구세포는그기능도다르다. 더욱이, 세포성면역에관여하는 T림프구세포 (T세포라고도함 ) 는, CD4를발현하는 CD4 양성세포와 CD8을발현하는 CD8 양성세포로분류된다. 종래에는 CD4 양성세포는헬퍼 (helper) 기능을완수하고, CD8 양성세포는세포장해성기능을완수하는것으로여겨져왔으며, 지금까지 CD4 양성세포와 CD8 양성세포를분리하는연구가다수이루어지고있다. 림프구세포를형태로구별하는것은어렵지만, 상기와같이항원형을기초로각서브세트로나누어기능을해석하는것이다수이루어지고있다. 그러나, 그대부분이주로각각의세포의항원형에대한단일클론항체, 예를들어항 CD4 단일클론항체나항 CD8 단일클론항체를사용한것이었다. 그리고, 자기마이크로비즈에결합한항체를림프구세포와반응시키고, 용기외부에서댄자석의자력으로자기마이크로비즈를모아상기비즈에항체를개입시켜결합한세포를분리하거나, 분리컬럼을이용해서분리하는방법이다. 또한, CD4 양성세포나 CD8 양성세포를대량으로수득하기위해, 마이크로비즈법에따라각각을분리한후, 다시활성화하여증폭배양하는방법도실시되고있다 ( 특허문헌 2 참조 ). 또한최근에는, 측정기기의진보로의해, 각각의표면항원에대한형광표지항체로림프구세포를염색하고, 셀소터 (cell sorter) 를이용하여분별하는방법도실시되고있다. 이러한방법은, 세포표면항원에대한항체를미리형광색소로표지하여표지항체를림프구세포에결합시키고, 이림프구세포를셀소터에의한측정에제공하여표면항원의발현상태를검출하고, 또한서브세트를분리한다. 그러나, 이러한방법은소규모에서의적용이라는점이문제였다 ( 비특허문헌 2 참조 )

5 어떤종래방법을채용하든, 고가의항체로림프구세포를표지하는등의복잡한작업을피할수없으며, 대량 의세포를수득하기위해서는비용과노력이필요했다. [0004] [000] [000] [000] [0008] 활성화 T림프구세포의제조방법, Sekine등에의한보고가최초이다. 이는, 활성화 T림프구세포군의증식을선택적으로자극하여증식된활성화 T림프구세포군을수득하는방법을최초로보고한것으로, 구체적으로는, 사람의말초혈림프구세포 (PBMC:Peripheral Blood Mononuclear Cell) 를항 CD3 항체의하나인 OKT3 항체가고상화 ( 固相化 ) 된배양플라스크내에서제1기배양하고, 이렇게배양된세포를 OKT3 항체의비존재하에서제2 기배양하는것이다. 이러한방법으로수득된활성화림프구세포군은다시인터루킨2(IL-2) 의존재하에서의배양을거쳐, 암의양자면역치료법으로해당말초혈을채취한환자에게투여할수있다 ( 특허문헌 1 참조 ). 또한, 동일하게하여, 도너유래의말초혈림프구세포를 OKT3 항체가고상화된배양용기에서 IL-2의존재하에서배양하고, 수득된활성화림프구세포군으로부터 CD4 양성세포를분리하고, 분리된 CD4 양성세포가총세포대비 90% 이상함유된제제로한, 감염증, 종양재발, 자기면역질환의예방용및치료용의약조성물을환자에게투여할수도있다 ( 특허문헌 2 참조 ). 이들림프구세포원으로는, 종양침윤림프구세포 (TIL:Tumor Infiltrating Lymphocyte), 재대혈, 골수등이사용가능하다 ( 특허문헌 2 참조 ). 다른기능적관점에서, 림프구세포를미경험 (naive) 림프구세포와기억 (memory) 림프구세포로분류하는경우가있다. 미경험림프구세포는아직항원자극을받지않은, CD4RA 항원을세포표면에발현하고있는림프구세포이며, 국소림프절등에서항원과만나자극을받는중에활성화되는것으로여겨지고있다. 기억림프구세포는, 특이적자극이나비특이적자극을불문하고, 이미항원자극을받아 CD4RO 항원을발현하고있는림프구세포이다. T림프구세포나 B림프구세포도각각의상태에따라미경험 T세포와기억 T세포, 미경험 B세포와기억 B세포로나눌수있다. 기억 T세포는다시효과기억 (effector memory;em) T세포와중심기억 (central memory;cm) T세포로나눌수있다. 중심기억 T세포에는림프절로귀소 (homing) 하여체내에침입하는이물이나항원과맞서싸우는기능이있으며, 효과기억 T세포에는본래있어야할부위에소속하여이물이나항원을붙잡는작용이있다. 따라서, 기억 T세포군을주성분으로함유하는제제는, 양자면역치료법에있어서높은치료효과를얻을수있는것으로예상되었다. 이에, Osumi등은양자면역치료법에사용되는활성화림프구세포의작용메카니즘을해명하기위해, 기억 T세포서브세트에주목하여, 활성화증폭배양하여수득된활성화림프구세포군의기능을해석했다. 그결과, 활성화림프구세포군에포함되는효과기억 T세포가종양세포와의공배양시작 24시간후에암세포에대한세포장해활성을발현했다는것, 한편중심기억 T세포는암세포와공배양을시작하여종양항원을인식한 48시간후에암세포에대한세포장해활성을발현한것으로, 그때효과기억 T세포로분화했다는것이밝혀졌다 ( 비특허문헌 2 참조 ). 기억 T세포를채취한보고는 Sekine 등에의한 2000년의문헌으로거슬러올라가며 ( 특허문헌 3 참조 ), 이는, 재대혈유래의림프구세포를항 CD3 항체와 IL-2의존재하에서활성화배양하고, 일간활성화증식시킨결과, CD3 양성세포의비율이 98%, CD4RO 양성세포의비율이 3% 인세포집단을채취한것이다. 그러나, 이시기의세포는증식이충분하지않아세포수가적다는문제가있었다. 상기의활성화림프구세포는증식배양후신속하게환자에게투여할필요가있으며, 병의상태에맞는신속한투여와안정적인품질관리가어려웠다. 이에, 환자의편의을고려하여, 환자혈에서림프구세포를조제할때활성화배양후에림프구세포를동결보존한보고가있다 ( 비특허문헌 1 참조 ). 여기서는동결해동한림프구세포를재차활성화배양하여수득되는활성화림프구세포중의 CD4 림프구세포및 CD8 림프구세포의점유율이산출되었으며, 거의모든개체군이거의병행적으로증식하고있다고결론짓고있다. 비특허문헌 3에서는, 재대혈및말초혈에서유래하는림프구세포를분리한후, 일단동결보존하고, 해동후에활성화배양했을때의서브세트변화를배양기간중추적한결과가개시되어있다. 재대혈및말초혈에서유래하는림프구세포는모두, 기억 T세포의서브세트인중심기억 T세포가배양시작후빠르게증식하여 일 ~일에증식이피크에이르고그후감소한다는것, 효과기억 T세포가배양후기에증식한다는것이보고되어있다. 또한, Sekine 등은, 환자의림프구세포를인비트로 (in vitro) 증식 / 활성화배양시킨후초저온냉각기내에서동결 / 보존하고, 사용시에동결상태로부터해동시킨직후에생리식염액을가하여현탁시켜투여용제제로하는투여용제제의제조방법 ( 특허문헌 4 참조 ) 이개시되어있다. 상기와같이양자면역치료법에서의기억 T세포의이용의유효성이시사되고있으며, 기억 T세포가풍부한분획을대량으로간편하게채취하는것이사회적요구라고할수있다. 그러나, 림프구세포제공자에게큰부담을강요하지않고임상에제공하기위해필요한기억 T세포를대량으로간편하게채취하는방법은없는것이현재상황이다. - -

6 선행기술문헌 [0009] 특허문헌 ( 특허문헌 0001) 특허문헌 1: 일본특허공개평 호공보 ( 특허문헌 0002) 특허문헌 2: 일본특허제 호공보 ( 특허문헌 0003) 특허문헌 3: 일본특허공개 호공보 ( 특허문헌 0004) 특허문헌 4: 특허제 호공보 [0010] 비특허문헌 ( 비특허문헌 0001) 비특허문헌 1: Sekine T., Human Cell, (3) (1992) ( 비특허문헌 0002) 비특허문헌 2: 제 32 회암면역외과연구회프로그램 / 초록집 103 페이지 2011 년 4 월 ( 비특허문헌 0003) 비특허문헌 3: Shikamura M., et al., Biotherapy 23(3) 2-22 (2009) 발명의내용 [0011] 해결하려는과제말초혈유래림프구세포군은, 활성화배양을실시하기전에는약 0% 를미경험 T세포가차지하고있지만, 활성화배양에의해그비율이저하된다. 한편, 배양시작전에는반수이하였던기억 T세포의점유율은활성화배양에의해증가하여 9% 에이르는데, 다시배양을계속하면점차감소한다. 본발명은, 항체등을사용하지않고간편하면서신속한고증식 ( 高增殖 ) 배양법에따라, CD4RO 양성의기억 T세포군을대량으로조제하는방법, 또는상기방법에따라제작한기억 T세포군을주성분으로하는의약용조성물등을제공하는것을과제로한다. [0012] [0013] [0014] 과제의해결수단본발명자들은, 활성화림프구세포에포함되는기억 T세포의비율을상승시키는것을목적으로다양한조건으로검토를거듭하여노력한결과, 말초혈림프구세포를항 CD3 항체고상화플라스크에 IL-2를포함하는배양액내에서활성화배양하면, 시간이경과함에따라세포표면항원이 CD4RO 양성이면서 CD2L 양성 (CD4RO+, CD2L+) 인 T세포군, 또는 CD4RO 양성이면서 CD2L 음성 (CD4RO+, CD2L-) 인 T세포군, 즉기억 T세포군이증가하여, 림프구세포군에서차지하는비율이상승하는것을발견하였다. 그러나, 이시점에서는아직총세포수가적기때문에배양을더계속할필요가있지만, 배양을계속하면기억 T세포군의비율이감소로바뀐다는것이판명되었다. 이에본발명자들은, 기억 T세포군의비율을감소시키지않고림프구세포를증식시켜, 기억 T세포군을주성분으로하는군을대량으로제조하는방법에대해예의검토했다. 그결과, 기억 T세포를대량으로수득하기위해, 활성화배양중인림프구세포군중의표면항원이 CD4RO+, CD2L+ 및 / 또는 CD4RO+, CD2L-인 T세포군의비율이바람직한비율로상승할때까지배양을계속하고, 그리고그바람직한비율까지상승한림프구세포군을수확할때에는, 세포밀도가일정한임계값을초과하는것을지표로하여상기수확한세포를동결보존한후, 다시활성화증폭배양함으로써상기과제를해결했다. 즉, 기억 T세포군의점유율의상승과활성화배양림프구세포군의세포밀도의관계를발견함으로써, 세포수확의지표가되는일정한임계값이상의세포밀도인것이, 상기기억 T세포군이바람직한점유율에이르렀다는것을의미한다는것이었다. 이로써, 세포밀도의측정이라는간편하고저비용의수단으로, 충분한세포수및높은기억 T세포군점유율을갖는세포군의수확에최적인시기를검지할수있게되었다. 또한, 파종시의세포밀도를관리함으로써, 수확까지의배양기간을최적으로제어가능한것도발견하여, 단시간에충분한세포수및높은기억 T세포군점유율을갖는세포군을수확할수있었다. 이와같이항체등을사용하지않고간편하고낮은비용으로기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군을대량제조하는방법을개발하기에이른것이다. 즉, 본발명은, [1](a) 채취된림프구세포를활성화배양하는공정 ; (b) 기억 T세포군의점유율상승을림프 - -

7 구세포밀도를바탕으로검지하여, 공정 (a) 의림프구세포를동결보존하는공정 ; 및 (c) 동결된림프구세포를해동하여활성화배양하는공정 ; 의 (a)~(c) 공정을순차적으로포함하는고증식배양법에따른기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조방법, [2] 공정 (b) 의림프구세포밀도를바탕으로한기억 T세포군의점유율상승의검지가, 배양액내에부유하는림프구세포수를지표로하는것을특징으로하는상기 [1] 에기재된제조방법, [3] 공정 (b) 의림프구세포밀도는, 배양액내에부유하는림프구세포수가 4 10 세포 /ml 이상인것을특징으로하는상기 [1] 또는 [2] 에기재된제조방법, [4] 활성화배양이 IL-2 및고상화항 CD3 항체의존재하에서배양하는것을특징으로하는상기 [1]~[3] 의어느하나에기재된제조방법으로이루어진다. [001] [001] 또한본발명은, [] 공정 (c) 를해동후 2주간이내에완료하는것을특징으로하는상기 [1]~[4] 의어느하나에기재된제조방법, [] 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군이, 림프구세포군의기억 T세포의점유율이 % 이상인림프구세포군인것을특징으로하는상기 [1]~[] 의어느하나에기재된제조방법, [] 기억 T세포가, 중심기억 T세포를림프구세포군의 0% 이상포함하는것을특징으로하는상기 [1]~[ ] 의어느하나에기재된제조방법, [8] 분리된림프구세포가사람말초혈유래인것을특징으로하는상기 [1]~[] 의어느하나에기재된제조방법, [9] 림프구세포군이제3자에게투여하기위한것인것을특징으로하는상기 [1]~[8] 의어느하나에기재된제조방법으로이루어진다. 또한, 본발명은, [10] 림프구세포군의 % 이상의기억 T세포를포함하는것을특징으로하는림프구세포군, [11] 림프구세포군의 0% 이상의중심기억 T세포를포함하는것을특징으로하는상기 [10] 에기재된림프구세포군, [12] 상기 [10] 또는 [11] 에기재된림프구세포군을유효성분으로하는의약조성물, [13 ](A) 림프구세포의활성화배양수단 ; (B) 림프구세포밀도를바탕으로하는기억 T세포군의점유율상승검지수단 ; (C) 림프구세포의동결보존수단 ; 및 (D) 동결된림프구세포의해동수단 ; 의 (A)~(D) 수단을구비하는, 고증식배양법에따른기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템으로이루어진다. [001] [0018] 발명의효과본발명에따르면, 말초혈유래의활성화림프구세포에함유되는 CD4RO+ 이면서 CD2L+, CD4RO+이면서 CD2L-인기억 T세포군을주성분으로하는림프구세포군을간편하면서대량으로제공할수있다. 활성화림프구세포군에포함되는기억 T세포군의증식을추적함에있어서, 종래방법에서실시되는세포표면항원의해석이라는, 고가의항체를사용한복잡한방법을이용하지않고, 활성화배양액내의세포수, 특히부유림프구세포수를계측하여세포밀도를산출하고미리설정된일정한임계값과비교하는, 지극히간편하고낮은비용의방법으로기억 T세포의증식및점유율의상황을파악할수있다. 이로써, 세포수확에최적인시기를찾아내세포를수확할수있을뿐아니라, 이렇게수확한세포를동결보존함으로써, 기억 T세포의점유율이증가한상태의림프구세포군을유지하며적절히사용할수있게된다. 또한, 동결한기억 T세포군을해동후에재차활성화배양함으로써, 높은기억 T세포군점유율을유지하면서세포군이증폭되어, 그결과, 기억 T세포군을주성분으로하는대량의림프구세포군을수득할수있도록한다. 또한, 본발명의제조방법은, 림프구세포수와배양시간, 그리고최종적으로수득되는기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의양에대해상세히검토한결과, 해동후 2주간이내의단기간에기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군을대량제조할수있다는효과도갖는다. 본발명에서는, 중심기억 T세포와효과기억 T세포를포함하는기억 T세포군의활성화배양에의한점유율증가를검지하고, 동결처리를실시하는공정을거쳐, 높은기억 T세포점유율을갖는림프구세포군을제조한다. 중심기억 T세포에는림프절로귀소하여체내에침입하는이물이나항원과맞서싸우는기능이있으며, 효과기억 T세포에는본래있어야할부위에소속하여이물이나항원을붙잡는작용이있다. 따라서, 상기기억 T세포군을주성분으로하는림프구세포군은, 동일생체로되돌리는양자면역치료법이나제3자에게투여하는의약조성물로이용할수있으며, 종래에양자면역치료법등에사용되고있던기억 T세포의점유율이낮은림프구세포군보다훨씬높은치료효과를기대할수있다. [0019] 도면의간단한설명도 1은활성화배양기간 1,,, 13일째의림프구세포를세포표면항원 (CD4RO, CD2L, CD3) 의유무에따라분류한결과를나타내는도면이다 (n=3). 말초혈림프구세포에서차지하는 CD4RO+CD2L+의 T림프구세포 (CM) 및 CD4RO+CD2L-의 T림프구세포 (EM) 의합계인기억 T세포 (memory) 의점유율은 일째, 일째에는 90% 를초과 - -

8 하지만배양이계속됨에따라저하된다. 도 2는동결보존전, 활성화배양후의세포군에서점유율이상승한기억 T세포군은, 동결해동후, 활성화배양및증폭배양과정에서도높은존재비율로유지되는것을나타내는도면이다 (n=3). 도 3은본발명의기억세포를주성분으로하는의료조성물의제조공정의개요를나타내는도면이다. 도 4 동결보존하지않는종래방법으로제작한활성화림프구세포군 (A) 과본발명의방법에따라제작한활성화림프구세포군 (B) 에서의, 각세포의존재비율을세포표면항원 (CD4RO, CD2L, CD3) 의유무를바탕으로분류해조사한결과를나타내는도면이다. PBMC: 배양시작시의말초혈관에서채혈분리한단핵구세포 ( 림프구세포-풍부분획 ), +0: 배양시작후 4일째에 0mL의배지를첨가하기직전의세포, +10 및 Freeze: 배양시작후 일째에 2번째배지첨가또는동결처리를실시하기직전의세포, 생BP: 동결공정에보내지않고 + 10에서추가로배양규모를확대하기직전의세포, 생H: 상기생BP의배양을종료하여수확하기직전의세포, TW(Thaw): 동결세포를해동한직후의세포, OKT: 확대배양종료후의 OKT3 항체에의한활성화배양2 직전의세포, 해동BP: 증폭배양에들어가기직전 ( 활성화배양2 후 ) 의세포, 해동H(Harvest): 증폭배양2 후의세포를나타낸다. [0020] [0021] [0022] [0023] 발명을실시하기위한구체적인내용본발명에있어서 ' 기억 T세포 ' 란, 림프구세포표면항원으로서 CD4RO를발현하는 T세포를말하며, 이러한기억 T세포로는중심기억 T세포또는효과기억 T세포를예시할수있다. 림프구세포는그표면에다양한세포표면항원을발현하며, 표면항원를바탕으로다수의서브세트로분류구별할수있다. 예를들어, 림프구세포는 T세포와 B세포로나눌수있는데, T세포는그표면에 CD3 표면항원을가짐으로써 B세포와구별된다. 또한, 표면항원으로는 CD4RO나 CD4RO의이소폼 (isoform) 인 CD4RA 항원이있으며, 이러한항원의유무에따른분류가있다. CD4RO는 CD4RA를발현하는미경험림프구세포가특이적이든비특이적이든항원자극을받았을때 CD4RA를대신해발현하는기억세포의지표의하나가되는항원형이다. CD2L은셀렉틴군 (selectin family) 에속하는 4kDa의당단백질로, 대부분의림프구세포에발현하고있으며, 림프구세포의림프절로의귀소 (homin g) 에관여하는세포접착분자이다. 이는세포표면항원으로서미경험세포에서도발현하지만, CD4RO의발현을수반하는경우, CD2L의발현강도에따라중심기억또는효과기억이라는기억세포서브세트의구별이가능해진다. 그리고, CD4RO+이면서 CD2L+인표면항원을갖는 T세포는중심기억 T세포로, CD4RO+이면서 CD2L-인표면항원을갖는 T세포는효과기억 T세포로여겨지고있다. 즉, 림프구세포표면에항원 CD3를발현하고있는 CD3 양성 (CD3+) 인 T세포중, 세포표면항원 CD4RO 양성이면서 CD2L 양성인 T세포군 (CD4RO+, CD2L+) 은중심기억 T세포군, 세포표면항원 CD4RO 양성이면서 CD2L 음성인 T세포군 (CD4RO+, CD2L-) 은효과기억 T세포군이며, 이들중심기억 T세포군과효과기억 T세포군을합쳐기억 T세포군을구성한다. 이러한세포표면항원의검출은, 형광색소로표지한항체 ( 항 CD3 항체, 항 CD4RO 항체, 항 CD2L 항체 ) 를이용해림프구세포를염색하고, 예를들어 FACS Calibur(Becton Dickinson) 등의유세포분석기 (flow cytometer) 를이용해그형광색소표지항체의유무및세포수를계측할수있다. 또한, 림프구세포를형광색소표지항체또는 1차항체및형광표지 2차항체로염색하고, 공초점레이저형광현미경으로관찰할수도있다. 통상적으로, 정상인의말초혈림프구세포군에서의기억 T세포의점유율은 40% 전후이지만, 본발명의제조방법에따라그점유율을상승시킬수있다. 본발명에있어서 ' 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군 '( 이하, ' 기억 T세포고함유림프구세포군 ' 이라고도한다 ) 은, 기억 T세포고함유림프구세포군에서의기억 T세포의점유율이바람직하게는 0% 이상, 보다바람직하게는 0% 이상, % 이상, 80% 이상, 8% 이상, 보다바람직하게는 90% 이상, 더욱더바람직하게는 9% 이상의림프구세포군을의미한다. 그중에서도, 림프구세포군에서의기억 T세포의점유율이 % 이상인것이바람직하다. 또한, 본발명의림프구세포군으로는, 림프구세포군의 0% 이상, 보다바람직하게는 % 이상, 80% 이상, 8% 이상, 보다바람직하게는 90%, 더욱더바람직하게는 9% 이상이중심기억 T세포인것이바람직하다. 아울러, 본발명의기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군은, 기억 T세포이외의 T세포의혼입을제외하는것은아니다. 또한, 본발명의기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조방법에서는, 공정 (a)~(c) 를순차적으로포함하는고증식배양법에따라, 동일생체로되돌리는양자면역치료법의실시나제3자에게투여하는의약조성물의조제를위한충분한양의기억 T세포고함유림프구세포군을제공할수있다. 여기서, 고증식 ( 高增殖 ) 배양법이란, 채혈시료내의림프구의수를 00배이상, 바람직하게는 00배이상, 00배이상, 800배이상, 보 - 8 -

9 다바람직하게는 900배이상으로증식시킬수있는배양방법이며, 이러한배양법을통해, 예를들어 0mL의혈액에서수득되는기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군에서의총림프구의수가, 바람직하게는 10 8 개이상, 보다바람직하게는 개, 더욱바람직하게는 개이상, 가장바람직하게는 개이상, 기억 T세포를고함유하는림프구세포군을수득할수있다. 또한, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의세포밀도가 10 4 개 /ml 이상, 바람직하게는 1 10 개 /ml 이상, 10 개 /ml 이상, 보다바람직하게는 1 10 개 /ml 이상인기억 T세포고함유림프구세포군을수득할수있다. [0024] [002] [002] [002] [0028] 또한, 공정 (a) 의 ' 채취된림프구세포 ' 로는, 통상의방법에따라채취된말초혈이나재대혈유래뿐아니라골수유래의림프구세포를예시할수있으나, 채취기회나채취의용이성의측면에서말초혈유래의림프구세포가바람직하다. 이러한말초혈로는타인유래말초혈이나자기유래말초혈을예로들수있으나, 양자면역치료법에이용할때는자기유래말초혈이유리하게이용된다. 종양및그재발, 및바이러스감염증이나자기면역질환에대한예방및치료의관점에서, 장기또는골수이식등을받은환자의경우는이식장기또는골수등의제공자유래의말초혈인것이바람직하다. 또한, 채취된림프구세포로서분리 (isolation) 된림프구세포를이용하는것이바람직하며, 이러한분리된림프구세포는, 혈관으로부터의채혈이나페레시스 (pheresis) 등에의해채취된말초혈, 바람직하게는정맥으로부터채취된말초혈을일반적인방법으로처리함으로써수득할수있다. 말초혈에서림프구세포의분리는, 자당이나시판의림프구세포분리제등을이용한불연속밀도구배원심법등의주지의림프구세포분리법에따라취득할수있다. 림프구세포분리용말초혈은, 혈액의응고가일어나지않도록헤파린이나구연산을가한것을사용할수있다. 상기말초혈의양은특별히제한되지않으며, 도너의부담, 채혈시간, 림프구세포의분리조작등를바탕으로적절히설정할수있으며, 1회에채혈하는양을 0.01mL 내지 100mL정도, 보다바람직하게는 ml 내지 0mL정도, 더욱더바람직하게는 10mL 내지 20mL로할수있다. 또한, 림프구세포의유래가특별히사람으로제한되는것은아니며, 원숭이, 말, 양, 염소, 돼지, 개, 고양이, 랫트, 생쥐, 햄스터도예로들수있으나, 본발명의림프구세포군을사람에게투여하는경우에는사람유래인것이바람직하다. 또한, 본발명의림프구세포군은, 투여대상유래일수도있고, 투여대상이외의개체유래일수도있다. 즉, 도너와수여자 (recipient) 는동일할수도있으며일치하지않을수도있다. 공정 (a) 나공정 (c) 에서의 ' 활성화배양 ' 으로는, 인비트로 (in vitro) 배양을통해기억 T세포군의점유율을상승할수있는, 예를들어일본특허공개평 3-800호공보에기재된바와같은주지의림프구세포의활성화배양이면특별히제한되지않으나, 인터루킨2(IL-2) 의존재하에서배양하는것이바람직하며, IL-2와항 CD3 항체의존재하에서배양하는것이보다바람직하다. 예를들어, IL-2를포함하는배양용배지에림프구세포를부유시키고, 항 CD3 항체를고상화한배양용기내에서의배양을바람직하게예시할수있다. 또한, 필요에따라각종마이토젠 (mitogen) 을사용하여림프구세포의활성화를실시할수있다. 상기항 CD3 항체로는, 림프구세포표면의 CD3 표면항원을인식하고증식 / 활성화를촉진할수있는항체면어느것이든사용할수있다. 림프구세포의활성화자극에사용하는항 CD3 항체는, 정제한 CD3 분자를사용하여동물또는세포에서생산할수도있지만, 안정성및용이성이우수한시판품인 OKT-3 항체 ( 제조원 :ebio) 를유리하게사용할수있다. 그리고, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템의림프구세포의활성화배양수단으로는, 세포의배양에통상적으로이용되는수단, 예를들어, 세포배양용기, 세포배양장치, 세포배양조등을들수있다. 상기활성화배양에서의배양법으로는, 고증식배양법을실시완료한후기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군이높은증식율로대량제조되는한, 그조건은특별히제한되지않는다. 활성화배양은, 항 CD3 항체의자극정보가림프구세포에전달될것, 기억 T세포군이증식하여림프구세포군에대한점유율을상승시키고, 또한이렇게상승한점유율이큰폭으로감소하지않을것이전제가되기때문에, 활성화배양의배양기간은, 충분한수의림프구세포가수득될때까지, 1~10일간, 보다바람직하게는 2~8일간, 더욱더바람직하게는 3~일간, 특히바람직하게는 4~일간을예시할수있다. 이배양기간중의배지의교환빈도에특별히제한은없지만, 배양액의열화및 IL-2 활성의저하를방지하기위해, 1~일에 1번실시하는것이바람직하며, 첨가전의배양액내의액량대비 0.1~배정도의양을첨가하는것이바람직하다. 공정 (a) 에서림프구세포의활성화배양을실시하는데, 통상적으로활성화배양림프구세포에는플라스크바닥면에부착되어증식하는세포도있고, 활성화를받은후배양액내에부유하면서증식해가는세포도있다. 부착되어증식하는세포는, 부유세포와마찬가지로생세포이다. 배양액이활성화배양시작시의배양액과동량인배양방법을이용할수도있지만, 배양도중에추가로배양액을첨가하여수일, 예를들어 1~2일활성화배양을 - 9 -

10 계속하여림프구세포를더욱증식하는배양방법을이용할수도있다. 상기배양액의첨가량은, 활성화배양시작시의배양액량의 0.~2배의양이바람직하고, 그중에서도활성화배양시작시의배양액량과동량의배양액을바람직하게예시할수있다. 상기배양액을추가로첨가하여계속배양할때에는, 배양액내에부유하는림프구세포만을계대배양할수도있지만, 부유림프구세포와함께배양용기에접착된림프구세포모두를계대배양할수도있다. [0029] 또한, 공정 (a) 의활성화배양에서, 배양시작시의림프구세포수에특별히제한은없으나, 세포배양에서배양시작시의세포수가너무적으면세포증식곡선이일어날때까지의기간이지체되며, 반대로너무많으면조기에정체기 (plateau) 에이르러배양액을첨가해전체량을늘리는등의방법을채용할수없기때문에, 충분한양의세포를수득할수없다. 따라서, 림프구세포의증식이신속하게일어나도록하는동시에, 상기 T세포군이증식하여활성화림프구세포에서차지하는비율이신속하게상승하여충분한양의세포를수득할수있도록, 시작시의파종수를조정하는것이바람직하다. 예를들어, ~ 세포 /ml, 바람직하게는 ~.0 10 세포 /ml, 보다바람직하게는 ~.0 10 세포 /ml로조제하여배양을시작하는것이바람직하다. 또한, 배양용기의용량및배양액량은, 조작성을고려하여적절히선택할수있으며, 예를들어 22cm 2 의플라스크에배양액 0mL, 또는 2cm 2 의플라스크에배양액 ml를사용하는것을예시할수있다. [0030] [0031] 상기와같이본발명의활성화배양에서는, 림프구세포의증식효율이나조작의용이성의관점에서, 항 CD3 항체를고상화하여사용하는것이바람직하다. 항 CD3 항체를고상화하는지지체로는, 유리, 폴리우레탄, 폴리올레핀, 폴리스틸렌등의재질로이루어진각종플라스크, 샬레, 플레이트, 백 (bag) 을사용할수있다. 입수가용이하기때문에, 시판의플라스틱제의멸균완료세포배양용플라스크등의기구를사용할수도있으며, 그크기는적절히선택할수있다. 상기항체의고상화방법은, 비특이적흡착이나화학결합에의한방법으로도실시할수있으나, 고상화한항 CD3 항체에의해림프구세포를자극할수있는고상화방법이면어떠한방법이라도좋다. 고상화는, 상기항 CD3 항체의희석액을고상화하는기구에분주하고, 예를들어 4~3 에서 2~24시간정치시킴으로써실시할수있다. 상기항 CD3 항체의희석액은, 멸균된둘베코 (dulbecco) 인산완충액등의생리적인완충액에항 CD3 항체를 1~30μg /ml의농도로희석하여희석액으로만들어이용하는것이바람직하다. 고상화기구는사용시까지냉장실이나냉장고 (4 ) 에서보존할수있으며, 사용시에상기희석액을제거하고, 상온의둘베코인산완충액등의생리적인완충액으로세척하는것이바람직하다. 또한상기와같이, 본발명의활성화배양에서는, 배양용배지액내에인터루킨2(IL-2) 를사용하는것이림프구세포의증식효율의관점에서바람직하다. IL-2는배양용배지액의농도가 1~2000U/mL가되도록희석해서사용하는것이바람직하다. 상기 IL-2로는시판품을이용할수있다. IL-2는물, 생리식염액, 둘베코인산완충액, RPMI-140, DMEM, IMDA, AIM-V 등의일반적으로폭넓게이용되는세포배양용배지액등에용해하여사용할수있다. 또한, 일단용해한것은활성의저하를막기위해냉장보존하는것이바람직하다. 또한, 상기활성화배양에서의배양액으로는, 림프구세포의배양에적합한것이라면특별히제한되지않으며, 혈청등의생물유래성분을함유하는배양액이나평형염류용액에아미노산, 비타민, 핵산염기등을부가한합성배지를사용할수있다. 구체적으로는, RPMI-140, DMEM, IMDA, AIM-V 등을예로들수있으며, 그중에서도 AIM-V가특히바람직하다. 배양용배지는, 정상사람혈청을첨가한것이증식효과가뛰어나기때문에바람직하다. 이러한배지및사람혈청은시판품을이용할수있다. 배양은일반적인세포배양의방법에따라실시할수있다. 예를들어, CO 2 인큐베이터내에서실시할수있다. CO 2 농도는 1~10%, 특히 % 가바람직하며, 온도는 30~40, 특히 3 가바람직하며, 습도는 90~100%, 특히 9% 가바람직하다. [0032] [0033] 본발명서의고증식배양법에서는, 상기활성화배양의전후에림프구세포의증식을위한배양을실시할수도있다. 상기배양으로는, IL-2의존재하에서항 CD3 항체의비존재하에서의배양 ( 확대배양이나증폭배양 ) 을예로들수있으며, 그배지성분은적절히조절할수있다. 예를들어, 공정 (c) 에서의해동한림프구세포의활성화배양에이어실시되는증폭배양에서는, 부유림프구세포및접착림프구세포를계대배양하여 4~13일실시하는배양을예로들수있다. 또한, 상기확대배양이나증폭배양에서의배양액으로는, 림프구세포의배양에적합한것이라면특별히제한되지않으며, 혈청등의생물유래성분을함유하는배양액이나평형염류용액에아미노산, 비타민, 핵산염기등을부가한합성배지를사용할수있으며, 시판품을입수할수있다. 구체적으로는, RPMI-140, DMEM, IMDA, AIM-V 등을예로들수가있으며, 그중에서도 AIM-V가특히바람직하다. 또한, 공정 (b) 에서의 ' 림프구세포밀도를바탕으로검지 ' 란, 공정 (a) 의림프구세포의인비트로에서의활성화배양에서, 필요에따라순차적으로배양액내의세포수를계측하면서세포밀도가일정한임계값이상이될

11 때까지활성화배양을계속할지를판단하는것을말한다. 세포밀도가일정한임계값, 예를들어 4 10 세포 /ml 이상이되었을경우, 활성화배양액내의기억 T세포의점유율상승을검지하는것이다. 상기림프구세포밀도를바탕으로한검지에는, 현미경을이용한림프구세포수의직접측정이나세포계수장치를이용한직접측정외에, 일정한세포배양조건하에서간접적으로림프구세포수를검지하는것이포함된다. 즉, 미리특정세포수의림프구를일정한활성화배양조건하에서배양했을때의세포수의측정데이터를바탕으로간접적으로림프구세포수를추측함으로써이루어지는검지도포함된다. 또한, 림프구를활성화배양하면, 일부세포는배양용기의바닥면에부착되어활성화증식하고, 일부세포는배양액내에부유하며증식한다. 한편, 활성화배양중에는순차적으로배양액내의세포수를계측하면서배양을계속한다. 그때문에복수회에걸쳐림프구세포수를계측하는경우가있다. 이경우, 바닥면에부착된림프구세포를피펫등을이용해박리하고, 박리림프구세포와부유림프구세포를균일한현탁액으로하여계측하면, 박리한림프구세포가그후증식을정지하는경우가있다. 이러한경우보다많은림프구세포를수확한다는관점에서문제가있기때문에, 배양중의세포수의계측은, 부착된세포를박리시키지않고부유림프구세포수를계측하는것이바람직하다. 부유림프구세포수와부착림프구세포수나총림프구세포수는어느정도연광성이있는것으로생각되므로, 부유림프구세포수를계측함으로써증식의추세를추측할수있다. 이에, 조작의간편성, 그에따른오염 (contamination) 을방지하는관점, 증식촉진의관점에서, 부유림프구세포의계측이유용하다. 또한, 배양을종료할때에는태핑 (tapping) 을통해배양용기바닥면에부착된세포도박리시켜총림프구세포수를계측하는것이수율등의관점에서는바람직하다. [0034] [003] 따라서, 공정 (b) 에서의 ' 기억 T세포군의점유율상승 ' 이란, 공정 (a) 에서활성화배양된림프구세포의총수에서기억 T세포가차지하는비율의상승, 구체적으로는기억 T세포의점유율이예를들어 80% 이상, 바람직하게는 8% 이상, 90% 이상, 보다바람직하게는 9% 이상이되는것을의미한다. 이러한기억 T세포의점유율은, 항체를이용하여유세포분석기로 CD3, CD4RO, CD2L 등의세포표면항원을직접조사함으로써산출할수도있다. 그리고, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템의, 림프구세포밀도를바탕으로하는기억 T세포군의점유율상승검지수단으로는, 림프구세포수의측정에통상적으로이용되는수단, 예를들어부유림프구세포의세포계수장치등을예로들수있다. 공정 (b) 에의 ' 동결보존 ' 은일반적인세포동결방법에따라실시할수있다. 예를들어, 림프구세포를 Bambanker( 림포텍 ) 나 CP-1(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.) 등의세포동결보존액제품에현탁하여동결보존용기에저장하고, 그용기를 BICELL(Nihon Freezer Co., Ltd.) 에넣어 -80 의초저온냉각기 (SANYO Electric Co., Ltd) 에서일시보관하고 2일후에, 액체질소탱크 (MVE) 로옮겨넣어동결보존세포로하여액체질소내에서보존할수있다. 또한, 동결 / 해동후의활성화배양에서의증식의일어남의관점에서, 1 개의동결보존용기에저장하는림프구세포수를조정하는것이바람직하며, 1개의동결보존용기당 1 10 ~.0 10 개를보존하는것이바람직하다. 복수의동결보존용기에보존한세포를합쳐동결해동후의배양에이용할수도있지만, 조작의용이성및품질관리의관점에서 1개의동결보존용기의림프구세포를 1개또는 2개이상의배양용기로옮겨배양하는것이바람직하다. 그리고, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템의림프구세포의동결보존수단으로는, 세포의동결보존에통상적으로이용되는수단, 예를들어, 동결보존용기, BICELL, 초저온냉각기, 액체질소탱크등을예로들수있다. [003] [003] 공정 (c) 에서의동결된림프구세포의 ' 해동 ' 은, 일반적인동결세포의해동방법에따라실시할수있다. 예를들어, 3 의 Dry thermo unit(taitec CORPORATION) 등을이용하여 4분간가열처리함으로써해동할수있다. 상기해동한림프구세포를적당량의배지로옮겨넣은후실온에서원심분리하여상등액을제거함으로써세포동결보존액을제거하는것이바람직하다. 또한, 상기해동후의림프구세포의활성화배양은, 항 CD3 항체의존재하에서의활성화배양후, 다시항 CD3 항체의활성화자극없이증폭배양을계속실시할수도있다. 즉, 항 CD3 항체를고상화하지않은기구, 예를들어배양용플라스크, 롤러병 (roller bottle), 가스투과성배양백등에서대량의세포를수득할때까지배양을계속할수있다. 이때, 인터루킨2(IL-2) 의존재하에서하는것이바람직하다. 이러한조건에서의림프구세포의배양은, 항 CD3 항체의자극이없는것외에는, 사람혈청의농도등, 활성화자극이있는배양의조건과같은것이바람직하며, 무혈청배지를적시에사용하는것이작업성, 비용성, 안전성등에서보다바람직하다. 그리고, 기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조시스템의, 동결된림프구세포의해동수단으로는, 동결세포의해동에통상적으로이용되는수단, 예를들어 Dry thermo unit 등을예로들수있다. 본발명의기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군의제조방법에따르면, % 이상, 바람직하게는

12 80% 이상, 8% 이상, 보다바람직하게는 90% 이상, 더욱더바람직하게는 9% 이상의기억 T세포를포함하는림프구세포군과 0% 이상, 보다바람직하게는 % 이상, 80% 이상, 8% 이상, 보다바람직하게는 90%, 더욱더바람직하게는 9% 이상의중심기억 T세포를포함하는림프구세포군을수득할수있다. 또한, 본발명은, 이러한기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군을유효성분으로함유하는양자면역치료법또는제3자에게투여하기위한의약조성물을제공할수있다. 상기의약조성물은, 항종양제, HIV 치료약, 바이러스감염증치료약, 자기면역질환치료약, 세포또는장기이식후의이식세포또는장기의생착촉진약, 종양재발예방약으로사용할수있다. 또한, 본발명의기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군은, 기억 T세포군의비율이 80% 이상으로높기때문에, 림프구세포군의세포표면에존재하는표면항원에대한항체등을이용하여기억 T세포군을분리하는등의복잡한분리농축조작을실시하지않고, 의약의재료로서적절한용액에현탁한것을사용할수있다. 본발명의의약조성물의형태로는비경구투여가바람직하며, 본발명의림프구세포군을현탁한주사제, 점적제등의액체형태가바람직하다. 특히, 사람혈청알부민을 0.01~% 가되도록첨가한수액용생리식염액등에본발명의림프구세포군을현탁한주사제나점적제가보다바람직하지만, 이에한정되는것은아니다. 투여방법으로는, 정맥에의점적또는정맥, 동맥, 국소등에의주사가바람직하다. 투여하는액량은, 투여방법, 투여하는부위에따라다르지만, 통상적으로는 1~00mL로하는것이바람직하며, 이액량내에후술하는림프구투여량의림프구세포수가포함되도록하는것이바람직하다. 또한, 본발명의의약조성물은, 기억 T세포고함유림프구세포군외에, 안정제나완충액성분, 다른치료약이나보조제등을함유할수도있다. 본발명의의약조성물의투여량, 투여회수, 투여기간등, 및본발명의의약조성물에서의림프구세포군의농도는특별히제한되지않으며, 투여대상의컨디션, 병의상태, 체중, 연령, 성별등에따라적절히조정할수있으며, 통상의경우에는, 투여대상의체중 1Kg 당림프구투여량을 개 ~ 개를기준으로설정하는것이바람직하다. 더욱유효하게하기위해서는, 체중 1Kg 당림프구투여량을 개이상으로하는것이바람직하지만, 10 8 개를초과해도효력증대를기대할수없기때문에, 체중 1Kg 당투여량을 개 ~ 10 8 개로하는것이가장바람직하다. 투여빈도는 1회 / 일 ~1회 / 월을바람직하게예시할수있으며, 또한투여회수는적어도 1회이상은필요하다. 본발명의의약조성물의사용에다른수술이나투약치료를병용할수도있다. [0038] [0039] [0040] [0041] [0042] [0043] [0044] [004] 이하실시예를들어본발명을구체적으로설명하지만, 본발명이이하의기재에한정되는것은아니다. 실시예1 [ 림프구세포의활성화증식 ] (1) 말초혈림프구세포의조제동의를얻은정상인 3명의말초혈각 0mL를정맥으로부터헤파린을가하여채혈했다. 각채혈검체를 20mL의원심관 (BD FALCON;320) 에옮기고, 검체마다세척용액 (0.1% 사람알부민첨가생리식염수 : 생리식염액 00mL 제조원 ;Otsuka Pharmaceutical, 2% 사람헌혈알부민 2.0mL 제조원 ;Mitsubishi Tanabe Pharma Corporation) 100mL를가하고조심히혼화하여 3배로희석했다. 본조작을포함하여이하의조작은무균조건으로실시했다. 1 검체당 1mL의피콜 (GE healthcare bio-sciences) 을분주한 0mL 원심관 (BD FALCON;3200) 4개에 3배희석한혈액을중층시키고, 그원심관을 1800rpm으로 20분간, 실온에서브레이크를걸지않고원심분리했다 ( 원심기 : KOKUSAN Co., Ltd.;H-00). 중간층의단핵구층을미리세척용액을분주한 0mL의원심관에회수했다. 원심관의뚜껑을닫아 2~3 회뒤집어혼화시키고 1800rpm으로 1분간, 실온에서원심분리했다. 원심후상등액을제거하고, 펠렛을분산시킨후세척용액을첨가하여, 총량 0mL의세포현탁액이되도록했다. 상기현탁액을 1800rpm, 10분간, 상온에서원심분리하고, 수득된펠렛에 0mL의배지1(2% 사람혈청 ( 림포텍 ) 및 30U/mL ril-2(proleukin:novartis) 를포함하는 AIM-V배지 (Invitrogen사제조 )) 를가해현탁하여세포현탁액으로했다. 40μl의 Turk's solution(muto PURE CHEMICALS) 을 ml의라운드튜브 (BD FALCON;32008) 에분주하고, 여기에상기세포현탁액 10μl를가해혼화하고, 혼화액 10μl를노이바우어혈구계산반 (ERMA사제조 ;931) 상에흘려넣고현미경 (Olympus Optical Co., Ltd.; ) 으로세포수를산출했다. 또한, 20μl의트립판블루염색액 (SIGMA사;939) 을 ml의라운드튜브 (BD FALCON;32008) 에분주하고, 여기에상기세포현탁액 10μl를혼화하고, 혼화액 10μl를노이바우어혈구계산반에흘려넣고현미경으로염색되지않은살아있는세포를계측하여, 생존률을산출했다. (2)OKT3 고상화플라스크의조제

13 [004] OKT3( 수입발매원 : Janssen-Kyowa Co., Ltd., 제조원 : Ortho pharmaceutical:okt3 주 ) 용액을생리식염액으 로 μg /ml로조제하고, 조제액 10mL를바닥면적 22cm 2 의배양용플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.;MS- 2180R) 에분주하고, 그바닥면전면이 OKT3 용액으로덮이도록했다. 3시간이상정치시킨후플라스크내의 OKT3 용액을흡인기로빨아들이고, 약 100mL의생리식염액 ( 제조원 ;Otsuka Pharmaceutical) 를쏟아붓고플라스크의뚜껑을닫아세게흔든후내부의액을버렸다. 다시약 100mL의생리식염액 ( 제조원 ;Otsuka Pharmaceutical) 을플라스크에흘려넣고, 고상화면을아래로하여실온에서 1분간정치시켰다. 그후, 뚜껑을닫아 1분간세게흔들고내부액을버렸다. 플라스크안과뚜껑에남아있는액을흡인기로주의깊게빨아들여 OKT3 고상화플라스크를조제했다. 조제당일에사용하지않는경우는, 소량의생리식염액을남겨사용시까지 4 에서보존했다. [004] [0048] [0049] 바닥면적 2cm 2 의배양용플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.;MS210R) 에도상기기재와동일하게고상화처리를실시했다. (3) 파종림프구세포수의검토-1 (1) 에서조제한세포현탁액을 800rpm으로 1분간, 실온에서원심분리했다. 배지1을이용하여세포밀도가각 각 개 /ml, 개 /ml, 개 /ml, 개 /ml,.0 10 개 /ml가되도록조제했다. 각세포밀도의세포현탁액 ml를상기 (2) 에서조제한 2cm 2 의 OKT3 고상화플라스크에각각분주파종하고, 배지1을이용하여 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0± 0.2% 에서배양했다. 배양기간중에적절히부유세포수와생존률을 (1) 과동일한방법으로계측 / 산출하고, 증식상태에따라배양액의색조변화를관찰하면서적절히배지1을첨가하여 10일간배양을계속했다. 또한, 배양종료시에는배양플라스크를태핑하여바닥면에부착된림프구세포도회수하고, 총림프구세포수및생존률을 (1) 과동일한방법으로계측 / 산출했다. [000] [001] 결과 : 표 1 에서, 파종세포밀도가 개 /ml 일때는 10 일간배양해도충분한세포수가수득되지않았으며, 또한 10 개 /ml일때는증식이저하되고생존률도불량했기때문에, 두파종세포밀도는부적당한것으로판정했다. 또한, 생존률이 90% 이하가되지않는파종세포밀도 개 /ml와 개 /ml 사이에서, 파종세포밀도를재검토하기로했다. 또한, 본검토에서는, 배양액의색조변화와부유세포수를지표로하여적절히배지1을추가했는데, 조작을보다간편하게하고더욱신속한세포증식을얻기위해, 세포밀도와배양일수로부터배지추가시기를결정할수있도록, 배양액추가시기의검토를실시하기로했다. [002] 표 1 파종세포밀도와증식및생존율의추이 파종세포밀도 개 /ml 1 10 개 /ml 2 10 개 /ml 2 10 개 /ml 10 개 /ml 배양일수 검체 총세포수생존율총세포수생존율총세포수생존율총세포수생존율총세포수생존율

14 [003] [004] [00] [00] (4) 배양액추가시기의검토 동의를얻은정상인 3 명에서 (1) 과동일한순서로말초혈림프구세포를조제하고세포수를계측했다. 조제한림프구세포를 (3) 과동일하게원심분리하고, 배지 1 을이용하여세포밀도가각각 개 /ml,

15 10 개 /ml, 개 /ml, 4 10 개 /ml, 8 10 / 개mL가되도록조제했다. 각세포밀도의세포현탁액 0mL를상기 (2) 에서조제한 22cm 2 의 OKT3 고상화플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.;MS-2180R) 에분주하고, 배지 1을이용하여 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0 ±0.2% 에서배양을시작했다. 배양효율화의관점에서, 배양시작 3일째에각플라스크에배양액 0mL를추가했는데, 배양액추가전에부유세포수, 추가다음날인 4일째의세포회수시의총세포수를 (1) 과동일한방법으로계측했다. [00] [008] 결과 : 표 2 에서, 파종세포수를 ( 개 /ml) 또는 ( 개 /ml) 로한경우에배양후총세포 수를파종세포수로나눈증식율이 2.배이상이되는검체가있었다. 즉, 검체1의 4일째 ( 개및 개 ) 및검체3의 4일째 ( 개 ) 이다. 배양액첨가후에수득된총세포수가 10 8 을초과하는검체에서는, 해당검체의배양액추가전의부유세포수가 개및.3 10 ( 검체1의 3일째 ) 및 개 ( 검체3의 3일째 ) 였다. 여기서, 배양시작 3일째이후에는, 부유세포수가 개 /ml이상, 또는 개 /ml에도달했을때배양액을첨가하기로했다. [009] 파종세포수 ( 파종세포밀도 ) 2.x10 (0. 10 개 /ml).0x10 ( 개 /ml) 1.0x10 ( 개 /ml) 2.0x10 ( 개 /ml) 4.0x10 ( 개 /ml) 표 2 검체1 검체2 검체3 3일째 4일째 3일째 4일째 3일째 4일째 2.3x10 8.3x10 8.3x10 3.3x10 3.3x10 2.x10.8x10 1.4x10 3.3x10 1.1x10 1.x10 1.1x10 1.1x10 4.x10 2.x10 1.x10 3.3x10 3.0x10 1.9x10 1.1x10 8.2x10.0x10.x10.x10 (.배).3x10 1.3x x10 2.0x10 2.0x10 1.0x10 8 (3.3배) (2.배) [000] [001] [002] () 파종림프구세포수의검토 -2 동의를얻은정상인 3 명에서 (1) 과동일한순서로말초혈림프구세포를조제하고세포수를계측했다. 조제한림프구세포를 (3) 의파종림프구세포수의검토 -1 과동일하게원심분리하고, 배지 1 을이용하여세포 밀도가각각 개 /ml, 개 /ml, 개 /ml, 개 /ml, 10 개 /ml, 8 10 개 /ml가되도록조제했다. 각세포현탁액 ml를상기 (2) 에서조제한 2cm 2 의 OKT3 고상화플라스크에분주하고, 배지1을이용하여 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 에서배양했다. 배양시작후부유세포수및생세포율을 (1) 과동일한방법으로점차적으로계측하고, 세포밀도 4 10 개 /ml이상이되었을때각플라스크에배양액 ml를추가하여최장총 일간배양했다. 배양종료시에는, 바닥면에부착된림프구세포를 (3) 과동일하게처리하여모든세포를채취하고, (1) 과동일한방법으로총세포수및생존률을계측 / 산출했다. [003] [004] [00] 결과 : 본검토에서는, 최단일수로활성화배양을실시하여최다세포를수득하는것을목표로했다. 파종세포밀도 개 /ml 에서는, 배양 일째에도 3 개의검체중 2 개의검체에서부유세포수가 4 10 개 /ml - 1 -

16 에도달하지않았다. 파종세포밀도가 개 /ml인검체3, 개 /ml인검체1~3, 개 /ml인검체 1~3, 및 개 /ml인검체1에서, 부유세포밀도가 4 10 개 /ml를초과한것은 일째였으며, 배양액 ml를추가했더니다음날인 일째에대부분에서총세포수가 을초과했다 개 /ml인검체2 및 3,.0 10 개 /ml인검체1~3, 및 개 /ml인검체1~3은, 모두 4일째에부유세포밀도가 4 10 개 /ml를초과했으며, 배양액을추가한다음날인 일째에는모두에서총세포수가 개를초과했다. [00] 이상정리하면, 배양시작시파종세포밀도 개 /ml 에서는 일째에 4 10 개 /ml 를초과하여다음날에는 배양을종료했으며, 개 /ml에서는 4일째에거의 4 10 개 /ml를초과하여다음날에는배양을종료했으며,.0 10 개 /ml 및 개 /ml에서는 4일째에모든예가 4 10 개 /ml를초과하여다음날에배양을종료했다. 이로써, 배양기간을단축하기위해서는파종세포밀도를 개 /ml이상, 개 /ml이하로설정하는것이적절한것으로판단되었다. [00] 표 3 배양개시시의세포수와증식의관계 파종세포수 검체 4일째 일째 일째 (/ml) 세포수 세포밀도 ( 세포수 /ml) 세포수 세포밀도 ( 세포수 /ml) 세포수 세포밀도 ( 세포수 /ml) 1.0x10 1 n/a n/a.x10 1.3x10 2.x10.1x10 2 n/a n/a 1.8x10 3.x10 4.8x10 9.x10 3 n/a n/a 2.x10.0x10 9.1x10 9.1x10 1.x10 1 n/a n/a 2.1x10 4.1x10 9.8x10 9.8x10 2 n/a n/a 3.x10.0x10 1.2x10 1.2x10 3 n/a n/a 3.1x10.1x10 1.2x10 1.2x10 2.0x x10 2.4x10 3.2x10.4x10 1.2x10 1.2x x10 3.3x10.x10 1.1x10 1.4x10 1.4x x10 3.2x10.x10 1.1x10 1.3x10 1.3x10 4.0x x10 3.3x10 4.2x10 8.3x10 1.3x10 1.3x x10.0x10 1.2x10 1.2x10 n/a n/a 3 2.4x10 4.8x10 1.1x10 1.1x10 n/a n/a.0x x10 4.2x10 1.4x10 1.4x10 n/a n/a 2 3.x10.1x10 1.4x10 1.4x10 n/a n/a 3 2.x10.3x10 1.2x10 1.2x10 n/a n/a 8.0x x10.2x10 1.2x10 1.2x10 n/a n/a 2.0x10 9.9x10 1.x10 1.x10 n/a n/a 3 4.9x10 9.8x10 1.2x10 1.2x10 n/a n/a n/a : not available [008] [009] 실시예 2 [ 활성화배양시의림프구세포표면항원의추이 ] - 1 -

17 [000] [001] [002] (1) 림프구세포의조제및활성화배양동의를얻은정상인 3명에서실시예1의 (1) 과동일한순서로말초혈림프구세포를조제하고세포수를계측했다. 조제한림프구세포를실시예1의 (3) 과동일하게원심분리하고, 배지1을이용하여림프구세포의세포밀도가 10 개 /ml가되도록조제했다. 이세포현탁액 0mL를실시예1의 (2) 에서제작한 22cm 2 의 OKT3 고상화플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.:MS-2180R) 에분주하고, 실시예1의 (3) 과동일하게배지1을이용하여 TE- HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 에서배양했다. 배양시에수시로부유세포를채취하여실시예1의 (1) 과동일하게부유세포수를계측했다. 배양 4일째에 4 10 개 /ml이상이되었기때문에, 0mL의배지1을추가하고배양을계속했다. 배양 일째에재차 0mL의배지1 을추가하고배양을계속했다. 배양 일째에, 고상화플라스크의바닥면에부착된림프구세포를태핑을통해박리시켜세포부유액으로했다. 이 2mL를 OKT3가고상화되지않은 22cm 2 의플라스크에분주하고, 다시 ml 의배지1을첨가하여배양을계속했다. 배양 9일째에 100mL의배지1을첨가하고다시배양을 13일째까지계속했다. 배양 13일째에플라스크의바닥면에부착된림프구세포를태핑을통해박리시켜세포부유액으로서회수하고배양을종료했다. [003] [004] [00] 이때, 배양시작시, 배양시작 일째 ( 배지첨가직전 ), 일째 ( 부착세포박리전 / 후 ), 및 13일째에, 세포부유액의일부를채취하여즉시채취림프구세포의표면항원을분석했다. 아울러, 이때림프구세포의거의 100% 가 CD3 양성세포인것을알수있다 ( 비특허인용문헌 3) (2) 림프구세포표면항원의해석방법상기 (1) 의일정으로채취한세포부유액의각 ml를 1mL의원심관 (BD FALCON;3209) 에취해 1800rpm으로 분간실온에서원심분리했다. 수득된펠렛에알부민시스액 (Beckman Coulter사 : IsoFlow) 을첨가하여 개 /ml로각세포현탁액을조제했다. ml의라운드튜브 (BD FALCON) 에형광색소로표지한각항체 ( 항 CD3 항체 Becton Dickinson , 항CD4RO 항체동340438, 항CD2L 항체 Becton Dickinson Pharmingen사 44) 10μl를각각분주하고, 이어서상기각세포현탁액 0μl를각튜브에분주하고, 차광, 4 에서 30분정치반응시켰다. 반응후의각튜브에알부민시스액 2mL를첨가하고, 1800rpm으로 분간실온에서원심분리했다. 상등액을흡인제거하고, 각펠렛에 CellFix(Becton Dickinson) 00μl를첨가하여현탁액으로했으며, 목적항체염색림프구세포집단에대해유세포분석기 (Becton Dickinson ;FACS Calibur) 를사용하여세포수 10,000개를측정했다. [00] [00] [008] [009] [0080] (3) 항체염색림프구세포집단의해석상기 (2) 의방법으로제작한항체염색림프구세포집단의해석을실시했다. 결과 : 통상적으로, 말초혈림프구세포에서차지하는 CD4RO+CD2L+T림프구세포와 CD4RO+CD2L-T림프구세포의비율은 20~40% 정도이다 ( 표 4). 그러나, 활성화배양을실시함으로써, 일째에는그점유율이이미 90% 를초과했으며, 일째에는 9% 를초과했다. 그러나, 배양을계속하면상승한점유율이 40% 대로당초수준으로저하되는것으로판명되었다 ( 표 4, 도 1). Naive는 CD4RO-, CD2L+, CD3+의미경험 T세포를, Effector는 CD4RO-, CD2L-, CD3+의효과 T세포를, CM은 CD4RO+, CD2L+, CD3+중심기억 T세포를, EM은 CD4RO+, CD2L-, CD3+의효과기억 T세포를, CM+EM 또는 memory는 CD4RO+, CD2L+/-, CD3+의기억 T세포를나타낸다. 따라서, 활성화배양중의부유세포밀도가 4 10 개 /ml이상이되어배지를추가한다음날이후에는 CD4RO+, CD2L+T림프구세포와 CD4RO+, CD2L-T림프구세포의점유율상승을확인할수있었다. 여기서, 수확기억 세포수를증가시키기위해, 부유세포밀도가 4 10 개 /ml 이상이되어배지를추가한다음날이후, 기억 T 세포 점유율의저하가일어나기전에활성화배양을중지시키고, 플라스크의바닥면에부착된림프구세포를태핑을 통해박리시켜부유세포로하고, 모든세포를회수하기로했다. 표 4-1 -

18 [0081] 활성화배양시의림프구표면항원의점유율추이 (%) 배양 기간 CD2L+ CD3+ CD3+ CD4RO+ CD2L+ CD3+ CD4RO+ CD4RO- CD4RO- CD2L- CD2L- CD3+ CD4RO+ CD2L+ CD3+ CD4RO+ CD2L- (Central (Effector (Naive) (Effector) Memory:CM) Memory:EM) (CM+EM) 1일 검체 검체 검체 일 검체 검체 검체 일 검체 검체 검체 일 검체 채혈 직후 CD3+ 검체 검체 검체 검체 검체 [0082] [0083] [0084] [008] [008] [008] 실시예 3 [ 동결공정에서의동결세포밀도의검토 ] 본발명의방법에따라수득되는 T세포군을함유하는제제는치료에사용하는것으로, 최종적으로수득되는림프구세포의수가많은편이효율적이다. 여기서, 동결보존시의 1 튜브당세포수가그후의활성화증폭배양에영향을미치는가능성을검토했다. (1) 동결세포밀도의검토-1 활성화배양동의를얻은정상인 3명에서실시예1의 (1) 과동일한순서로말초혈림프구세포를조제하고세포수를계측했다. 조제한림프구세포를실시예1의 (3) 과동일하게원심분리하고, 배지1을이용하여림프구세포의세포밀도가 10 개 /ml가되도록조제했다. 이세포현탁액 0mL를실시예1의 (2) 에서제작한 22cm 2 의 OKT3 고상화플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.;MS-2180R) 에분주하고, 실시예1의 (3) 과동일하게 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 에서배양했다. 배양시작 3일째에부유세포수가 4 10 개 /ml를초과하여, 0mL의배지1을첨가하고다음날까지배양을계속했다. 배양시작 4일째에활성화배양을중지시키고, 플라스크의바닥면에부착된림프구세포를태핑을통해박리시켜부유세포로하고, 모든세포를회수해배지1에의한세포현탁액을수득했다. 상기현탁액내의세포수를실시예 1의 (1) 과동일한순서로계측했다. [0088] [0089] (2) 동결세포밀도의검토 -2 동결보존 상기 (1) 에서계측한세포밀도를바탕으로, 3 개의검체에대해동결보존튜브 (CORNING 사 ) 1 개당림프구세포 수를 개, 개, 개,.0 10 개가되도록배지 1 을추가하여조제하고, 1mL 의원심관에 분주하여 1200rpm 으로 분간실온에서원심분리했다. 원심분리후, 각원심관내의상등액을제거하고수득된 펠렛을분산시키고, 동결보존튜브 1 개당 1.8mL 의액량이되도록세포동결보존액 (CP-1: Kyokuto

19 Pharmaceutical Industrial Co., Ltd.) 을첨가하여세포를현탁시켜동결보존튜브에분주하고, 그동결보존 튜브를 BICELL(Nihon Freezer Co., Ltd.) 에넣어 -80 의초저온냉각기 (SANYO Electric Co., Ltd) 에서일시 보관 2 일후에액체질소탱크 (MVE) 로옮겨넣어동결보존세포로서보존했다. [0090] [0091] (3) 동결세포밀도의검토-3 해동처리각세포밀도로동결보존한동결보존튜브를액체질소탱크에서꺼내 3 로설정한 Dry thermo unit(taitec CORPORATION) 내에서 4분간가온하여동결림프구세포를해동했다. 해동한림프구세포를 10mL의배지1을이용하여현탁하면서 1mL의원심관으로옮겨넣고, 1200rpm으로 3분간실온에서원심분리했다. 원심분리후상등액을제거하고, 펠렛을분산시키고 10mL의배지1을첨가하여세포현탁액으로하였으며, 실시예1의 (1) 과동일하게세포수를계측했다. 해동한림프구세포는, 튜브마다세포수가다르기때문에그대로동량의배지에서현탁파종하면, 파종세포수의차이가증식에영향을미칠가능성이있다. 이러한가능성을배제하기위해서, 해동한세포를파종하여배양하는공정에서, 파종전및공정마다림프구세포수를계측하고, 파종시의세포밀도 는물론첨가하는배양액량을조제하여세포밀도가거의일정하도록했다 (. 10 개 /ml). 동결보존튜브에 따라다른세포수를배양시작시에액량조정하는이방법은, 다음의확대배양, 활성화배양, 증폭배양에서도 채용했다. 표 에각공정에서의배양액량과첨가액량을나타냈다. [0092] 해동시의조작으로, 표 에나타내는액량의상기현탁액을플레인 24 웰의멀티웰플레이트 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) 에 1 웰당 2mL 씩파종하고, 파종일을제 1 일로하여 3, 습도 9%, CO 2 농도.0% 의탄산가스배양 기내에서 2 일간배양했다. [0093] 표 각공정에서의배양액량과첨가한배지 1 의양 세포수 / 동결보존튜브 배양조건해동시확대배양활성화배양 2 증폭배양 1 증폭배양 배양용기 24well 2cm 2 cm 2 22cm 2 22cm 2 2 배양액량 ml 14mL 3mL 149mL 29mL 첨가액량 8mL 22mL 113mL 14mL 배양용기 24well cm 2 22cm 2 22cm 2 2 1L bag 배양액량 13mL 30mL 8mL 322mL 39mL 첨가액량 1mL 48mL 244mL 31mL 배양용기 24well 22cm 2 22cm 2 1L bag 1L bag 2 배양액량 40mL 90mL 240mL 1,000mL 2,000mL 첨가액량 0mL 10mL 0mL 1,000mL.0 10 배양용기 24well 22cm 2 22cm 2 2 1L bag 1L bag 2 배양액량 ml 149mL 39mL 1,34mL 3,238mL 첨가액량 83mL 24mL 1,238mL 1,04mL [0094] [009] (4) 확대배양과활성화배양상기 (3) 에서해동처리후에배양한림프구세포를 3일째에 24웰의멀티웰플레이트에서각각플레인플라스크로옮기고, 표 에기재된각각의첨가액량의배지1로 24웰의멀티웰플레이트의웰내를세척하고남은세포를회수하여, 플라스크내의액량을표 에기재된액량이되도록조제했다. 각플라스크를 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 의탄산가스배양기내에서다시 2 일 간배양했다 ( 표, 확대배양 ). [009] 상기확대배양후, 배양플라스크내의세포현탁액을, 활성화배양을실시하기위해실시예1의 (2) 과동일하게조제한표 에나타낸용량의 OKT3 고상화플라스크내로옮기고, 상기배양플라스크내를배지1로세척하고남은세포를회수하여, 최종적으로 OKT3 고상화플라스크내의액량이표 에기재된액량이되도록조제하고, 각플라스크를 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 에서

20 다시 2 일간배양했다 ( 표, 활성화배양 2). [009] 상기활성화배양후, 각 OKT3 고상화플라스크를태핑하여바닥면에부착된세포를박리시켜세포현탁액으로했다. 수득된세포현탁액을표 에기재된신규플레인배양플라스크 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) 또는신규가스투과성배양백 (1000mL, Kohjin Bio Co., Ltd ) 으로옮겨넣고, 다시각플라스크내를표 에나타낸첨가액량의배지2(1% 사람혈청 ( 림포텍 ), 1U/mL ril-2(proleukin;novartis) 를포함하는 AIM-V 배지 :Invitrogen) 로세척하고, 상기세척액을상기플레인플라스크또는가스투과성배양백내의세포현탁액과합쳐서 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 에서다 시 3 일간배양했다 ( 표, 증폭배양 1). [0098] 상기증폭배양 1 후, 상기배양용기에표 에기재된첨가액량의배지 2 를첨가하고, 3, 습도 9%, CO 2 농 도.0% 의탄산가스배양기내에서다시 4일간배양을계속했다. 여기서, 배양용기로플라스크를새로추가한경우는, 배양중의플라스크에첨가액량의배지2를첨가하고, 플라스크를세게흔들어세포현탁액을교반하고, 새로운플라스크내에용량의반을옮겨배양을계속했다. 배양용기를플라스크에서백으로이행한경우는, 2개의플라스크에첨가액량의배지2를분주하고, 플라스크를세게흔들어세포현탁액을교반하고, 새로운백에내용량의전부를옮겨배양을계속했다. 배양용기로백을새롭게늘려사용한경우는, 새롭게사용하는배양백에표 에기재된첨가액량의배지2를첨가하고, 이를상기증폭배양1에서배양한배양백에무균조건으로접합하고, 두백내의내용물을잘혼합하여다시배양을계속했다 ( 표, 증폭배양2). [0099] [0100] (3) 및 (4) 에기재한각조작을실시할때, 각검체의세포수와생존률을실시예1의 (1) 과동일하게계측 / 산출했다. 그결과를표 에나타냈다. 결과 : 동결보존튜브에저장하는세포수를각각의설정값으로조정하여동결보존했는데, 각처리공정에서 3 개의검체간에큰차이는나타나지않았다. 그러나, 본발명의방법으로제조한기억 T림프구세포군은치료용이며, 효율의관점에서, 일련의배양으로수득되는세포수가많은편이바람직하다. 따라서, 적절한배양규모 가바람직하므로, 동결보존튜브하나당세포수는 개 ~.0 10 개가타당한것으로판단했다. 본실시예 (1)~(4) 의공정에서는, 배양증식에대한파종세포밀도의영향을배제하기위해, 표 에나타내는바와같이, 첨가액에따라세포밀도를일정하게조절했다. 한편, 증폭배양1의배양시작시세포수를 개, 개, 개로설정하고배양시작시액량을일정하게하여배양을실시한결과, 개에서는증폭이약 2일늦어졌지만, 개및 개에서는유의한차이없이, 상기증폭배양2의공정후에충분한양의기억 T림프구세포군이수득되는것을확인할수있었다. 상기동결보존튜브하나당세포수를 ~.0 10 개로하면, 이조건을만족할수있다. [0101] 표 해동처리공정이후의세포수, 생존율및세포밀도 ( 실측값 ) 처리일 공정명 1 해동처리 검체 각검체의세포수, 생존율 (%) 및세포밀도 ( 실측값 ) 0.x10 / 개 1.0x10 / 개 3.0x10 / 개.0x10 / 개 4.14x10 (93.24) (.90x10 /ml) 8.1x10 (93.0) (.0x10 /ml) 2.80x10 (94.9) (.00x10 /ml) 4.82x10 (94.81) (.30x10 /ml) 4.14x10 (94.2) 9.3x10 (9.00) 2.88x10 (9.00) 4.82x10 (94.81) (.90x10 /ml) (.20x10 /ml) (.20x10 /ml) (.30x10 /ml) 4.08x10 (9.) 9.2x10 (9.3) 2.88x10 (94.4) 4.9x10 (94.94) (.40x10 /ml) (.40x10 /ml) (.20x10 /ml) (.0x10 /ml)

21 3 확대배양 x10 (98.3) (.4x10 /ml).1x10 (9.3) 1.2x10 (98.11) (.0x10 /ml) 1.1x10 (9.49).4x10 (9.3) (8.0x10 /ml) 4.8x10 (94.) 1.2x10 8 (9.0) (8.4x10 /ml) 8.32x10 (93.33) 3 (.11x10 /ml) 1.04x10 (9.4) (.3x10 /ml) 2.31x10 (9.34) (.20x10 /ml).39x10 (9.2) (.8x10 /ml) 1.11x10 8 (9.40) 활성화배양 (.42x10 /ml) 2.9x10 (9.3) (8.2x10 /ml) 2.88x10 (9.38) (8.00x10 /ml) 3.02x10 (9.9) (.0x10 /ml).18x10 (9.9) (.92x10 /ml).x10 (9.) (9.81x10 /ml) 8.29x10 (9.2) (.10x10 /ml) 2.8x10 8 (98.03) (1.12x10 /ml) 2.91x10 8 (9.29) (1.21x10 /ml) 3.04x10 8 (9.9) (.44x10 /ml) 3.x10 (98.0) (9.x10 /ml) 4.x10 8 (9.8) (1.1x10 /ml) 4.43x10 8 (9.0) 증폭배양 (8.39x10 /ml) 3.49x10 (94.1) (2.34x10 /ml) 3.3x10 (93.30) (2.3x10 /ml) 3.28x10 (93.81) (1.01x10 /ml) 8.11x10 (92.8) (2.1x10 /ml) 1.08x10 8 (9.83) (3.3x10 /ml) 9.44x10 (93.80) (1.2x10 /ml) 2.83x10 8 (9.1) (2.83x10 /ml) 3.41x10 8 (9.9) (3.41x10 /ml) 3.19x10 8 (9.00) (1.12x10 /ml) 3.2x10 8 (9.4) (1.99x10 /ml) 3.0x10 8 (92.80) (2.20x10 /ml) 3.x10 8 (92.23) 10 증폭배양 (2.20x10 /ml) 2.4x10 8 (9.) (8.9x10 /ml) 3.3x10 8 (9.39) (1.8x10 /ml) 4.2x10 8 (9.92) (2.93x10 /ml) 8.03x10 8 (9.8) (1.2x10 /ml) 8.0x10 8 (98.02) (1.2x10 /ml) 9.4x10 8 (98.31) (3.19x10 /ml) 1.89x10 9 (9.43) (9.4x10 /ml) 2.x10 9 (98.08) (1.28x10 /ml) 3.21x10 9 (9.8) (2.30x10 /ml) 3.3x10 9 (9.00) (1.1x10 /ml) 4.x10 9 (9.8) (1.43x10 /ml) 3.8x10 9 (9.4) (1.44x10 /ml) (1.48x10 /ml) (1.0x10 /ml) (1.13x10 /ml) [0102] [0103] [0104] [010] [010] 실시예4 [ 동결보존을거쳐활성화증폭하는공정에서의림프구세포표면항원의추이 ] (1) 동결보존세포의제작실시예2에서, 세포동결전의활성화배양에서는배양액내의세포밀도가 4 10 개 /ml이상이된단계에서배양액내의세포중기억 T세포군의점유비율이상승한다는것이판명되었다. 여기서, 실시예3의 (1) 과동일하게, 동의를얻은정상인 3명에서실시예1의 (1) 과동일한순서로말초혈림프구 세포를조제하고, 수득된세포현탁액의세포수를계측하여세포밀도가 10 개 /ml가되도록조제하고, 그 0mL를실시예1의 (2) 과동일한순서로제작한 22cm 2 의 OKT3 고상화플라스크에분주하고, TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 에서배양했다. 배양시작 3일째에부유세포수가 4 10 개 /ml를초과했으므로, 기억 T세포군의점유비율이상승한것으로하여 0mL의배지1을첨가하고다음날까지배양을계속했다. 다음날, 즉배양시작 4일째에활성화배양을중지시키고, 플라스크의바닥면에부착된림프구세포를태핑을통해박리시켜부유세포로하고, 모든세포를회수해배지1을이용하여세포현탁액으로했다. 상기현탁액내의세포수및생존률을실시예1의 (1) 과동일한순서로계측하고,.0 10 개의세포상당량의현탁액을 0mL 원심관으로옮겨넣고, 1200rpm으로 분간실온에서원심분리했다. 원심관내의상등액을제거하고, 펠렛에 3.mL의 CP-1 세포동결보존액 (Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.,Ltd.) 을첨가하여현탁했다. 상기현탁액을 1.8mL씩 2개의동결보존튜브에분주하고, 실시예3 의 (2) 와동일하게동결보존했다

22 [010] [0108] [0109] [0110] (2) 동결보존세포의해동처리동결보존세포를 1주일후에액체질소탱크에서꺼내실시예3의 (3) 동결세포밀도의검토-3과동일하게해동처리했다. 3 로설정한 Dry thermo unit(taitec CORPORATION) 내에서 4분간가온하여동결림프구세포를해동했다. 해동한림프구세포를 10mL의배지1을이용하여현탁하면서 1mL 원심관으로옮겨넣고, 1200rpm으로 3 분간실온에서원심분리했다. 원심분리후, 상등액을제거하고펠렛을분산시키고, 40mL의배지1을첨가해세포현탁액으로했으며, 실시예1의 (1) 과동일하게세포수를계측했다. 아울러, 동결보존후의림프구세포의거의 100% 가 CD3 양성세포인것을알수있다 ( 비특허인용문헌 1). (3) 동결보존세포의확대활성화증폭배양상기현탁액을실시예3의 (4) 와동일하게플레인 24웰의멀티웰플레이트 (Sumitomo Bakelite Co., Ltd.) 에 1웰당 2mL씩파종하고, 파종일을제1일로하여 3, 습도 9%, CO 2 농도.0% 의탄산가스배양기내에서 2일간배 양했다. 배양한림프구를 3일째에 24웰의멀티웰플레이트에서플레인플라스크로옮기고, 배지1로 24웰멀티웰플레이트의웰내를세척하고남은세포를회수하여, 플라스크내의세포현탁액의액량이 90mL가되도록조제했다. 상기플라스크를 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 의탄산가스배양기내에서다시 2일간배양했다 ( 확대배양 ). 상기배양후, 배양플라스크내의세포현탁액을활성화배양을실시하기위해 22cm 2 의 OKT3 고상화플라스크내로옮기고, 상기배양플라스크내를배지1로세척하고남은세포를회수하여, 최종적으로 OKT3 고상화플라스크내의액량이 240mL가되도록조정하고, 플라스크를 TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 에서다시 2일간배양했다 ( 활성화배양2). 상기활성화배양후, OKT3 고상화플라스크를태핑하여바닥면에부착된세포를박리시켜세포현탁액으로했다. 수득된세포현탁액을신규가스투과성배양백 (1000mL, Kohjin Bio Co., Ltd ) 으로옮겨넣고, 다시플라스크내를배지2(1% 사람혈청 ( 림포텍 ), 1U/mL ril- 2(Proleukin;Novartis) 를포함하는 AIM-V배지 :Invitrogen) 로세척하고, 상기세척액을상기가스투과성배양백내의세포현탁액과합쳐액량이 1000mL가되도록하고, TE-HER CO 2 배양기 (HIRASAWA 주식회사 ) 내에서온도 3.0±0., 습도 9%, CO 2 농도.0% 에서다시 3일간배양했다 ( 증폭배양1). 상기배양후, 새로사용하는배양백에 1000mL의배지2를첨가하고, 이를상기증폭배양1에서배양한가스투과성배양백에무균조건으로접합하고, 두백내의내용물을잘혼합하여다시배양을계속했다. 상기배양용기는 3, 습도 9%, CO 2 농도.0% 의탄산가스배양기내에서다시 4일간배양했다 ( 증폭배양2). [0111] [0112] [0113] [0114] (4) 항체염색림프구세포집단의해석본실시예4의 (2) 내지 (3) 의공정에서, 동결세포를해동한날을제1일로하고, 플레인플라스크 (22cm 2 ) 에서의배양을종료하고 OKT3 고상화플라스크에서의활성화배양을시작하기직전을제일째로하고, 활성화배양을종료하고가스투과성배양백 (1000mL, Kohjin Bio Co., Ltd ) 에서의배양을시작하기직전을제 일째로하고, 가스투과성배양백에서의배양을종료하고다른하나의가스투과성배양백을접합한배양이종료한날을제14일째로하여, 제1일째 ( 해동직후 ), 제일째 ( 활성화직전 ), 제일째 ( 활성화직후 ), 및제14일째 ( 종료직전 ) 에배양중의세포현탁액의일부를무균조건으로채취하고, 수득된세포의서브세트의해석을실시예2의 (2) 와같은방법으로항 CD3 항체 (Becton Dickinson ), 항사람CD4RO 항체 (Becton Dickinson ) 및항사람CD2L 항체 (Becton Dickinson Pharmingen 44) 에대해실시했다. 결과 : 그결과를표 에나타냈다. 동결보존전에활성화배양세포내에서점유율이상승한기억 T세포군은, 동결해동후, 통상의배양및활성화배양의과정에서도양호하게높은존재비율이유지되는것으로판명되었다. 제일째에중심기억 T세포의존재비율이약간의저하를나타내지만, 배양을계속함에따라회복을보였으며, 기억 T세포군으로서는완만한존재비율의저하를나타내지만, 점유율은 80% 를초과했다. 상기로인해, 피험자에서말초혈림프구세포의채취를실시한직후의림프구세포서브세트이미지와비교해, 기억 T세포군이높은비율로존재하는활성화림프구세포를수득할수있다는것이밝혀졌다 ( 도 2). Naive는 CD4RO-, CD2L+, CD3+의미경험 T세포를, Effector는 CD4RO-, CD2L-, CD3+의효과 T세포를, CM은 CD4RO+, CD2L+, CD3 + 중심기억 T세포를, EM은 CD4RO+, CD2L-, CD3+의효과기억 T세포를, CM+EM 또는 memory는 CD4RO+, CD2L+/-, CD3+의기억 T세포를나타낸다

23 [011] 표 동결보존을거쳐활성화증식하는공정에서의림프구세포표면항원의추이 (%) 해동직후 1 일 활성화직전 일 활성화직후 ( 증폭직전 ) 일 종료직전 13 일 CD2L+ CD3+ CD3+ CD4RO+ CD2L+ CD3+ (Central Memory:CM) CD4RO+ CD3+ (Effector Memory:EM) CD4RO+ CD2L+ CD3+ CD4RO+ 처리일검체 CD4RO- CD4RO- CD2L- CD2L- CD2L- CD3+ (CM+EM) (Naive) (Effector) [011] [011] [0118] [0119] [0120] [0121] [0122] [0123] () 동결보존세포의안정성상기실시예4의 (1) 과같은방법으로, 동시에동결보존한세포를 1주간, 1개월, 2개월, 4개월, 개월간액체질소하에서보관하여, 동결보존세포의안정성에대해검토를실시했다 (n=3). 해동후의세포수, 세포표현형이나해동후의세포증폭율및증폭세포의세포표현형을해석한결과, 동결보존후 개월까지는해동후의세포수, 생존률및세포표현형, 해동후의배양공정에서의세포증폭율및세포표현형에서도아무런차이가나타나지않았다. 따라서, 동결보존세포는적어도 개월동안은안정적이며, 동결보존세포는안정적으로장기보존할수있는것으로나타났다. 실시예 본발명의기억세포를주성분으로하는의료조성물을제조했다. 제조공정의개요를도 3에나타냈다. [ 본발명의기억세포를주성분으로하는의료조성물의제조 ] 1. 활성화배양1 공정항 CD3 항체 (OKT3) 를고상화한 22cm 2 의활성화플라스크에, 실시예1의 (1) 과동일하게조정한 0mL의세포부유액을분주하고, 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 TE-HER CO 2 배양기내에서배양했 다. 조제한세포부유액량이 100mL를초과하는경우는 2개의활성화플라스크에 0mL씩세포부유액을분주했다. 세포부유액의양이 0mL이상 100mL미만인경우에는 0mL를분주했다. 배양시작 3일째에배양액 0.01mL를채취하여부유세포수를계측했다 ( 공정내검사II). 부유세포밀도가 4 10 개 /ml이상인경우에는배양액1을 0mL 추가했다 ( 배양액추가 ). [0124] 배양시작 3 일째의공정내검사 II 에서부유세포밀도가 4 10 개 /ml 에이르지않은경우에는, 다시 1 일배양을 계속하여다음날 ( 배양시작 4 일째 ) 부유세포수를계측하고, 부유세포밀도가 4 10 개 /ml 이상인경우에는배 양액추가공정으로진행했다. [012] 배양시작 일째까지부유세포밀도가 4 10 개 /ml 에이르면배양액추가공정으로진행하고, 이르지못한경 우에는배양을중지하고재차채혈을실시한다

24 [012] [012] 2. 동결보존공정 배양액을추가한다음날플라스크바닥면에부착된세포를박리시켜균일하게현탁하고, 공정내검사 III 용샘플 로서 1mL 를샘플링했다. 1200rpm 으로 분간실온에서원심분리함으로써세포현탁액에서세포를회수하고, 세포 를 3 10 개 / 튜브에서동결한다. 여기서세포는 3 10 개 / 튜브에서세포동결보존액 CP-1(Kyokuto Pharmaceutical Industrial Co.,Ltd.) 에부유시켜동결보존튜브에저장하고, 그튜브를 BICELL 에넣어 -80 의냉각기내에서급속히동결시켰다. 다음날 -80 의냉각기에서동결튜브를꺼내액체질소내에서보존했다. [0128] [0129] [0130] [0131] [0132] [0133] [0134] 3. 해동처리공정동결보존세포가저장된튜브를액체질소탱크에서꺼내, 3 로가열한 Dry thermo unit에서 4분간가온하여동결세포를해동했다. 10mL의배지1가들어있는 1mL의원심관에해동한세포액을가하고, 뒤집어혼화시켜잘교반하고, 1200rpm으로 3분간실온에서원심분리했다. 상등액을제거하고, 세포를분산시킨후 40mL의배지1을이용하여균일하게부유시켰다. 세포를잘혼화시키고, 0.mL를샘플링하여공정내검사 IV의샘플로했다. 나머지세포부유액을플레인 24웰의멀티웰플레이트에 2mL/well로분주하고, 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 CO 2 배양기내에서 2일간배양했다. 4. 확대배양공정배양 3일째에 24웰멀티웰플레이트로부터세포를 22cm 2 의플레인플라스크로옮겼다. 배지1을이용하여 24웰멀티웰플레이트를세척하고남은세포를회수했다. 최종적으로총90mL가되도록배지1을이용하여세포를부유시키고, 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 CO 2 배양기내에서 2일간배양했다.. 활성화배양2 공정 2일간배양후, 22cm 2 의플레인플라스크내의세포를항 CD3 항체 (OKT3) 가고상화된활성화플라스크로 옮겼다. 배지 1 로 22cm 2 의플레인플라스크를세척하고남은세포를회수해, 최종적으로배양액량이 20mL 가되 도록했다. 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 CO 2 배양기내에서 2 일간배양했다. [013] [013] [013] [0138]. 증폭배양1 공정 2일간배양후, 활성화플라스크의바닥면에부착된세포를박리시켜세포부유액을수득했다. 1mL의세포부유액을샘플링하여공정내검사 V의샘플로했다. 나머지세포부유액 20mL를, 0mL의배지2(1U/mL의 IL-2를포함하는 1% 사람혈청첨가배지 ) 를충전한가스투과성배양백으로옮기고, 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 CO 2 배양기내에서 3일간배양했다 ( 총배양액량약1L).. 증폭배양2 공정 3일간배양한배양백과 1L의배지2를충전한가스투과성배양백을무균조건으로접합하여두개의배양액을잘혼합하고, 온도 3.0±0., 습도 9.0±.0%, CO 2 농도.0±0.2% 의 CO 2 배양기내에서 4일간배양했다 ( 총배 양액량약 2L). [0139] [0140] [0141] [0142] 8. 조제및충전공정증폭배양2 개시후, 4일째 ( 통산 14~1일째 ) 에두개의연결된배양백의한쪽으로부터 20mL의원심관 4개로 20mL씩배양액을옮기고, 1,00rpm으로 8분간실온에서원심분리했다. 상등액을제거하고, 나머지하나의백의배양액을상기 20mL의원심관으로옮겼다. 처음의백과동일한조건에서원심분리하고상등액을제거했다. 20mL의원심관 4개의세포를분산시킨후, 0.1% 사람알부민첨가생리식염수 00mL로현탁하고 2개의 20mL 원심관에모아, 1,00rpm으로 8분간 4 에서원심분리하고세포를세척했다. 동일한조작을반복하여세포를 2 회세척했다. 세척한세포를분산시키고, 4 로냉각한 1% 사람알부민첨가생리식염수 210mL에현탁시켰다. 현탁시킨세포액의 10mL를채취하여출하검정용샘플로했다. 나머지 200mL를제품충전용백에충전하여제품으로했다. [ 본발명의기억세포를주성분으로하는의료조성물의해석 ] 본발명의방법에따라수득된활성화림프구세포와종래방법으로제작한활성화림프구세포의서브세트해

25 석을, 실시예 2 의 (2) 와동일한방법으로, 항사람 CD4RO 항체 (Becton Dickinson) 및항사람 CD2L 항체 (Becton Dickinson Pharmingen) 에대해실시했다 ( 도 4). [0143] 본발명의방법은실시예 에기재된방법으로실시했다. 배양시작시의말초혈관에서채혈분리한단핵구세포 ( 림프구세포-풍부분획 )(PBMC) 를 OKT 고상화플라스크에서활성화배양했다. 이 4 10 /ml이상이된활성화배양후 4일째에샘플 (+0) 을채취한후, 0mL의배지1을첨가하고 1일간배양하여샘플 (Freeze) 을채취한후동결보존공정을실시했다. 동결세포의해동직후에샘플 (TW(Thaw)) 을채취하여확대배양공정을실시하고, 그후활성화배양2를 OKT 고상화플라스크에서실시했다. 활성화배양2 직전에샘플 (OKT) 을채취하고, 직후에샘플 ( 해동BP) 을채취했다. 그후배양백에서증폭배양2를실시하여림프구세포를수확했는데, 수확직전에세포샘플 ( 해동H(Harvest)) 을채취했다. [0144] 종래방법에서는, 배양시작시의말초혈관에서채혈분리한단핵구세포 ( 림프구세포 - 풍부분획 )(PBMC) 를배지 1 을이용하여세포현탁액으로하고, 그현탁액 0mL 를 OKT 고상화플라스크에서활성화배양했다. 이 4 10 /ml이상이된활성화배양후 4일째에샘플 (+0) 을채취한후, 0mL의배지1을첨가하고 1일간배양했다. 일째에샘플 (+10) 을채취하고 10mL의배지1을첨가하여배양했다. 다시다음날샘플 ( 생BP) 을채취했다. 100mL의배지1을첨가하여배양하고, 배양종료직전에샘플 ( 생H) 을채취했다. 또한 +10 및 Freeze샘플은동결군과비동결군으로나눈직후에채취하는샘플이므로, 실질적으로같은것이다. [014] [014] [014] 상기샘플의세포서브세트를조사한결과, 종래와같이동결처리공정을포함하지않는방법에서는, 수득된림프구세포군에서기억 T세포의비율이 40% 정도로, PBMC와동일한정도가되었지만 ( 도 4A), 본발명의방법을이용하면, 수득된림프구세포군에서기억 T세포가약 % 를차지했다 ( 도 4B). 따라서, 본발명의방법에따라채취한림프구세포를동결보존함으로써편리성을높일수있을뿐아니라, 양자면역치료법등에서유효성분인기억 T세포를주성분으로하는림프구세포군을수득할수있었다. Osumi등이양자면역치료법에사용되는활성화림프구세포의작용메카니즘을해명하기위해, 활성화증폭배양하여수득된활성화림프구세포의기능을기억 T세포서브세트에주목하여이를해석했다. 그결과, 활성화림프구세포에포함되는효과기억 T세포가암세포에대해 24시간에세포장해활성을나타낸다는것, 중심기억 T세포가종양항원을인식한후활성화되고효과기억 T세포로분화되어 48시간에세포장해활성을발현한다는것이밝혀졌다. 이하, 중심기억 T세포및효과기억 T세포의종양세포에대한효과를나타낸다. 항사람CD4RO 항체 (Becton Dickinson) 및항사람CD2L 항체 (Becton Dickinson Pharmingen) 의유무를지표로하여, 유세포분석기 (Becton Dickinson ;FACS Calibur) 를이용해활성화자기림프구세포 (KC-32) 를중심기억 T세포 (CM) 와효과기억 T 세포 (EM) 군으로나누었다 (CM순도 99.%, EM순도 98.%). 그다음, 나눈각세포군과 KT-32( 환자유래종양세포주 ) 의공배양을실시하여세포장해활성을해석했다 ( 표 8). [0148] 표 8 Relative Cell Number of Effector Cell KT-32 24hr 48hr None (KT-32 alone) Central Memory T cell Effector Memory T cell N.D. [0149] [010] [011] KT-32 단독 ( 컨트롤 ) 에서는세포수가배양시작시점의세포수와비교하여 24시간에 2.배, 48시간에.3배로증가했다. 한편, CM과의공배양에서는 24시간에 0.9배로증식억제가나타났으며, 48시간에는 0.3배로감소했다. 배양후 48시간시점에서림프구세포를회수하여유세포분석기 (Becton Dickinson ;FACS Calibur) 로해석했더니, CM의항원형이 EM으로변화해있었다. KT-32와 EM의공배양에서는, 컨트롤의배양시작시점의세포수와비교하여 24시간에 0.2배로세포수가감소했으며, 48시간에는살아있는세포가나타나지않았다. 따라서, CM 및 EM은모두세포장해활성을가지며, 그중에서도 CM은장해활성의발현에시간차는있지만, EM 에비해그수명이훨씬길기때문에, 장기간에걸쳐 EM의안정적공급원이될것으로생각되며, 이러한점에서 - 2 -

26 CM 을선택적으로증폭한림프구세포군을함유하는조성물은효과적인치료제가될것으로시사된다. [012] 종래방법으로수득되는활성화림프구세포군은, PBMC 채취후활성화배양 3~일정도의한정된기간에밖에중심기억 T세포점유율이높은활성화림프액군을수득할수없으며, 게다가이기간은세포수가여전히충분히증가하지않고, 세포수가충분히증가한후에는중심기억 T세포의점유율이 20% 이하로저하된다는문제가있었다 ( 비특허문헌 3). 그에반해, 본발명의방법에따르면, 충분히세포수를증가시키면서도 EM에비해 CM이압도적으로많은본발명의활성화림프구세포군을수득할수있으며, 세포장해활성에서는 EM에비하면활성발현에약간의지연이있지만, 활성그자체는 EM에비해손색이없으며그투여를통해세포장해활성이높은 EM의장기적인안정된공급을얻을수있어, 유효한치료효과를실현할것으로생각된다. 게다가, 세포동결단계를포함하며, 그동결기간이특별히제한되지않기때문에, 장기보관및갑작스러운요청에대해서도신속히기억 T세포, 특히중심기억 T세포점유율이높은활성화림프구세포군을조제할수가있다는점에서편리성이매우높다. [013] 산업상이용가능성 본발명은, 활성화림프구세포를포함하는치료제분야등에매우적합하게이용할수있다. 도면 도면 1-2 -

27 도면 2-2 -

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