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병숙 유
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1 대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호, 2008 Zoledronate 가인간양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에미치는영향 주보선 1 ㆍ안준협 2 ㆍ안병민 1 ㆍ최태영 1 ㆍ송두열 3 ㆍ김형회 3 ㆍ문화숙 1,4 좋은문화병원불임의학연구소 1, 내분비내과 2, 부산대학교병원진단검사의학과 3, 좋은문화병원산부인과 4 = Abstract = The Effect of Zoledronate on the Differentiation of Human Amniotic Fluid-Derived Mesencymal Stem Cells into Adipocytes Bo Sun Joo 1, Joon Hyop An 2, Byeong Min An 1, Tae Young Choi 1, Du Yeal Song 3, Hyung Hoi Kim 3, Hwa Sook Moon 1,4 Center for Reproductive Medicine 1, Department of Internal Medicine 2, Good Moonhwa Hospital, Department of Laboratory Medicine, Pusan National University Hospital 3, Department of Obstetrics and Gynecology, Good Moonhwa Hospital 4, Busan, Korea Background: Amniotic fluid is a rich source of fetal mesenchymal stem cells (MSCs). However, little is known about whether bisphosphonates affect the differentiation into adipocytes. Therefore, this study was aimed to investigate whether zoledronate influences the differentiation of AFMSCs into adipocytes. Methods: Amniotic fluid cells samples were obtained from 6 pregnant women by second trimester amniocentesis for performing fetal karyotyping. The cells were treated with various concentration (10 10, 10 8, 10 6 M) of zoledronate and the cells were analyzed over 21 days of culture. Differentiation into adipocytes was determined by oil-red O staining and for fatty acid synthase (FAS), acetyl CoA carboxylase 1 (ACC1) and sterol regulatory elementary binding protein-1 (SREBP-1). Results: Differentiation of AFMSCs into adipocytes was found by oil-red O staining. Zoledronate influenced the differentiation of AFMSCs into adipocytes in a dose- and time-dependent manner. At 7 days of culture, the expressions of FAS and SREBP-1 showed no significant differences compared to that of the control regardless of the dose of zoledronate. Very little ACC1 expression was found. However, the expressions of these three markers were remarkably increased at 14 days of culture. Of them, the ACC1 expression was significantly increased by 10 8 M and 10 6 M of zoledronate. At 21 days of culture, there were no effects of zoledronate on the expressions of FAS and SREBP-1. However, the ACC1 expression was decreased with an increasing dose of zoledronate (P<.05). Conclusion: This study shows that AFMSCs can be differentiated into adipocytes. The induction of this differentiation following zoledronate treatment appears to be dose dependent and time-of-culture dependent. (Korean J Blood Transfus 2008;19: ) Key words: Amniotic fluid, Mesenchymal stem cell, Adipocyte, Zoledronate 접수일 :2008년 12월 8일, 승인일 :2008년 12월 17일책임저자 : 주보선 부산시동구범일동 좋은문화병원불임의학연구소 TEL: 051) , FAX: 051) , bosunjoo@hanmail.net

2 대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호 서론 골, 연골, 근육및지방등의세포로분화가능한중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells) 는인간골수는물론성인의말초혈액, 지방조직및결체조직등다양한조직에존재하는것으로보고되고있다. 1,2) 그러나다분화능줄기세포의대표적인표지인자인 Oct-4를분비하는세포가양수에존재함이밝혀진이후, 3) 양수세포가다양한종류의줄기세포를함유하고있을가능성이제기되었으며, 최근에는중간엽줄기세포가양수에다량존재함이보고되었다. 4,5) 더욱이양수는배아줄기세포와관련된윤리적문제를야기하지않으며, 산전유전검사를위한정상적인배양조건을방해하지않고골수에비해보다쉽게채취할수있다는이점이있다. 이런점에서양수가세포치료를위한중간엽줄기세포의매우유용한제공원으로주목받고있으며, 6,7) 양수유래의중간엽줄기세포가체외에서어떤세포계통으로분화가능한지에대한연구가매우가치있는이슈로부각되고있다. 비스포스포네이트 (bisphosphonate) 는현재임상에서골다공증의치료에가장많이사용되는약제일뿐아니라골형성부전증 (osteogenesis imperfecta), 파젯병 (Paget s disease), 섬유성이형성증 (fibrous dysplasia) 등의다양한골관련질환에서사용되고있다. 8) 이러한비스포스포네이트의일차적인작용은파골세포의골흡수억제이다. 그러나최근비스포스포네이트가조골세포에도영향을준다는연구들이제시되고있으며, 일부연구는조골세포의증식과분화를증진시키고, 9-11) 세포고사를감소시킨다고보고하고있다. 12) 지방세포는조골세포와동일한계열의중간엽줄기세포로부터분화된다. 나이증가에따라조골세포보다는지방세포로우선적으로분화하는 골수의분화양상의변화가고령으로인한골다공증에있어서중요한기전이되고있다. 13) 비스포스포네이트의일종인 alendronate는중간엽줄기세포의조골세포로의분화와지방세포로의분화능력에상반된효과를주고있다. 14) 그러나이러한비스포스포네이트가중간엽줄기세포로부터지방세포로분화에미치는효과에대한연구는매우제한적이다. 특히, 인간양수유래의중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에관한연구는거의없다. 그러므로본연구는제 3세대비스포스포네이트제재중가장강력한 zoledronate가임신제2 삼분기의양수세포유래의중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에미치는효과를조사하고자한다. 재료및방법좋은문화병원산부인과에서임신제 2삼분기 (17 19주) 에산전태아염색체검사를위해시행한양수천자시, 임산부로부터임상연구에대한서면동의를받은 6명의양수를실험에이용하였다. 양수천자의대상은 35세이상의고령 4예와 Quad 검사양성 2예였으며, 염색체검사결과모두정상적인핵형을보였다. Zoledronate는노바티스회사에요청하여연구목적으로공급받아 0.1 N NaOH 용액에녹인후사용하였다. 채취한양수 20 ml 가운데 18 ml는염색체검사에제공하였으며, 나머지 2 ml는원심분리 (1,500 rpm, 7분 ) 후상층액을제거하고침전된세포를 5 ml의 PBS에서원심분리 (1,500 rpm, 7분 ) 하여세척하였다. 침전된세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Gibco BRL, USA), 100 U/mL penicillin, 10μg/mL streptomycin이첨가된 α-modified Eagle Medium (α-mem, Gibco) 에 /ml 의농도로 60 mm 배양접시에부유시킨후 37 o C,

3 Zoledronate 가중간엽줄기세포의분화에미치는영향 5% CO 2 배양기에넣어부유된세포가배양접시바닥에부착할수있게하였다. 부착된세포가바닥에 90% 정도충만하게자랄때까지약 15일동안배양하였으며배양액은 3 4일간격으로교체하였다. 양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화를유도하기위해충만하게자란단층세포를 10% FBS, 1 mm dexamethasone, 0.5 mm 3d-siobutyl-1-methylxanthine (Sigma), 1 mg/ml insulin이함유된 a-mem 배지에서 21일동안배양하였다. 배지는 3 4일간격으로교환해주었으며, Oil-Red O 염색방법에의해지방세포로의분화여부를관찰하였다. Zoledronate는분화제가첨가한배지에배양을시작할때부터각각 10 10, 10 8, 10 6 M의농도로처리하였으며, 배양 7일, 14일및 21일째 sterol regulatory elementary binding protein (SREBP)-1, Acetyl-CoA carboxylase-1 (ACC-1) 및 fatty acid synthase (FAS) 의 3가지지방세포분화표지자에대한역전사중합효소반응 (RT-PCR; reverse transcription-polymerase chain reaction) 으로분화여부를조사하였다. 전체 RNA를 Trizol Reagent (Invitrogen) 를이용하여제품설명서를토대로배양된세포로부터분리하고, RNA 양과순도는흡광계를이용하여 260 nm 파장과 280 nm 파장사이에서측정하였다. cdna는 3μg의 RNA를 M-MLV Reverse Transcriptase (Promega) 와 random hexamer (COSMO, Korea) 를이용해합성하였다. 역전사반응을위한혼합물은 42 o C에서 30분동안반응시켰고, 그후 99 o C에서 10분동안열을가하고 4 o C로냉각시켰다. Actin 유전자의발현을 RT-PCR의양성대조군으로사용하였다. FAS 유전자의 primer는 5 -GAAACTGCAGGA- GCTGTC-3 (sense), 5 -CACGGAGTTGAG GCG- CAT-3 (antisense), SREBP-1 유전자 primer는 5 - ACGGCAGCC CCTGTAACGACCA CTGTGA-3 (sense), 5 -TGCCAAGATGGTTCCGCCACTCAC- CAGG-3 (antisense), ACC1 유전자 primer는 5 - GCTGCTCGGA TCACTAGTGAA-3 (sense), 5 -TTC- TGCTATCAGTC TGTCCAG-3 (antisense), Actin 유전자 primer는 5 -GACTACCTCATGAAGATC-3 (sense), 5 -GATCCA CATCTGCTGGAA-3 (antisense) 을사용하였다. 각각의 cdna를증폭시키기위해 DNA polymerase (COSMO, Korea) 와 dntp (Takara) 그리고각각의 primer를섞어사용하였다. PCR 결과물은 1.6% agarose gel에 loading하였다. 밴드의수치화는 ImageJ 프로그램 (NIH.GOV.NCBI) 을이용하였다. 6개의양수시료에대한 SREBP1, ACC1, FAS 발현양은평균 ±SEM으로표시하였으며, zoledronate 처리에따른이들분화인자의발현양에대한통계적유의성은 SPSS 프로그램 (version 12.0) 을이용하여사용하여 student t-test 방법으로검증하였고, P<0.05인경우를유의성이있는것으로판단하였다. 결과양수세포를지방세포분화배지에서 21일동안배양하여 Oil-Red O 염색방법으로염색한결과 Fig. 1과같은양성세포를확인할수있었다. 이러한결과는양수내지방세포로분화할수있는중간엽줄기세포가존재함을의미한다. 이러한양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에 zoledronate가미치는효과를조사하기위해다양한농도의 zoledronate (10 10, 10 8, 10 6 M) 를지방세포분화배지에첨가하고 7일, 14일, 21일째지방세포로의분화를 FAS, ACC1,

대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호 Fig. 1. Differentiation assay for amniotic fluidderived mechenchimal stem cells into adipogenic cells by Oil-Red O staining. 40 magnification.

4 대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호 Fig. 1. Differentiation assay for amniotic fluidderived mechenchimal stem cells into adipogenic cells by Oil-Red O staining. 40 magnification. SREBP-1의 mrna 발현여부를 RT-PCR 방법으로측정하였다. 배양 7일째에는첨가한 zoledronate 농도에관계없이 FAS와 SREBP-1의발현이대조군과유의한차이가없었으며, ACC1의경우발현이거의나타나지않았다. 그러나 SREBP-1 발현은 zoledronate 10 8 M 농도에최고치를보이다가 10 6 M 농도에서다시감소하는양상을나타내었다 (Fig. 2). 배양 14일째에는지방세포분화표지자의발현이배양 7일째에비해전체적으로증가하는경향을보이면서배양 7일째와다른경향을보였다. 특히, 배양 7일째발현이거의되지않았던 ACC1 Fig. 2. Effects of zoledronate on adipocyte differentiation from amniotic fluid derived MSCs (7 days in culture). Lane 1, adipogenic differentiation media without zoledronate (control); Lane 2 4, adipogenic differentiation media treated with 10 10, 10 8, 10 6 M of zoledronate, respectively. Data are the mean± SEM. *P<0.05 compared with control. Fig. 3. Effects of zoledronate on adipocyte differentiation from amniotic fluid derived MSCs (14 days in culture). Lane 1, adipogenic differentiation media without zoledronate (control); Lane 2 4, adipogenic differentiation media treated with 10 10, 10 8, 10 6 M of zoledronate, respectively. Data are the mean± SEM. *P<0.05 compared with control

5 Zoledronate 가중간엽줄기세포의분화에미치는영향 의발현은 10 8 M 과 10 6 M zoledronate 농도에서대조군에비해유의한증가를보였다. Zoledronate 10 8 M 농도이후농도가증가할수록 FAS, ACC1, SREBP-1의세표지자의발현이대조군에비해증가하였으며, 특히 FAS와 ACC1 유전자발현은유의하게증가하였다 (P<.05) (Fig. 3). 배양 21일째에는 FAS 유전자의발현이 10 8 M 농도에서대조군에비해다소감소하는경향을보였으나유의한차이가없었으며, SREBP-1 유전자의발현역시 zoledronate 농도에따른차이가 Fig. 4. Effects of zoledronate on adipocyte differentiation from amniotic fluid derived MSCs (21 days in culture). Lane 1, adipogenic differentiation media without zoledronate (control); Lane 2 4, adipogenic differentiation media treated with 10 10, 10 8, 10 6 M of zoledronate, respectively. Data are the mean± SEM. *P<0.05 compared with control. 없었다. 그러나 ACC1 유전자의발현은 zoledronate의농도가증가함에따라점차감소하다가 10 6 M 농도에서유의한감소를보였다 (P<.05) (Fig. 4). 고찰 양수는삼배엽층을구성하는다양한종류의태아및배아유래의세포를함유하고있어, 15) (Gosden 1983), 산전유전검사를위한시료로널리사용되어지고있다. 그럼에도불구하고양수세포의기원이나성질에대해서는잘알려져있지않을뿐아니라중간엽줄기세포의존재에대한연구는매우미비하였다. 그러나최근들어양수유래의중간엽줄기세포로부터조골세포와지방세포로분화가일어남이보고되고있다. 6,8,16) 더구나양수는중간엽줄기세포의제공원으로널리이용되어왔던골수에비해채취가용이하고, 배양하여얻을수있는줄기세포의양도더풍부할뿐아니라골수유래줄기세포에비해덜분화되어있다. 4) 또한 Nardi 등 17) 은중간엽줄기세포의증식이나콜로니 ( 집락 ) 형성능력이골수보다양수에서증가한다고보고하였다. 이러한결과는양수가골수보다중간엽줄기세포의제공원으로보다유용하게활용될수있는가능성을충분히시사하고있다. 5) 본연구역시임신제 2삼분기의양수세포로부터지방세포로의분화를확인함으로써양수내중간엽줄기세포의존재를재입증하고있다. 그러나본연구에서주목할만한결과는이러한양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에비스포스포네이트제제중가장강력한 zoledronate가농도및배양시간에의존적으로영향을미친다는것이다. 이러한결과는저자들의문헌고찰에의하면처음인것으로사료된다

6 대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호 본연구는 zoledronate에의한지방세포로의분화효과가배양초기인 7일째에는나타나지않다고배양 14일째에유의한효과가관찰되었으며, 배양 21일째는분화효과의증가가없거나오히려감소하는경향을가짐을보여주고있다. 이러한결과는 Liu 등 18) 의결과와유사하다. 그들은골수와지방조직유래의중간엽줄기세포로부터골세포, 지방세포, 및연골세포의분화에관한연구에서지방세포로의분화가배양 14일째나타남을보고하였다. 일반적으로음식을섭취하였을경우일차적으로 SREBP-1과 ACC1의발현이우선되고, 이러한발현이 FAS의발현을촉진시켜지방세포의수와크기를결정하는것으로알려져있다. 19) 그러나본연구에서 FAS의발현은배양초기인 7일째부터발현되기시작하여배양 21일째까지계속되었으며, zoledronate에의한 FAS 발현의증가효과는배양 14일째에만확인되었으며, 배양 21일째 zoledronate의효과가소실되었다. 반면 ACC1의유의한발현은배양 14일째부터확인되었으며, 배양 21일째고농도 (10 6 M) 의 zoledronate에서다시감소하였다. SREBP-1의발현은배양 7일째부터 21일째까지관찰되었으나, zoledronate의의한유의한효과는없었다. Duque와 Rivas 등 14) 은골수유래중간엽줄기세포로부터골세포와지방세포로의분화연구에서또다른비스포스포네이트인 alendronate가골세포의분화를촉진시키는반면, 지방세포로의분화를억제한다고보고하였다. 이러한결과는 zoledronate가지방세포의분화를촉진시킨다는본연구결과와상반된다. 이러한결과의차이가비스포스포네이트종류의차이에기인하는것이지중간엽줄기세포의제공원의차이에기인하는것인지는확실하지않다. 그러나비스포스포네이트는종류에따라파골세포의흡수억제효과가다르 고, 20-22) 골수와양수내중간엽줄기세포의분화정도의차이를고려할때, 4,15) 비스포스포네이트종류와중간엽줄기세포의제공원에따른지방세포의분화능력의차이에대한더많은연구가진행되어야할것으로사료된다. 본연구는 zolendronate가지방세포로의증식과분화에작용하는기전에대해서는규명하지못하고있다. Liu 등 18) 은골수및지방조직유래의중간엽줄기세포로부터지방세포의분화동안 C/ EBPα와 Peroxisome proliferator adipogenic transcription factor (PPAR)γ의두전사인자의발현이촉진된다고보고하였다. 저자들은조골세포분화특이세포주인 C2C12 와 MC3T3-E1 세포를이용한연구에서 alendronate가 C/EBPβ의발현을촉진함을확인한바있다 ( 미발표결과 ). 따라서 zoledronate에의한지방세포로의분화촉진효과가이러한전사인자를통하여이루어지는지에대한더많은연구가필요하다. 본연구의또다른제한점은지방세포로의분화를 RT-PCR을통한분화표지자의발현량만을측정하였다는것이다. 따라서앞으로유세포분리기 (fluorescent activated cell sorter; FACS) 등을이용한분화된지방세포의양적측정실험을수행함으로써 RT-PCR 결과를보다명확히할수있는연구가진행되어야할것으로사료된다. 결론적으로본연구는양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화를확인할수있었으며, zoledronate가지방세포로의분화에미치는효과는농도에따르며, 지방세포의각분화인자에미치는효과또한분화기간에따라다른양상을보여주고있다. 그러나 Oct-4 양성세포의수가양수내전체세포의약 % 에불과하며, 분석된양수시료의약절반만이 Oct-4 양성세포를함유하고있기때문에, 3) 양수세포를제공하는개체간에중간엽줄기세포의분포와분화능력에

7 Zoledronate 가중간엽줄기세포의분화에미치는영향 있어서는많은다양성이존재할수있다. 따라서 6 개양수시료를대상으로한본연구의결과를 보다명확히하기위해서는더많은시료를대상으로한연구가필요할것으로사료된다. 요약 배경 : 양수가중간엽줄기세포의매우유용한제공원으로주목받고있다. 그러나양수유래의중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에관한연구는매우제한적이며, 특히비스포스포네이트가지방세포로의분화에미치는효과에대한연구는거의없다. 그러므로본연구는제 3세대비스포스포네이트제재인 zoledronate가임신제2 삼분기의양수세포유래의중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화에미치는효과를조사하고자한다. 방법 : 양수는 6명의임산부로부터임신제 2 삼분기에산전염색체검사를위한양수천자에의해채취하였다. 채취한양수유래중간엽줄기세포에다양한농도 (0, 10 10, 10 8, 10 6 M) 의 zoledronate를처리하고 7일부터 21일째까지일주일간격으로지방세포의분화를 oil-red O 염색방법과 fatty acid synthase (FAS), acetyl CoA carboxylase 1 (ACC1), 및 sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) 유전자의발현을 RT-PCR 방법으로조사하였다. 결과 : 양수세포를지방세포분화배지에서 21 일동안배양하여 Oil-Red O 염색방법으로염색한결과지방세포에대한양성세포를확인할수있었다. 이러한결과는양수내지방세포로분화할수있는중간엽줄기세포가존재함을의미한다. Zoledronate가양수유래중간엽줄기세포로부터지방세로포의분화에농도및배양시간에의존적으로영향을미쳤다. 배양 7일째에는 zoledronate 농도에관계없이 FAS와 SREBP-1의발현이대조군과유의한차이가없었으며, ACC1의발현은거의나타나지않았다. 그러나배양 14일째에지방세포분화표지자의발현이배양 7일째에비해전체적으로증가하였으며, ACC1의발현은확연하게유의한증가를보였다. 배양 21일째에는 FAS와 SREBP-1 유전자의발현에서는 zoledronate의효과가없었으나, ACC1 유전자의발현은 zoledronate의농도가증가함에따라점차감소하다가 10 6 M 농도에서유의한감소를보였다 (P<.05). 결론 : 본연구는양수유래중간엽줄기세포로부터지방세포로의분화를확인할수있었으며, zoledronate가지방세포로의분화에미치는효과는농도에따르며, 지방세포의각분화인자에미치는효과또한분화기간에따라다른양상을보여주고있다. 참고문헌 1. Minguell JJ, Erices A, Conget P. Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med (Maywood) 2001; 226: Bartholomew A, Sturgeon C, Siatskas M, Ferrer K, McIntosh K, Patil S, et al. Mesenchymal stem cells suppress lymphocyte proliferation in vitro and prolong skin graft survival in vivo. Exp Hematol 2002;30: Prusa AR, Marton E, Rosner M, Bernaschek G, Hengstschläger M. Oct-4-expressing cells in human amniotic fluid: a new source for stem cell research? Hum Reprod 2003;18: Kim J, Lee Y, Kim H, Hwang KJ, Kwon HC, Kim SK, et al. Human amniotic fluid-derived stem cells have characteristics of multipotent stem cells. Cell Prolif 2007;40: Siegel N, Rosner M, Hanneder M, Valli A,

8 대한수혈학회지 : 제 19 권제 3 호 Hengstschläger M. Stem cells in amniotic fluid as new tools to study human genetic diseases. Stem Cell Rev 2007;3: In 't Anker PS, Scherjon SA, Kleijburg-van der Keur C, Noort WA, Claas FH, Willemze R, et al. Amniotic fluid as a novel source of mesenchymal stem cells for therapeutic transplantation. Blood 2003;102: Tsai MS, Lee JL, Chang YJ, Hwang SM. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluid using a novel two-stage culture protocol. Hum Reprod 2004;19: Devogelaer JP. Treatment of bone diseases with bisphosphonates, excluding osteoporosis. Curr Opin Rheumatol 2000;12: Reinholz GG, Getz B, Pederson L, Sanders EL, Subramaniam M, Ingle JN, et al. Bisphosphonates directly regulate cell proliferation, differentiation, and gene expression in human osteoblasts. Cancer Res 2000;60: Fromigué O, Body JJ. Bisphosphonates influence the proliferation and the maturation of normal human osteoblasts. J Endocrinol Invest 2002;25: Im GI, Qureshi SA, Kenney J, Rubash HE, Shanbhag AS. Osteoblast proliferation and maturation by bisphosphonates. Biomaterials 2004;25: Aubin JE. Bone stem cells. J Cell Biochem Suppl 1998;30-31: Gimble JM, Zvonic S, Floyd ZE, Kassem M, Nuttall ME. Playing with bone and fat. J Cell Biochem 2006;98: Duque G, Rivas D. Alendronate has an anabolic effect on bone through the differentiation of mesenchymal stem cells. J Bone Miner Res 2007;22: Gosden CM. Amniotic fluid cell types and culture. Br Med Bull 1983;39: Peng HH, Wang TH, Chao AS, Chang SD. Isolation of differentiation of human mesenchymal stem cells obtained from second trimester amniotic fluid; experiments at Chang Gung Memorial Hospital. Chang Gung Med J 2007;30: Nadri S, Soleimani M. Comparative analysis of mesenchymal steromal cells from murine bone marrow and amniotic fluid. Cytotherapy 2007;9: Liu TM, Martina M, Hutmacher DW, Hui JH, Lee EH, Lim B. Identification of common pathways mediating differentiation of bone marrow- and adipose tissue-derived human mesenchymal stem cells into three mesenchymal lineages. Stem Cells 2007;25: Kim JB, Sarraf P, Wright M, Yao KM, Mueller E, Solanes G, et al. Nutritional and insulin regulation of fatty acid synthetase and leptin gene expression through ADD1/SREBP1. J Clin Invest 1998;101: Green JR. Chemical and biological prerequisites for novel bisphosphonate molecules: results of comparative preclinical studies. Semin Oncol 2001;28(Suppl 2): Kellinsalmi M, Mönkkönen H, Mönkkönen J, Leskelä HV, Parikka V, Hämäläinen M, et al. In vitro comparison of clodronate, pamidronate and zoledronic acid effects on rat osteoclasts and human stem cell-derived osteoblasts. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005;97: von Knoch F, Jaquiery C, Kowalsky M, Schaeren S, Alabre C, Martin I, et al. Effects of bisphosphonates on proliferation and osteoblast differentiation of human bone marrow stromal cells. Biomaterials 2005;26:

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α α α α α α α α 太陰調胃湯加減方 dbdb 마우스 肝에 대한 아디포사이토카인 및 발현에 미치는 영향 SREBPs 와 섞어서 하고 마커 또한 하여 전기 영동을 하였다 전기영동을 한 후에 에 를 쪼여서 각 를 확인하였다 이 를 프로그램을 이용해 수치화하 여 분석하였다 肝 조직 동결 절편 분리한 조직은 로 시간 동안 고정 시킨 후 에 세척한 후 물기를