특허청구의범위 청구항 1 1 내지 100 nm 의아펠린 (apelin) 을함유하는것을특징으로하는줄기세포의재생능향상을위한배지조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기배지는셀레늄 (selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-1

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본승 호
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1 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 (43) 공개일자 2014년11월19일 (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/02 ( ) C12N 5/074 ( ) C12N 5/0775 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2013 년 05 월 09 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 9 항 2014 년 04 월 17 일 (71) 출원인 라정찬 충청북도청원군내수읍신기초정로 699 주식회사케이스템셀 서울특별시영등포구국회대로 76 길 10 ( 여의도동, 기독교한국침례회총회빌딩 ) (72) 발명자 라정찬 충청북도청원군내수읍신기초정로 699 강성근 서울특별시관악구성현로 80, 116 동 504 호 ( 봉천동, 관악드림타운아파트 ) 조정윤 서울특별시송파구동남로 28 길 13 ( 오금동 ) (74) 대리인 이처영 (54) 발명의명칭줄기세포의재생능향상을위한배지조성물및이를이용한줄기세포의배양방법 (57) 요약 본발명은줄기세포의재생능향상을위한아펠린을함유하는배지조성물및이를이용한줄기세포의배양방법에관한것이다. 본발명에따르면, 줄기세포를세포특성의변화없이효과적으로증식및배양할수있고활성을증가시킬수있으므로줄기세포를이용한세포치료효능을획기적으로증진시킬수있다. 대표도 - 도 4-1 -

2 특허청구의범위 청구항 1 1 내지 100 nm 의아펠린 (apelin) 을함유하는것을특징으로하는줄기세포의재생능향상을위한배지조성물. 청구항 2 제1항에있어서, 상기배지는셀레늄 (selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10 (CoQ-10), 레스베라톨 (resveratol), T-BHQ, oltipraz, 오리나무추출물, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid) 로구성된군에서선택되는 1종이상을추가로함유하는것을특징으로하는줄기세포의재생능향상을위한배지조성물. 청구항 3 제 2 항에있어서, 상기추가되는성분은코엔자임 Q-10 (CoQ-10) 또는 oltipraz 인것을특징으로하는줄기세포 의재생능향상을위한배지조성물. 청구항 4 제1항에있어서, 상기배지는 NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린또는인슐린유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bfgf (basic fibroblast growth factor), 헤파란황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2- mercaptoethanol) 및 EGF (epidermal growth factor) 로구성된군에서선택되는 1가지이상의성분을추가로함유하는것을특징으로하는줄기세포의재생능향상을위한배지조성물. 청구항 5 제 1 항에있어서, 상기줄기세포는성체줄기세포인것을특징으로하는줄기세포의재생능향상을위한배지조 성물. 청구항 6 제 5 항에있어서, 상기줄기세포는지방조직유래중간엽줄기세포인것을특징으로하는줄기세포의재생능향 상을위한배지조성물. 청구항 7 제 1 항내지제 6 항중어느한항의배지조성물에서줄기세포를배양하는단계를포함하는줄기세포의재생능을 향상시키는방법. 청구항 8 제 7 항에있어서, 상기줄기세포는성체줄기세포인것을특징으로하는줄기세포의재생능을향상시키는방법. 청구항 9-2 -

3 제 8 항에있어서, 상기줄기세포는지방조직유래중간엽줄기세포인것을특징으로하는줄기세포의재생능을 향상시키는방법. 명세서 [0001] 기술분야본발명은줄기세포의재생능향상을위한배지조성물및이를이용한줄기세포의배양방법에관한것으로, 보다상세하게는노령인의줄기세포가젊은사람의줄기세포수준의재생능을가지도록, 크기와활성의변화없이줄기세포의재생능을효과적으로향상시킬수있는줄기세포의배지조성물및이를이용한줄기세포의배양방법에관한것이다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] 배경기술줄기세포 (stem cell) 는자기복제능력을가지면서두개이상의세포로분화하는능력을갖는세포를말하며, 만능줄기세포 (totipotent stem cell), 전분화능줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능줄기세포 (multipotent stem cell) 로분류할수있다. 만능줄기세포 (totipotent stem cell) 는하나의완전한개체로발생해나갈수있는만능의성질을가진세포로난자와정자의수정이후 8세포기까지의세포가이러한성질을가지며이세포를분리하여자궁에이식하면하나의완전한개체로발생해나갈수있다. 전분화능줄기세포 (pluripotent stem cell) 는외배엽, 중배엽, 내배엽층유래의다양한세포와조직으로발생할수있는세포로서, 수정 4 5일후나타나는배반포 (blastocyst) 의안쪽에위치한내세포괴 (inner cell mass) 에서유래하며, 이를배아줄기세포라하며다양한다른조직세포로분화되지만새로운생명체를형성하지는못한다. 다분화능줄기세포 (multipotent stem cell) 는이세포가포함되어있는조직및기관에특이적인세포로만분화할수있는줄기세포로서, 태아기, 신생아기및성체기의각조직및장기의성장과발달은물론성체조직의항상성유지와조직손상시재생을유도하는기능에관여하고있으며조직특이적다능성세포들을총칭하여성체줄기세포라한다. 성체줄기세포는인체의각종장기에이미존재하는세포를채취, 줄기세포를발전시킨것으로특정조직으로만분화되는특징이있다. 그러나최근에는성체줄기세포를이용, 간세포등각종여러조직으로분화시키는실험이성공을거두고있어주목된다. 특히, 병이나사고에의한기능장애나부조화에빠진생체조직및장기의재생및기능회복을위해세포를적극적으로활용하여실시하는치료법인재생의료에있어서, 환자본인으로부터줄기세포, 혈액유래단핵세포혹은골수유래단핵세포를수집하는단계, 시험관배양으로세포증식및 / 또는분화를유도하는단계, 및선택된미분화 ( 줄기세포및 / 또는전구세포 ) 및 / 또는분화세포를착상에의해환자자신의몸에도입하는단계를포함하는방법이많이이용되고있다. 이처럼, 기존의고전적인약물처치나수술적방법을통한질병치료가손상된세포 조직 장기를건강한것으로바꾸는세포 조직대체치료법으로대체될것으로예측됨으로써, 줄기세포의활용도는더욱높아지게될것이다. 따라서, 현재줄기세포의다양한기능이연구되고있는실정이며, 그중에서도중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells) 를이용한세포치료기술이각광을받기시작하면서, 인체로부터분리된중간엽줄기세포를치료에적합하도록개선하기위한기술이개발되고있다 (WO 2006/019357, 대한민국등록특허제 호, 대한민국등록특허제 호 ). 한편, 인간의연령이증가하면몸속장기의기능이나세포의재생능력이감소하듯이, in vitro 상에서줄기세포를거듭배양하거나외부인자의자극이있는경우, 세포의기능및모양이변할수있다. 즉, in vitro 상에서세포의배양이시작되는순간거의감지할수없을정도이지만세포가기능을잃기시작하며노화 (senescence) 의상태로들어간다. 이러한세포특성때문에유전자치료에이용할세포로는초기세포를사용하는것이좋으며, 또는오랜기간배양을진행하여도증식능, 분화능, 표현형, 형태, 활성 (telomere 길이 ) 과같은줄기세포의특성에큰변화가없는줄기세포를사용하는것이좋으므로이와관련된연구들이진행중에있다 (BMC Cell Biology 2006, 7:14, Ageing Research Reviews 5, 2006, 91116). 이에, 본발명자들은줄기세포를거듭배양하여도세포의모양이나활성등의세포특성에변화가없으면서세포의재생능을개선할수있는배지성분을탐색하고자예의노력한결과, 아펠린을함유하는배지조성물에서줄기세포를배양하는경우, 세포의재생능을향상시킬수있음을확인하고본발명을완성하게되었다. 발명의내용 - 3 -

4 [0007] 해결하려는과제 본발명의목적은노령인의줄기세포로부터젊은사람의줄기세포수준의재생능을갖도록줄기세포의재생능을 향상시키기위한배지조성물및이를이용한줄기세포의배양방법을제공하는데있다. [0008] [0009] 과제의해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명은아펠린을함유하는것을특징으로하는줄기세포배양용배지조성물을제공한다. 본발명은또한, 아펠린을함유하는배지조성물에서줄기세포를배양하는단계를포함하는줄기세포의재생능을향상시키는방법을제공한다. [0010] 발명의효과본발명에따르면, 줄기세포를거듭배양하여도세포의활성이나크기등의세포의특성에는변화가없으면서세포의재생능은향상시킬수있으므로단기간에다량의줄기세포를수득할수있어줄기세포를이용한세포치료효능을획기적으로증진시킬수있다. [0011] 도면의간단한설명 도 1 은 40 대, 50 대및 60 대유래의지방줄기세포를실시예 1 에제시한배양배지로 3 계대 (passage) 까지계대한 후, 각각의배지에서 4 일차까지의현미경상에서형태를확인한사진이다. 도 2는 40대, 50대및 60대유래의지방줄기세포를실시예 1에제시한배양배지로 3 계대 (passage) 까지계대한후, 각각의배지에서 4일차까지의세포의생존력 (viability) 을나타낸그래프이다. 도 3은 40대, 50대및 60대유래의지방줄기세포를실시예 1에제시한배양배지로 3 계대 (passage) 까지계대한후, 각각의배지에서 4일차까지의세포의크기를나타낸그래프이다. 도 4은 40대, 50대및 60대유래의지방줄기세포를실시예 1에제시한배양배지로 3 계대 (passage) 까지계대한후, 각각의배지에서 4일차까지의 CPDL(cell population doubling level) 을나타낸그래프이다. [0012] 발명을실시하기위한구체적인내용달리정의되지않는한, 본명세서에서사용된모든기술적및과학적용어들은본발명이속하는기술분야에서숙련된전문가에의해서통상적으로이해되는것과동일한의미를갖는다. 일반적으로, 본명세서에서사용된명명법및이하에서기술하는실험방법은본기술분야에서잘알려져있고통상적으로사용되는것이다. [0013] [0014] [0015] [0016] 본발명에서, " 줄기세포 (stem cell)" 란자기복제능력을가지면서두개이상의세포로분화하는능력을갖는세포를말하며, " 성체줄기세포 " 는발생과정이진행되어배아의각장기가형성되는단계혹은성체단계에서나타나는줄기세포를의미한다. 본발명에서, " 중간엽줄기세포 " 는인간또는포유류의조직으로부터분리해낸미분화된줄기세포로서, 다양한조직에서유래할수있다. 특히, 제대유래중간엽줄기세포, 제대혈유래중간엽줄기세포, 골수유래중간엽줄기세포, 지방유래중간엽줄기세포, 근육유래중간엽줄기세포, 신경유래중간엽줄기세포, 피부유래중간엽줄기세포, 양막유래중간엽줄기세포및태반유래중간엽줄기세포일수있으며, 각조직에서줄기세포를분리하는기술은당해업계에이미공지되어있다. 본발명에서, " 지방조직유래중간엽줄기세포 " 란지방조직에서분리해낸미분화된성체줄기세포로서, 본명세서에축약하여 지방유래성체줄기세포, 지방줄기세포 또는 지방유래줄기세포 라고지칭하기도한다. 이는당업계에공지된통상의방법을통하여수득할수있는데, 그분리방법은예를들어다음과같을수있다. 즉, 지방흡입술로부터얻어지는생리식염수에부유된지방함유 suspension을배양한다음, 플라스크등배양용기에부착된줄기세포층을트립신으로처리한다음회수하거나, 스크래퍼로긁어서소량의생리식염수에부유되는것을직접회수하거나하는방법등을통해지방유래중간엽줄기세포를분리할수있다. 본발명에서, 줄기세포의크기의 ( 가 ) 변화없이 는줄기세포의형태 (morphology) 나크기 (size) 가배지조성 - 4 -

5 물에서배양되기전의상태와거의유사하게그형태를유지하는것을의미하는것이다. [0017] [0018] [0019] [0020] 본발명에서, 배지 (culture media)" 는체외배양조건에서줄기세포의성장및생존을지지할수있게하는배양액을의미하고, 줄기세포의배양에적절한당분야에서사용되는통상의배지를모두포함한다. 또한, 세포의종류에따라배지와배양조건을선택할수있다. 본발명에서, 증식 (proliferation)" 이란, 세포수의증가를의미하는것으로성장 (growth) 과동일한의미로사용된다. 본발명에서, 재생능 (renewal ability)" 이란, 세포가자신과똑같은복사본을만들어낼수있는능력을의미하는것으로, 재생능이개선되는경우세포의증식능이우수하다. 본발명에서, 계대배양 이란, 세포를건강한상태로지속적으로장기간배양하기위해주기적으로세포의일부를새로운배양용기에옮긴후배양배지를갈아주면서세포의대 ( 代 ) 를계속이어서배양하는방법을의미한다. 한정된공간을가진배양용기내에서세포의수가늘어나면서일정시간이지나면증식영양분이소비되거나오염물질이쌓여세포가자연히죽게되므로, 건강한세포의수를늘리기위한방법으로사용되며, 통상적으로한차례배지 ( 배양용기 ) 를교체하는것또는세포군을나누어배양하는것을 1 계대 (1 passage) 라고한다. 계대배양의방법은당업계에공지된방법을제한없이사용할수있으나, 바람직하게는기계적분리또는효소적분리로수행될수있다. [0021] [0022] 줄기세포는배양을거듭하거나, 외부로부터자극을받을수록세포의형태나크기등이미세하게변형되거나달라지며, 세포의재생능과활성 (telomerase activity) 이낮아진다는문제점, 즉세포노화가진행된다는문제점이있다. 세포의재생능과활성등의특징은세포를어떤배지에서배양하는지에따라차이가있으므로, 거듭되는배양에도불구하고형태등의세포특성에큰변화없이재생능이나활성도가낮아지지않도록하는배지조성물에서줄기세포를배양하는것이중요하다. 즉, 세포의노화를지연또는개선시키거나초기세포상태를유지시키는배지조성물에서줄기세포를배양하는것이중요하다. 그러나종래의배지조성물에서의줄기세포배양에의하면, 높은수율의줄기세포를얻기위하여계대배양을여러차례수행하여야하므로인력및시간이많이소요되며, 특히계대배양에필요한배지성분중일부는대단히고가여서경제적으로도장점이존재하지않았다. 또한, 거듭되는계대배양에의하여세포의재생능이낮아진다는문제점이있었다. 본발명은세포의형태나활성에변화가없으면서세포의재생능을향상시킬수있는배지조성물을제공하는것이가능하다. [0023] [0024] 따라서, 본발명은일관점에서, 아펠린을함유하는것을특징으로하는줄기세포배지조성물을제공한다. 아펠린 (apelin) 은, 1998년 Fujino M 팀에서 rat와 bovin의우유에서발견된것으로, 특히초유에많은신규한펩타이드로 APLN 유전자에암호화되는인체내에있는단백질이며 (Tatemoto K et al., (1998). "Isolation and characterization of a novel endogenous peptide ligand for the human APJ receptor". Biochem. Biophys. Res. Commun. 251 (2): doi: /bbrc PMID ), 몇몇세포표면에발현하는 G-단백질에결합되어있는 APJ 수용체에대한내재적인리간드이다 (Lee DK et al., (2000). "Characterization of apelin, the ligand for the APJ receptor", J. Neurochem. 74 (1): doi: /j x. PMID Szokodi I et al., (2002). "Apelin, the novel endogenous ligand of the orphan receptor APJ, regulates cardiac contractility". Circ. Res. 91 (5): doi: /01.res PMID , Kleinz MJ, Davenport AP (2005)."Emerging roles of apelin in biology and medicine". Pharmacol. Ther. 107 (2): doi: /j.pharmthera PMID , O'Dowd BF et al., (December 1993). "A human gene that shows identity with the gene encoding the angiotensin receptor is located on chromosome 11". Gene 136 (12): doi: / (93)90495-o. PMID , Devic E et al., (October 1996). "Expression of a new G protein-coupled receptor X-msr is associated with an endothelial lineage in Xenopus laevis". Mech. Dev. 59 (2): doi: / (96) PMID ). 아펠린은폭넓게심장, 간, 폐, 신장, 지방조직, 위장간, 뇌, 부신땀쌤, 내피, 그리고사람의혈장등다양한기간에서발현되며, 이중혈관내피조직에서높은발현을나타낸다

6 [0025] [0026] [0027] 아펠린유전자는 N-terminal 부분에서신호단백질인 77개의아미노산의 pre-proprotein을암호화한다. 아펠린의몇가지활성적인 fragment (apelin-36, apelin-19, apelin-17, apelin-16, apelin-13 및 apelin-12) 는비교적유사한생물학적활성을공유한다 (Invited Review Article, Targeting the ACE2 and Apelin Pathways are Novel Therapies for Heart Failure: Opportunities and Challenges). 더자세히기술하면 endoplasmic reticulum ( 세포망상질 ) 안에서 translocation과신호단백질을절단한후 55개의아미노산의 proprotein은여러가지활성적인 fragment을생성할수있는데이는 (apelin 36) sequence에연결되는 36 개아미노펩타이드, (apelin 17) sequence에연결되는 17개아미노펩타이드, (apelin 13) sequence에연결되는 13개아미노펩타이드이다. 이다음 fragment는 N-terminal 글루타민잔기의수준에서 pyroglutamylation (N-terminal에있는글루타민에서 pyroglutamic acid의에스테르 (ester) 를형성하는과정 ) 을겪는다. 그러나사람의혈장내의이들펩타이드의농도에대해서는아직까지잘알려져있지는않다 (Mesmin C, Dubois M, Becher F, Fenaille F, Ezan E (2010). "Liquid chromatography/tandem mass spectrometry assay for the absolute quantification of the expected circulating apelin peptides in human plasma". Rapid Commun Mass Spectrom 24 (19): doi: /rcm PMID ). 아펠린은 2006년 Audigier에의해 G proten-coupled receptors의 family인막수용체 (membrane receptor) 또는몇몇의포텐셜리간드 (potential ligands) 와작용하는시그널경로 (signal pathway) 가밝혀졌다. Receptor 발현의 sites는 organism 내에서아펠린에의해작동한다른기능으로연결된다 (wikipedia 발췌 ). 아펠린수용체의활성은아펠린펩타이드에결합하여세포활성변화를개시한다. 아펠린은심장부전의 biomarker로써적용될가능성이있고혈관수축및확장을포함한생물학적효과에직접적으로관여한다고한다. 최근연구에서도아펠린과아펠린수용체시스템이혈관발생과관련이있다는보고들이있으며, 혈관계통의질병에서도밀접한관계가있다는보고가있다. 아펠린과수용체의기능은사람의생리학과병리생리학에중요하며, 그예로아펠린이혈관확장에서산화질소 (nitric oxide) 를생산하여 L-아르기닌 / 산화질소합성효소 (nitric oxide synthase ;NOS)/ 산화질소를활성화한다고하며이는혈관확장과수축의역할과도관계가있다고한다. 아펠린수용체와 Angiotensin II 수용체는상당한 homology를가지는데혈관병리생리학의관점에서아펠린시그널링이잠재적역할을할것으로생각된다. 혈관기능 (Vascular fuction) 의관점에서아펠린시그널링의기능은내피세포에의한아펠린수용체의활성에의해서발현되는데혈관생성과혈관의가소성에도움을주며, 그리고휴지상태의내피세포에저혈압을유도하는기능을한다. 2008년 Eyies에의해연구된내용에서도저산소상황에서아펠린의발현이내피세포의분열과혈관형성재생을조절한다고기술되어있다. 이는저산소증으로아펠린유전자의상향조절 (upregulation) 에의해유도되거나내피세포에서아펠린의 mitogenic activity에관여된다. 반면에 Akt의 Activation에의한혈압강하작용도일어난다. 또한혈관에서는혈압을조절하며신생혈관의생성을촉진하며 NO 생성은증가시키고동맥경화증과대동맥류를유발하는안지오텐신 II 에의해유발되는신호전달은차단시켜안지오텐신 II의작용을억제시킨다. 아펠린시그널링의혈관과내피세포에서의기능은리간드와수용체유전자를무효화시킴으로그에따라나타나는표현형 (phenotype) 으로증명되었다. 아펠린수용체에결핍이있는쥐에실험한결과혈관수축제에대하여 Angiotensin II가증가하는반면아펠린결핍이있는쥐에서는망막의혈관발달이감소되는것을보였다. 또한다른기관에서도영향을미치는데심장에서는초기배아형성단계에서발현되며혈압과혈류조절에관여, 뇌에서는수분과식이섭취를담당하는부위의뉴런에서발현하며호르몬과채액을조절에관여한다. 소화기관의몇몇창자친크롬세포에서도아펠린수용체가발현되는데, 히스타민분비를억제시키거나위산분비억제, 글루코스에의해증가된인슐린분비억제, 혈액내글루코스를일정하게조절하는데관여한다. 또한골아세포의표면에서발현되며뼈형성에관여한다. 따라서아펠린 / APJ system에의한아펠린시그널링은이시그널링의조절장애로인한허혈성질환이나심혈관질환관한질환과같은혈관기능장애, 그밖의질병으로인한환자들에게높은치료효능이있을것이라고생각된다 (Dr Yves AUDIGIER. Institute of Molecular Medecine of Rangueil. Archived topic page last updated on 22 September 그러나, 아펠린은줄기세포의증식과관련하여서는그기능이나활성이전혀알려진바없다. 본발명의구체적인실시예에의하면, 아펠린을함유하는배지에서중간엽줄기세포를배양시키면 3 계대이상에서도줄기세포의형태등의세포의특성에는변화가없으면서세포의활성이유지되며, 그증식능은효율적으로증가한다는것을알수있었다. 본발명에서 아펠린 (apelin) 은시중에서판매하는것을구입하여사용할수있는데, 이에제한되지않으며직접합성한것을사용할수도있다. 본발명의구체적인실시예에서는, 1 내지 100 nm의농도로아펠린이배지조성물내에함유될수있도록, 바람직하게는 20 내지 50 nm의농도로아펠린이함유되도록하였으며, 아펠린은 Bachem사의 catalog no H-4566 (powder 형태 ) 을구입한것을용해물질 ( 예컨대, DMSO (dimethyl sulfoxide) - 6 -

7 등 ) 에용해시켜사용하였다. [0028] [0029] [0030] [0031] [0032] [0033] [0034] [0035] [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] [0041] 아펠린을함유하는본발명의배지조성물에서배양되는줄기세포는형태나활성의변화없이세포의재생능은개선되므로세포의특성의변화없이단기간에다량의줄기세포를수득하는것이가능하다 ( 실시예 2 참조 ). 상기본발명의배지조성물은아펠린이외에, 셀레늄 (selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10 (CoQ-10), 레스베라톨 (resveratol), T-BHQ, oltipraz, 오리나무추출물, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid) 중에서선택된 1종이상의항산화제를추가로함유할수있다. 아펠린과상기항산화제를함유하는배지조성물에서배양된줄기세포도형태나활성의변화없이세포의증식능이우수함을확인할수있었다. 이때, 상기항산화제는아펠린 20nM에대하여 1uM 내지 20uM의양으로포함될수있다. 본발명의일실시예에서는아펠린과코엔자임 Q-10을함유하는배지에서배양된줄기세포의세포증식능이우수함을알수있었다 ( 실시예 2 참조 ). 한편, 본발명의배지조성물은아펠린 ; 또는아펠린과셀레늄 (selenium), 아스코르브산, 비타민 E, 카테킨, 라이코펜, 베타카로틴, 코엔자임 Q-10 (CoQ-10), 레스베라톨 (resveratol), T-BHQ, oltipraz, 오리나무추출물, EPA(eicosapentaenoic acid) 및 DHA(docosahexanoic acid) 중에서선택된 1종이상의항산화제는당업계에서줄기세포배양에적합하다고알려져있는간단한조성을가지는통상적인배지 (basal medium) 를함께함유할수있다. 일반적으로배양에이용되는기본배지로는 MEM (Minimal Essential Medium), DMEM (Dulbecco modified Eagle Medium), RPMI (Roswell Park Memorial Institute Medium), K-SFM (Keratinocyte Serum Free Medium) 이있으며, 이외에도당해업계에서이용되는배지이면족하다. 바람직하게는, M199/F12(mixture)(GIBCO), MEM-alpha배지 (GIBCO), 저농도글루코오스함유 DMEM배지 (Welgene), MCDB 131배지 (Welgene), IMEM배지 (GIBCO), K-SFM, DMEM/F12 배지, PCM 배지및 MSC 확장배지 (Chemicon) 로구성된군에서선택될수있다. 특히, 이중에서도바람직하게는 K-SFM 배지를사용할수있다. 상기중간엽줄기세포배양물의획득에사용되는기본배지는당업계에공지된, 중간엽줄기세포의미분화된표현형의증식을촉진하면서분화는억제하는첨가제로보충될수있다. 또한, 배지는등장액중의중성완충제 ( 예컨대인산염및 / 또는고농도중탄산염 ) 및단백질영양분 ( 예를들면혈청, 예컨대 FBS, FCS (fetal calf serum), horse serum, 혈청대체물, 알부민, 또는필수아미노산및비필수아미노산, 예컨대글루타민, L-글루타민 ) 을함유할수있다. 나아가, 지질 ( 지방산, 콜레스테롤, 혈청의 HDL 또는 LDL 추출물 ) 및이종류의대부분의보존액배지에서발견되는기타성분 ( 예컨대트랜스페린, 뉴클레오시드또는뉴클레오티드, 피루빈산염, 임의의이온화형태또는염인당원, 예컨대글루코스, 글루코코르티코이드, 예컨대히드로코르티존및 / 또는환원제, 예컨대 β-메르캅토에탄올 ) 을함유할수있다. 또한, 배지는세포가서로유착하거나, 용기벽에유착하거나, 너무큰다발을형성하는것을방지할목적으로, 항응집제 (anti-clumping agent), 예컨대 Invitrogen이판매하는것들 (Cat # AE) 을포함하는것이유익할수있다. 그중에서도, 하기의 1이상의추가의첨가제를사용하는것이유리할수있다 : ㆍ줄기세포인자 (SCF, Steel 인자 ), c-키트를이량화하는다른리간드또는항체, 및동일한신호전달경로의다른활성제ㆍ다른티로신키나아제관련수용체, 예컨대혈소판-유도된성장인자 (Platelet-Derived Growth Factor; PDGF), 대식세포콜로니-자극인자, Flt-3 리간드및혈관내피성장인자 (Vascular Endothelial Growth Factor; VEGF) 의수용체를위한리간드ㆍ환형 AMP 농도를높이는인자, 예컨대포르스콜린ㆍ gp130을유도하는인자, 예컨대 LIF 또는 Oncostatin-M ㆍ조혈모성장인자, 예컨대트롬보포이에틴 (TPO) ㆍ변형성성장인자, 예컨대 TGFβ1 ㆍ뉴로트로핀, 예컨대 CNTF ㆍ항생제, 예컨대겐타마이신 (gentamicin), 페니실린, 스트렙토마이신 - 7 -

8 [0042] [0043] [0044] [0045] [0046] [0047] [0048] [0049] 본발명의배지조성물은상기성분이외에, NAC(N-acetyl-L-cysteine), 인슐린또는인슐린유사인자, 하이드로코르티손, 덱사메타손, bfgf (basic fibroblast growth factor), 헤파란황산 (heparan sulfate), 2-메르캅토에탄올 (2-mercaptoethanol) 및 EGF (epidermal growth factor) 로구성된군에서선택되는 1가지이상의성분을추가로함유할수도있다. 구체적으로, 인슐린을대체하는성분으로인슐린유사인자를함유할수있는데, 이는포도당대사와단백질대사를향상시켜세포성장을촉진하는역할을한다. 특히재조합 IGF-1(Insulin-like growth factor-1) 을사용하는것이바람직하다. 인슐린유사인자의바람직한함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의성분이 10ng/ml 미만일경우에는세포자살 (Apoptosis) 을초래하며, 50 ng/ml을초과할경우에는세포독성및비용증가의문제점이있다. 섬유아세포증식인자 (bfgf) 를함유할수있는데, 이는 in vivo 상태에서다양한형태의세포증식을야기할수있으며, 바람직하기로는재조합단백질을사용한다. 섬유아세포증식인자의바람직한함량은 1 내지 100 ng/ml 이다. 본발명에서사용되는배지는 FBS (fetal bovin serum), 칼슘및 EGF으로구성된군에서선택되는성분을추가로함유할수있다. 상피세포성장인자 (Epidermal growth factor; EGF) 는바람직하기로는재조합단백질을사용한다. 상피세포성장인자의바람직한함량은 10 내지 50 ng/ml이며, 이의함량이 10 ng/ml 미만이면특별한효과가없으며, 50ng/ml을초과하면세포에독성을가진다. 본발명에서사용되는줄기세포는바람직하게는성체줄기세포, 그중에서도지방조직, 또는모낭 양막등상피조직에서얻어지는성체줄기세포를이용할수있다. 가장바람직하게는지방조직유래성체줄기세포를사용할수있다. 중간엽줄기세포 (mesenchymal stem cells, MSCs) 를사용할수있고, 특히지방조직유래중간엽줄기세포 (Adipose tissue-derived mesencymal stem cell, AdMSCs) 일수있다. 상기지방또는상피조직은포유류유래인것이바람직하고, 그중에서도인간유래인것이더욱바람직하다. 본발명의일실시예에서는인간지방조직유래중간엽줄기세포 (Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cell, AdMSCs) 를사용하였다. 본발명의줄기세포배지조성물에서줄기세포를배양하는경우, 줄기세포의특성에는변화가없으면서증식능이향상된줄기세포를수득하는것이가능하다. 따라서, 본발명은다른관점에서, 아펠린을함유하는배지조성물에서줄기세포를배양하는단계를포함하는줄기세포의증식능을향상시키는방법을제공한다. [0050] 본발명의일실시예에서는본발명에따른배지에서지방유래중간엽줄기세포를배양하였다. 지방유래중간엽줄기세포는다음과같은방법으로획득할수있다. 우선, 지방흡입술 (Liposuction) 등에의해복부로부터얻어진인간지방조직을분리하여 PBS로세척한다음, 조직을잘게자른후콜라겐분해효소를첨가한 DMEM배지를사용하여분해후, PBS로세척하고 1000 rpm에서 5분간원심분리한다. 상층액은제거하고바닥에남은펠렛은 PBS로세척한후 1000 rpm으로 5분간원심분리한다. 100 μm매쉬를사용하여부유물을제거한다음, PBS로다시세척하였다. DMEM(10% FBS. 2 mm NAC, 0.2 mm 아스코르브산 ) 배지에서배양하고, 하룻밤지난후배양용기바닥에부착되지않은세포들은 PBS로세척하고, NAC, 아스코르브산, 칼슘, regf, 인슐린및하이드로코티손을함유한 K-SFM 배지를 2일마다교체하면서배양하여중간엽줄기세포를분리하여계대배양하여중간엽줄기세포를얻을수있다. 그러나이외에도당업계에공지된방법으로중간엽줄기세포를얻을수있다. [0051] 이하, 실시예를통하여본발명을더욱상세히설명하고자한다. 이들실시예는오로지본발명을예시하기위 한것으로서, 본발명의범위가이들실시예에의해제한되는것으로해석되지는않는것은당업계에서통상의 지식을가진자에게있어서자명할것이다. [0052] [0053] 실시예 1: 인간지방조직유래중간엽줄기세포분리 지방흡입술 (Liposuction) 에의해 40 대 (n=1), 50 대 (n=1) 및 60 대 (n=1) 의복부피하에서지방조직을각각분 리한후, PBS 로세척하였다. 세척된지방조직을잘게자른후콜라게나아제타입 1 (1mg/ml) 을첨가한 DMEM - 8 -

9 media를이용해 37 에서 2시간동안조직을분해시켰다. 콜라게나아제처리된조직을 PBS로세척후 1000rpm에서 5분간원심분리하여, 상층액을제거하고, 펠렛을 PBS로세척한후 1000rpm으로 5분간원심분리하였다. 100 μm mesh에필터링하여부유물을제거한후 PBS로세척하고, 10% FBS, 2mM NAC(N-acetyl-L-cysteine), 0.2mM 아스코르브산이첨가된 DMEM 배지에서배양하였다. [0054] 하룻밤지난후부착되지않은세포들은 PBS 로세척하고, 5% FBS, 2mM NAC, 0.2mM 아스코르브산, 0.09mM 칼슘, 5ng/ml regf, 5 μg /ml 인슐린, 10 ng bfgf 및 74ng/ml 하이드로코르티손및 1ng/ml 의셀레늄 (selenium) 을함유 한 K-SFM 을 2 일마다교체하면서계대배양하였으며, 3 계대까지배양하여지방유래중간엽줄기세포를얻었다. [0055] [0056] 실시예 2: 줄기세포의재생능에영향을미치는배지성분의탐색실시예 1에서 3 계대까지배양하여얻은연령별 1명씩, 총 3명의지방유래중간엽줄기세포를하기의각배지에 seeding하고 4일에걸쳐배양하였다. 4일의배양동안, 세포의형태 (morphology) 를관찰하였다. 또한, 세포의크기, 생존률및 CDPL(Cell population doubling level) 을측정하여평균값을표시하였다. [0057] [0058] [0059] [0060] [0061] [0062] [0063] [0064] [0065] [0066] [0067] [0068] [0069] [0070] [0071] 배지 1 :drk 배지 * drk 배지는, "K-SFM (Keratinocyte-SFM) 배지 + 2mM NAC mm 아스코르브산 mm 칼슘 + 5 μg/ml 인슐린 + 74 ng/ml 하이드로코르티손 + 항산화제 ( 셀레늄 )" 이다. 배지 2: : M9 배지 ( 대조군 ) * M9 배지는, drk 배지에서항산화제 ( 셀레늄 ) 을제외시킨배지임. 배지 3: M9배지 % DMSO ( 대조군 ) 배지 4: drk 배지 + 3 factors * 3 factors는, 20 nm 아펠린 + 5μM CoQ μM T-BHQ 배지 5: M9 배지 + 3 factors 배지 6: M9 배지 + 20 nm 아펠린배지 7: M9 배지 + 50 nm 아펠린배지 8: M9 배지 + 20 nm 아펠린 + 5μM CoQ10 배지 9: M9 배지 + 20 nm 아펠린 + 20μM T-BHQ 배지 10: M9 배지 + 20 nm 아펠린 + 1μM Resveratol 배지 11: M9 배지 + 20 nm 아펠린 + 5μg/ml 오리나무추출물배지 12: M9 배지 + 20 nm 아펠린 + 10 μm oltipraz [0072] 상기실시예 1에서분리한지방조직유래중간엽줄기세포를각배지에서배양하면서각배양일수별로지방조직유래중간엽줄기세포를분리하여세포의생존률, 세포크기, CPDL를측정하였으며, telemorase activity는 3계대상태에서측정하였다. 배지 11의오리나무추출물은다음과같은방법으로제조한것을사용하였다. 오리나무수피 ( 중국산 ) 을세척한후, 80% 로희석한주정으로침전하여 60 에서 1차추출하였다. 1차추출액을여과한후, 농축탱크로이송하고 60 에서진공농축하여주정은완전히회수하였다. 1차농축액 ( 고형분 25%) 은회수하고, 탱크내벽에부착되어미회수정유성분은주정을소량첨가하고 60 에서 20~40분간가열, 용출하여재회수하였다. 재회수한용출액은 1차농축액과혼합하였다 (1). 1차추출한오리나무수피에회수한 80% 주정을이용하여침전시켜 60 에서 10~16시간 2차추출하였다. 2차추출액을여과후농축탱크에서진공농축하여주정을완전히회수하였다. 2차농축액 ( 고형분 25%) 은회수하고, 탱크내벽에부착되어미회수정유성분은주정 (95%) 을농축탱크에소량첨가하고 60 에서가열, 용출하여재회수하였다. 재회수한용출액은 2차농축액과혼합하였다 (2). (1) 과 (2) 혼합농축액 ( 고형분함량 25%) 을함께혼합하고, 부형제 ( 덱스트린 ) 20% ( 오리나무수피추출물고형분대비 20%) 혼합하여분무건조후함습되지않는조건하에서가급적빠르게포장하는방법 - 9 -

10 으로제조하였다. [0073] [0074] (1) 줄기세포의형태 (morphology) 줄기세포의형태는위상차현미경하에서관찰후촬영하였다 ( 도 1 참조 ). 관찰결과세포의 morphology에있어서는큰차이가없었다. 즉, 아펠린또는본발명에서사용된 CoQ10 등의항산화제가세포의형태에큰영향을주지않음을알수있었다. [0075] (2) 줄기세포의생존력 (viability) [0076] [0077] 실험결과, 첨가되는성분에따른줄기세포의생존력에는큰차이가없었다. 즉, 아펠린또는본발명에서사용 된 CoQ10 등의항산화제가세포의크기에큰영향을주지않음을알수있었다 ( 도 2 참조 ). Luna automated cell counter 를이용하여줄기세포의생존률를측정하였다 (n=3). [0078] (3) 줄기세포의크기 (size) [0079] [0080] 실시예 1에서분리한지방조직유래중간엽줄기세포를각배지에서 seeding 한후, 배양일별로트립신을처리한후지방조직유래중간엽줄기세포를분리한후, Luna automated cell counter를이용하여줄기세포의입도 ( μm ) 를측정하였다 (n=3). 측정결과, 첨가되는성분에따른세포의크기에는큰차이가없었다 ( 도 3 참조 ). 즉, 아펠린또는본발명에서사용된 CoQ10 등의항산화제가세포의크기에큰영향을주지않음을알수있었다

11 [0081] (4) 줄기세포의세포성장률 (CPDL : cell population doubling level) [0082] [0083] [0084] [0085] 줄기세포의세포성장률인 Cell population doubling level (CPDL) 은다음의계산법으로계산하였다. CPDL = Log (N final - N initial )/Log 2 (N final : 최종적으로얻은세포수 ; N initial : 처음 seeding 세포수 ) 실험결과, 아펠린을첨가한배지에서줄기세포를배양한경우, 아펠린과기타의항산화제를함께첨가한배지에서줄기세포를배양한경우, 세포의 CPDL 값이증가하였음, 즉재생능이개선됨을확인할수있었다 ( 도 4 참조 ). 아펠린과기타항산화제가함께첨가된경우와관련하여, CoQ10 또는 oltipraz를아펠린과함께사용한경우 CPDL 값이높았다. 또한, 동종계열이제거된 drk 배지, M9 배지의 mix 된 3 factor (3 factor= apelin+ coq10 + T-BHQ) 군이 drk 배지이나 M9 단독군보다는 CPDL 값이높았으나다른 2가지 mix 군에비하면좋지않았다. 오히려 drk 배지에들어있는항산화제가 3 factor의효과를감소시킨다는결과를얻었다. [0086] (5) 줄기세포의 telemorease activity 측정 [0087] [0088] 실시예 1의방법으로분리된 40대, 50대및 60대유래지방줄기세포를상기표 4에나타난배지에서 3계대까지계대한후, 줄기세포의텔로머라아제활성을확인하였다. telemorase activity의활성은 Telo TAGGG Telomerase PCR ELISA kit (Roche) 을이용하여측정하였다. 확인결과, 아펠린을 20 nm의농도로첨가한배지에서배양한줄기세포의 telemorase activity가가장높다는것을확인할수있었다. [0089] 이상으로본발명의내용을상세히기술하였는바, 당업계의통상의지식을가진자에게있어서, 이러한구체적

12 기술은단지바람직한실시양태일뿐이며, 이에의해본발명의범위가제한되는것이아닌점은명백할 것이다. 따라서본발명의실질적인범위는첨부된청구항들과그것들의등가물에의하여정의된다고할 것이다. 도면 도면

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등록특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0775 ( ) C12N 5/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일

등록특허 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0775 ( ) C12N 5/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 등록특허공보 (B1) (51) 국제특허분류 (Int. Cl.) C12N 5/0775 (2010.01) C12N 5/02 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0068959 (22) 출원일자 2010 년 07 월 16 일 심사청구일자 2010 년 07 월 16 일 (65) 공개번호 10-2012-0008223