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준서 여
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1 대한수혈학회지 : 제 26 권제 1 호, 201 The Korean Journal of Blood Transfusion Vol. 26, No. 1, 18-2, April pissn eissn Original Article 조혈모세포로부터적혈구분화에사용되는무혈청배지의성능비교 김지연ㆍ김신영ㆍ전유라ㆍ최용욱ㆍ김현옥 연세대학교의과대학진단검사의학교실 Comparison of Serum-Free Media in RBC Differentiation from Human Hematopoietic Stem Cells Ji Yeon Kim, Sinyoung Kim, You La Jeon, Yongwook Choi, Hyun Ok Kim Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, Seoul, Korea Background: Research on RBC production from hematopoietic stem cells has been conducted competitively in many countries. However those were in vitro successes and many hurdles still remain for large scale transfusable RBC production from stem cells. A need for large volume of culture media is a crucial factor for culture condition which researchers must overcome. In this study, we evaluated the efficiency of two commercial serum-free media, StemPro -34 SFM and Stemline II hematopoietic stem cell expansion medium, in RBC differentiation from cord derived stem cells. Methods: We cultured cord derived CD34+ cells in vitro and evaluated over the periods of 7 days, 14 days, 17 days and 21 days in culture for expanded cell count, cell morphology and differential count using the Wright Giemsa stain. Results: Cell expansion and RBC differentiation developed rapidly in Stemline media compared to StemPro media. Enucleated RBCs were observed at culture days and orthochromatic erythroblasts were shown up to 0 % among culture cells at 17 days in Stemline media. The enucleated RBCs were observed at 17 days in StemPro Media. Although the erythroblasts in StemPro media are slow at differentiation, they maintain continuous expansion up to 21 days. Conclusion: In Stemline media, the expansion and differentiation to mature RBCs are processed much faster, but the cell condition slows down after 17 days. In the RBC production aspects, Stemline media is better than StemPro media as a rapid differentiation because it reduces the cost due to in vitro short culture duration. (Korean J Blood Transfus 201;26:18-2) Key words: Serum-free media, Hematopoietic stem cells, RBC differentiation Received on December, Revised on December 19, Accepted on December 23, 2014 Correspondence to: Hyun Ok Kim Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine, 0-1 Yonsei-ro, Seodaemun-gu, Seoul , Korea Tel: , Fax: , hyunok1019@yuhs.ac This study was supported by a grant of the Korean Health Technology R&D Project, Ministry of Health & Welfare, Republic of Korea (HI10C1740). This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License ( which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited. Copyright C 201 The Korean Society of Blood Transfusion

2 김지연외 : 무혈청배지의성능비교 서론 세포를체외배양으로증폭시키는경우배지의성분조성이중요하다. 그러나상품으로시판되고있는특정배지의성분조성은회사마다특허로보호되고있으며, 이배지조성물에따라체외배양을할때세포의생존과세포수의증가에큰영향을주는것으로알려져있다. 1) 제대혈을이용한조혈모세포이식에서이식의활성화를저해하는가장큰요소는제대혈내포함되어있는줄기세포의절대량이적어이식대상이소아연령군으로한정되는것이다. 따라서체외에서증폭시킨 CD34 양성세포가그기능을유지하는경우제대혈이식적용대상자를성인까지확대할수있기때문에조혈모세포의체외증폭에관한연구가많이진행되고있다. 2,3) 그러나각종조혈성장인자의병용으로단기간의액체배양만으로도조혈세포의대량증폭은가능하나조혈성장인자에의존하는경우조혈모세포의자기갱신을유도하는세포증식보다는성숙한세포로의분화가능성이크며, 상당부분의조혈모세포가세포사멸에빠지게됨으로서조혈모세포의증폭은실험적으로가능하나임상적용이어렵다는한계에도달하게되었다. 일반적으로세포를배양할때는 IMDM (Iscove s Modified Dulbecco s Medium, Gibco, Carlsbad, CA, USA) 또는 DMEM (Dulbecco Modified Eagle Medium, Gibco, USA) 등의기본배지에필요한첨가물 (supplement), 10% 우태아혈청및분화특이성을갖는사이토카인을첨가하여분화배지로사용한다. 그러나최근에는제대혈, 골수농축액또는 G-CSF로가동화시킨말초혈액에서내피기원세포 (endothelial progenitor cell) 를분리하고증폭시키는 EGM-2 (Endothelial cell growth medium, Lonza, Walkersville, MD, USA) 기본배지또는중 간엽줄기세포의분리배양에좀더효율적인 MSGM (Mesenchymal stem cell growth medium, Lonza) 배지등조혈모세포의증폭을위한특정배지가상품화되어시판되고있다. 실제내피기원세포나마우스등에서의중간엽줄기세포를배양해야하는경우초기에 EGM 또는 MSGM 배양배지를사용하는경우그분리효율이높음은이미보고된바있다. 4) 세계적으로조혈모세포로부터적혈구로분화시키는연구는프랑스의 Neildez-Nguyen 등 ) 에의해 2002년처음보고되었고최근에는일본, 미국, 영국, 호주, 한국등에서연구가활발히진행되고있다. 6-14) 이때수혈용성숙적혈구를대량생산하기위해 CD34 양성세포를조혈모세포단계에서대량증폭시킨후적혈구로분화시키거나분화되는적혈구아세포에서세포사멸을통해없어지는세포를줄이는두방향으로연구를진행하고있다. 물론수혈용혈액의대량생산을위해세포증식을유도하는다양한경로를자극또는차단시키는저분자화합물의필요성이대두되고있으며 3D culture system, 나아가서는생물반응장치 (bioreactor) 를이용하는방법등이제안되고있다. 1,16) 그러나아직까지는 in vitro 실험실단계이며, 실용화되기까지는수년은걸릴것으로예상된다. 또한이런생물반응장치를이용하는경우많은양의배지가필요하며, 이에필요한첨가물과사이토카인사용량의증가는생산수가를올려고비용저효율생산성의결정요소가된다. 따라서본연구에서는검사실에서만드는자가제조배지의제조회차당변화 (batch to batch variation) 한계를극복하고대량생산을위한대용량배지를확보하기위해시판되고있는조혈모세포의대표적인증식배지인 StemPro R -34 SFM (Life Technologies Co., Carlsbad, CA, USA 이하 StemPro로표기 ) 과

3 Korean J Blood Transfus Vol. 26, No. 1, 18-2, Apr. 201 Stemline II hematopoietic stem cell expansion medium (Sigma-Aldrich Co., St. Louis, MO, USA 이하 Stemline으로표기 ) 을사용하여제대혈유래줄기세포로부터적혈구분화를시도하여두배지의효율을평가하고자하였다. 재료및방법 1. 제대혈로부터 CD34 양성세포분리제대혈은정상분만한산모의동의를얻어분만후태반이반출되기전탯줄의정맥혈을통해채취하였다. CPDA 항응고제가들어가있는제대혈백 ( 녹십자 ( 주 ), 용인, 한국 ) 을사용하여무균적으로채취하였으며 (IRB 승인번호 : ) 분만후 6시간이내에 Ficoll-Hypaque (density, 1.077; Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 을사용하여단핵세포를분리하고이를 MediMACS 와 MiniMACS 시스템 (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA) 을이용하여두번에걸쳐 CD34 양성세포를분리하였으며순도가 9% 이상인경우의세포만을실험에사용하였다 (Fig. 1). CD34 양성세포수는 Stem-kit R (Beckman Coulter Inc. Fullerton, CA, USA) 로 CD4-FITC, CD34-PE 에대한단클론성항체를이용하였고, 유세포분석기 EPI-CS R XL (Beckman Coulter Inc.) 로분석하였다. 2. 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구로의분화실험 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구의분화실험에서의기본배지는제조회사에서배지와동시에공급하는첨가물을혼합한 StemPRO 배지와 Stemline 배지를각각사용하여이미보고하였던방법에따라 4단계로나누어진행하였다. 12,13) 1단계는 CD34 양성세포를 10 4 /ml의농도로맞춘후 (cell count를맞춤 ) 12 well 배양용기 (Nunc, Rochester, NY, USA) 에 1 ml씩분주하였다. 그리고기본배지에동일하게 Stem cell factor (SCF, Peprotech, Rehovot, Israel) 100 ng/ml, Interleukin-3 (IL-3, Peprotech) 10 ng/ml와 recombinant Erythropoietin (EPO RecormonEpoetin beta, Roche, Mannheim, Germany) 6 IU/mL을첨가하였다. 액상배지는 1주일에두번갈아주었다. 그다음 1주일간은 IL-3 농도는그대로 10 ng/ml를유지하였으나 SCF는 0 ng/ml, EPO는 3 IU/mL로줄여배양하였다. 배양 14일후에는 SCF 0 ng/ml 와 EPO는 2 IU/mL를첨가하여배양하였다. hydrodynamic stress로부터세포막을보호하는 0.0% Fig. 1. The purity of cord blood CD34+ cells after double MACS separation. We used the CD34+ cells, which was 9% purity, for differentiation of cultured matured RBCs

4 김지연외 : 무혈청배지의성능비교 poloxamer 188 (Pluronic F68 [F68], Sigma Chemical Co., St Louis, MO; MW nonionic block copolymer chemical surfactant) 를첨가하였다. 마지막 4일간은모든사이토카인을빼고기본배지에 poloxamer 188만넣고배양하였다 (Table 1). 3. 세포수측정배양은 CD34 양성세포 10 4 /ml로시작하였다. CD34 양성세포를배양 4일, 7일, 10일, 14일, 17일, 21일에 hemocytometer를사용하여세포수를수기로측정하였다. 두배지에서의배양된세포수의통계는 Excel (Microsoft) program으로 student t test로처리하였으며 P<0.0를통계적차이가있는것으로해석하였다. 10 /ml로세포수가늘어나지않았으나배양 7일째에는 13.8± /ml로약 26배, 10일째에는 21.3± /ml로증폭배수가 43배였다. 14일에는세포수가 9.± /ml로 19배증가로 10일째의증가속도보다낮아지기시작하였으며, 17일째는 2.9± /ml로 6배, 21일에는 2.2± /ml로 4.배세포수증가를보였다. StemPro 배지에서는 4일째까지거의세포증식은 4. 세포형태및백분율측정배양 14일, 17일, 21일에각각도말슬라이드를만들었으며, Wright Giemsa 염색하에현미경으로세포의형태와백분율을산정하였다. 1. 세포수의측정 결과 Stemline 배지에서배양 4 일째에는 0.±0.07 Fig. 2. Comparison of the expansion of erythroid cells between in Stemline II media and in StemPro media. The cells were counted using a hemocytometer ( 10 /ml) and averaged for all 3 wells in each condition (N=3). There is a statistically difference at 7 days in culture (*P<0.0). Table 1. Formulation in expansion and differentiation media Culture Parameter Phase I 0 7 days Phase II 7 14 days Phase III days Phase IV days M hydrocortisone + Stem cell factor (SCF, ng/ml) Interleukin 3 (IL-3, ng/ml) Erythropoietin (EPO, IU/mL) % F Basic Supplement 0 ng/ml human transferrin, 90 ng/ml ferric nitrate, 0 g/ml insulin, 2 mm glutamine, 30.8 M vitamin C, 160 M monothioglycerol, 2 g/ml cholesterol

Korean J Blood Transfus Vol. 26, No. 1, 18-2, Apr. 201 Fig. 3.

different culture media. H-E stain ( 1000).

This slide showed the representative case. 없었으며, 7일째에는 6.9±3.

02 10 /ml로 47배 증 가하였으며 14일, 17일, 21일 각각 12.4±.09 10 /ml (2배), 7.4±6.

그러나 빠르게 세포수가 증가하고 분화 하는 대신 배양 후반부에서는 적혈구 전구세포의 binucleation 또는 megaloblastic

StemPro 배지에서는 적 혈구로의 분화가 천천히 진행되었지만 배양 21일 까지 세포의 형태는 Stemline 배지에 비해 잘 유지 되면서

5 Korean J Blood Transfus Vol. 26, No. 1, 18-2, Apr. 201 Fig. 3. Comparison of cell morphological changes and differential count in the different culture media. H-E stain ( 1000). CD34 cells selected from cord blood were cultured for 21 days in vitro. This slide showed the representative case. 없었으며, 7일째에는 6.9± /ml로 13배 증 가하여 Stemline에 비해 초기 증가속도가 늦었으 나, 10일째부터는 23.± /ml로 47배 증 가하였으며 14일, 17일, 21일 각각 12.4± /ml (2배), 7.4± /ml (1배), 2.± /ml (배)로 Stemline에 비해 그 증폭배수를 높게 유지 하였다(Fig. 2). 되었다. 그러나 빠르게 세포수가 증가하고 분화 하는 대신 배양 후반부에서는 적혈구 전구세포의 binucleation 또는 megaloblastic maturation 등 형태 학적 이상이 관찰되었다. StemPro 배지에서는 적 혈구로의 분화가 천천히 진행되었지만 배양 21일 까지 세포의 형태는 Stemline 배지에 비해 잘 유지 되면서 계속 분화하는 양상이 관찰되었다(Fig. 3). 2. 세포형태 및 백분율 변화 고 찰 Stemline 배지에서는 빠르게 분화가 진행되어 10일째부터 탈핵을 한 성숙적혈구가 관찰되기 시 작하였으며 배양 17일째는 0% 이상의 정색소성 적혈구아세포(orthrochromatic erythroblast)가 관찰 수혈을 통한 감염원의 종류가 증가하고 있으 며, 최근 세계적으로 노령화 인구의 증가와 젊은 층의 감소로 혈액의 부족 현상은 예측되고 있다. 22

6 김지연외 : 무혈청배지의성능비교 덴마크의경우수혈량의 76% 가 6세이상의환자에서사용되고있으며 16) 국내에서도점점노령인구증가에의한수혈량이증가할것으로예상된다. 또한수혈전파감염에대한선별검사로 NAT 검사까지도입되면서그어느때보다도안전성이확보되고있지만 17) 2008년전세계적으로채혈된 9천 2백만건의혈액중절반만이검사가가능한선진국에서채혈된것인데, 이는전세계인구의 1% 밖에해당하지않는수치로아직도많은경제빈곤국에서는수혈로인한감염의위험성에노출되어있다. 1) 과거부터이를극복하기위해인공혈액생산에대한연구가진행되었으며, 대부분의연구가혈색소기반산소운반체와산소친화력이있는 perfluorocarbone 용액이었는데임상시험에서각종부작용의발생으로아직도상용화된인공혈액은개발되고있지못하다. 18) 한편이런종류의인공혈액과는다른세포기반적혈구생산기술이 2002년 Neildez-Nguyen 등 ) 에의해소개되어인공혈액생산에새로운전기를마련하게되었다. 조혈모세포인 CD34 양성세포는주로골수에서있으면서일생우리몸의혈액을생산하는조혈세포를생산하게된다. 조혈모세포원으로서 CD34 양성세포는골수외에도제대혈, 조혈모세포성장인자로가동화한말초혈액, 그리고아주소량이지만말초혈액에서도관찰된다. 이러한조혈모세포를이용하여실험실에서정상적혈구와비슷한혈색소농도와일정기간수명을지닌성숙적혈구로의완전한분화성공은 200년에이루어졌고 19) 이어서같은연구그룹에의해체외생산된적혈구로수혈을할수있음을증명한임상시험이보고되었다. 20) 다만제대혈이나골수에서의 CD34 양성세포로부터의적혈구생산량은아직은검사실수준이기때문에 1회헌혈로얻을수있는적혈구한단위의양을생산하기에는아직그기술력이못미치 고있다. 세계적으로이미배아줄기세포로부터, 유도만능줄기세포로부터최종성숙단계의적혈구로의분화까지는이미성공한기술로, 21,22) 줄기세포기반적혈구생산기술은수혈의학분야에서유망한연구과제임에는틀림없으나아직도많은단계에서극복해야할새로운기술수요가있다. 그러나아직까지헌혈혈액을대체할수있는충분한양의수혈용적혈구생산까지의기술은확보되어있지못하므로앞으로의연구는비용효과적인측면에서대량생산기술에그연구가집중될것으로예측되고있다. 즉한단위의적혈구생산을위해서는적어도 개의적혈구를생산해야하는데현재까지의세계적인기술은최대 10 8 정도까지의체외증폭기술이기때문에이한계를극복하기위해제시된방법이기존의 2D culture system 에서 3D culture system 연구로옮겨가고있으며이때생물반응장치를이용하는기술로그연구방향이집중되고있다. 1) 그러나체외배양과정에드는비용은사실상실용화하기어려울정도로고가이고 개의적혈구를체외배양하기위해서는 13 L 이상의배지가필요하기때문에 16) 이때가장중요한것이배지의개발이다. 물론각연구실마다사용하는배양액이나사이토카인등의첨가물질의농도와종류가조금씩은차이가나지만대부분유사성을갖고있으며 23) 최근특수배지로조혈모세포증식배지가상용화되어 StemPro와 Stemline이라는두종류의배지가소개되고있다. 따라서과거에일반적으로 IMDM 기본배지에 10% 우태아혈청을사용하던것을무혈청배지인두상용화배지를주로사용하게되면서두배지가기존의검사실에서배양에사용된배지에비해세포의증식속도유지와적혈구분화율이우수함을알수있었다. 다만본연구결과 StemPro 배지는조혈모세포의분화능이조금늦게나타나고더오랜기간세포증식

7 Korean J Blood Transfus Vol. 26, No. 1, 18-2, Apr. 201 을보여주었으나 Stemline은좀더빨리세포수의증가를보이면서성숙적혈구의분화가이루어져서 Stemline 배지가적혈구로의분화를빨리유도하여체외배양기간을감소시키는장점으로해석하였다. 그러나두배양배지의실제조성은완전히공개되지는않았다. 따라서 StemPro는조혈모세포의증폭배지로서, Stemline은적혈구분화배지로서더적합하다고판단되었으며이기준에따라적혈구분화배지의선택은그목적에따라선택할수있을것이다. 결론적으로본연구에서는두상용화배지의사용목적에따라선택할수있는특징을제시하였다. 요약배경 : 각나라에서의줄기세포기반적혈구생산기술에대한연구의경쟁이치열하다. 그러나시험관내소량생산의성공이며, 실제수혈을위한적혈구의대량생산은아직성공하지못한기술이며이중비용효율적인면에서가장중요한요소가배지의선택이다. 본연구에서는적혈구대량생산을위해대표적인조혈모세포증식배지인 StemPro R -34 SFM과 Stemline II hematopoietic stem cell expansion medium을사용하여제대혈유래줄기세포로부터적혈구분화를시도하여두배지의효율을평가하고자하였다. 방법 : 제대혈로부터 CD34 양성세포를분리하여두개의상업용무혈청배지를기본으로하여적혈구분화실험을진행하였다. 21일간적혈구로분화시키면서 7일부터일주일간격으로 21일까지 4회 hemocytometer를사용하여수기로세포수를산정하였으며, 말초도말슬라이드를제작하여세포의형태변화와적혈구분화를백분율로비교하였다. 결과 : Stemline 배지에서는빠르게분화가진행 되어 10 14일째부터탈핵을한성숙적혈구가관찰되기시작하였으며배양 17일째는 0% 이상의정색소성적혈구아세포 (orthrochromatic erythroblast) 가관찰되었다. StemPro 배지에서는성숙적혈구가 17일이되서야많이관찰되기시작하였다. 그러나 StemPro 배지에서는적혈구로의분화가천천히진행되었지만배양 21일까지세포의형태는 Stemline 배지에비해잘유지되면서계속분화하는양상이관찰되었다. 결론 : StemPro 배지는조혈모세포의분화능이조금늦게나타나고더오랜기간세포증식을보여주었다. Stemline은좀더빨리세포수의증가를보이면서성숙적혈구의분화가이루어졌으나배양 17일부터는세포의형태나숫자의증가가둔화되었다. 따라서 Stemline 은배양기간을줄여짧은기간동안에성숙적혈구를얻을수있기때문에적혈구분화배지로서더적합하다고판단되었다. References 1. Hannoun Z, Fletcher J, Greenhough S, Medine C, Samuel K, Sharma R, et al. The comparison between conditioned media and serum-free media in human embryonic stem cell culture and differentiation. Cell Reprogram 2010;12: Ballen KK, Gluckman E, Broxmeyer HE. Umbilical cord blood transplantation: the first 2 years and beyond. Blood 2013;122: Cord blood banking introduction-state of the art. Monaco: The World Marrow Donor Association, [Online] (last visited on 18 Dec 2014). 4. Kim HS, Heo JS, You J, Park T, Choi Y, Kim E, et al. Fast and efficient isolation of mouse

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untitled 대한수혈학회지 : 제 27 권제 3 호, 2016 The Korean Journal of Blood Transfusion Vol. 27, No. 3, 209-219, December 2016 https://doi.org/10.17945/kjbt.2016.27.3.209 pissn 1226-9336 eissn 2383-6881 Review Article 줄기세포기반수혈용적혈구생산