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1 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자발현변화분석 연세대학교대학원 의학과 김창기

2 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자발현변화분석 지도교수김현옥 이논문을석사학위논문으로제출함 2005 년 6 월일 연세대학교대학원의학과김창기

3 김창기의석사학위논문을인준함 심사위원김현옥인 심사위원김현숙인 심사위원유철주인 연세대학교대학원 2005 년 6 월일

4 감사의글 본논문을완성함에있어서많은지도편달과가르침을주신김현옥교수님께감사의말씀을드립니다. 또한 microarry 를본연구에적용할수있도록도움을주신라선영조교수님과세포배양을도와준이민선연구원에게심심한사의를전합니다. 항상애정어린관심과지도를주신김현숙교수님과진료와교육으로바쁘신와중에도도움말씀을주신소아과유철주부교수님께도깊은감사를드립니다. 끝으로언제나힘이되어준부모님께도감사의마음을전합니다. 저자씀

5 차례국문요약 1 Ⅰ. 서론 3 Ⅱ. 재료및방법 4 1. 제대혈채집 4 2. 조혈모세포분리 4 3. 배양 5 4. 유세포분석 6 5. 배양세포의유전자 microarray 분석 6 가. RNA 추출 6 나. RNA 증폭 6 (1) 첫번째 cdna strand 합성 6 (2) 두번째 CDNA strand 합성 7 (3) 체외전사 7 다. RNA labeling 과교잡반응 8 라. 이미지스캔및자료분석 8 Ⅲ. 결과 8 1. 제대혈조혈모세포분리및배양 8 가. CD34 양성세포의순수분리결과 8 나. 적혈구분화유도배양에있어서 EPO 의효과 9 2. 면역표현형의변화 배양세포의유전자프로파일분석 12 Ⅳ. 고찰 15 Ⅴ. 결론 17 참고문헌 19 영문요약 22

6 그림차례 그림 1. Mini-MACS 를이용하여분리한제대혈유래 CD34 양성세포의면역표현형 11 그림 2. 배양조건에따른제대혈 CD34 양성세포의증식정도비교 12 그림 3. 배양기간에따른배양세포의형태적변화 13 그림 4. 배양 7 일세포와배양 14 일세포에서차이를보이는 125 개유전자의 hierarchical clustering 15 그림 5. 적혈구생성과관련이있는유전자항목들에대한개별분석 17

7 표차례 표 1. 배양된제대혈유래 CD34 양성세포의면역표현형의변화 14 표 2. 통계적분석후배양 7 일에비해 14 일세포에서발현이증가한유전자항목리스트 16

8 국문요약 제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자프로파일분석 적혈구는골수의조혈모세포에서여러단계를거쳐생성되며, erythropoietin (EPO) 은적혈구생성에서가장중요한성장인자로알려져있다. 대부분의적혈구분화를위한시험관내배양은 EPO 를첨가하지않고조혈모세포의증식을촉진하는단계와 EPO 의자극을통해적혈구분화를유도하는단계로구성된다. 따라서본연구에서는제대혈유래조혈모세포로부터적혈구로분화시키는과정에서 EPO 를첨가하는시기와농도를달리하여첨가하는방법을통해 RBC 분화에미치는 EPO 의효과를평가하였으며, 연구의최종목표는제대혈유래 CD34 양성세포로부터적혈구분화를유도하고자하였다. 건강한산모의제대혈에서 Ficoll-Hypaque 및 MACS system 을이용하여 CD34 양성세포를분리하였으며, 배양은여러성장인자의조합을달리하여세단계로총 21 일간진행하였다. 배양첫 1 주간은 stem cell factor, Flt- 3 ligand, thrombopoietin 을첨가한배지에서 CD34 양성세포의증폭을유도하였으며, EPO 는배양 8 일부터 21 까지 3 U/mL 의농도로첨가하였다. 또한 EPO 의농도에따른효과를알아보기위하여배양초기부터 EPO 를 0, 3, 10 그리고 20 U/mL 의농도로첨가하여배양을진행하였다. 배양기간동안세포의수와형태를관찰하였고유세포분석기를이용하여 CD34, CD38, CD45, glycophorin A (GPA) 의표현변화를측정하였다. 또한분화과정에서유전자의변화를알아보기위해서 high density microarray 방법을이용하여유전자의발현정도를분석하였다. 세포증식은모든배양조건에서배양 14 일에가장높았고그이후감소하기시작하였다. EPO 농도에따른배양효과를비교하였을때, EPO 를 20 U/mL 농도로첨가한경우에서세포수가가장많이증가하는것을관찰할수있었다. 그러나 3 주배양시유핵적혈구및적혈구의전형적인세포는거의관찰되지않았으며유핵세포에서의 GPA 의표현도낮게측정되었다. Microarray 분석에서 false discovery rate (FDR) 이 0.74% 인유전자는총 125 개였다. 이중배양 7 일에비해 14 일에서그발현이 3 배이상증가한유전자가 17 개있었으나, 적혈구분화와는상관성이낮은유전자였다. 그러나적혈구분화와관련이높은유전자항목을개별적으로분석한결과 glycophorin A, Rhesus blood group CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의발현이배양이진행되면서증가함을알수있었다. 결론적으로조혈모세포로부터적혈구를생산하고자할경우 EPO 의농도와세포증식간에는양의상관성이있었다. 또한배양초기부터 EPO 를첨가하 1

9 는경우에서더많은세포수가증가하여 EPO 를후기배양에첨가하는기존방법보다우수한것으로생각되었다. 그러나 3 주배양이진행되는과정에서적혈구분화에관련된유전자들의발현은증가하였으나배양세포의형태나표현형분석결과적혈구계열세포보다는다른계열세포로의분화가더많이관찰되었다. 따라서적혈구분화배양의순수도를높이기위하여성장인자조합외에도미세환경조성과조혈모세포와보급세포와의상호작용등적혈구분화에미치는요소에대한연구가더필요할것으로생각된다. 핵심되는말 : 제대혈, 조혈모세포, CD34 양성세포, erythropoietin, 적혈구 2

10 제대혈유래 CD34 양성세로로부터적혈구분화유도와 microarray 를이용한유전자프로파일분석 < 지도교수김현옥 > 연세대학교대학원의학과김창기 Ⅰ. 서론 적혈구는골수의조혈모세포로부터생성되며, 하루평균 2 x 의적혈구가인체내에서생성된다. 1 적혈구는수혈과관련하여가장많이사용되고있는혈액제제로서급성출혈, 수술등실혈이있는경우와다양한빈혈의치료에이용되고있다. 그러나제한된적혈구의공급에비해혈액에대한수요가증가하고있고, 수혈로인한감염증을예방하기위해헌혈자문진강화로헌혈자감소하면서전세계적으로혈액부족사태가빈번히발생하고있다. 2,3 그러나안전한혈액을공급하려는노력에도불구하고최근수혈을통한 B형간염, C형간염, HIV 감염사례가사회적으로큰파장을준바있다. 4-6 또한 West Nile virus, variant Creutzfeldt-Jakob disease 등의새로운병원체로인한수혈전파성감염이보고되고있다 따라서감염의위험이없으며안정적으로혈액을공급하기위한노력이모색되어왔으며, 그중하나로조혈모세포를배양하여새로운혈액의공급원으로이용하려는연구가시도되었다. 1,11-21 조혈모세포에대한개념이부족하였던과거에는성인의골수나말초혈액에서분리한단핵구를바로배양에이용하였다. 14,19,22 그러나조혈모세포의표지인자인 CD34에대한단클론성항체가소개된후이를이용하여순수한조혈모세포분리가가능하게되었다. 12,21,23 또한조혈모세포원으로가장많이쓰이는것은골수이지만최근제대혈의이용이늘고있다. 24,25 골수에비해서제대혈은비교적구하기쉽고조혈모세포의농도가높으며, 26,27 조혈모세포가보다더미성숙하고증식능력이우수하여배양시간이짧은장점이있어이를이용한세포배양이활발히진행되고있다. 11,26,28 적혈구분화를위한조혈모세포의배양과정은보통두단계로나누어진다. 이는초기배양에필요한성장인자와적혈구분화를유도하는성장인자가다르기때문이다. 29 Flt3-ligand (Flt3-L), stem cell factor (SCF) 그리고 thrombopoietin (TPO) 등의성장인자는다양한분화능력을가진혈액줄기세포의성장과증식을촉진한다. 1 이들중 SCF는조혈모세포의초기성장뿐 3

11 아니라특정세포의분화와성숙을유지하는데도움을준다. 15 반면 erythropoietin (EPO) 은적혈구모세포에대해서 mitogen 의역할과성장인자로서작용하여적혈구모세포의증식과적혈구로의분화를촉진한다. 1 특히적혈구계열이아닌다른혈구들의분화를억제하기위해서는 EPO의자극이가장중요한것으로알려져있다. 1,11 Sato 등은조혈모세포배양중에다량의 anti-epo monoclonal antibody를첨가하여 EPO를중화시키면적혈구로의분화가억제된다고보고하였다. 12 조혈모세포는다양한성장인자와 EPO에의해적혈구로분화하게되고표현항원에변화가발생하게된다. 적혈구로분화해가면서 CD34 항원이나 CD45 항원의표현은감소하는양상을보이며 glycophorin A (GPA) 등의항원은그표현이증가하게된다. 23 GPA는적혈구특이표지인자이며분화초기에급격히증가해서후반기까지계속유지된다. 23 따라서유세포기법을이용하여위의표지인자를측정하면조혈모세포로부터적혈구계열의세포로분화되는과정을분석할수있다. 기존의연구에서는적혈구생성을유도하기위해다양한배양방법을이용하였다. 대부분의경우배양과정을 EPO에독립적인초기와 EPO를통해최종적혈구분화를유도하는후기의두단계로구분하는유사점이있다. 그러나적혈구분화를위한적정 EPO 농도와배양초기에 EPO가미치는영향에대해서는아직더연구되어야할점이많다. 따라서본연구에서는제대혈유래조혈모세포인 CD34 양성세포를분리하여세분화된배양조건에서배양하여적혈구분화를유도하고또한배양초기부터다양한농도의 EPO를첨가하는실험을병행한후유세포분석과 high-density microarray를이용하여배양에따른변화를측정하였다. 1. 제대혈의채집 Ⅱ. 재료및방법 세브란스병원분만실에서정상분만한산모로부터제대혈을채집하였다. 분만후제대를이중으로결찰하고소독한후제대를절단하였으며, 태반이만출되기전제대정맥에서항응고제 CPDA-1 이 25 ml 이포함된채혈백 ( 녹십자, 서울, 한국 ) 을사용하여제대혈을채취하였다. 2. 조혈모세포분리 제대혈백에있는제대혈을 50 ml tube 에옮긴후, Ficoll-Hypaque ( 비중 1.077, Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 를이용하여 density gradient 4

12 centrifugation (2500 rpm, 20 분 ) 을통해단핵구층을분리하였다. 분리된단핵구는 phosphate buffered saline (PBS) 으로세번세척한후 PBE (50 mm EDTA 와 1% FBS 를포함하는 ph 7.4 의 phosphate-buffered saline) 에부유하였다. CD34 양성세포는분리된단핵구로부터 high-grade magnetic field 와 mini-macs column (Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA) 을이용한 superparamagnetic microbead 방법으로다음과같이분리하였다. 단핵구를 PBE 300 μl 당 10 8 개로조절하여부유시킨다음, 세포 10 8 개당 100 μl 의 Fc 수용체차단시약 ( 사람면역글로불린 ) 과 100 μl 의자석입자가부착된항 CD34 항체를첨가하여 30 분간냉장온도에서반응시킨후세척하였다. 세포를배양하는중에 MACS 원주를다음과같이준비하였다. 금속판에자석입자를부착한다음원주를부착하고, 이를 PBS 로 1 회세척한다음사용하였다. 500 μl 의단핵구는잘부유시켜서, 30 μm 여과장치 (Pre- Separation Filter, Miltenyi Biotech, Auburn, CA, USA) 가부착된원주에투과시켜죽은세포와불순물을제거하였다. 이후원주로부터배출된 CD34 음성분획은버리고원주내에잔류하는 CD34 양성분획을회수하였다. 경우에따라서는새로운원주로세포분리를반복하였다. 잔류세포의분리는원주에 500 μl 의 PBE 를첨가한후자석입자로부터원주를분리시키고플런저로밀어서방출시키는과정을 2 회반복하여방출되는모든세포분획을회수하였다. 분리된세포는 Neubauer chamber (Neubauer Improved, Marienfeld, Germany) 를이용하여세포농도를측정하였다. 3. 배양 분리한 CD34 양성세포를배양하기위해 50 μg/ml iron-saturated human transferrin, 90 μg/ml ferric nitrate, 100 μg/ml insulin, 30 μg/ml soybean lecithin, 7.5 μg/ml cholesterol 그리고 10-6 M hydrocortisone 을 X-Vivo 10 (BioWhittaker, Walkersville, MD, USA) 에첨가여기본배지를만들었다. 배양은 3주 (21일) 동안진행하였고세단계로구성하였다. 첫 1주는조혈모세포의증식을유도하는단계로서 CD34 양성세포를 10 4 /ml 농도로기본배지에부유시키고, 50 ng/ml Flt3-L (PeptroTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA), 100 ng/ml TPO (PeptroTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) 그리고 100 ng/ml SCF (Endogen, Woburn, MA, USA) 의농도로배지에첨가하였다. 2주째에는적혈구모세포의증식을위해 50 ng/ml SCF, 3 U/mL EPO 그리고 50 ng/ml Insulin like growth factor (IGF-1, PeptroTech Inc., Rocky Hill, NJ, USA) 이첨가된배지에서세포를배양하였다. 마지막 3주에는적혈구모세포의최종분화를유도하기위해 3 U/mL EPO와 50 ng/ml IGF-1이첨가된배지에서배양을시행하였다. 5

13 37 의온도와 5% 의 CO 2 대기조건에서배양을시행하였으며, 적절한세포증식을위해서 3 4 일마다배지를교체하였다. 배양세포의증식정도는 hemocytometer 를이용하여측정하였으며, 새로분주하는세포수를 1 x 10 5 개로조정하였다. 또한세포의형태변화를분석하기위하여슬라이드도말표본을만들어 Wright-Giemsa 염색후현미경으로관찰하였다. 조건별로 3 개씩총 12 개의배양을시행하였다. 4. 유세포분석 제대혈단핵구에서 Mini-MACS column 을통해분리된세포를배양하기직전에 CD45 와 CD34 에대한단큰론성항체를이용하여분리순수도를측정하였다. 배양 7 일, 14 일, 21 일배양세포에대해각각 CD45, CD34, CD38, GPA 의표현을측정하였다. 유세포분석은 EPICS XL (Beckman-Coulter Inc., Miami, FL, USA) 을사용하였다. 5. 배양세포의유전자 Microarray 분석 가. RNA 추출 제대혈에서분리한신선 CD34 양성세포와 7 일, 14 일그리고 21 일째배양한세포를 1 x 10 5 정도취하여 TRIzol LS Reagent (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) 와 RNeasy mini kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 을이용하여 total RNA 를분리, 정제하였다. Total RNA 의양과질을분광광도계, 전기영동및 BioAnalyzer 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, USA) 를이용하여결정하였다. 나. RNA 증폭 (1) 첫번째 cdna strand 합성 4 μg 의총 RNA 를사용하여첫번째증폭에사용하였다. RNA template 와 2 μg 의 oligo-dt 24 /T7 primer (5'-GGCCAGTGAA TTGTAATACGACTCACTATAGGGAGGCGG-3') 를 9 μl 의 RNase-free water 에넣었다. RNA/primer 혼합물을 65 에서 10 분간 denaturation 시킨후얼음에서 5 분간냉각시켰다. RNA 용액에 5X first strand buffer (250 mm Tris-HCl, ph 8.3, 375 mm KCl, 15 mm MgCl2, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 4 μl, 6

14 0.1M DTT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2 μl, SuperScript II RT (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 2 μl, 10 mm dntp mix 2 μl, 그리고 RNAsin 1 μl 를가하고, 혼합액을 42 에서 1 시간동안반응시켰다. (2) 두번째 cdna strand 합성 첫번째반응이끝난혼합물에 RNase-free water 91 μl, 5X second strand buffer 30 μl, 10 mm dntp mix 3 μl, DNA ligase 10U, DNA polymerase I 4U, RNase H 2U 를가하고 16 에서 2 시간동안반응시켰다. 이후 T4 DNA polymerase 를가하고 16 에서 5 분간반응시키고, 1M NaOH 10 μl 와 0.5M EDTA 10 μl 를가하여반응을중단시켰다. 65 에서 10 분간둔뒤 Tris-HCl (ph 7.5) 25 μl 를가하여중화시켰다. Phenol : chloroform : isoamyl alcohol (25:24:1) 을이용하여이중 cdna 를추출하고 1 μl 의 Linear acrylamide (0.1 μg/μl) 의존재하에에탄올로침전시켰고, 건조된침전물은 9 μl 의 RNase-free water 에부유시켰다. (3) 체외전사 T7 MEGAscript kit (Ambion, Austin, TX, USA) 을사용하여 double stranded cdna 로부터 mrna 를전사했다. 75mM NTP 각 2 μl, enzyme mix, 10X reaction buffer 를 8 μl 의 cdna 에가하고 37 에서 5 시간동안반응시켰다. 증폭된 mrna 는 RNeasy mini kit 를사용하여정제하였다. RNA 의양은분광광도계로 OD260 을읽어측정하였으며, 질은 agarose gel 전기영동을이용하여결정했다. 배양 21 일째세포에서는충분한 RNA 를증폭하지못하여 microarray 를진행하지못하였다. 다. RNA labeling 과교잡반응 증폭된 mrna 4 μg 의역전사반응에 Cyanine 3-dUTP 혹은 Cyanine 5-dUTP 를가하여 labeling 을시행하였다. RNA 에 6 μg 의 random primer (oligo-dt primer) 를가하고, 65 에서 10 분간반응시켰다. RNA 용액에 5X first strand buffer 8 μl, 100mM DTT 4 μl, SuperScript II RT 2 μl, 20X low-dt/dntp mix 2 μl, RNAsin 1 μl 를가하고 42 에서 2 시간동안반응시켰다. 남은 RNA 를가수분해하기위하여 0.1M NaOH 15 μl 를가하고 65 에서 30 분간반응시킨후 5 μl 의 HCl 을가하여중화시켰다. Cyanine3 및 Cyanine5 로표지된표식자는 QIAquick PCR Purificatio kit (Qiagen, Valencia, CA, USA) 를사용하여정제하였으며, 20 μg 의사람 COT-1 DNA, 20 μg 의효모 trna 및 20 μg 의 poly(a) RNA 와혼합하였다. 최종적으로표 7

15 식자는 Microcon YM-30 column (Millipore, Bedford, MA, USA) 로적당한용적을맞추었으며, 100 에서 2 분간 denaturation 시켰다. 17,000 개의인간유전자를포함한 cdna chip (GenomicTree, 대전, 한국 ) 에 3.5X SSC, 0.1% SDS, 10 mg/ml BSA 를가하여 42 에서 1 시간동안 prehybridization 을시켰다. 배양세포및제대혈조혈모세포의증폭된 RNA 로부터만들어진표식자 4 μg 을 25% formaldehyde, 5X SSC, 0.1% SDS 와함께 62 에서습도를유지하면서하룻밤동안반응시켰다. 분석디자인은배양전 CD34 양성세포 / 배양 1 주세포, 배양전 CD34 양성세포 / 배양 2 주세포조합으로각각시행하였다. 교잡반응이끝난다음 array 는 2X SSC 와 0.1% SDS, 1X SSC 와 0.1% SDS, 0.2X SSC 및 0.05X SSC 로순서대로각 2 분간세척하였고, 500g 에서원심분리하였다. 라. 이미지스캔및자료분석 Array 는 GenePix 4000B (Axon Instruments, Union City, CA, USA) 로스캔하였으며, GenePix Pro 4.0 으로 background signal 을제거한후형광신호를계산하였다. 결과분석은 within-print tip Lowess function 을이용하여 normalization 을시행한후계층군집분석을하였고, SAM (Significant Analysis of Microarray) 기법으로유의한유전자를찾았다. 또한통계분석후유의한유전자로선택되지않았으나적혈구생성과관련이있는유전자에대해서는형광신호의평균값을통해개별적으로비교하였다. 1. 제대혈조혈모세포분리및배양 가. CD34 양성세포의순수분리결과 Ⅲ. 결과 산모로부터채집한제대혈은평균 71 ml ( 항응고제 25 ml 포함 ) 이었다. 제대혈의단핵구를비중을이용하여분리하였고 2회의 MACS분리후얻은 CD34+ 세포는평균 5.5 x 10 5 이었다. 유세포분석기로측정한결과제대혈에서분리된세포중에서 CD45+/CD34+ 인세포군이 92% 이상이었고, 동시에 CD38도 90% 이상높게표현하고있었다 ( 그림 1). 8

16 그림 1. Mini-MACS를이용하여분리한제대혈유래 CD34 양성세포의면역표현형. Low side scatter와 low forward scatter를보이는 homogenous한세포군집이관찰되었다. 분리된세포는 CD34, CD45와 CD38을모두 90% 이상높게표현하고있다. 나. 적혈구분화유도배양에있어서의 EPO 의효과 EPO 를 8 일부터 3 U/mL 농도로첨가하여세단계로배양한경우와 EPO 가배양초기에미치는역할을규명하기위하여배양시작부터 EPO 의농도를달리하여배양한경우모두에서 2 주까지세포수가증가하다가그이후감소하였다 ( 그림 2). EPO 의농도가높아질수록세포수가증가되는양상이관찰되었으며, EPO 를 20 U/mL 농도로배양시작부터첨가한경우에서가장많이세포가증가하는것을관찰할수있었다 (n=3, 14 일, 평균 233 배 ). 대조군으로 EPO 를첨가하지않고배양한경우에는모두증식을유지할수없어실험을중단하였다. 9

17 Cell expansion Day of culture 20 U/mL 10 U/mL 3 U/mL 3 steps 그림 2. 배양조건에따른제대혈 CD34 양성세포의증식정도비교. 모든배양에서 14일에세포수가가장많이증식하였다. EPO 를 20 U/mL로배양처음부터첨가한경우평균 233배로증식하였고 10 U/mL에서는평균 199배, 3 U/mL에서는 127배증식하였다. EPO를배양 8일부터주는세단계배양에서평균 63배증식하여가장낮은배양성적을보였다. 배양세포는각시기별로염색하여그형태를관찰하였다 ( 그림 3). 제대혈에서바로분리한 CD34 양성세포는크기가큰단핵구의형태이며세포질내에과립이관찰되지않았다. 그러나배양 7 일째부터세포질내에호산구성과립이많이관찰되기시작했다. 전반적으로배양이진행되면서호염기성인세포질을가지는적혈구모세포의형태적특징을보이는세포보다는세포의모양이불규칙해지고세포질내에공포 (vacuole) 와과립이많은백혈구계열의세포가대부분관찰되었다. 10

18 A B C D (Wright-Giemsa stain, x 1000) 그림 3. 배양기간에따른배양세포의형태적변화. A는배양하기전의 CD34 양성세포이다. B는 7일, 그림 C는 14일그리고 D는 21일배양세포의사진이다. 배양이진행되면서모양이불규칙해지고과립과공포가증가하는모습을보이고있다. 2. 면역표현형의변화 제대혈로부터분리한 CD34 양성세포를배양직전에측정한경우 CD34, CD45 그리고 CD38 항원의표현율은 90% 이상높게측정되었다. 배양이진행되면서 CD34 와 CD45 항원표현이감소하였다. CD34 의경우배양 7 일에는어떠한조건에서도 15% 를넘지않을정도로급속하게감소하였고, CD45 는그에비해비교적높게표현되는양상이었지만배양 21 일에는 20.2~33.9% 정도로뚜렷하게감소하였다. 기본적인배양조건인세단계배양에서만배양 7 일에 CD34 가 EPO 를처음부터넣어준배양보다높게표현되어 EPO 를배양초기에첨가할경우조혈모세포가더빨리 CD34 의표현이감소하는것을알수있었다. 그러나모든조건에서시간이경과함에따라 CD34 와 CD45 가뚜렷하게감소하였지만적혈구의대표적인표지자인 glycophorin A 의표현은 3% 이하였고, 배양기간동안표현의변화를보이지않았다 ( 표 1). 11

19 표 1. 배양된제대혈유래 CD34 양성세포의면역표현형의변화 EPO conc. EPO 3 steps (n=3) 3 U/mL (n=3) 10 U/ml (n=3) 20 U/mL (n=3) Culture day CD34 CD38 CD45 GPA* day day NT 0.5 day day day day day day day day day day * glycophorin A EPO 를배양 2 단계부터첨가한기본적인배양조건임. Not tested 3. 배양세포의유전자프로파일의분석 제대혈로부터분리한신선 CD34 양성세포를대조군으로하여배양 7 일, 14 일그리고 21 일세포에서유전자표현의변화를측정하였다. 그러나배양 21 일째세포에서는충분한 RNA 를얻지못하여 microarray 를진행하지못하였다. 17,000 개의유전자중에서 normalization 과 filtering 을시행하여 10,986 개유전자를선택하였다. 10,986 개의유전자중에서배양 7 일에비해배양 14 일에서유의한유전자발현의차이를보이는유전자를 SAM (Significant Analysis of Microarray) 을이용하여검색하였다. 그결과 False discovery rate (FDR) 가 0.74% 인유의한 125 개의유전자를선정하였고, 선정된유전자군을이용한 hierarchical clustering 결과배양 7 일과 14 일군의분류를확인하였다 ( 그림 4). 이들유전자중에서 17 개의유전자가 7 일배양세포에비해 14 배양세포에서 3 배이상발현이증가하였으나적혈구분화와관련된유전자의변화는관찰할수없었다 ( 표 2). 12

20 Day 7 (n=3) Day 14 (n=4) 그림 4. 배양 7일세포와배양 14일세포에서차이를보이는 125개유전자의 hierarchical clustering. SAM (significant analysis of microarray) 을이용하여배양진행되면서발현에차이를보이는유전자를검색하였고, 그중에서 False discovery rate (FDR) 가 0.74% 로유의한유전자 125항목을선택하였다. 배양 7일군과 14일군이구분됨을확인할수있다. 13

21 표 2. 통계적분석후배양 7 일에비해 14 일세포에서발현이증가한유전자항목리스트 Annotation Fold difference* Solute carrier family 21 (organic anion transporter), member Small inducible cytokine A4 (homologous to mouse Mip-1b) 5.4 Isocitrate dehydrogenase 2 (NADP+), mitochondrial 4.8 EST (gene ID: AA953113) 4.8 Dual specificity phosphatase Cyclin I 3.7 ATP-binding cassette, sub-family A (ABC1), member Inhibitor of DNA binding 2, dominant negative helix-loop-helix protein 3.6 H2A histone family, member L 3.6 B-cell translocation gene 1, anti-proliferative 3.6 Related RAS viral (r-ras) oncogene homolog 3.4 Fatty-acid-Coenzyme A ligase, long-chain Human mrna for SB classii histocompatibility antigen alpha-chain 3.2 Brain-specific angiogenesis inhibitor Ceroid-lipofuscinosis, neuronal 2, late infantile (Jansky- Bielschowsky disease) 3.1 Putative translation initiation factor 3.1 HSPC022 protein 3.1 * 배양 7일세포에비해 14일에서유전자발현이 3배이상증가한경우 를유의한증가로판단하였다. SAM 분석에서는유의한차이를보이지않았으나 glycophorin A, Rhesus blood group, CcEe antigens erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의경우 7 일세포에비해 14 일세포에서발현정도가증가해있었다 ( 그림 5). 14

22 Fold difference Glycophorin A Rhesus blood group, CcEe antigens erythrocyte membrane protein band 4.2 erythropoietin receptor 그림 5. 적혈구생성과관련이있는유전자항목들에대한개별분석. 배양 7일에비해배양 14일에서 glycophorin A는 10배, rhesus blood group, CcEe antigens는 8.3배, erythrocyte membrane protein band 4.2는 3.0배그리고 erythropoietin receptor는 1.5 배발현이증가하였다. Ⅳ. 고찰 적혈구생성은매우복잡한과정이며다양한성장인자와사이토카인, 조혈모세포그리고골수미세환경의상호작용에의해서조절된다. 27 EPO는 38 kdal의 α-globulin으로신장에서생성되며, 적혈구모세포에표현된 EPO receptor (EPOR) 에작용하여적혈구로의분화와증식을촉진하는역할을하는적혈구생성의핵심성장인자이다. 11,12,14,16,17,19-22,28,29 Wu 등은 EPO와 EPOR이 knockout된쥐들에심한빈혈이발생되어결국사망에이르는것을관찰하여적혈구생성에 EPO와 EPOR의상호작용이적혈구생성에필수적임을증명하였다. 30 SCF는처음에는분화되지않은혈구모세포의증식을촉진하는것으로알려졌지만이미계열이정해진혈구세포의성장을돕는기능이있는것으로밝혀졌다. 16 적혈구생성에있어서 EPO와 SCF의상승작용이여러연구에서증명되었고, 대부분의적혈구생성실험에서이두성장인자를사용하고있다. 12,13,16,17,28,31,32 골수의조혈모세포에서성숙한적혈구로분화하는과정은여러단계로구성되며, 크게 EPO가필요없는초기단계와 EPO 의존적인후기단계로나뉜다. 많은체외적혈구생성연구에서도실제생체에서의조건과유사하게하기위하여배양과정을두단계로나누었다. 즉 EPO의자극이필요없는단계에서는 SCF나 TPO 같은성장인자를첨가하여조혈모세포를증식시키고그뒤에적혈구로의최종분화를유도 15

23 하기위하여 EPO를첨가하였다. 2002년 Neildez-Nguyen 등은배양조건을조혈모세포가증식하는단계, 적혈구모세포의증식과분화를촉진하는단계그리고적혈구의최종분화를유도하는단계로기존연구에비해배양조건을더욱세분하여높은순수도의적혈구계열세포를생성하였음을보고하였다. 1 따라서본연구에서도적혈구생성에가장중요한성장인자인 EPO와 SCF를첨가하여배양을진행하였고, 배양조건은 EPO가첨가되지않는 1단계와 EPO가첨가된 2, 3단계로구성되며총 21일간배양을시행하였다. 그러나여러연구에서적혈구생성에있어서 EPO의중요성에대해강조하였으나실험마다 EPO 농도에차이가있었다. 일반적으로정상인의혈중 EPO 농도는 50 mu/ml 정도이지만, 22 기존연구에서사용한 EPO의농도는 1 U/mL에서 4 U/mL로다양하였다. 또한적혈구생성에있어서적정한 EPO 농도와 EPO 농도를증가시켰을때의변화에대한내용에대해서는알려진내용이적었다. 본실험에서는기본적으로단계별배양을진행하는한편배양시작부터 EPO의농도를 0 U/mL에서 20 U/mL로다양하게하여그영향을비교하였다. 조혈모세포배양결과모든배양조건에서 14일까지급속하게세포수가증식하였으나배양 3단계에서는세포수가약간감소하는양상을보였다. 이는기존연구와유사한결과였다. 1 또한 EPO농도가증가하면서세포증식이증가하는경향을관찰할수있었고가장높은농도인 20 U/mL에서다른조건에비해월등한세포증식을관찰할수있었다. 따라서 EPO의농도와세포증식간에는양의상관관계가있음을알수있었다. 반면대조군으로 EPO를첨가하지않은경우배양 14일까지세포형태는유지하였지만세포수가증식하지못하고그대로사멸하였다. EPO를 1주배양후첨가한세단계배양의경우 EPO를처음부터첨가한배양보다세포가더적게증식하였는데이는 EPO를배양초기부터첨가하여좋은배양성적을얻었다는 Giarratana 등의보고와일치하는소견이었다. 15 따라서 EPO의첨가유무로배양과정을구분하는것은적혈구생성에큰의미가없을것으로판단된다. 그러나 EPO 의자극으로세포의증식이증가되는반면대부분의배양세포의형태는적혈구계열의세포와는차이가있었다. 대부분의배양세포에서세포질내과립과공포를흔히관찰할수있었고배양이진행되면서그양이증가하였다. 배양세포의면역표현형분석결과배양이진행되면서 CD34와 CD45의표현이감소하였다. CD34의경우모든배양에서배양 7일에 15% 이하로급속히감소하였고, EPO를처음부터첨가하지않은경우가첨가한배양에비해더높은 CD34 표현을보였다. 따라서 EPO를배양초기에첨가할경우조혈모세포의분화를촉진하는것으로생각되었다. 그러나 CD45와 CD34가감소하는데비하여모든배양조건에서 GPA의표현은매우낮았다. Liquid culture를통한적혈구생성의경우배양세포가여러계열의세포로분화되어낮은순수도를보이는것이문제점으로지적된바있고, 1 본실험에서도배양세포의형태와표현형결과를통해조혈모세포로부터증식된세포가적혈구계 16

24 열로의분화가충분하게진행되지못한것으로해석하였다. 배양세포의형태나표현형분석뿐아니라유전자의발현단계에서의변화를알기위해 17,000 유전자에대한 microarray를시행하여배양 7일세포와 14일세포의유전자발현을비교하였다. SAM 분석을통하여 7일과 14일세포에서발현이유의한변화를보이며 FDR이 0.74% 로유의한유전자는 125 개였다. 7일에비해 14일에 3배이상발현이증가한유전자는 17개였지만적혈구분화와관련성이알려진유전자는아니었다. 그러나 SAM를이용하지않고적혈구생성과관련성이높은유전자들을개별적으로분석하였을경우 glycophorin A, Rhesus blood group, CcEe antigens erythrocyte membrane protein band 4.2 그리고 erythropoietin receptor 유전자의발현이증가해있었다. 따라서본실험의배양조건을통해배양세포의형태나표현형은뚜렷한변화를보이지않았으나관련유전자의발현이증가했음을알수있었다. 그러나유전자단계의변화가표현형의변화로연결되지못한정확한원인을규명하지못하였다. 지금까지조혈모세포로부터적혈구세포를얻으려는많은노력이있어왔다. 그러나적혈구의경우대부분의연구에서충분한수의성숙한세포를얻는데실패하였다. 또한지금까지의연구성과에도불구하고체외에서호산성적혈모구 (orthochromic normoblast) 로부터핵을유출시켜성숙한적혈구를얻는과정은분화에있어서가장큰걸림돌로판단되고있다. 그원인은골수의미세환경과다른세포와의상호작용을체외배양에서구현할수없기때문으로알려져있다. 11,15 배양세포를쥐에투여하거나배양중에 DMSO를첨가하여핵의유출을유도하는방법이소개되었으나, 1,11 임상적으로이용되기에는어려운모델이다. 그러나최근골수의기질세포와조혈모세포의동시배양을통하여대규모의적혈구생성에성공한연구보고가있어 15 희귀혈액형의적혈구생산과혈색소병증치료등의임상적활용이가능할것으로생각된다. 앞으로체외에서생성된적혈구를환자치료에사용하기위해서는적혈구분화를위한최적조건을찾는연구가더진행되어야할것이다. Ⅴ. 결론 본연구에서는제대혈의 CD34 양성세포를분리하여 EPO 등의자극을통하여적혈구로분화를시도하였다. 또한 EPO 농도와첨가시기가배양에미치는영향을규명하기위하여유세포검사를통해면역표현형을, microarray 를이용하여유전자발현의변화를알아보고자하였다. 제대혈의 CD34 양성세포를다양한성장인자를첨가한배지에서 3 주간배양하였고, EPO 의농도와첨가시기를달리하여결과를비교하였다. 배양세포는모든조건에서 14 일에가장높은세포수의증식을보였으며 EPO 의농도가 17

25 높을수록처음부터첨가할수록좋은증식을보였다. CD34 와 CD45 는초기에 90% 이상높게표현하였고배양이진행되면서그표현이감소하였다. 그러나적혈구에특이적인항원인 GPA 의표현이두드러지지않았다. 배양세포가높은순수도를가지는적혈구세포는아니었지만 microarray 분석을통해배양이진행되면서 erythropoiesis 와관련이깊은유전자들의발현이증가하는변화를관찰할수있었다. 이에따라조혈모세포를배양할경우적혈구분화를유도하는것으로알려진 EPO 가농도에따라서세포증식을촉진하는사실을확인하였다. 또한 EPO 첨가하는시기로세분화하는기존의배양방법보다배양초기부터 EPO 를첨가하는것이세포증식에더유리하였다. 유전자단계에서는적혈구와관련된여러유전자의발현이증가하였으나표현형의변화가미흡하였다. 따라서생체내의조건과좀더유사한배양조건을규명하는연구가필요할것으로생각된다. 18

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29 Abstract Ex vivo generation of RBCs from CD34+ cells in human umbilical cord blood and expression profile analysis using microarray. Chang Ki Kim Department of Medicine The Graduate school, Yonsei University (Directed by Professor Hyun Ok Kim) RBCs are produced by erythropoiesis in the bone marrow with a help of erythropoietin (EPO), which is a key factor for RBCs production. For Ex vivo generation of RBCs, a lot of studies used sequential culture protocols, which were consisted of the expansion period without EPO and the differentiation period with EPO. In this study, we have tried to generate RBCs from CD34+ cells in cord blood using 3 steps culture protocol and also evaluated the changes in immunophenotypic characteristics and genetic profiles according to EPO concentration and culture duration. Using mini-macs columns, CD34+ cells were isolated from cord blood. The culture procedure comprised three steps. For each step, cells were cultured sequentially for 7 days in a serum free liquid medium with specific combinations of growth factors for 21 days. [1 st step: Flt3- ligand (Flt3-L), thormbopoietin (TPO) and stem cell factor (SCF); 2 nd step: IGF-1, SCF, EPO; 3 rd step: IGF-1, EPO] To evaluate the EPO effect on proliferation and differentiation, cells were cultured with three different EPO concentrations (0, 3, 10 & 20 U/mL). Cell count and morphology were monitored during this period. For phenotyping, antibodies to CD34, CD38, CD45 and glycophorin A (GPA) were used and phenotype analyses were performed on an EPICS XL. The genetic profile of cultured cells was analyzed by 17,000-gene microarray analysis. As erythropoietin concentration increased, cell expansion was also increased, showing a maximum expansion at 20 U/ml (233-fold amplification). The cell population showed a gradual decrease in expression of CD34 and CD45 whereas the expression of GPA was not prominent in any conditions (less than 3%). Through the SAM (significant analysis of microarray), 125 genes that showed 22

30 significant results were selected. When we analyzed genes associated with erythropoiesis, we observed increased expression in glycophorin A, rhesus blood group, CcEe antigens, erythrocyte membrane protein band 4.2 and erythropoietin receptor gene as cultures progressed. Our study shows that erythropoietin enhance a proliferation of hematopoietic progenitor cells as well as a differentiation to erythroid lineage. Our culture system did not achieve pure production of RBCs, but induced genetic changes that indicated erythroid differentiation. Key words: cord blood, CD34+ cells, erythropoietin, RBCs 23