J Dent Hyg Sci Vol. 16, No. 1, 2016, pp.70-76 http://dx.doi.org/10.17135/jdhs.2016.16.1.70 RESEARCH ARTICLE 임플란트적용을위한하이드록시아파타이트 이산화티탄표면의생체적합성평가 강민경ㆍ배성숙 한서대학교치위생학과 A Biocompatibility Evaluation of Hydroxyapaite Titania Surface for Dental Implant Min-Kyung Kang and Sung-Suk Bae Department of Dental Hygiene, Hanseo University, Seosan 31962, Korea The objective of this study was to fabricate hydroxyapatite () containing titania layer by blasting and anodization method to obtain advantages of both methods and evaluated biocompatibility. To fabricate the containing titania layer on titanium, blasting treatment was performed followed by microarc oxidation () using the electrolyte solution of 0.04 M -glycerol phosphate disodium salt n-hydrate and 0.4 M calcium acetate n-hydrate on the condition of various applied voltages (100, 150, 200, 250 V) for 3 minutes. The experimental group was divided according to the surface treatment procedure: (simple machined polishing treatment),,, + 100, + 150, + 200, + 250. The wettability of surface was observed by contact angle measurement. Biocompatibility was evaluated by cell adhesion, and cell differentiation including alkaline phosphatase activity and calcium concentration with MC3T3-E1 cells. The porous titanium oxide containing was formed at 150 and 200 V. These surfaces had a more hydrophilic characteristic. Biocompatibility was demonstrated that titania composite layer on titanium showed enhanced cell adhesion, and cell differentiation. Therefore, these results suggested that containing titania layer on titanium was improved biological properties that could be applied as material for dental implant system. Key Words: Anodization, Blasting, Dental implants, Hydroxyapatite, Titania 서론 오늘날평균수명이늘어나면서치아상실인구가많아지고있고이를수복하기위해임플란트치료의요구와기대도가증가하고있다 1). 임플란트치료법의성공을좌우하는것은골과임플란트의직접적인결합상태인골융합으로우수한골융합은임플란트표면의모양, 표면에너지, 화학적성분등이영향을미치게된다 2). 따라서표면의거칠기를증대시키고표면에너지를향상시키며칼슘포스페이트등의골전도성물질을코팅하여임플란트의성공률을높이고자 많은표면처리방법들이개발되고있다 3). 칼슘포스페이트코팅을위한플라즈마스프레이법은수마이크로미터단위에서밀리미터단위까지원하는두께의코팅층을얻을수있다는장점이있으나티타늄표면과코팅층의결합력이약하다는단점이있다. 또한실온에서공정할수있는졸겔코팅방법은용매로사용되는알코올등이생체적합성에문제를일으킬수있으며이역시코팅층과의낮은결합력때문에쉽게코팅층이박리될수있는한계점이있다 3,4). 한편, 블라스팅방법은표면에하이드록시아파타이트등의세라믹입자를압축공기를이용, 노즐을 Received: December 21, 2015, Revised: January 7, 2016, Accepted: January 8, 2016 Correspondence to: Sung-Suk Bae Department of Dental Hygiene, Hanseo University, 46 Hanseo 1-ro, Haemi-myeon, Seosan 31962, Korea Tel: +82-41-660-1573, Fax: +82-41-660-1579, E-mail: ssbae@hanseo.ac. ISSN 1598-4478 (Print) / ISSN 2233-7679 (Online) Copyright 2016 by the Korean Society of Dental Hygiene Science This is an Open Access article distributed under the terms of the Creative Commons Attribution Non-Commercial License (http://creativecommons.org/licenses/ by-nc/4.0) which permits unrestricted non-commercial use, distribution, and reproduction in any medium, provided the original work is properly cited.
강민경ㆍ배성숙 : 하이드록시아파타이트 이산화티탄표면의생체적합성평가 통해분사시켜표면거칠기를증대시키는방법중하나로사용되고있다 5,6). O Hare 등 7) 은블라스팅방법을통하여향상된골생성능과더불어코팅층의우수한결합강도를보고한바있다. 한편거칠기를증대시키는또다른방법으로다공성산화막을두껍게형성시키는양극산화방법이있다. Ishizawa와 Ogino 8) 는산화막내에칼슘과인을포함시켜우수한골융합을보고하였다. 더욱이이두꺼운다공성산화막은우수한부식저항성을가져우수한생체적합성을나타내었다. 그러나생체활성도가떨어져골융합이되기까지오랜시간이걸린다는단점이있다 9,10). 한편선행연구에서는블라스팅방법과양극산화방법의단점을보완하고각각의장점을얻고자블라스팅후양극산화처리를시행하여하이드록시아파타이트 이산화티탄복합표면을형성하였다. 그리고복합표면의기계적, 물리적성질을평가한결과블라스팅이나양극산화중한방법으로만표면처리된시편보다더높은표면거칠기를나타냈으며, 티타늄표면과코팅층간의결합강도가향상된것으로나타났다. 또한낮은전류밀도값을가지며높은부식저항성을나타내었다 11). 따라서이번연구의목적은하이드록시아파타이트 이산화티탄복합표면의생체적합성을평가하고자세포의부착양상을관찰하고알카린포스파타제 (alkaline phosphatase, ALP) 활성도와칼슘양을측정하여세포의분화능을평가하는데있다. Table 1. Surface Treatment Process of the Specimens Group + 100 + 150 + 200 + 250 연구대상및방법 1. 연구재료이실험에서는시편으로상용티타늄 (Grade 2; Hyundai Titanium, Incheon, Korea) 을사용하였으며, 실험을위해서절단기를이용하여 10 10 1 mm 3 의크기로시편을절단하 Treatment process Polishing Polishing+anodization 250 V +anodization 100 V +anodization 150 V +anodization 200 V +anodization 250 V 였다. 각실험군당사용한시편의개수는아래의표면처리에따라 15개씩이었다. 2. 연구방법 1) 시편제작 (1) 연마제작된상용티타늄을 #100 #1200의 SiC 연마지를이용하여순차적으로연마하였다. 연마한시편의표면은아세톤에서 5분, 에탄올에서 5분, 증류수에서 5분씩초음파세척한뒤, air-spray로표면에물기를제거한다음, 상온의건조기에서 24시간이상건조시켰다. (2) 하이드록시아파타이트블라스팅입자분사기 (Dust INN 2000; Deldent, Windsor, CT, USA) 를이용하여티타늄표면에하이드록시아파타이트블라스팅처리하였다. 하이드록시아파타이트분말의평균입도는 45 180 m (MCD Powder; Himed, New York, NY, USA) 을사용하였다. 균일한분사를위하여시편에서부터 tip 사이의거리를 10 mm로유지한후 4 bar의압력으로시편당 30초씩전체적으로고르게입자분사처리를하였다. 입자분사처리한시편의표면은증류수에 5분간초음파세척하고 air-spray로표면에물기를제거한다음, 상온의건조기에서 24시간이상건조시켰다. (3) 양극산화연마또는연마후블라스팅처리한시편을각각 100 250 V 전압하에서직류전원공급장치 (Genesys 600-2.6; Densei-Lambda, Tokyo, Japan) 를이용하여 3분간양극산화처리하였다. 전해액은 0.4 M의칼슘아세테이트 (calcium acetate) 와 0.04 M의베타글리세롤포스페이트다이소디움솔트엔하이드레이트 (beta-glycerol phosphate disodium salt n-hydrate) 를혼합하여사용하였다. 표면처리방법을달리하여티타늄표면을변형시킨실험군은 Table 1과같다. 2) 표면접촉각분석표면처리된시편들의젖음성을관찰하기위하여각군당시편을준비하여 50 o C 온도의건조기에서 24시간동안건조시켰다. 이시편들 15 cm 위에 2차증류수 100 l를떨어뜨리고 1분후, 시편과증류수간에형성된좌, 우의접촉각의평균값을접촉각측정기 (DSA10; Kerus, Hamburg, Germany) 를사용하여접촉각으로측정하였다 (n=15). 71
J Dent Hyg Sci Vol. 16, No. 1, 2016 3) 세포부착관찰각군의시편을에틸렌옥사이드가스 (ethylene oxide gas) 로멸균처리하여각군당 2개씩 24 well에넣었다. MC3T3-E1 (Mouse osteoblastic cell; ATCC, Manassas, VA, USA) 세포를 10% fetal bovin serum (Gibco, Calsbad, CA, USA) 를함유한 α-mem 배지 (Gibco) 에 5 10 4 개 /ml 의농도로희석하고, 시편이담긴 well 에 1 ml 씩분주하고 37 o C, 5% CO 2 배양기 (VS-9160C; Vison Scientific, Daejeon, Korea) 에서 4시간동안배양하였다. 배양이끝나는시점에시편을꺼내어 phosphate-buffered saline (PBS, Gibco) 으로세척하고, Karnovy 고정액 (2% glutaraldehyde, 2% paraformaldehyde, 0.5% CaCl 2) 에 12 시간동안담가부착된세포를고정하고, 여분의 1차고정액을 PBS로수세하였다. 지질의성분을보호해주면서시료를안정화시키기위하여 1% OsO 4 (osmium tetroxide) 로 1 시간동안고정하고, OsO 4 와알코올이직접만나면시료내외에검은염색성이나타나는것을방지하고자다시 PBS로 10분간수세하였다. 수세과정후저농도알코올부터무수알코올순서로세포를탈수시켰다. Critical point dryer (CPD, HCP-2; Hitachi, Tokyo, Japan) 에서임계점건조를한다음시료의전도성을높이고 2차전자를많이발산할수있도록하기위해서 Ion coater (Eiko IB-3; Eiko Engineering, Hitachinaka, Japan) 를이용하여 300 Å 두께로코팅을하였다. 코팅이끝난후시편위에부착된세포를주사전자현미경 (FE-SEM, S-800; Hitachi) 으로관찰하였다. 4) ALP 활성평가 ALP 활성도 (ALP activity) 는 1, 2, 3주동안 Alkaline Phosphate Assay Kit (Quantichrom TM Alkaline Phosphate Assay Kit, DALP-250; Bioassay System, Hayward, CA, USA) 를사용하여평가하였다. MC3T3-E1 세포를 1 10 4 개 / Table 2. Contact Angle of Specimens Group Angle ( o ) 60.6±2.1 a 30.1±1.7 b 16.9±4.0 c + 100 8.6±3.0 d,e + 150 7.5±2.5 d,e + 200 11.9±3.3 c,d,e + 250 19.6±3.8 c Values are presented as mean±standard deviation. a~e The same letters showed no significant differences (p>0.05). Refer to Table 1 for defintion of each group. ml의농도로희석하여시편에 1 ml씩분주하고, 37 o C, 5% CO 2 배양기 (VS-9160C) 에서 1주, 2주, 3주간배양하였다. 배양이끝나는시점에 0.2% Triton X-100 (Sigma, St. Louis, MO, USA) 용액으로초음파처리하여세포를분리하고 96-well로옮겼다. ELISA reader (Benchmark Plus; BiO-RAD, Hercules, CA, USA) 를이용하여 405 nm 파장에서흡광도 (optical density) 를측정하여 ALP 활성도를평가하였다 (n=15). 5) 칼슘양평가 MC3T3-E1 세포를 1 10 4 개 /ml의농도로희석하여시편위에 1 ml씩분주하고 1, 2, 3주간배양하였다. 배양이끝나는시점에서세포를분리하여 Calcium Assay Kit (Quantichrom TM Calcium Assay Kit DICA-500, Bioassay System) 를사용하여 612 nm 파장에서 ELISA reader를이용하여흡광도를측정하였다 (n=15). 6) 통계처리접촉각측정, ALP 활성도평가, 칼슘양평가결과는그룹별유의성을검증하기위해 one-way ANOVA로통계처리하였다. 통계처리는 SPSS software ver. 12.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 을사용하였다. 모든분석은 95% 신뢰수준에서시행되었다. 결과 1. 표면접촉각측정 Table 2는접촉각을평가한결과이다. 그결과, (60.6 o ± 2.1 o ), (30.1 o ±1.7 o ), (16.9 o ±4.0 o ), + 100 (8.6 o ±3.0 o ), + 150 (7.5 o ±2.5 o ), + 200 (11.9 o ±3.3 o ), + 250 (19.6 o ±3.8 o ) 이었다. + 100과 + 150은유의하게낮은접촉각을나타내었다 (p<0.05). 그러나 + 200과는유의한차이가없었다 (p>0.05). 2. 세포부착관찰 Fig. 1은시편위의세포부착모습을주사전자현미경을통해관찰한이미지이다. 연마처리한 시편에서는납작한모양으로세포가붙어있는모습을관찰할수있었으나 (Fig. 1A), 표면처리된실험군에서는세포의모양이시편을따라좀더길게뻗어있으며강하게부착하고있음을보였다 (Fig. 1B 1G). 72
강민경ㆍ배성숙 하이드록시아파타이트 이산화티탄 표면의 생체적합성 평가 Fig. 1. Scanning electron microscope image of MCT3-E1 cells adhered to the modified titanium after 4 hours ( 500; inset, 50,000). (A), (B), (C), (D) 100, (E) 150, (F) 200, and (G) 250. Refer to Table 1 for defintion of each abbreviation. Table 3. The Alkaline Phosphatase (ALP) Activities of the MC3T3-E1 Cells on the Modified Titanium after the 1, 2, and 3 Weeks Culture Time Group 100 150 200 250 ALP activity (IU/L) 1 Week 2 Week 3 Week 0.23±0.1 0.48±0.1 0.60±0.4 1.47±1.0 4.31±2.3 3.05±2.0 0.54±0.2 2.28±0.2 2.00±0.6 1.04±0.9 3.02±2.0 2.82±1.9 1.61±0.7 4.51±3.0 4.10±2.9 2.00±0.3 4.34±2.0 3.64±0.5 0.50±0.3 1.89±1.0 1.14±0.6 Values are presented as mean±standard deviation. Refer to Table 1 for defintion of each group. 3. ALP 활성도 평가 ALP 활성 측정 결과는 Table 3에 나타내었다. 세포 배양 1주 뒤의 결과는 다음의 순서와 같았다: 200 (2 IU/L) 150 (1.61 IU/L) (1.47 IU/L) 100 (1.04 IU/L) (0.54 IU/L) 250 (0.5 IU/L) (0.23 IU/L). 그러나 모든 실험 군간 유의한 차이는 없었다(p 0.05). 그리고 2주와 3주 뒤 ALP 활성 평가 결과는 다음의 순서와 같았다: Table 4. Calcium Concentration of MC3T3-E1 Cells on the Modified Titanium after the 1, 2, and 3 Weeks Culture Time Group 100 150 200 250 Calcium concentration (mg/dl) 1 Week 2 Week 3 Week 0.27±0.1 0.48±0.1 0.59±0.1 0.75±0.4 1.31±0.6 1.49±0.5 0.52±0.1 0.98±0.2 1.06±0.3 0.73±0.1 1.23±0.4 1.52±0.7 0.79±0.2 1.44±0.4 2.30±0.6 0.93±0.3 1.53±0.5 2.16±1.0 0.48±0.1 1.20±0.5 1.47±0.1 Values are presented as mean±standard deviation. a~c The same letters showed no significant differences (p 0.05). Refer to Table 1 for defintion of each group. 150 (4.51, 4.1 IU/L) 200 (4.34, 3.64 IU/L) (4.31, 3.05 IU/L) 100 (3.02, 2.82 IU/L) 250 (1.89, 1.14 IU/L) (2.28, 2 IU/L) (0.48, 0.6 IU/L). 그러나 이 역시 그룹 간 유 의한 차이는 없었다(p 0.05). 150 과 200은 1, 2, 3주 모든 기간에 있어 가장 높은 ALP 활 성도를 나타내었다. 73
J Dent Hyg Sci Vol. 16, No. 1, 2016 4. 칼슘양평가 Table 4는세포분화능을평가하기위해칼슘양을평가한결과이다. 1주뒤칼슘의양은다음의순서로증가하였다 : (0.27 mg/dl)<+ 250 (0.48 mg/dl)< (0.52 mg/dl)<+ 100 (0.73 mg/dl)< (0.75 mg/dl)<+ 150 (0.79 mg/dl)< + 200 (0.93 mg/dl)., + 150, 그리고 + 200은 보다유의하게높은칼슘양을나타내었다 (p<0.05). 그러나세그룹간에는유의한차이가없었으며 (p>0.05),, + 100, 그리고 + 250 그룹간에도역시유의한차이가없었다 (p> 0.05). 2주와 3주뒤에는다음의순서로칼슘의양이증가하였다 : (0.48 mg/dl)< (0.98 mg/dl)<+ 250 (1.2 mg/dl)<+ 100 (1.23 mg/dl) < (1.31 mg/dl)<+ 150 (1.44 mg/dl) <+ 200 (1.53 mg/dl) and (0.59 mg/dl) < (1.06 mg/dl)<+ 250 (1.47 mg/dl) < (1.49 mg/dl) <+ 100 (1.52 mg/dl) <+ 200 (2.16 mg/dl)<+ 150 (2.3 mg/dl). + 150과 + 200은유의하게높은칼슘양을나타내었다 (p>0.05). 그리고 + 150과 + 200은 1 3주간가장높은칼슘양을나타내었다. 고찰 골융합은임플란트치료의성공을위해중요한요소이다. 따라서빠르고우수한골융합을위한임플란트표면처리연구는현재까지활발히진행되고있다. 임플란트표면처리에있어표면거칠기를증대시키고칼슘포스페이트와같은골전도성물질을코팅하는것은골융합을향상시킬수있다고보고되고있다 2,3). 선행연구에서하이드록시아파타이트입자를블라스팅방법으로처리한뒤양극산화방법으로처리하여하이드록시아파타이트 이산화티탄복합층을형성하였다. 그리고표면을평가한결과블라스팅처리로인해표면은약 1 m의높은거칠기를가지면서코팅층과티타늄은높은결합력을보였다. 또한양극산화처리로인해높은부식저항성을보여물리적기계적성질이블라스팅또는양극산화처리만따로하였을때보다향상되었음을관찰할수있었다 11). 이번연구의목적은하이드록시아파타이트블라스팅처리후양극산화처리하여이복합표면층의생체적합성을생체외 (in vitro) 평가하는데있다. 생체적합성을평가하기에앞서접촉각평가를시행하였다. 접촉각은표면의에너지를의미하며세포의부착및활동에있어매우밀접한관련이있다 12). 접촉각측정결과에서는 (Table 2), + 100과 + 150에서다른실험군과비교하여접촉각이유의하게낮아 (p<0.05), 친수성을가졌다. 표면의접촉각은표면의화학적성분뿐만아니라마이크로단위의표면구조등표면의형상역시영향을미치게된다. 특히, 다공성표면구조는다공성구조내부로물방울이퍼져들어가접촉각을감소시킬수있으며, 표면의칼슘과인과같은성분은수화작용을촉진시키게되므로그결과접촉각을감소시킬수있다 13,14). Park 등 15) 의연구에서도표면에칼슘과인을함유하면서마이크로단위표면을갖는실험군에서대조군에비해접촉각이작게관찰되었다. 따라서이번연구에서도복합표면처리된실험군의접촉각을감소시키는데성분과구조가모두영향을미쳤을것이라생각된다. 임플란트표면의친수성성질은세포의증식에영향을미칠뿐만아니라프로트롬빈과같은혈액성분흡착에도움을주어초기골융합에있어중요한영향을미치게된다 16). 시편에부착한세포의양상을주사전자현미경으로관찰한결과 (Fig. 1), 연마처리만한 시편을제외한모든실험군위에서의세포의모습은시편을따라길게뻗은모습을관찰할수있었다. 즉, 시편에서보다표면을변형시킨시편에서세포에서더많은 filopodia가관찰되며더욱활발한세포의움직임을추측할수있었다. 이러한세포부착양상은표면의성분, 거칠기, 젖음성과같은표면의물리화학적성질이영향을미쳤을것이라고생각된다. 보다표면처리된시편모두친수성성질을가지므로즉, 친수성일수록표면에너지가높아세포의부착된모습이좀더활동적인양상을띠게된것으로보인다. 표면위의세포부착양상은세포와재료간의상호작용을통해이루어지며뒤로이어지는세포의증식및분화도단계에서도영향을미치게된다. 따라서표면의생체적합성을평가하는데있어세포의부착양상은중요한첫번째단계가된다 17). 세포의분화능을평가하기위해 ALP 활성도를측정하였다. ALP는세포막에붙어있는효소로골모세포의분화능을평가하기위해많은연구에서 ALP 활성도를측정하였다 17-21). 그중 Boyan 등 20) 은표면의거칠기가증가할수록높은 ALP 활성도를나타내었다고보고하였다. 이번연구에서도선행연구에서표면거칠기가가장컸던 + 150과 + 200에서가장높은 ALP 활성도를나타내었지만유의한차이가없었다 (p>0.05). 활성도는 1주에서 2주사이는증가하였지만, 2주에서 3주사이는증가하지않는것 74
강민경ㆍ배성숙 : 하이드록시아파타이트 이산화티탄표면의생체적합성평가 으로나타났다. 이는 Giordano 등 22) 의연구경향과일치하였으며, 이는골모세포의분화순서에따라초기 1 2주간은 ALP 활성도가증가되고 2 3주차때에는골모세포가점차성숙됨에따라석회화를위한 osteocalcin이분비되면서그양이감소되기때문이다 23,24). 따라서 ALP 활성도는세포분화도초기단계에있어중요한지표가된다. 이어세포분화도를측정하기위해칼슘양을측정하였다. 그결과 + 150과 + 200에서모든기간동안높은칼슘양을나타내었다. 칼슘의침착량은골모세포의분화순서에서따라최종적인석회화단계를대표할수있다 25,26). Chehroudi 등 27) 은칼슘의침착량은표면의거칠기뿐만아니라요철구조와같은표면의형상역시영향을미칠수있다고보고하였다. 따라서블라스팅처리와양극산화방법은표면의거칠기를증대시킬뿐만아니라다공성구조를형성할수있어칼슘침착에있어큰영향을미칠수있었을것이라생각된다. 이번실험에서는임플란트표면처리로블라스팅처리후양극산화복합처리를통해표면에너지가높고세포활성도가우수한표면을제작할수있었다. 그러나임플란트재료로서효과와안정성을입증하기위해서는세포독성및생체적합성에대한추가적인생체 (in vivo) 실험도추가적으로수행되어야할것이다. 요약 이번연구의목적은하이드록시아파타이트를이용하여블라스팅처리한뒤양극산화방법을이용하여하이드록시아파타이트와이산화티탄이복합된표면을만들고, 이에대해세포부착양상을관찰하고 ALP 활성도와칼슘침착량을측정함으로써세포분화능을평가하여표면의생체적합성을평가하는데있다. 이를위해실험을진행한결과다음과같은결과를얻었다. 접촉각분석결과, 복합처리된 +100과 + 150은유의하게낮은접촉각을나타내었다 (p<0.05). 세포부착관찰결과연마처리한 시편에서는납작한모양으로세포가붙어있는모습을관찰할수있었으나, 표면처리된실험군에서는세포의모양이시편을따라좀더길게뻗어부착된모습을관찰할수있었다. ALP 활성도측정결과 + 150과 + 200은 1, 2, 3주모든기간에서가장높은 ALP 활성도를나타내었다 (p>0.05). 칼슘양측정결과 + 150 과 + 200은 1, 2, 3 주모든기간에서가장많은칼슘양을나타내었다 (p< 0.05). 따라서하이드록시아파타이트 이산화티탄이복합코팅된표면은높은표면에너지를가지며우수한세포활성도를나타내어치과용임플란트표면으로유용하게사용될수있을것이라고생각된다. References 1. Han JH, Kim KE: Comparion of expectation and satisfaction of implant patients in pre-post implant therapy. J Dent Hyg Sci 11: 121-127, 2011. 2. Liu X, Chu PK, Ding C: Surface modification of titanium, titanium alloys, and related materials for biomedical applications. Mater Sci Eng R-Rep 47: 49-121, 2004. 3.Coelho PG, Granjeiro JM, Romanos GE, et al.: Basic research methods and current trends of dental implant surfaces. J Biomed Mater Res B Appl Biomater 88: 579-596, 2009. 4. Le Guéhennec L, Soueidan A, Layrolle P, Amouriq Y: Surface treatments of titanium dental implants for rapid osseointegration. Dent Mater 23: 844-854, 2007. 5. Ishikawa K, Miyamoto Y, Nagayama M, Asaoka K: Blast coating method: new method of coating titanium surface with hydroxyapatite at room temperature. J Biomed Mater Res 38: 129-134, 1997. 6. Kang MK, Moon SK, Kim KN: An evaluation of antibacterial titanium surface for dental implant. J Dent Hyg Sci 11: 405-410, 2011. 7. O'Hare P, Meenan BJ, Burke GA, Byrne G, Dowling D, Hunt JA: Biological responses to hydroxyapatite surfaces deposited via a co-incident microblasting technique. Biomaterials 31: 515-522, 2010. 8. Ishizawa H, Ogino M: Formation and characterization of anodic titanium oxide films containing Ca and P. J Biomed Mater Res 29: 65-72, 1995. 9. Yang B, Uchida M, Kim HM, Zhang X, Kokubo T: Preparation of bioactive titanium metal via anodic oxidation treatment. Biomaterials 25: 1003-1010, 2004. 10. Ishizawa H, Ogino M: Characterization of thin hydroxyapatite layers formed on anodic titanium oxide films containing Ca and P by hydrothermal treatment. J Biomed Mater Res 29: 1071-1079, 1995. 11. Kang MK, Moon SK, Kwon JS, Kim KM, Kim KN: Characterization of hydroxyapatite containing a titania layer 75
J Dent Hyg Sci Vol. 16, No. 1, 2016 formed by anodization coupled with blasting. Acta Odontol Scand 72: 989-998, 2014. 12. Elias CN, Oshida Y, Lima JHC, Muller CA: Relationship between surface properties (roughness, wettability and morphology) of titanium and dental implant removal torque. J Mech Behav Biomed Mater 1: 234-242, 2008. 13. Bico J, Thiele U, Quéré D: Wetting of textured surfaces. Colloids Surf A 206: 41-46, 2002. 14. Zhu X, Chen J, Scheideler L, Reichl R, Geis-Gerstorfer J: Effects of topography and composition of titanium surface oxides on osteoblast responses. Biomaterials 25: 4087-4103, 2004. 15. Park JW, Jang JH, Lee CS, Hanawa T: Osteoconductivity of hydrophilic microstructured titanium implants with phosphate ion chemistry. Acta Biomater 5: 2311-2321, 2009. 16. Macak JM, Tsuchiya H, Ghicov A, et al.: TiO2 nanotubes: self-organized electrochemical formation, properties and applications. Curr Opin Solid State Mat Sci 11: 3-18, 2007. 17. Anselme K: Osteoblast adhesion on biomaterials. Biomaterials 21: 667-681, 2000. 18. Beck GR: Inorganic phosphate as a signaling molecule in osteoblast differentiation. J Cell Biochem 90: 234-243, 2003. 19. Kieswetter K, Schwartz Z, Hummert TW, et al.: Surface roughness modulates the local production of growth factors and cytokines by osteoblast-like MG-63 cells. J Biomed Mater Res 32: 55-63, 1996. 20. Boyan BD, Batzer R, Kieswetter K, et al.: Titanium surface roughness alters responsiveness of MG63 osteoblast-like cells to 1,25-(OH) 2D 3. J Biomed Mater Res 39: 77-85, 1998. 21. Lee SI: The role of NFATC1 on osteoblastic differentiation in human periodontal ligament cells. J Dent Hyg Sci 15: 488-494, 2015. 22. Giordano C, Sandrini E, Busini V, et al.: A new chemical etching process to improve endosseous implant osseointegration: In vitro evaluation on human osteoblast-like cells. Int J Artif Organs 29: 772-780, 2006. 23. Le Guehennec L, Lopez-Heredia MA, Enkel B, Weiss P, Amouriq Y, Layrolle P: Osteoblastic cell behaviour on different titanium implant surfaces. Acta Biomater 4: 535-543, 2008. 24. Lian JB, Stein GS: Concepts of osteoblast growth and differentiation: basis for modulation of bone cell development and tissue formation. Crit Rev Oral Biol Med 3: 269-305, 1992. 25. Beck GR: Inorganic phosphate as a signaling molecule in osteoblast differentiation. J Cell Biochem 90: 234-243, 2003. 26. Anderson H: Matrix vesicles and calcification. Curr Rheumatol Rep 5: 222-226, 2003. 27. Chehroudi B, McDonnell D, Brunette DM: The effects of micromachined surfaces on formation of bonelike tissue on subcutaneous implants as assessed by radiography and computer image processing. J Biomed Mater Res 34: 279-290, 1997. 76