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의학과박사학위논문 아토피피부염에서기저막결함과 재생잠재능력의감소 2017 년 2 월 서울대학교대학원 의학과피부과학전공 신정원

아토피피부염에서기저막결함과 재생잠재능력의감소 지도교수박경찬 이논문을신정원박사학위논문으로제출함 2016 년 10 월 서울대학교대학원 의학과피부과학전공 신정원 신정원의박사학위논문을인준함 2017 년 1 월 위 원 장 ( 인 ) 부위원장 ( 인 ) 위 원 ( 인 ) 위 원 ( 인 ) 위 원 ( 인 )

Defective basement membrane and decreased regenerative potential in atopic dermatitis by Jung Won Shin, M.D. (Directed by Kyoung Chan Park, M.D.,Ph.D.) A thesis submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of doctor of Medicine (Dermatology) in Seoul National University, Seoul, Korea Doctorial committee: Professor Professor Chairman Vice Chairman Professor Professor Professor

국문초록 아토피피부염에서기저막결함과 재생잠재능력의감소 배경 : 아토피피부염은피부장벽이상과면역조절이상으로인해생기는대표적인 만성염증성피부질환이다. 아토피피부염의발생에는 Th2 면역반응이중요한데, 특히 IL-13 은주요 Th2 cytokine 중하나로아토피피부염의급성병변뿐 아니라만성병변에서도발현되는것으로알려져있다. 아토피피부염에서는 IL- 13 에의해자극받은각질형성세포가분비하는기질단백분해효소 (matrix metalloproteinase, MMP)-9 이염증유발에중요한역할을할것이라고생각된다. MMP-9 은기저막의주요구성성분인 type IV collagen 을분해할수있어 기저막의결함을유도할수있는데, 아토피피부염에서기저막의이상에대해서는 아직까지깊게연구된바없다. 또한기저막은표피줄기세포의 niche 역할을 하므로기저막이손상되면표피줄기세포에변화가있을것으로기대되나이에 대한연구는시행된바없다. 연구목적 : 본연구에서연구자들은아토피피부염에서의기저막이상과 줄기세포능의변화에대해밝히고이러한변화를정상피부및대표적인만성

피부질환중하나인화폐상습진과비교하고자하였다. 또한현재까지표피의 줄기세포를나타낼수있는특이한표지자가없으므로줄기세포만을감별해낼수 있는특이한표지자를발굴하여아토피피부염조직에적용해보고자하였다. 방법 : 열개의아토피피부염조직과네개의화폐상습진조직, 여섯개의 정상피부조직을얻어연구에이용하였다. Type IV collagen 과 integrin α6, involucrin 과 filaggrin, p63 에대해면역조직화학염색을시행하여기저막의상태, 표피분화정도, 표피줄기세포능에대해각각평가하였다. 또한 IL-13 을처리한 인공피부모델을제작하여역시위의표지자에대해면역조직화학염색을시행하여 IL-13 이피부에미치는영향을평가하였다. 추가실험에서는열다섯개의 아토피피부염조직과열한개의정상조직을얻어 HDAC1 과 p63 에대해동시에 면역형광염색을시행하여 p63 양성 /HDAC1 음성인세포의비율을각군간에 비교하였다. 결과 : Type IV collagen 과 integrin α6 는아토피피부염의기저막에서화폐상 습진이나정상피부와비교하였을때유의하게발현이감소하였다. Filaggrin 발현이나 p63 의발현역시아토피피부염에서다른군에비해현저히감소하였다. 인공피부모델에서도 IL-13 을첨가했을때대조군에비해위의표지자들의발현이 현저하게감소하는양상을보였다. 추가실험에서표피줄기세포의좀더특이한

표지자로생각되는 p63 양성 /HDAC1 음성세포의비율이아토피피부염에서 정상피부에비해현저히감소해있었다. 결론 : 아토피피부염에서는기저막의결함이있으며줄기세포가감소해있다. IL- 13 은이러한기저막의결함을일으키는데중요한역할을할것이라고생각된다. 기저막의결함은줄기세포가생존하는환경의변화를일으켜줄기세포수를 감소시킬것으로생각되며이는아토피피부염환자들이피부재생이더디고만성 재발성경과를가지는것과연관될수있다. 주요어 : 아토피피부염, IL-13, 기저막, 줄기세포능, HDAC1, p63, type IV collagen 학번 : 2012-30512

목차 I. 서론 ------------------------------ 1 II. 대상및방법 -------------------------- 4 III. 결과 ------------------------------ 13 1. 아토피피부염과화폐상습진의조직학적소견 ------ 13 2. 아토피피부염에서기저막의결함 -------------- 13 3. 아토피피부염에서표피분화의결함 -------------- 17 4. 아토피피부염에서줄기세포표지자의감소 ---------- 18 5.IL-13 을처리한인공피부모델의배양 ---------- 18 6. 인공피부모델의면역조직화학염색 -------------- 20 7. 아토피피부염에서 HDAC1 과 p63 의동시발현패턴 -- 23 IV. 고찰 -------------------------- 27 V. 결론 -------------------------- 34 참고문헌 ------------------------------ 35 영문초록 ------------------------------ 38

List of Tables Table 1. Clinical information of atopic dermatitis and nummular eczema in experiment 1 ----------------------------------------------------------------------------------------- 5 Table 2. Clinical information of atopic dermatitis in experiment 2 -------------------- 10 Table 3. Comparison of mean staining intensity between three groups --------------- 16

List of Figures Figure 1. Expression of type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, and p63 in atopic dermatitis, chronic nummular eczema, and normal skin ------------ 15 Figure 2. Staining intensity of immunohistochemical markers for basement membrane in normal control, nummular eczema, and atopic dermatitis --------------- 16 Figure 3. In vitro effect of IL-13 on cells and skin equivalent (SE) ------------------ 19 Figure 4. Decreased type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, and p63 staining in IL-13 treated skin equivalent (SE) ------------------------------- 22 Figure 5. HDAC1 and p63 expressions in normal skin and atopic dermatitis ------ 25 Figure 6. Percentage of p63 positive/ HDAC1 negative cells to the total epidermal cells in normal control and atopic dermatitis --------------------------------------- 26 Figure 7. Possible role of IL-13 in atopic dermatitis ----------------------------------- 33 _

서론 아토피피부염은산업이발달하고서구화된나라에서더욱흔하게나타나는대표적인만성습진성질환으로우리나라에서도큰증가추세를보이고있다. 아토피피부염의중요한두병인으로는 비정상적인면역반응 과 피부장벽이상 이받아들여지고있으며이두가지요인이상호복합적으로작용하여 아토피피부염을발생, 유지시키는것으로알려져있다. 1-4 비정상적인면역반응의 경우 Th1 과 Th2 아형을모두포함하는 skin-infiltrating CD4+ T cell 이작용하는데, Th2 반응은주로아토피피부염의급성병변의발생에중요한역할을하며 Th1 반응은만성병변의유지에주로작용한다. 5, 6 Th2 cytokine 에는 interleukin (IL)-4, IL-5, IL-13, IL-31 등이속해있고, 이중 IL-13 은 알레르기성염증반응의중요한매개물질로알려져있다. 7 다른 Th2 cytokine 들이 주로아토피피부염의급성병변에서만발현되는반면에 IL-13 은급성, 만성 병변에서모두발현된다. 8, 9 IL-13 은이전의연구에서표피의각질형성세포로부터 피부의염증반응에중요한역할을하는 matrix metalloproteinase (MMP)-9 의 형성을유도함이밝혀졌다. 10 이연구에서는배양한각질형성세포에 IL-13 을 처리했을때 MMP-9 의생성이유의하게증가하였으며 CD4+ T 림프구가이동하여염증이유발됨을보여주었다. 또한정상피부조직에 IL-13 을처리하면표피에 MMP-9 의발현이증가함을면역조직화학염색을통해증명하였다. 실제로한연구에서아토피피부염환자피부병변에서의 MMP-9 의발현이비병변부나정상인의피부에서보다유의하게증가되어있다고보고한바있다. 11 MMP-9 은 type IV collagen 을포함하는세포외기질 (extracellular matrix) 을분해할수 1

있는데, type IV collagen 은피부의기저막의주요구성성분이므로아토피피부염에서기저막의결함이나타날수있는이론적인근거가된다. 12 하지만현재까지아토피피부염에대한연구에서기저막에초점을두거나기저막의결함에대해밝힌연구는없었다. 또하나의병인은피부장벽이상인데, 아토피피부염에서는피부장벽에서견고한 벽돌의역할을수행하는필라그린이감소되어있음이잘알려져있다. 13 장벽기능의 감소는외부알레르겐의체내침투를증가시켜알레르기반응을유발하고수분소실을일으켜건조피부가유발됨으로써아토피피부염이발병하게된다. 최근피부기저막은진피-표피접합부위 (dermal epidermal junction, DEJ) 상호작용을조절함으로써피부의형성과항상성유지, 분화등에중요한역할을한다고보고된바있다. 14 앞서언급되었듯이피부장벽기능은표피의분화와밀접한관련이있는데, 따라서기저막의이상은피부장벽기능이상에서가장대표적으로잘알려진필라그린발현의감소와도이론적으로맞닿아있다. 실제로한연구에서 DEJ 의구성성분인 heparan sulfate 가결핍된인공피부모델을만들어봤을때필라그린의발현이저해된것을관찰하여보고하였다. 14 또한이전의다른연구에서는 MMP-2, MMP-9 과 urokinase-type plasminogen activator 가기저막의형성과표피분화를모두억제함을보고한바있었다. 15 앞서기술했듯이기저막의결함은아토피피부염의가장중요한병인으로알려져있는비정상적인면역반응이나피부장벽기능의이상과이론적으로잘맞닿아있음에도현재까지 기저막의결함 의관점에서아토피피부염에대해접근한연구는없었다. 이번연구에서는아토피피부염의기저막상태에대해밝히고정상피부나다른만성습진과는어떠한차이가있는지알아보고자한다. 또한기저막의기능과관련된다른요소들의변화도관찰하고자한다. 특히기저막은 2

표피줄기세포의 niche 역할을하며줄기세포의생존과활동에큰영향을미치는것으로알려져있다. 16 위에서언급한내용을토대로아토피피부염에서기저막의손상이있다면표피줄기세포의수나기능도떨어져있으리라고생각할수있다. 따라서줄기세포가감소되어있다면재생능력이감소되어있고, 이것이아토피피부염이만성재발성경과를보이며피부회복이느린현상을설명할수있는하나의이론적근거가될수있을것으로생각된다. 이번연구에서는아토피피부염이있는피부의표피줄기세포상태에대해서도관찰하고자하였다. 현재까지표피의줄기세포에대한표지자로가장널리사용되는것이 p63 인데 p63 으로정상표피를염색해보면표피의상층까지광범위하게염색되며줄기세포로보기에는너무많은세포들이염색되어줄기세포에대한특이한표지자로사용되기에는한계가있다. 따라서본연구에서는 p63 과함께표피의줄기세포를나타낼수있는특이한표지자를발굴하여아토피피부염조직에적용해보고자한다. 3

대상및방법 실험 1 임상조직 (Clinical sample) 열명의아토피피부염과네명의화폐상습진 (nummular eczema), 그리고여섯 명의정상대조군의피부조직을얻었다. 아토피피부염은진단기준에따라 가려움증을동반한만성재발성습진이특징적인부위에분포하고 (2 세이하에서 주로얼굴, 몸통, 팔다리의폄부위에존재 / 2 세이상에서얼굴과목, 팔다리의 접히는부분에존재 ) 전체적으로건조한피부를가지며, 아토피질환 ( 아토피피부염, 천식, 알레르기비염 ) 의병력혹은가족력이있는등의특징적인 증상이있을때진단하였다. 반면화폐상습진은위에언급된증상없이주로 사지의폄쪽에주변피부와경계가잘구분되는원형의습진성판이산재해있을 때진단하였다. 평균연령은아토피피부염환자에서 17.20±15.42 세, 화폐상 습진에서 42.50±21.21 세로조사되었다. 나이, 성별, 조직채취부위와조직학적 결과는 Table 1 에정리하였다. 4

Table 1. Clinical information of atopic dermatitis and nummular eczema in experiment 1 Group Number Sex Age Biopsy site Pathologic diagnosis 1 M 2 Trunk Acute spongiotic dermatitis 2 M 7 Lower leg Subacute spongiotic dermatitis 3 M 7 Abdomen Subacute spongiotic dermatitis 4 F 13 Buttock Chronic psoriasiform dermatitis Atopic dermatitis 5 F 13 Arm Subacute spongiotic dermatitis 6 M 22 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 7 M 49 Flank Chronic psoriasiform dermatitis 8 M 2 Abdomen Subacute spongiotic dermatitis 9 M 37 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 10 M 20 Thigh Chronic psoriasiform dermatitis 1 F 56 Ankle Chronic psoriasiform dermatitis Nummular eczema 2 M 15 Knee Chronic psoriasiform dermatitis 3 F 62 Buttock Chronic psoriasiform dermatitis 4 M 37 Leg Chronic psoriasiform dermatitis 임상조직의면역조직화학염색 10% 중성포르말린고정, 파라핀에포매한조직으로통상적인면역조직화학적 검색인 streptavidin-biotin peroxidase 검색법 (LSAB, Dako) 을시행하였다. 파라핀포매된조직은 HistoChoice Clearing Agent (Amresco, solon, OH, 5

USA) 를이용하여탈파라핀시킨후순차적으로희석시킨알코올을처리하여다시 수화시켰다. Type VI collagen 염색을위해 proteinase K (Roche Applied Science, Penzberg, Germany) 를이용하여항원 retrieval 을시행하였으며, 다른 항체들을위해서는 Trilogy solution (Cell Marque, Rocklin, CA, USA) 과 압력솥을이용하여열항원 retrieval 을시행하였다. 내인성과산화효소 (peroxidase) 의활성을억제하기위해 0.3% hydrogen peroxide 를 10 분간 처리하고비특이적단백결합을막기위해 Animal-Free Blocker (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) 를처리하였다. 일차항체는 type IV collagen (239M-16, Cell Marque), involucrin (#I9018, Sigma, St. Louis, MO); integrin α6 (sc-6597, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p63 (4A4; sc-8431, Santa Cruz Biotechnology), and filaggrin (BT576, Biomedical Technologies, Stoughton, MA, USA) 을이용하였다. 일차항체를실온에서하룻밤 동안반응시킨다음 HRP 가결합된 anti-mouse/rabbit IgG antibody (DAKO, Glostrup, Denmark) 혹은 anti-goat IgG antibody (Vector laboratories) 를 2 차항체로반응시켰다. 이후 AEC Single Solution (ASS-125, SPRING Bioscience, Pleasanton, CA, USA) 을이용하여발색하고 10% Mayer s hematoxylin 으로대조염색을한후광학현미경으로관찰하였다. 6

각항체에대한염색도의판정은이전연구에서시행했던방법에따라 17 0 점에서 5 점까지점수를매겼다 (0 = 전혀염색되지않음, 1 = 매우약하게염색됨, 2 = 약하게염색됨, 3 = 뚜렷하게염색됨, 4 = 강하게염색됨, 5 = 매우강하게 염색됨 ). 인공피부모델의제작과 IL-13 의처리 사람의포피에서분리된각질형성세포와섬유모세포를이용하여일차배양을 시행하였다. 18 각질형성세포는 serum-free KGM (keratinocyte growth medium, CC-3111, Lonza, Walkersville, MD, USA) 에서배양하였고섬유모세포는 10% fetal bovine serum (FBS; Thermo Scientific HyClone, Logan, UT, USA) 이 보강된 Eagle s medium (DMEM; LM001-05, WelGENE, Daegu, South Korea) 에서배양하였다. Cell Counting Kit-8 (CCK-8; CK04, Dojindo, Kumamoto, Japan) 를이용하여재조합인체 interleukin-13 (hil-13; 213-IL, R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) 의세포독성을농도별로 (0.5-100 ng/ml) 처리하여관찰하였다. 세포의활성도를측정하기위해 CCK-8 용액을 넣고 37 C 에서 2 시간동안배양하였다. 세포내의탈수소효소의활성도에의해 생성되는수용성 formazan 의양을 SpectraMax Plus Microplate Reader (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) 로측정하였다. 7

인공피부모델은실험실에서통상적으로쓰는방법대로제작하였다. 18, 19 요약해 보면, 먼저쥐꼬리의힘줄에서 type I collagen 을추출하였다. 그후 type I collagen 용액, 열배농축된 DMEM/F12 (DMEM and Ham s nutrient mixture F12 at a ratio 3:1; Invitrogen GIBCO, Grand Island, NY, USA), 중화완충제 buffer (0.05 N NaOH, 0.26 mm NaHCO3, and 200 mm HEPES from Sigma) 를 8:1:1 로섞어진피대체물 (dermal substitute) 을제작하고 5 10 5 섬유모세포를 첨가하였다. 진피대체물을 25 mm polycarbonate membrane insert 에겔화시킨 후각질형성세포 (1 10 6 cells) 를첨가하였다. 하루후공기 - 액체인터페이스 환경에노출하여 2 주간배양하였다. 배양액은 1 DMEM/F12 (DMEM and Ham s nutrient mixture F12 at a ratio 3:1; WelGENE) 와 5% FBS, 0.4μg/mL hydrocortisone (Sigma, St. Louis, MO, USA), 1 μm isoproterenol (Sigma), and 5μg/mL insulin (Sigma) 으로구성되었다. 저농도의 EGF (1ng/mL; Sigma) 는 액체환경의배양조건에첨가하고고농도의 EGF (10ng/mL) 는공기 - 액체 인터페이스배양조건에첨가하였다. 표피의층화를촉진시키기위해공기에노출 3 일후 6 일간아스코르빈산을첨가하였다. 배지는주 3 회교환하였으며모든 실험은같은조건에서최소두번씩반복시행하였다. 공기노출 9 일후에 IL-13 (1, 10, 50 ng/ml) 을처리하였고배지를갈때마다매번첨가하였다. 8

인공피부모델의조직학적관찰과면역조직화학염색 15 일후인공피부모델은 1% paraformaldehyde 와 0.1% glutaraldehyde 용액에 고정하였으며포매하여파라핀블록으로제작하였다. 3 µm 두께로절편을만들어 hematoxylin and eosin (H&E) 으로염색하였다. 면역조직화학염색은앞의임상조직을이용한염색과동일하게시행하였다. 염색성은 ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA) 를 이용하여정량적으로분석하였다. 통계분석 임상조직의면역조직화학염색의염색도에대한비교를위해통계분석을시행하였다. 비모수적인방법인 Kruskal-Wallis 검정을사용하여세그룹간의결과를 비교하였다. 그후 Kruskal-Wallis 에대한사후검정법이개발되어있지않기 때문에엄밀한방법은아니지만 Mann-Whitney U 검정을이용하여두그룹간의 결과를비교하였다. 통계프로그램은 SPSS (version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용하였으며 P 값이 0.05 미만일때통계적으로유의하다고판정하였다. 실험 2 임상조직 (Clinical sample) 9

열다섯명의아토피피부염환자의피부조직과열한명의정상대조군의피부조직을 얻었다. 아토피피부염은앞서실험 1 에서언급한바와같이특징적인임상증상이 있을때진단하였다. 나이, 성별, 조직채취부위와조직학적결과는 Table 2 에 정리하였다. 평균나이는아토피피부염에서 17.33±9.84 세, 대조군에서 15.18±7.37 세였다. Table 2. Clinical information of atopic dermatitis in experiment 2. Number Sex Age Biopsy site Pathologic diagnosis 1 M 19 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 2 M 21 Arm Subacute spongiotic dermatitis 3 M 19 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 4 F 4 Lower leg Acute spongiotic dermatitis 5 M 14 Lower leg Chronic psoriasiform dermatitis 6 F 6 Trunk Subacute spongiotic dermatitis 7 M 19 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 8 F 29 Thigh Chronic psoriasiform dermatitis 9 M 0 Trunk Acute spongiotic dermatitis 10 M 20 Thigh Chronic psoriasiform dermatitis 11 F 14 Arm Subacute spongiotic dermatitis 12 M 41 Arm Chronic psoriasiform dermatitis 13 M 18 Lower leg Chronic psoriasiform dermatitis 10

14 M 18 Trunk Chronic psoriasiform dermatitis 15 M 18 Arm Chronic psoriasiform dermatitis 임상조직의면역조직화학염색 10% 중성포르말린고정, 파라핀에포매한조직으로면역형광검사를시행하였다. 파라핀포매된조직은 HistoChoice Clearing Agent (Amresco, solon, OH, USA) 를이용하여탈파라핀시킨후순차적으로희석시킨알코올을처리하여다시 수화시켰다. Trilogy solution (Cell Marque, Rocklin, CA, USA) 과압력솥을 이용하여열항원 retrieval 을시행하였다. 내인성과산화효소 (peroxidase) 의 활성을억제하기위해 0.3% hydrogen peroxide 를 10 분간처리하고비특이적 단백결합을막기위해 normal goat(x0907, Dako, Carpinteria, CA, USA) 와 donkey (ab7475, Abcam, Cambridge, UK) serum 을사용하였다. 일차항체는 HDAC1(10E2), mouse monoclonal antibody (sc-81598, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), p63 (H-137) 와 rabbit polyclonal antibody (sc-8343, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 를 사용하였는데, 저자는이전연구에서이표지자들의조합이 p63 단독보다표피의 줄기세포를조금더특이하게표현할수있음을밝힌바있다 ( 아직게재되지않은 데이터임 ). 11

일차항체를실온에서하룻밤동안반응시킨다음 Alexa Fluorâ 488 goat antimouse IgG (A11001, Molecular Probes â, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 과 Rhodamine donkey anti-rabbit (sc-2095, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) 를 2 차항체로사용하여반응시켰다. DAPI (1 μg/ml, 10236276001, Roche, Indianapolis, Indiana, USA) 로핵을염색한후 Confocal Laser Scanning Microscope (CARL ZEISS, #LSM710, Jena, Germany) 를 이용하여촬영하고 ZEN 2011 microscope software (CARL ZEISS) 를이용하여 촬영된이미지를분석하였다. 통계분석 Mann-Whitney U 검정을사용하여두그룹간의결과를비교하였다. 통계 프로그램은 SPSS (version 18.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA) 를이용하였으며 P 값이 0.05 미만일때통계적으로유의하다고판정하였다. 12

결과 실험 1 아토피피부염과화폐상습진의조직학적소견 두질환모두표피에서극세포증 (acanthosis) 과다양한정도의과각화증 (hyperkeratosis) 이관찰되었으며일부의경우국소적인해면화소견이 관찰되었다. 진피에서는두질환에서모두염증세포의침윤을관찰할수있었다. 양군간의특별한조직학적차이는관찰되지않았다. 아토피피부염에서기저막의결함 기저막의상태를알아보기위해피부기저막의주성분인 Type IV collagen 발현을 관찰하였다. 여섯개의정상조직중네개에서기저막을따라 type IV collagen 이 연속성있게강하게발현되었다 (Fig.1A). 염색의강도를등급화했을때평균 값은 3.16±1.17 (Table 3) 이었다. 화폐상습진에서도 type IV collagen 은 기저막을따라강하게염색되었으며염색강도등급의평균값은 3.25±1.50 (Fig.1B, Table 2) 이었다. 반면아토피피부염조직에서는대부분에서 type IV collagen 이발현되지않았으며 (Fig.1C) 오직한조직에서매우약하게 염색되었다. 염색의강도를등급화했을때평균값은 0.10±0.32 로정상이나 13

화폐상습진과비교했을때통계적으로유의하게낮은수치를보였다 ( 각각 P <.001 and P =.002, Fig.2, Table 3). Integrin α6 는표피 - 진피접합부를따라분포하는세포외결합수용체이며 20 기저막의상태를알아보기위해염색하였다. 정상피부에서 integrin α6 는비교적 잘염색되었으며평균염색강도등급은 2.50±1.05 (Fig. 1D, Table 3) 로 측정되었다. 화폐상습진에서는대부분의조직에서 integrin α6 가강하게 염색되었으며평균염색강도등급은 2.50±1.05 (Fig.1E, Table 3) 이었다. 반면 아토피피부염에서는대부분의조직에서 integrin α6 가염색되지않았다. 평균 염색강도등급은 0.40±0.70 로화폐상습진이나정상피부에서보다유의하게낮은 결과를보였다 (P =.002) (Fig 2, Table 3). 14

Figure 1. Expression of type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, and p63 in atopic dermatitis, chronic nummular eczema, and normal skin. (immunoperoxidase stain; original magnifications: X 200.) 15

Figure 2. Staining intensity of immunohistochemical markers for basement membrane in normal control, nummular eczema, and atopic dermatitis. A, Type IV collagen. B, Integrin α6. * P <.05; ** P <.01 Table 3. Comparison of mean staining intensity between three groups Normal skin Nummular eczema Atopic dermatitis Type IV collagen 3.16 ± 1.17 3.25 ±1.50 0.1 ± 0.32 * α6 integrin 2.50 ± 1.05 4.25 ±0.96 0.40 ±0.70 * Involucrin 3.16 ± 0.75 1.5 ± 0.58 1.80 ±0.63 ** Filaggrin 2.83 ± 1.33 1.50 ±0.58 1.20 ± 1.03 p63 3.17 ± 2.04 4.25 ± 0.96 1.90 ± 1.10 * P <. 01 compared with normal skin and nummular eczema; ** P <. 01 compared with normal skin; P <. 05 compared with normal skin; P <. 01 compared with nummular eczema 16

아토피피부염에서표피분화의결함 Involucrin 은표피각질세포막의전구체이며표피분화를알수있는표지자중 하나이다. 21 정상피부에서는가시세포층의윗부분과과립층에 involucrin 이 발현되었다. 아토피피부염과화폐상습진에서는 involucrin 발현이감소되어있었다 (Fig.1G, H, I). 평균염색강도등급은아토피에서는 1.80±0.63, 화폐상 습진에서는 1.5±0.58 로측정되었으며정상피부와비교하여유의하게낮은수치를 보였다 ( 각각 P =.005, P =.019, Table 3). Filaggrin 은표피과립층에서 keratohyalin 과립을형성하는단백질인 profilaggrin 의형태로존재하다가, 각질형성세포의죄종분화과정에서 필라그린으로분해된후각질세포막을형성할때케라틴필라멘트를응집하여 각질세포의단단하고편평한구조를만듦으로써피부장벽에서견고한벽돌의 역할을수행하게된다. 22 정상피부에서 filaggrin 은표피의과립층에비교적잘 염색되는양상을보였다 (Fig.1J). 화폐상습진에서는강도는약하지만모든 조직에서 filaggrin 에대해염색이되었다 (Fig.1K). 아토피피부염에서는 filaggrin 이잘염색되지않거나매우약하게염색되는양상을보였다 (Fig.1L). 염색정도의평균등급은아토피피부염에서 1.20±1.03 로 2.83±1.33 인 정상피부조직에서보다유의하게낮았다 (P =.023, Table 3). 17

아토피피부염에서줄기세포표지자의감소 p63 은 p53 유전자군에속하며표피줄기세포의줄기세포표지자로널리쓰이고 있다. 23 p63 의발현은세군간에큰차이를보였다. 정상피부조직에서는 p63 이잘 발현되었고염색정도의평균값은 3.17±2.04 (Table 3) 로측정되었으며, 화폐상 습진에서도역시 p63 이잘발현되었고평균염색정도는 4.25±0.96 (Table 3) 로 측정되었다. 반면아토피피부염에서는 p63 이앞의두군에비해약하게 발현되었으며 (Fig.1) 평균염색정도는 1.90±1.10 로측정되어정상이나화폐상 습진에서보다유의하게낮은수치를보였다 (P =.008, Table 3). IL-13 을처리한인공피부모델의배양 섬유모세포와각질형성세포에 IL-13 의농도를 0.5ng/ml 부터 100ng/ml 까지 변화시키며 24 시간동안처리하여독성을평가하였다. 세포활성도를측정하였을때 섬유모세포와각질형성세포모두 100ng/ml 의농도까지세포독성을보이지않았다 (Fig.3A, B). IL-13 의농도를 1ng/ml, 10ng/ml, 50ng/ml 로변화시키면서인공피부모델에 처리해보았다. IL-13 을첨가하자농도에비례하여표피가편평해졌으며 기저층의입방형세포가점차사라지는양상을보았다. 세포독성검사에서 IL- 13 이 100ng/ml 까지독성을보이지않았으므로이것은 IL-13 의간접적인 18

영향으로생각할수있겠다. IL-13 을처리하지않은대조군과 50ng/ml 를처리한 모델을이용하여추가적인면역조직화학염색을시행하였다. Figure 3. In vitro effect of IL-13 on cells and skin equivalent (SE). A, Cytotoxicity of IL-13 on keratinocytes and fibroblasts. Cells were treated with increasing concentrations of IL-13 and incubated for 24 hr. Result is a mean of triplicate and a representative result from repeated experiments. B, C, E, Epidermal change after treatment with IL-13 in SE model. B, Control. C, IL-13 (1ng/ml) treated SE. D, IL-13 (10 ng/ml) treated SE. E, IL-13 (50 ng/ml) treated SE. 19

인공피부모델의면역조직화학염색 IL-13 이기저막상태에끼치는영향을알아보기위해 type IV collage 과 integrin α6 의발현양상을관찰하였다. IL-13 을첨가하지않은대조군 모델에서는 type IV collage 과 integrin α6 가표피 - 진피경계부를따라선상으로 확연하게발현되었다. 반면 IL-13 을처리한모델에서는위의표지자의발현이 확연하게감소하는양상을보였다 (Fig.4A). 염색정도를정량적으로측정하기위해 무작위로세개의영역을골라염색된부분의넓이가전체표피에서차지하는 비율을구하였다. 그결과, IL-13 을처리한모델에서 type IV collage 과 integrin α6 가발현되는비율이확연하게감소하는양상을보였다 (Fig.4B). 표피분화상태를평가하기위해 filaggrin 과 involucrin 을염색하여분석하였다. 무작위로택한세개의영역에서 filaggrin 과 involucrin 이염색된넓이를구하여 전체표피에서차지하는비율을구하였다. 그결과 IL-13 을처리한모델에서 대조군에비해위의표지자들의발현이확연하게감소하는양상을보였다 (Fig.4A, C). 표피의줄기세포표지자로흔히이용되고있는 p63 을이용하여 IL-13 이표피의 재생능력에미치는영향을평가하였다. p63 역시 IL-13 을처리하였을때 대조군에비해유의하게감소하였다. 무작위로택한세개의영역에서 p63 20

양성으로염색된세포의수는대조군모델에서 29.17/10 4 um 2 로측정되었으며, IL-13 을처리한모델에서는전혀관찰되지않았다 (Fig.4A). 21

Figure 4. Decreased type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, and p63 staining in IL- 13 treated skin equivalent (SE). A, Expression of type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, and p63 in control skin equivalent and IL-13 treated skin equivalent. (immunoperoxidase stain; original magnifications: X 200.) B, The mean ratio of positively stained area to total epidermal area for type IV collagen and integrin α6 in 3 randomly selected fields. C, The mean ratio of positively stained area to total epidermal area for involucrin and filaggrin in 3 randomly selected fields. 22

실험 2 아토피피부염에서 HDAC1 과 p63 의동시발현패턴 정상조직에서의 HDAC1 과 p63 의발현은이전의연구결과와비슷한양상을 보였다 ( 아직게재되지않은데이터 ). HDAC1 은표피전층에걸쳐염색되었지만 분화하는세포들이존재하는상층부에서가장강하게염색되었다 (Fig.5). 또한 기저층에는일부에서 HDAC1 이전혀발현되지않는세포들도존재하였다. 반면 p63 은기저층에서가장강하게발현되었다. 비록대부분에서 p63 이기저층뿐 아니라상층부까지염색되는양상을보였지만층이올라갈수록염색강도가 감소하며과립층에서는거의염색되지않는양상을보였다 (Fig.5). 각각염색된 그림을합쳐보았을때, 기저층에는 p63 양성 / HDAC1 음성의발현패턴을보이는 세포들이존재하였다 ( 흰화살표 ). 아토피피부염에서 HDAC1 의발현패턴은정상조직과약간차이가있었다. HDAC1 은표피전층에걸쳐염색되었으며상층부에서강하게염색되긴했지만 기저층에도강하게염색되는세포가존재하였으며전혀염색이되지않는세포는 매우드물었다 (Fig.5). p63 은정상조직과비교적비슷한양상으로발현되었는데, 정상조직보다강도는약하지만기저층에서강하게염색되었으며상층부로갈수록 염색강도가감소하였다 (Fig.5). 합쳐진그림에서 p63 양성 / HDAC1 음성의 23

발현패턴을보이는세포들이드물게존재하였으나정상조직에비해확연하게적은 수로관찰되었다 (Fig.5). 24

Figure 5. HDAC1 and p63 expressions in normal skin and atopic dermatitis. In a merged image, there was a minor subpopulation of cells with p63-positive/hdac1-negative staining pattern in the basal layer (white arrow) (green; HDAC1 staining, red; p63 staining, X200). 25

각조직에대해무작위로선택된세개의동일면적의표피에서표피전체세포에 대해 p63 양성 / HDAC1 음성세포가차지하는비율을구해보았을때 아토피피부염에서는 2.77±2.26%, 정상에서는 5.39 ± 2.50% 로통계적으로 유의하게 (P <0.001) 아토피피부염에서감소된양상을보였다 (Fig.6). Figure 6. Percentage of p63 positive/ HDAC1 negative cells to the total epidermal cells in normal control and atopic dermatitis. * P <.01 % * 26

고찰 아토피피부염의급성기에는 Th2 면역반응이우세한반면, 만성기에는 Th1 면역반응이주로작용하여조직학적으로는다른만성피부염과구분이어려운것이 사실이다. 5, 6 현재까지아토피피부염과다른종류의만성피부염을기저막의상태나 줄기세포능의관점에서비교한연구는없었다. 이번연구에서는아토피피부염에서 화폐상습진이나정상피부에비해 type IV collage 과 integrin α6 의발현이 유의하게감소되어있었다 (Fig1, 2). 이결과는아토피피부염에서표피 - 진피 경계부에결함이있을가능성을의미한다. 많은연구들을통해아토피피부염의초기발생에 Th2 면역반응이매우 중요하다는것이알려져왔다. 24-28 IL-13 은잘알려진 Th2 cytokine 중하나로 알레르기염증반응의중요한매개체이다. 7 잘알려진또다른 Th2 cytokine 인 IL-4 는아토피피부염의급성병변에서만발현되는반면, IL-13 은급성병변뿐 아니라만성병변에서도발현된다고밝혀져있다. 8, 9 이전의연구에서 IL-13 은 각질형성세포를자극하여 MMP-9 을생성하게하는데 MMP-9 은 type IV collagen 을분해하는작용을한다. 10 Type IV collagen 은기저막의주요 27

구성성분이기때문에이론적으로는 IL-13 은기저막의손상을야기할수있다. MMP-9 뿐아니라 MMP-2 에의해서도 type IV collagen 의손실이유발될수 있는데, 29 이전의한동물연구에서는 MMP-2 를억제하는 tissue inhibitor of metalloproteinase-2 (TIMP-2) 가만성습진의호전에도움을준다는것을밝힌 바있다. 30 이러한결과들은 MMP 가아토피피부염과같은만성습진의병태생리에 중요한역할을할수있음을의미한다. 최근기저막의결함이면역세포의표피로의 이동을촉진시킨다는것이밝혀졌다. 31 또한기저막은표피 - 진피상호작용을통해 피부형태형성 (morphogenesis) 과항상성유지, 분화에중요한역할을 한다. 14 분화의관점에서보면, 표피분화의중요표지자중하나인 filaggrin 의 발현이아토피피부염에서저하되어있음은잘알려져있는사실이다. 이번 연구에서도 filaggrin 의발현을비교해보았을때화폐상습진이나정상피부에 비해아토피피부염에서그발현이현저하게저하되어있는것을관찰할수있었다. Filaggrin 유전자의돌연변이가아토피피부염발생에중요한역할을한다고알려져 있으나실제로 filaggrin 유전자의돌연변이비율은, 특히아토피피부염의증상이 가벼울때는, 유병율에비해낮음이보고되어왔다. 32, 33 흥미롭게도폴란드에서 28

시행한한연구에의해 filaggrin 유전자의돌연변이가특정 IL-13 유전자의 다형성 (polymorphism) 과더해지면아토피피부염의발생위험을높일수있음이 밝혀졌다. 32 따라서 IL-13 은아토피피부염의발생에중요한인자로작용할수 있다고유추할수있겠다 다음단계로, 저자는아토피피부염에서재생능력을평가해보고자하였다. p63 은 p53 유전자군으로상피의발생에중심적인역할을하며표피줄기세포의표지자로 널리사용되고있다. 23 또한 p63 은기저층세포의기저막과의부착과생존을 조절할수있음이증명되었다. 34 본연구에서정상피부조직에서는 p63 이표피의 하단부에매우염색이잘되었다. 화폐상습진에서도 p63 은두꺼워진표피를따라 현저하게발현되었다. 반면아토피피부염에서는 p63 에양성으로염색된세포의 수가다른군에비해유의하게적었다 (Table 3). 이러한결과들을바탕으로같은 만성습진이라도줄기세포의활성도가화폐상습진에서는잘보존되어있는반면 아토피피부염에서는그렇지않다고유추할수있겠다. 위에서언급되었듯이 기저막의 type IV collagen 의발현이아토피피부염에서유의하게감소되어있고 이는표피줄기세포 niche 의장애를유발할수있다. 그결과아토피피부염에서는 29

줄기세포의기능이떨어져염증에의해손상된피부를재생시키기어려워지고이로 인해만성재발성경과를가지게된다고해석해볼수있겠다. 저자는첫번째 연구에서줄기세포를염색하기위해 p63 을이용하였다. p63 은표피의발생과 유지에중요한조절자로서현재까지표피줄기세포의표지자로 23, 35-38 흔히 사용되고있다. 하지만 p63 을이용하여표피를염색해보면흔히기저층의세포 뿐아니라상층부의세포까지염색이되는것을관찰할수있으며이는 p63 이 표피줄기세포에대한특이한표지자가아님을의미한다. 모낭의줄기세포 표지자는잘알려져있는반면 ( 마우스에서 CD 34 39, 사람에서 CD 200 40 ) 표피 줄기세포의표지자는아직잘확립되어있지않다. 저자는이전의연구에서 HDAC1 과 p63 염색의조합이표피줄기세포의표지자로유용하게사용될수 있을가능성에대해보고한바있다 ( 아직게재되지않은데이터 ). HDAC1 은주로 분화가이루어진표피바깥층에염색되며 HDAC1 이포함된핵복합체는세포가 분화를촉진하는신호를받아세포주기를영구적으로떠나는과정에관여하는 것으로알려져있다. 35, 41 따라서 p63 양성 / HDAC1 음성발현양상을보이는 기저층의세포가표피의줄기세포일가능성이높다는결론을제시하였다. 본 30

연구에서도열다섯케이스의아토피피부염조직과연령이일치하는열한케이스의 정상조직을더모아서추가연구를시행하였다. 추가연구에서는 HDAC1 과 p63 의 발현패턴이아토피피부염에서정상조직과비교하여어떤차이가있는지보았는데 p63 양성 / HDAC1 음성의발현양상을보이는기저층의세포가정상조직에비해 아토피피부염에서확연히감소하는양상을보였다 (Fig.6). 특히아토피피부염에서 p63 염색양상이정상과비슷하게나타나는경우도흔했지만, 그경우기저층까지 HDAC1 발현이증가되어있어 p63 양성 / HDAC1 음성의세포는정상에비해 감소되어있었다. 이를전체표피세포에서차지하는백분율로구해보았을때 통계적으로유의하게차이가있어 (Fig.6) 아토피피부염에서정상피부에비해표피 줄기세포능이감소되어있다는처음연구의결과를뒷받침해주었다. 이제까지의실험결과를요약하자면, 생체조직을이용한면역조직화학염색결과 아토피피부염에서는기저막의결함이있으며이러한결함은표피분화이상과 각질형성세포의재생능력감소와밀접한연관이있을것으로생각된다. 대부분의 임상가들은아토피피부염이다른만성피부질환보다더치료하기어렵고자주 재발하는경과를보이는데의견을같이한다. 본연구의결과는아토피피부염이왜 31

이렇게치료에저항하며만성의경과를보이는지설명할수있는실마리를일부 제공할수있다고생각한다. 마지막으로저자는 IL-13 을이용한아토피피부염인공피부모델을사용하여 면역조직화학염색을시행하고결과를분석해보았다. 앞서도언급되었지만 IL- 13 은아토피피부염에서 IL-4 와는독립적으로중요한역할을한다. 아토피피부염환자의혈청 IL-13 수준은혈정 IgE 수준과매우강하게연관되어 2, 42 있다는것도알려져있다. 아토피피부염환자에서 분리된혈액내 단핵세포에서는 IgE 상태와는별개로 IL-13 이상승되어분비된다. 43 또한 IL-13 형질전환마우스에서는소양증을동반한습진, IgE 상승, 염증세포의피부침윤, cytokine 과 chemokine 의상승등아토피피부염의특징적인증상이발생함이 2, 44 알려져있다. 이전의 다른한연구에서는 IL-4 와 IL-13 을과발현시키면 filaggrin 유전자발현이유의하게줄어듦이보고하였다. 17 이번연구에서도 IL- 13 을처리한인공피부모델은앞서생체조직을이용한면역조직화학염색결과와 비슷한결과를보였다. IL-13 을처리했을때 type IV collagen 과 integrin α6 의 발현이확연하게줄어드는양상을보였다 (Fig.4). 또한, 표피분화의지표인 32

filaggrin 과 involucrin 역시 IL-13 을처리했을때줄어드는결과를보였다. 줄기세포표지자인 p63 또한 IL-13 을처리한모델에서매우줄어들어거의 발현이되지않는양상을보였다. 이러한결과는 IL-13 이아토피피부염에서 기저막의결함과분화의결함, 그리고줄기세포능의감소에중요한역할을할수 있는근거가될수있겠다 (Fig.7). 이번연구는샘플의수가많지않고 연구대상의나이나조직채취부위가통일되지않았다는한계점이있다. 하지만 아토피피부염에서기저막과줄기세포능의이상을최초로밝혀낸것은의미가 있다고여겨진다. 이번연구에서도출된결과를확인하기위해향후더심화된 대규모의연구가필요할것으로생각된다. Figure 7. Possible role of IL-13 in atopic dermatitis. 33

결론 이번연구는아토피피부염에서기저막의결함이있으며재생능력이감소해 있다는사실을새로이밝혔다. 기저막의결함은면역세포나 cytokine 등이표피로 침투하는것을촉진시키고다양한알레르기유발항원등아토피피부염을일으키는 외부인자가체내혈액으로쉽게도달할수있도록할것이다. 또한아토피피부염이 치료에잘반응하지않고만성재발성경과를보이는데표피재생능력감소도 일정부분역할을할것으로생각된다. 34

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Abstract Defective basement membrane and decreased regenerative potential in atopic dermatitis Background: Atopic dermatitis (AD) is a chronic inflammatory skin disease characterized by altered skin barrier function and immune dysregulation. Th2 responses are known to be important in development of AD, and interleukin (IL)-13 which is one of the key Th2 cytokine is expressed in both acute and chronic lesions of AD. In AD, matrix metalloproteinase (MMP)-9 released by IL-13 stimulated keratinocytes is thought to play a crucial role in skin inflammation. Although MMP-9 can degrade type IV collagen, a major component of basement membrane (BM), BM defect in AD has not yet been thoroughly investigated. Moreover, since BM acts as an epidermal stem cell niche, stem cells are expected to be altered if BM gets damaged. However, stem cell alteration in AD has also not been investigated yet. Objective: In the present study, the author sought to elucidate the status of basement membrane and stem cell in atopic dermatitis and to compare them with those in nummular chronic eczema and normal skin. Moreover, a potential new specific marker 38

for epidermal stem cells was applied to investigate the stem cell status of atopic dermatitis. Methods: Tissue samples of 10 AD patients, 4 nummular eczema patients, and 6 normal controls were collected. Immunohistochemical staining of type IV collagen, integrin α6, involucrin, filaggrin, p63 was performed to study the status of BM, epidermal cell differentiation, and epidermal cell stemness. Moreover, in vitro AD models were made using skin equivalents (SE) treated with IL-13 and conducted the same immunohistochemical staining on these models. In the supplement experiment, 15 atopic dermatitis and 11 normal tissues were stained against HDAC1 and p63 by immunofluorescence method. Results: Type IV collagen and integrin α6 were significantly decreased in BM of AD compared with nummular eczema and normal skin. Filaggrin expression was decreased in AD and the p63 positivity was also decreased in AD compared to other groups. In the SE model, all these markers were decreased upon the addition of IL-13. In the supplement experiment, the portion of p63 positive / HDAC1 negative cells which are considered as true epidermal stem cells was decreased significantly in atopic dermatitis compared with those in normal skin. 39

Conclusions: These results support that AD skin has an important role for BM defects in AD. Defective BM is thought to decrease the number of stem cells via microenvironmental alteration and this may lead to delayed wound healing and chronic relapsing disease course in atopic dermatitis. Key words: atopic dermatitis, basement membrane, HCAD1, IL-13, stemness, p63, type IV collagen, Student Number: 2012-30512 40