특 집 나노약물전달체의제조및응용 이정임 ᆞ 유혁상 1. 서론 약물전달시스템 (DDS: Drug Delivery System) 은표적부위에약물을선택적으로전달하여장시간동안유효혈중농도를질병에따라최적화함으로써치료효능및효과를극대화시키고, 약물부작용의극소화를목적으로한다. 기존의항암치료에서의약물전달체는약물의투여횟수가늘어날수록효과보다는부작용과항암제의다약제내성 (MDR effect: Multidrug Resistance effect) 이나타나치료효과를저하시키는중요한원인이되었다. 다약제내성은약물을반복적으로투여하게되면암세포가세포안으로들어온약물을세포밖으로다시내보내는일종의세포막펌프가작용하게되는것으로, 이펌프가작동하면일정농도이상의약물이세포질내에서존재할수없기때문에계속적인약물투여에도별효과가나타나지않는것을말한다. 이에표적부위에서항암제가충분한양이축적적용하기위해서는나노크기의전달체가 이정임 06 08 08 현재 유혁상 1996 1998 02 02.9 03.8 03.9 05.2 04.9 05.2 05.3 현재 강원대학교생물소재공학과 ( 학사 ) 강원대학교생물소재공학과 ( 석사 ) 강원대학교생명공학과, 박사과정 한국과학기술원생물과학과 ( 학사 ) 한국과학기술원생물과학과 ( 석사 ) 한국과학기술원생물과학과 ( 박사 ) 한국과학기술원자연과학연구소 (Post Doc.) 한국과학기술연구원의과학연구센터 (Post Doc.) Department of Biomedical Engineering, School of Medicine, Johns Hopkins University(Post Doc) 강원대학교생명공학부생물소재공학전공조교수 오랜시간동안인체내의혈관내에서순환하여야할필요가있다. 나노입자는항암제의내성및암세포지향성을제제로단일복용으로오랜시간동안혈액에전달체를통한약물의농도를유지시킬수있으며, 병리적부위에서만선택적으로약물을방출하여다른부위에서의부작용도줄일수있다. 이렇듯약물전달체로서나노입자는선택적표적부위전달을위한방법중하나로, 입자의크기가수 nm 에서수백 nm 크기의넓은표면적을가진콜로이드상의불균일분산입자를의미한다. 나노입자는특정적인입자의크기때문에혈관이매우약하며느슨한구조를갖는암, 염증등의부위의조직에서쉽게혈관내로통과할수있다 (EPR effect: Enhanced Permeability and Retention effect). 나노입자의크기적인특성외에도암세포에만특별히존재하는항원에대한수용체를나노입자에부착하여선택적전달효율을높일수있다. 나노입자는특정질병부위에대한선택적표적부위전달로효과적인치료가가능하며, 약물의투여로인한정상적인기관, 조직, 세포등에서발생할수있는여러가지부작용을해결할수있는기술분야이다. 1 나노약물전달체의제조방법으로는자가유화확산법을이용한나노입자, 블록공중합체등을이용한미셀 (micelle) 형성을통한나노입자, 자성을이용한나노입자, 이온성고분자의복합체 (complex) 반응을이용한나노입자등이있다. 2 나노입자가인체에투입될때는주사, 경구, 피부등다양한방법을통해전달되며이때약물의분포는다른전달체와는구별되는약물의분포를나타내며이것은나노입자의특성에따라조금씩다르게나타난다. 나노약물전달체의응용범위는입자자체의크기뿐만아니라입자의고기능화로선택적전달및외부자극에의한조절방출에연구의초점이맞추어지고있다. 이러한나노입자를이용한약물전달시스템은항암제, 단백질약물, 유전자치료, 질병의진단 (molecular imaging) 에응용되는기술로그분야는더욱넓어질것이다. 2. 나노약물전달체제조및응용 2.1 자발적유화용매확산을이용한나노입자 (Spontaneous Emulsion Solvent Diffusion) 2.1.1 제조 Preparation and Application of Nano Drug Delivery Systems 강원대학교생명공학부생물소재공학전공 (Jung Im Lee and Hyuk Sang Yoo, Department of Biomaterials Engineering, Kangwon National University, Hyoja-dong, Chuncheon, Kangwon-do 0-701, Korea) e-mail: hsyoo@kangwon.ac.kr 146 Polymer Science and Technology Vol. 19, No. 2, April 08
나노입자를제조하는방법에는수많은방법이사용되고있지만그중자발적유화용매확산방법이가장많이사용되고있는과정이다. 일반적인방법은고분자가용해될수있는유기용매상에고분자를용해시킨후이를일정량의유화제가첨가된수용액상에분산시켜나노입자를얻는것으로, 첫번째단계에서고분자용액을유화수용액안에서분산시킬때고분자용액이 1 5 마이크론크기의에멀젼방울이계면에서자발적으로형성된다. 두번째단계에서고분자에대한친화도가낮은수용액상에서에멀션이확산되고, 계면에서는유기용매농도가증가함에따라유화제와함께고분자의코아세르베이션 (coacervation) 이일어나고마지막단계로고분자의응고 (solidification) 가일어나구형의나노입자를형성하며이러한과정들은순간적이며자발적으로진행된다. 나노입자의크기는안정화제, 고분자의종류, 분산방법에따라달라진다. 이때나노입자에봉입하려고하는약물은고분자와함께유기용매에용해되어야한다. 2 고분자에이온화될수있는기능기를사용하여유화제없이자가유화되는방법도있다. 2.1.2 응용암치료를위한효과적인방법으로, 혈관생성억제제인콤브레타스타틴 (combretastatin A4) 과항종양제인독소루비신 (doxorubicin) 을나노셀 (nanocell) 형태로제조하였다. 3 활성화된폴리락타이드글리콜라이드공중합체 (PLGA(poly(lactic-co-glycolic) acid)) 와독소루비신, 트리에틸렌아민 (triethylamine: TEA) 을몰비로 1:1:4 로하여디메틸포름아미드 (dimethylformamide: DMF) 에서녹인다. 나노입자는유화용매증발법 (emulsion solvent evaporation) 을사용하여 PLGA copolymer-doxorubicin conjugate로만들어지며, 크기는 1 nm 이다. 나노입자를지질 (lipid) 막으로캡슐화하고, 지질막사이에콤브레타스타틴을첨가한다. 이렇게제조된나노셀은 1 0 nm 크기를가지며, 콤브레타스타틴은 12 시간안에거의빠르게방출되고, 나노입자는 PLGA 가분해되면서 15 일넘게천천히독소루비신이방출된다. 이는종양세포로의혈액공급을차단해주고, 종양세포를나중에죽이는효과가있다. 또다른연구에서는, 수동적표적부위전달과서방성을위해화학적으로독소루비신과 PLGA 를결합하였다. 4 Doxorubicin-PLGA conjugate 를제조하기위해먼저파라나이트로페닐클로로포메이트 (p-nitrophenyl chloroformate) 와피리딘 (pyridine) 에의해 PLGA 양말단을활성화시킨다. 디메틸포름아미드에녹인활성화된 PLGA 는독소루비신과트리에틸렌아민과반응한다. Doxorubicin-PLGA conjugate 를아세톤에녹이고, 1% Pluronic F-127 이포함된물에천천히첨가한다. 나노입자는수용액상에서형성되고, 초원심분리기로나노입자를모은다. 이후 PBS 로다시부유시킨다. Doxorubicin-PLGA conjugate 나노입자의크기는 356.0 nm이고표면전하는 -86.6 mv 이며, 모양은뭉치지않고각각둥근모양을하고있는것을확인하였다 ( 그림 1). 화학적으로독소루비신과결합되어있는나노입자는물리적으로포접되어있는나노입자보다포접률이높고조절방출되는서방성방출의특징을나타냈다. 2.2 블록공중합체등을이용한미셀형성을통한나노입자 2.2.1 제조수용성고분자중양친성고분자는친수성인성질을가지는블록과소수성을가지는블록을단일분자내에동시에가지고있는고분자를말한다. 양친성고분자는수용액내에서소수성고분자블록이자 (a) (b) 그림 1. Doxorubicin-PLGA conjugate 나노입자의투과전자현미경 (transmission electron microscopic) 사진. 기집합체를이루지만여전히물에용해되는성질을가지고있다. 이런블록공중합체 (amphiphilic block copolymer) 는수용액상에서회합하여내부의소수성영역과외부의친수성영역으로구성되는미셀을형성하는데, 미셀내부에소수성약물을봉입하고, 친수성블록이바깥쪽을감싸면서세망내피계 (RES; reticuloendothelial system) 나다른기관들에의해빠르게흡수되어지는것을막을수있는역할을한다. 이는고분자미셀이오랫동안혈관순환의잠재성을가지게되는것이다. 블록공중합체를주로이용하는고분자미셀은단량체의종류와그조성비율등의변경을통하여다양한물성을얻을수있으며일반적으로그물리적안정성과동적평형상수등이저분자미셀에비하여우위를나타내는장점을나타낸다. 따라서, 다양한단량체들과이들의비율을조절하여제조할수있는공중합체들을응용하여난용성약물의가용화를증진시키고기존의미셀에비하여그안정성과효율성을향상시킨다양한고분자미셀이개발중에있다. 고분자미셀은자체적으로소수성약물및유전자전달을위한전달체뿐만아니라, 외부자극에감응성을가지는첨가물질로도사용된다. 5,6 2.2.2 응용외부자극에의한표적부위에서약물방출을위해소수성블록과온도민감성블록의블록공중합체로온도민감성고분자미셀을제조하였다. 미셀안쪽의소수성블록으로는폴리락타이드 (poly(d,lactide)) 와폴리카프로락톤 (poly(ε-caprolactone)) 을사용하였고, 바깥쪽은온도민감성블록으로 poly(n-isopropylacrylamide-co-, N-dimethylacrylamide) 을사용하였다. P(IPAAm-co-DAAm)- b-pla, P(IPAAm-co-DAAm)-b-PCL, 그리고 P(IPAAmco-DAAm)-b-poly(LA-co-CL) 미셀을만들어각각의하한임계용액온도 (LCST: lower critical solution temperature) 와크기를조사하였다. 이렇게제조된미셀안쪽에항암제인독소루비신 고분자과학과기술제 19 권 2 호 08 년 4 월 147
500 Tumor volume(mm 3 ) 0 300 0 그림 2. DOX-PEG-FOL conjugate 을이용하여 folated-targeted DOX nano-aggregates 의제조. 0 5 10 15 25 Time(day) 그림 4. 동물실험에서독소루비신 nano-aggregates 의항암효과. (a) (b) (c) 그림 3. 37 에서 3 시간동안같은양의독소루비신 50 μm 농도로 DOX (a), DOX nano-aggregates (b), 그리고 DOX/FOL nano-aggregates (c) 를 KB cells 에서배양한공초점현미경 (confocal microscopic) 사진. 이포접되어 LCST 이하보다는이상에서독소루비신의방출이증가한다. 7 나노입자는암세포에서특별히축적되는행동을가지며, 나노입자표면에항체나리간드결합시키면선택적으로엔도사이토시스 (endocytosis) 하여종양세포로의섭취 (uptake) 를향상시킬수있다. 그방법으로 NH 2 -PEG-COOH 의양말단에엽산 (FOL: folate) 과독소루비신 (DOX: doxorubicin) 을붙여 FOL-PEG-DOX 를만들고, 여기에독소루비신을넣어자발적으로 DOX/FOL nano-aggregate 의고분자미셀형태로나노입자를형성하였다 ( 그림 2). 나노입자는약 0± 11.8 nm 이고, 표적세포를인지하기위해표면에는엽산이노출되어있으며, 보통의고분자미셀보다더쉽게독소루비신을포접할수있다. 선택적전달능력을알아보기위해엽산수용체가있는암세포 (KB cell) 와엽산수용체가없는암세포 (A549 cell) 에세포내로의섭취를조사한결과 KB cell 에서 FOL-receptor-mediated endocytosis 과정에의해 free DOX 나 DOX nano-aggregate에비해더많이섭취된것을확인하였다 ( 그림 3). 사람암이이종이식된누드쥐 (human tumor xenograft nude mice) 의꼬리정맥에 free DOX, DOX nano-aggregate, DOX/FOL nano-aggregate를주입한결과항암효과는 DOX/FOL nano-aggregate 가가장우수한것을확인하였다 ( 그림 4). DOX/FOL nano-aggregate 는수동적, 능동적타겟팅효과를보여줌으로써암치료를위한나노약물전달체로서의가능성을보여줬다. 8 2.3 자성나노입자 2.3.1 제조자성나노입자란강자성을띠는입자로서그종류로는산화철 (Fe 2 O 3, Fe 3 O 4 ), 규소철 (CoFe 2 O 4, MnFe 2 O 4 ), 합금 (FePt, CoPt) 등다양하다. 자성체를약물전달체로사용하기위해서는서로뭉쳐 덩어리지지않고잘분산되어있어야하기때문에자성체표면을변화시켜일정한크기로제조할수있어야한다. 최근철, 코발트, 니켈같은강한자기성을갖는원자와기능기를갖고있는탄화수소분자사이의상호작용원리가밝혀지면서균일한자성체나노입자에관한연구가활발히이뤄지고있다. 균일하게제조된자성나노입자를이용해인체의특정부위에약물을집중투여함으로써약물치료효과를극대화하는치료법은현재외부에서유도하는방법과몸의특정부위에직접심는 2가지방법이연구되어지고있다. 만약간암에걸린환자라면간에무해한자석을심은후치료용캡슐을주입하면캡슐은혈관을타고간으로가암세포를죽이게된다. 이때일반세포는항암제의영향을받지않기때문에부작용등이발생할염려가없고정확한투여가가능하다. 암세포에결합시킨자성나노입자에외부에서자기장을걸어주면열이발생해암세포를죽일수도있다. 자성에의한표적화약물은일반적으로어느특정한목표지점의약물의농도를높이며, 더욱중요한것은자장의도움으로세망내피계 (RES) 로부터격리시킬수있다는것이다. 자장에반응하는나노입자는단백질과세포분리등의생의학적응용에이용되고, 암세포에의해오염된골수세포의, 소위면역자기비드법 (immunomagnetic bead) 을사용한정제는임상치료법에서잘정립된방법으로받아들여지고있다. 9 자성입자물질인자기성유체 (ferrofluids) 는쥐의경우 250 mg/ kg까지주입해도독성이없고인체에도 1 3 mg/kg 까지는안전함이보고되어있다. 10 자성약물전달체제조는항암제, 자성물질, 고분자등을사용하여제조할수있다 ( 그림 5). 2.3.2 응용혈관에서오랜순환을하기위한자성을가지는자성나노전달체 (magnetite nanoparticle) 를코어 (core) 로하고, 약물의조절방출을하기위해고분자를껍질 (shell) 로하여나노입자를제조하였다. 초상자성체 (superparamagnetic) 나노입자는높은자성과생체적합성으로고열요법 (hyperthermia), 약물의조절방출, 그리고자기공명영상법 (MRI: magnetic resonance imaging) 조영제를위한자성약물전달체이다. 강자성체가서로뭉치는것을방지하기위해 Fe 3 O 4 의표면을변화시킨후, 독소루비신을결합한다. Smart polymer 로캡슐화하여세포내엔도좀의환경 (ph 5.3) 과하한임계용액온도보다높은온도에서약물을조절방출하는나노입자를제조하였다. 하한임계용액온도이상과이하의온도와생체 ph에서독소루비신의방출패턴을보았을때, 하한임계용액온도이상의온도인 와 ph 5.3 에서가장많은방출이이루어지는것으로원하는자성나노입자 148 Polymer Science and Technology Vol. 19, No. 2, April 08
biodegradable polymer (controlled drug release) blood vessel drug 그림 5. 표적지향성자성약물전달체계. magnetic nanoparticle (targeting) N S 표 1. 다른온도에서 PEI/DNA complex 와플루로닉이결합된나노겔의크기와표면전하의변화 37 diameter(nm) ζ-potential diameter(nm) ζ-potential PEI/DNA 265.8±2.7 +30.6±1.7 216.5±4.1 +31.6±3.1 Nanogel (5% Pluronic) Nanogel (10% Pluronic) a N/D:not determined. 1.5±13.2 N/D a 231.6±16.6 +18.7±1.6 1011.7±7.3 N/D a 772.2±16.2 +18.4±8.2 가제조된것을확인할수있었다. 11 2.4 이온성고분자의복합체반응을이용한나노입자 2.4.1 제조양이온성고분자는비바이러스성유전자전달체로 DNA 를 50 0 nm로응집시킬수있다. 이는 DNA의인산음이온과비바이러스벡터양이온의정전기적상호작용을통해 DNA 의응집이발생된다. 매개체 (medium) 의이온강도와대응이온의양이온강도는 DNA 응집을유발한다. DNA 응집에서다가양이온은일정량혼합에서쿨롱인력이무질서도 (entropic) 인력보다우세하게되므로 DNA 는구형, 토로이드 (toroid), 또는막대형으로응집하게된다. 이때 DNA 응집체의크기는 DNA 의 topology와양이온특성에의존하며대체적으로 0 nm 이하의나노입자를형성한다. DNA 응집체의형성에는약 0 500 의염기쌍이관여하는것으로알려져있다. 다가양이온과 DNA 사이의응집이정전기적중화를통한자유에너지변화에주로기인하지만, 입체적그리고화학적변화, 즉 DNA 의벤딩, 수화, 혼합등과같은요인또한 DNA 응집에있어중요하게작용하고있다. 2 2.4.2 응용유전자전달의높은발현효율을위해엔도좀탈출은중요한요인이된다. 물리적으로엔도좀을탈출하기위해 PEI/DNA 복합체표면에플루로닉 (Pluronic, (poly(ethylene oxide)[peo]-poly(propylene oxide)[ppo]-[peo])) 을결합하여낮은온도의자극 (cold-shock) 을주는방법을사용하였다. 먼저높은 N/P ratio(nitrogen/phosphate ratio) 에서 DNA 와 PEI(polyethyleneimine) 가결합하면표면에아민기가노출된다. 이 PEI/DNA complex 가포함된용액을 ph 8.2 로맞추고, 아민기에반응하는활성화된플루로닉 (activated- Pluronic) 을 5%, 10% 로첨가하여 PEI/DNA-Pluronic 나노겔 Relative inensity Relative inensity 'C 37'C 0 'C PEI/DNA complex 0 diameter(nm) (a) 'C 37'C 0 'C Col 2 PEI/DNA complex 0 diameter(nm) (b) 그림 6. 와 37 에서 5% (a) 와 10% (b) 플루로닉으로표면변화된나노겔의다양한크기분포. 플루로닉이없는 PEI/DNA complex 의경우 에서만측정. (nanogel) 을제조하였다. 플루로닉은온도감응성고분자로수용액상에서미셀형태를가지며, 하한임계용액온도이상에서소수성블록인 PPO 끼리결합으로겔화되는특성을가진다. 나노겔은하한임계 고분자과학과기술제 19 권 2 호 08 년 4 월 149
N- Bromosuccimide DNA amine terminated quantum dot Dissociation No FRET Complexation Texas red labeled chitosan FRET signals Ex 488nm Fluorescence Resonance Energy Transfer Em Em 5nm Em 610nm 그림 7. Texas Red-chitosan/quantum dot-dna complex 의 FRET. 용액온도이상에서 PEI/ DNA complex 크기와비슷하지만, 낮은온도에서는 PEO 의뻗음에의해크기가커진다 ( 표 1, 그림 6). 온도에따른엔도좀의붕괴를보기위해나노겔과 lysosome 에각각 FITC 와 LysoTracker Red DND-99 을염색하여 cell 내로의 transfection 시낮은온도의자극을주었을때붉은색의 LysoTracker Red DND-99 의감소되는것을통해물리적으로엔도좀탈출이이루어졌으며, 이것은 in vitro transfection 에영향을주었다. PEI/DNA- Pluronic 나노겔은낮은온도의자극 (cold-shock) 에의해전달효율이더높게나왔다. 결론적으로플루로닉으로표면변화된나노겔은 37 의온도에서는 PEI/DNA 복합체와비슷한크기를가져세포로의섭취가잘되고, 이후낮은온도의자극을주었을때플루로닉의뻗음에의해물리적으로엔도좀을빠져나와발현효율이더증가하였다. 분자량이다른양이온성고분자인키토산과 DNA 는정전기적반응에의해복합체를이룬다. 분자수준에서전달효율을밝히기위해 FRET(fluorescence resonance energy transfer) 원리를이용하였다. FRET 는도너 (donor) 와어셉터 (acceptor) 가 10 nm 보다가까울때도너의방출값 (emission) 에의해어셉터가흥분 (excitation) 되는원리로, 본실험에서는키토산과 DNA 에각각 Texas Red 와 Quantum Dot(QD) 를표지하여복합체상태일때는 FRET 효과가나오고, 분리되었을때는 FRET 이나타나지않는것으로 cell 내에서의위치에따른분리를볼수있다 ( 그림 7). 키토산의분자량이높을수록높은양이온성때문에 DNA 와의결합이더컴팩트하게이루어지는것을 DLS 를통해보았다. 또한분자량이높을수록 ph 5.0 에서 DNA 와분리도빠르게일어나서 in vitro transfection 효율이높은분자량일때높게나오는것을밝힐수있었다 ( 그림 8). 12 fluorescence intensity ratio (I 610 /I 5, %) 10kDa kda 500kDa 0 0 10 30 50 ph 5.0 ph 7.4 time (h) time (h) 그림 8. 키토산 /DNA 복합체를 350 nm에서 excitation 하여 ph5.0( 왼쪽 ) 과 ph7.4( 오른쪽 ) 에서 FRET donor(qd) 와 FRET acceptor(texas Red) 사이의형광세기를측정. 3. 결론 0 0 10 30 50 약물전달체로서나노입자는수많은연구로원하는목적에맞는적절한입자크기및크기분포를가지면서입자의표면에반응성그룹, 리간드의도입또는표면전하밀도를조절하여반응성및레올로지특성을향상시켰다. 여러소재를이용한나노약물전달체는병변부위의이미징, 진단, 그리고치료를할수있게해줄것이다. 예를들어이미징을통해서세포의위치와약물방출, 그리고약물의양에따른분자수준에서의치료방안을제시해줄것이다. 앞으로항암제, 단백질, 유전자가원하는세포에도달할때까지변성 (denature) 하지않게보호하는더많은새로운전달시스템의연구가절실히요구된다. 10kDa kda 500kDa 150 Polymer Science and Technology Vol. 19, No. 2, April 08
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