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효춘 조
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1 Biomaterials Research (2013) 17(3) : Biomaterials Research C The Korean Society for Biomaterials 파클리탁셀의하이드로트로픽가용화를위한양친매성 Poly(4-vinyl benzoic acid-co-diethylacrylamide) 의합성및평가 Synthesis and Characterization of Amphiphilic Poly(4-vinyl benzoic acid-co-diethylacrylamide) for Hydrotropic Solubilization of Paclitaxel 오동환 최종훈 배진우 박기동 * Dong Hwan Oh, Jong Hoon Choi, Jin Woo Bae, and Ki Dong Park* 아주대학교분자과학기술학과 Department of Molecular Science and Technology, Ajou University, San 5, Woncheon-Dong, Yeongtong-Gu, Suwon , Korea (Received July 5, 2013 / Accepted August 12, 2013) This study describes the synthesis and characterization of micelle-forming amphiphilic copolymers comprised of vinylbenzoic acid (VBA) and diethylacrylamide (DEAAm) for hydrotropic solubilization of paclitaxel. For the synthesis of the copolymer, N-hydroxysuccinimide activated VBA (NSVB) and DEAAm were randomly copolymerized via reversible addition-fragmentation chain transfer (RAFT) polymerization to obtain poly(nsvb-co-deaam)(pnd), followed by grafting of amine-terminated poly(ethylene glycol) methyl ether (mpeg) to NSVB. The resulting poly(vb-co-deaam)-gmpeg(pvdp) and PND were characterized by 1 H-NMR and TGA. It was found that PVDP could significantly improve water solubility of PTX with increasing concentration of PVDP. At a low concentration, the aqueous solution of PVDP containing PTX looked opaque but became transparent with increasing PVDP concentration. The water solubility of PTX was increased up to fold at 8 wt% of PVDP, as compared with PTX alone. We measured the average diameter of PVDP at this concentration using a dynamic light scattering. The result showed that PVDP had 137 ± 18 nm in diameter, indicating that the improved water solubility of PTX was probably due to the micelle-forming amphiphilic nature of hydrotropic PVDP. Therefore, we expect that the amphiphilic PVDP copolymer with a hydrotropic property can be used to improve water solubility of poorly water-soluble drugs including PTX. Key words: Paclitaxel, Micelles, Hydrotropic solubilization, Poorly water-soluble drugs 약 서론 물흡수촉진기술은치료용약물의체내흡수를촉진하고투여경로를다양화하여생체이용률 (bioavailability) 을개선시키는기술로서, 효율적약물전달을통해부작용을줄이고치료효능및환자의복약편의성을극대화하는약물전달시스템의핵심기술군중의하나이다. 약물흡수촉진기술의핵심기술은일반적으로위장관내안정화및흡수능향상기술, 약물수송체계이용기술, 나노 / 마이크로입자이용흡수촉진기술, 난용성약물가용화기술, 단백성약물흡수촉진기술으로분류될수있다. 1) 그중난용성약물의가용화는생체활성증진을위한제제및제형개발에있어많은관심을받고있다. 최근, 우수한약효가기대되는다양한약물들이지속적으로밝혀지고있으나그중 40% 에달하는약물들은난용성의성질을지닌것으로확인된다. 2) 난용성약물은제형개발단계로진입하는데있어낮은용해도와그에따른여러부작용으로인해어려움 * 책임연락저자 : kdp@ajou.ac.kr 을겪고있다. 대표적예로, 우수한항암치료효과를보이는파클리탁셀 (paclitaxel, PTX) 은물에대한용해도가 0.3 µg/ml로매우낮아제제화에제약이있으며 3) PTX의가용화를위해 1990년도에 Cremophore EL 과에탄올을 1:1 비율로섞어 PTX를봉입한미셀 (micelle) 제형인 Taxol 이개발되었다. 4) 그러나유기용매의사용으로인한체내독성및부작용의문제가있으며이를해결하기위한방안으로다당류유도체, 덴드리머, 블록공중합체등의다양한전달체가개발되었다. 5-7) 최근, 난용성약물을가용화하는방법으로하이드로트로픽물질 (hydrotropic agent) 을이용한연구결과가보고된바있다. 8) 수용성인하이드로트로픽물질은일정농도이상에서소수성화합물을가용화시킬수있는화합물로서, N,N-diethylnicotinamide 혹은 N,N-dimethylbenzamide 등이 PTX 가용화에효과가있음이밝혀졌다. 9) 그러나 PTX 가용화를높이기위해서는고농도의하이드로트로픽물질이필요한단점이있어이를해결하기위해고분자미셀에하이드로트로픽물질을도입하여해결하고자하는연구가보고된바있다 ) 양친매성공중합체 (amphiphilic copolymer) 는수용액환경에 109

2 110 오동환 최종훈 배진우 박기동 서자가조립 (self-assembly) 과정을통해고분자미셀 (polymeric micelle) 을형성할수있다. 자가조립구조를형성할때양친매성공중합체의소수성부분은입자내부에위치하여난용성약물들을포집함으로써약물의용해도를높일수있으며, 친수성부분은미셀표면을구성하여세포또는단백질의흡착이나미셀간의응집등을효과적으로억제할수있다. 널리사용되는친수성고분자인 poly(ethylene glycol)(peg) 은 Stealth Effect 를통해혈류내체류시간을증진시키는효과가있음이알려져있다. 14) 또한고분자미셀은유화제시스템과비교하여미셀을형성하기위한최저농도인임계미셀농도 (critical micelle concentration) 가낮아안정하게입자구조를유지할수있으며, 오랜시간체내에서순환하므로병변부위에보다장시간약물전달이가능하다. 15) 이러한고분자미셀시스템은양친매성공중합체의합성시단량체의종류와조성등을변화시켜서체내분해속도, 약물방출시간조절등의물성을다양하게변화시킬수있으며, 표적화를위한리간드를도입하여다기능성약물전달시스템개발로응용할수있는장점이있다. 16) 본연구에서는소수성단량체인 vinylbenzoic acid와친수성단량체인 diethylacrylamide를공중합하여하이드로트로픽성질을갖는고분자주쇄를합성하고여기에 PEG를도입하여하이드로트로픽양친매성공중합체를합성하였다. 합성된공중합체의구조분석과함께, 공중합체를이용한 PTX 가용화도를측정하였다. 재료및방법 시약및재료 4-vinylbenzoic acid (VBA), diethylacrylamide (DEAAm) 은 TCI (Tokyo, Japan) 에서구매하였고, poly(ethylene glycol) methyl ether (mpeg, Mn = 2,000 Da), N-hydroxysuccinimide (NHS), 4-dimethylamino pyridine (DMAP), triethylamine (TEA), p- nitrophenylchloroformate (PNC), ethylenediamine, chlorobenzene은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) 에서구매하였다. N,N-dimethylformamide (DMF) 은 Kanto (Tokyo, Japan) 에서, acetonitrile (ACN), ethyl acetate (EA), methylene chloride (MC), diethyl ether 및 methanol은 J. T. Baker (Phillipsburg, NJ, USA) 에서구입하였다. Dicyclohexylcarbodiimide (DCC) 은 Fluka (Buchs, Switzerland) 에서구매하였다. Dimethyl sulfoxide (DMSO) 와 2-azobis(2-methylpropionitrile)(AIBN) 은 Junsei Chemical (Tokyo, Japan) 에서구매하였고 PTX는 Samyang Genex (Seoul, Korea) 에서구매하였다. AIBN은메탄올을이용한재결정을통해정제하였고 DEAAm은감압증류법으로정제하여사용하였다. 그외모든시약은연구용등급으로추가정제없이사용하였다. N-hydroxysuccinimide 4-vinyl benzoate(nsvb) 의합성 NHS가도입된 VBA 단량체 (NSVB) 는다음의방법으로합성하였다. 17) VBA(33.8 mmol), NHS(50.6 mmol), DCC(50.6 mmol), DMAP(1.7 mmol) 을 EA(125 ml) 에녹인후 36 시간동안반응을진행하였다. 반응종료후생성된흰색침전물을필터로거른뒤, 회전증발농축기를이용해 EA 를모두제거하고 MC (50 ml) 에다시녹였다. 이후 NaHCO 3 포화용액 (200 ml) 으로 3 회에걸쳐추출하고다시증류수 (200 ml) 로 3 회세척한후 MC 용액층을추출하였고, 남은잔여수분을 MgSO 4 를이용해제거하고, diethyl ether(200 ml) 에침전시켜생성물을분리한뒤여과및진공건조단계를통해수득하였다. NSVB-DEAAm 공중합체의합성 : poly(nsvb-co-deaam) (PND) NSVB와 DEAAm의공중합체는 RAFT (reversible addition fragmentation chain transfer) 중합법으로합성하였으며, 중합에사용된연쇄이동제 2-(2-carboxyethylsulfanylthiocarbonylsulfanyl)propionic acid (TTC) 는기존에보고된논문을참조하여합성하였다. 18) NSVB(4 mmol) 와 DEAAm(6 mmol) 을 chlorobenzene과 ACN이 2:1의부피비율로혼합된용매 (3 ml) 에녹인후 freeze-pump-thaw를거쳐용존산소를제거하고 AIBN(0.02 mmol) 과 TTC(0.1 mmol) 를첨가한뒤 60 o C에서 72시간동안질소기류하에서중합반응을진행하였다. 중합이종료된후, MC(30 ml) 에용해시키고 diethyl ether(200 ml) 을이용하여침전및여과후진공건조시켜수득하였다. PND-g-mPEG(PVDP) 공중합체의합성 mpeg-nh 2 합성을위해 mpeg(5 mmol) 를 MC(100 ml) 에녹인후촉매제인 DMAP(10 mmol) 과 TEA(10 mmol) 를첨가하고 15 분간질소기류하에서상온반응시킨뒤 PNC(10 mmol) 용액에서 24 시간동안교반하였다. 반응이종료된후회전증발농축기를이용해농축하였고, diethyl ether(1000 ml) 에서침전을통해생성된침전물을여과한뒤진공오븐에서건조시켰다. PNC 가결합된 mpeg(5 mmol) 를다시 DMF(50 ml) 에녹인후 ethylenediamine(250 mmol) 용액에넣고 6 시간동안교반하였다. 그후침전을통해생성물을얻고여과및진공건조하여 mpeg-nh 2 를수득하였다. PND(200 mg) 와 mpeg-nh 2 (500 mg) 를각각 10 ml 의 DMSO 용액에녹인후 1:2 몰비율로혼합하여 24 시간동안반응하였다. 반응이종료된후용매의치환및부산물의제거를위해투석막 (MWCO=6-8kDa) 을이용해 3 일동안증류수를이용하여투석한후필터로여과한뒤동결건조하여 PVDP 공중합체를수득하였다. 공중합체의분자구조및화학조성분석합성된 PND 및 PVDP 공중합체의화학구조및조성은핵자기공명분광계 ( 1 H-NMR spectroscopy, AS400, OXFORD instruments, UK) 를통해서확인하였다. 공중합체의화학조성은 TGA Q50 분석기 (TA Instrument, USA) 를이용하여질소분위기하에서 10 o C/min 의승온속도로, o C 의온도범위에서측정하였다. Biomaterials Research 2013

3 파클리탁셀의하이드로트로픽가용화를위한양친매성 Poly(4-vinyl benzoic acid-co-diethylacrylamide) 의합성및평가 111 PTX 용해도측정다양한양의공중합체와 3mg 의 PTX 를 1mL 의 PBS (0.01 M, ph 7.4) 에첨가하고 30 초간교반한뒤, 인큐베이터 (37 o C, 100 rpm) 에서 24 시간동안보관하였다. Cellulose acetate 필터 (pore size, 0.2 µm) 를이용하여용해되지않은 PTX 를제거하고, MC 1 ml 을첨가해 3 시간동안교반하여 PTX 를추출하였다. 진공건조하여 MC 를증발시킨뒤 methanol 과 ACN 이 1:1 의부피비로혼합된전개용매를 1 ml 넣어주어 PTX 를용해시키고 HPLC (Ultimate3000, Dionex, Sunnyvale, CA, USA) 를이용해 PTX 의정량분석을수행하였다. 다음과같은공식을통해약물의함량 (loading capacity) 및봉입효율 (encapsulation efficiency) 을계산하였다. 19) 약물함량 (%)= ( 고분자수용액내의 PTX 함유량 ) 100 ( 고분자수용액내의고분자의양 ) 봉입효율 (%)= ( 고분자수용액내의 PTX 함유량 ) 100 ( 사용한전체 PTX 의양 ) 결과및고찰 본연구에서는 RAFT 중합법을이용하여 NHS 로치환된 VBA (NSVB) 와 DEAAm 로구성된 PND 공중합체를합성하였고, NSVB 에친수성 mpeg 를그래프트하여수용액상에서고분자미셀을형성할수있는양친매성공중합체인 PVDP 를합성하였다 (Figure 1). PND 공중합체 1 H-NMR 스펙트럼에서나타난것과같이 NSVB 의 aromatic ring 은 7.1 과 7.8, NHS 는 2.8 ppm 에서각각확인되었고, DEAAm 의특징적인피크는 0.9 ppm 에서나타났다 (Figure 2A). Aromatic ring 과 DEAAm 의피크적분값을통해두단량체가중합과정에서약 1:1 의몰비율로 PND 공중합체를형성하였음을확인하였다. Figure 2(B) 는 PVDP 공중합체의 1 H-NMR 결과이며, mpeg 의특징피크를 ppm 에서확인할수있었고각단량체들의특징피크역시동일한위치에나타난것을통해 VBA, DEAAm 그리고 mpeg 로구성된 PVDP 공중합체구조를확인할수있었다. mpeg 의 methyl 기는 3.4 ppm 에서나타났는데, 이피크의적분값과 aromatic ring 의피크적분값을비교하여 PND 공중합체에서약 50% 의 NSVB 에 mpeg 가그래프트되었음을알수있었다. Figure 2. 1 H-NMR spectra of (a) PND and (b) PVDP copolymers. 합성된공중합체들의온도변화에따른무게변화를 TGA 를이용하여분석하였다 (Figure 3). Figure 3(A) 는단량체로사용된 DEAAm 과 VBA 그리고이들의공중합체인 PND 의 TGA 분석결과를보여준다. DEAAm 의경우 o C 의온도구간에서약 90% 의무게가감소되었고, NSVB 의경우 o C 의온도구간에서 1 차무게감소가발생한이후 o C 의온도구간에서 2 차무게감소가발생하였다. 그리고 PND 공중합체는 NSVB 와유사한형태를보였으나 2 차적인열분해온도구간에서분해속도가증가하였고, 이는 DEAAm 단량체의열분해가분해속도에영향을미치는것으로사료된다. Figure 3(B) 는 PND 공중합체, mpeg 그리고 PVDP 그래프트공중합체의열분석결과이다. mpeg 는 o C 의온도구간에서약 90% 가량분해거동을보이는데 PND 공중합체의 2 차적인열분해와비슷한구간에서나타난다. PVDP 공중합체는 PND 공중합체와유사하게두온도구간에서분해거동을보였으나 mpeg 의도입에의해각각의열분해온도구간에서감소하는무게비율이달라짐을확인하였다. PND, PVDP 공중합체의 1, Figure 1. Synthetic route to PVDP. Vol. 17, No. 3

4 112 오동환 최종훈 배진우 박기동 Figure 4. Water solubility of PTX at varied concentrations of PVDP. Figure 3. TGA curves of (a) PND and (b) PVDP copolymers. 2 차열분해온도구간에서감소하는무게비율을토대로공중합체의화학조성을분석하였고 1 H-NMR 스펙트럼에서확인한것과동일한결과를얻었다. 물에대한용해도를확인한결과, PND 공중합체는증류수에녹지않았으나 mpeg 가그래프트되어있는 PVDP 는양친매성을가지므로미셀형성시 PND 는마이셀의코어부분으로이동하여 PTX 의봉입에관여할것을예상할수있다. 수용액에서의 PVDP 의농도에따른 PTX 의용해도측정결과는 Figure 4 에나와있으며수용액중 PVDP 의농도가 wt% 로증가함에따라고분자수용액상에녹아있는 PTX 의농도는최대 2.7 mg/ml 로증가하였고, 증류수에서의 PTX 의용해도 (0.3 µg/ml) 에비해약 10 4 배증가하였다. 약물봉입효율및빛투과도는고분자농도가증가함에따 라각각 6-91%, 0-95% 로나타났으며 PTX 용해도와동일한경향성을나타냄을확인하였다. Table 1 에는 PVDP 고분자미셀농도에따른 PTX 의함량, 봉입효율및투과율을정리하였다. 약물함량은 PVDP 미셀및 PTX 간조성에따라 % 의결과를나타내었다. PTX 가봉입된 8 wt% 의 PVDP 고분자미셀직경을동적광산란법 (dynamic light scattering, DLS) 을통해확인한결과, 137 ± 18 nm 로나타났다. 앞서기술한바와같이수용액상에서고분자미셀을형성할수있는하이드로트로픽양친매성공중합체를이용한난용성약물의용해도향상에관한연구는이전에보고된바있다. Lee et al. 은 PEG-b-P(VBOENA) 공중합체를이용하여 배향상된 PTX 용해도와더불어생체이용률을 12.4% 까지증진시켰다. 20) Huh et al. 은 PEG-PLA 와비교하여 PEG-b-PDENA 공중합체의높은 PTX 봉입효율과안정성을보고하였다. 12) 본연구에서는 PTX 용해도를향상시키기위해벤젠기를갖는 VBA 와디에틸 3 차아민기를갖는 DEAAm 로구성된고분자주쇄에 PEG 를그래프트시킴으로써미셀을형성할수있는 PVDP 공중합체의 PTX 에대한하이드로트로픽특성을확인하였다. 하지만, PTX 용해도를보다개선하기위해단량체조성변화와 PVDP 및 PEG 분자량변화에따른미셀특성규명과함께 Table 1. PTX loading and encapsulation efficiencies at different concentrations of PVDP (n = 3). PVDP (wt%) Feed amount of PTX Loading amount of PTX (mg) (mg/ml) Loading (%) Encapsulation (%) Transmittance* (%) ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± * Transmittance was recorded at 600 nm using a UV-visible spectrophotometer. Biomaterials Research 2013

5 파클리탁셀의하이드로트로픽가용화를위한양친매성 Poly(4-vinyl benzoic acid-co-diethylacrylamide) 의합성및평가 113 미셀안정성에관한추가연구가요구된다. 결론 난용성약물의가용화를위하여 RAFT 중합하여하이드로트로픽특성을갖는 PND 고분자주쇄에 mpeg 를그래트프시킨 PVDP 고분자를합성하였으며 PND 와 PVDP 고분자를 1 H- NMR 과 TGA 를이용하여분자구조및화학조성을확인하였다. 합성된고분자를이용하여 wt% 농도의고분자수용액을제조하고난용성약물인 PTX 를봉입해고분자농도에따른용해도를측정하였으며고분자농도가증가함에따라용해도가증가해 8wt% 고분자수용액에서약 2.7 mg/ml 의 PTX 가녹아있으며약 91% 의봉입효율은보이는것을확인하였다. 이러한결과로부터합성된 PVDP 공중합체는난용성약물전달체로서사용이가능하다고판단되고, 나아가단량체의중합에이용한 TTC 로인해 PND 고분자주쇄의말단부는카르복실기를가지며이를이용하여암표적화물질을결합해능동적목표지향성을구현하거나생리활성물질의결합혹은가교가능한반응기를결합하여암치료용미셀기반의 PTX 전달체로활용될수있을것으로기대된다. 감사의글 본연구는보건복지부보건의료연구개발사업 (A110278) 의지원을받아수행되었으며이에감사드립니다. 참고문헌 1. W. Yoo, Studies on establishment of the mid- and long-term Technology Roadmap in Health Industry Field, Korea Health Industry Development Institute (2003). 2. U. Gupta, H. B. Agashe, A. Asthana, and N. K. Jain, Dendrimers: novel polymeric nanoarchitectures for solubility enhancement. Biomacromolecules, Biomacromolecules, 7, (2006). 3. B. R. Goldspiel, Clinical Overview of the Taxanes., Pharmacotherapy: The Journal of Human Pharmacology and Drug Therapy, 17, (1997). 4. L. A. Trissel, Pharmaceutical properties of paclitaxel and their effects on preparation and administration, Pharmacotherapy, 17, (1997). 5. X. Zhang, X. Zhang, Z. Wu, X. Gao, C. Cheng, Z. Wang, and C. Li, A hydrotropic beta-cyclodextrin grafted hyperbranched polyglycerol co-polymer for hydrophobic drug delivery, Acta biomaterialia, 7, (2011). 6. I. Orienti, G. Zuccari, R. Carosio, and P. G. Montaldo, Improvement of aqueous solubility of fenretinide and other hydrophobic anti-tumor drugs by complexation with amphiphilic dextrins, Drug delivery, 16, (2009). 7. M. Crothers, N. M. Ricardo, F. Heatley, S. K. Nixon, D. Attwood, and C. Booth, Solubilisation of drugs in micellar solutions of diblock copolymers of ethylene oxide and styrene oxide, International journal of pharmaceutics, 358, (2008). 8. J. Lee, S. C. Lee, G. Acharya, C. J. Chang, and K. Park, Hydrotropic solubilization of paclitaxel: analysis of chemical structures for hydrotropic property, Pharmaceutical research, 20, (2003). 9. J. Y. Kim, S. Kim, R. Pinal, and K. Park, Hydrotropic polymer micelles as versatile vehicles for delivery of poorly water-soluble drugs, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 152, (2011). 10. S. Kim, J. Y. Kim, K. M. Huh, G. Acharya, and K. Park, Hydrotropic polymer micelles containing acrylic acid moieties for oral delivery of paclitaxel, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 132, (2008). 11. K. M. Huh, H. S. Min, S. C. Lee, H. J. Lee, S. Kim, and K. Park, A new hydrotropic block copolymer micelle system for aqueous solubilization of paclitaxel, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 126, (2008). 12. K. M. Huh, S. C. Lee, Y. W. Cho, J. Lee, J. H. Jeong, and K. Park, Hydrotropic polymer micelle system for delivery of paclitaxel, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 101, (2005). 13. Y. W. Cho, J. Lee, S. C. Lee, K. M. Huh, and K. Park, Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 97, (2004). 14. S. D. Li and L. Huang, Stealth nanoparticles: high density but sheddable PEG is a key for tumor targeting, Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society, 145, (2010). 15. K. Kazunori, S. K. Glenn, Y. Masayuki, O. Teruo, and S. Yasuhisa, Block copolymer micelles as vehicles for drug delivery, Journal of Controlled Release, 24, (1993). 16. K. Kataoka, A. Harada, and Y. Nagasaki, Block copolymer micelles for drug delivery: design, characterization and biological significance, Advanced drug delivery reviews, 47, (2001). 17. K. A. Aamer and G. N. Tew, RAFT polymerization of a novel activated ester monomer and conversion to a terpyridinecontaining homopolymer, Journal of Polymer Science Part A: Polymer Chemistry, 45, (2007). 18. R. Wang, C. L. McCormick, and A. B. Lowe, Synthesis and evaluation of new dicarboxylic acid functional trithiocarbonates: RAFT synthesis of telechelic poly(n-butyl acrylate)s, Macromolecules, 38, (2005). 19. X. Shuai, T. Merdan, A. K. Schaper, F. Xi, and T. Kissel, Core-crosslinked polymeric micelles as paclitaxel Carriers, Bioconjugate chemistry, 15, (2004). 20. S. C. Lee, K. M. Huh, J. Lee, Y. W. Cho, R. E. Galinsky, and K. Park, Hydrotropic polymeric micelles for enhanced paclitaxel solubility: in vitro and in vivo characterization, Biomacromolecules, 8, 202 (2007). Vol. 17, No. 3

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