1 제브라피쉬 (zebrafish) 를이용한혈관연구 - in vivo 이미지화를통한연구 - 권혁범, 이효종, 김규원 * 서울대학교약학대학 To whom correspondence should be addressed. E-mail qwonkim@plaza.snu.ac.kr * 목차 1. 서론 2. 본론 2-1. 제브라피쉬배아의혈관형성과정 2-2. 제브라피쉬혈관이미지화를통한혈관연구 2-2-1. 미세주입법을이용한이미지화 2-2-2. 레이저를이용한이미지화 2-2-3. 형질전환물고기를이용한이미지화 3. 결론 : 적용및전망 4. 참고문헌
2 1. 서론 척추동물의발생과정을연구하는것은여러가지질환의치료에많은도움을줄수있다. 특히혈관발생과정에대한이해는혈관관련질환및암조직의혈관신생을억제할수있는치료법개발등의기반이되므로최근활발한연구가진행되고있다. 열대담수어인제브라피쉬는가장단순한척추동물로서, 무척추동물인초파리나 C. elegans에는존재하지않는척추동물고유의기관이나세포발생을연구하기위해최근에확립된연구모델이다. 마우스를이용한발생연구가비용이많이들고배아가자궁속에서자라기때문에관찰이용이하지않은반면체외수정으로만들어진제브라피쉬의배아는배양이쉬우며초기발생과정이고등척추동물과매우유사할뿐만아니라발생속도가빠르고알이투명하여일반적인해부현미경아래에서발생의모든과정을육안으로지켜볼수있다. 또한초파리와 C. elegans 연구에사용되어온대량의돌연변이선별 (mutant screening) 이가능하여이미혈관형성을비롯한여러초기발생과정에필수적인유전자 2000여개를발견한바있다. 특히혈류의방향에따라구분되던동맥과정맥이혈류가흐르기전, 혈관형성과정에서이미다르게발생한다는것이최근제브라피쉬를이용한연구로처음밝혀진바있다. 본리뷰에서는혈관연구에있어이상적인모델동물인제브라피쉬의발생초기배아의혈관형성과정과함께, 제브라피쉬혈관이미지화를이용한연구방법을소개하고자한다. 2. 본론 2-1. 제브라피쉬배아의혈관형성과정척추동물의혈관은크게혈관형성과정 (vasculogenesis) 과혈관신생과정 (angiogenesis) 과정을통해만들어진다. 혈관형성과정동안혈관전구세포 (angioblast) 는분화를하여주요혈관을형성하게된다. 혈관형성과정은혈관전구세포의분화양상에따라 2가지형태로나뉘어질수있다 (Poole and Coffin, 1991). 몸통의혈관이생성될때와같이혈관내피세포가제자리에서분화하게되는제1형혈관형성과, 심장내막 (endocardium) 이나머리부분에혈관이형성되는경우와같이혈관전구세포가넓은범위에서이동하며분화하게되는제2형혈관형성과정으로나누어볼수있다. 두번째로혈관신생은이미존재하는혈관에서새로운혈관이만들어지는것을말한다 (Folkman and Shing, 1992 ). 이러한혈관신생은배아의발생과정동안이나, 상처가치료되는과정, 암화과정에서관찰되어진다. 제브라피쉬의혈관전구세포는장배형성시기에주머니배가장자리부근에서생성된다 ( 그림1). 발생중인척추동물의혈관내피세포와조혈세포는 hemangioblast 라는동일한전구세포에서유래한다 (Ribatti et. al, 2000, Kimmel et. al, 1995).
3 Hemangioblast 는대략 3-5 체절 (somite) 시기에측판중배엽에서관찰된다. 혈관전구세포는약 10 체절시기에조혈모세포로부터분리되어나타나기시작하는데, 이러한세포들은특이적인유전자의발현을통해분별할수있다. 이후혈관전구세포는몸통의중간부분으로이동하기시작하여, 약 15 체절시기에두개의축 (cord) 을형성한다. 먼저 Dorsal Aorta (DA) 가만들어지고, 그다음에 Posterior Cardinal Vein (PCV) 을형성한다 ( 그림1 B). PCV는 DA의배쪽에, 몸통내배엽에대해서는등쪽부위에위치한다 (Fouquet et. al, 1997). 두개의혈관은 24hpf (hour post fertilization) 즈음에관내강 (lumen) 을형성하게되고, 몸통을통과하여혈액을운반하게된다. 이렇게몸통을가로지르는혈관들은척추동물에서처음으로기능을하는혈관으로, 몸통을지나꼬리로혈액을운반하게된다. 그리고 26 hpf 경에는머리부분에순환분지 (cranial circulatory branch) 가나타나기시작한다 (Isogai et. al, 2001 ) ( 그림1 C). A B C 그림 1. 제브라피쉬배아의운명지도장배형성초기에제브라피쉬의혈관내피세포의전구체인혈관전구세포는주머니배의가장자리부근에서운명이결정된다 (A). 제브라피쉬의혈관은먼저몸통부위에 DA와 PCV을형성하고 (B), 그이후머리부분에분지가형성된다 (C) (Isogai et. al, 2001). 제브라피쉬의 DA와 PCV가혈관형성과정을통해만들어지면, 그이후이미형성된혈관으로부터새로운혈관이만들어지기시작한다. 이과정은제브라피쉬의몸통부분에서일어난다. 제브라피쉬의몸통에는여러개의체절이존재하는데, 이체절사이로혈관전구세포들이이동하여축을형성하고, 그이후에관내강을형성하여혈액을운반하게된다. 이때, DA와 Dorsal Langitudinal Anastomotic
4 Vessel (DLAV) 사이에혈관이형성되는데필요한혈관전구세포들은 3-4개정도라고한다. (Child et. al, 2002) ( 그림2) A B 그림 2. ISV의형성혈관에서 GFP를발현하도록만든형질전환물고기 Tg(fli1:egfp) 를이용하여, 체절사이로혈관전구세포가이동하는모습을찍은사진이다 (A). 혈관전구세포는체절사이를이동하여 ISV를형성하게된다 (B). 발생첫주동안제브라피쉬배아의혈관은빠른속도로전범위에서만들어지며특정기관이만들어지는시기에맞춰형성된다. 창자부위의혈관 (intestinal vasculature) 이나흉부동맥 (pectoral artery) 은 2.5-3 dpf(day post fertilization) 사이에, 간부위혈관 (hepatic vessels) 은약 3dpf 에생성된다 ( 그림 3). 2.5dpf 로부터 7dpf 시기에제브라피쉬는수영을하기시작하며먹이를먹을수있는유생 (larva) 이된다. 이시기에제브라피쉬의주요혈관들은대부분형태를갖춘다.
5 그림3. 제브라피쉬혈관발달과정. < 붉은색 > 은제브라피쉬발달상태를나타내는지표. [hpf (hour post fertilization), dpf (day post fertilization)] 2-2. 제브라피쉬혈관이미지화를통한혈관연구 2-2-1. 미세주입법을이용한이미지화 서론에서도언급했듯이제브라피쉬의배아는다루기가쉽고, 투명하기때문에관찰에용이하다는장점이있다. 이러한장점을지닌제브라피쉬의혈관을이미지화하여혈관의형성과정을관찰할수있다. 혈관을이미지화하는방법에는첫째로미세주입법이있다 ( 그림 4). 미세주입법은형광으로표지된미세한입자 (fluorescence microsphere) 들을발생중인제브라피쉬배아에주입하고현미경으로관찰하는것이다. 미세주입법은주입하는입자의상대적인농도를조절하므로써다양한이미지를얻을수있다는장점이있다. 이러한미세주입법을통해제브라피쉬의뇌깊숙한곳에위치한세밀한혈관도관찰가능하다 (Weinstein et. al, 1995).
6 그러나미세주입법은혈관에관내강이형성되어야만할수있다는단점을지니고있다. 이는주입한미세입자가혈류를따라흘러야하기에관내강이형성되지않은발생초기배아의혈관은관찰하기어렵기때문이다. 이러한이유로미세주입법은관내강이형성된 1dpf 이후에실시하게된다. 그림 4 미세주입법을이용한혈관이미지화제브라피쉬배아를아가로즈젤로만들어진틀 (A) 위에올려놓고형광으로표지된입자를미세주입한다 (B), (web site: zfin.org). (C) FITC-dextran을혈관에미세주입하여얻은이미지. 2-2-2. 레이저를이용한이미지화레이저를이용한이미지화방법은미세주입법의단점을보완하여혈관발생초기단계에대한연구를가능하게해주었다. 이방법은미세주입과같은방법으로 caged fluorescence dye를배아에집어넣게된다. 이때주입된 dye는 cage에싸여있어형광을내지않고있다가레이저를조사하게되면 cage가벗겨지면서형광을발하게된다 ( 그림 5 A). 이러한방법을이용하여발생초기에배아의운명지도를작성할수있게되었으며 ( 그림1), 혈관전구세포가어느부위에서기원하여어느부위로이동하는지연구가가능하게되었다 ( 그림5 B).
7 그림 5 레이저를이용한이미지화 cage에싸여있는형광 dye를레이저를이용하여활성화시킨다 (A) (Gee et. al, 2001). 이러한방법을이용하여혈관생성초기에세포들의운명이어떻게결정되고, 어느곳으로이동하는지알수있다 (Child et.al, 2002). 2-2-3. 형질전환물고기를이용한이미지화혈관을이미지화하는또다른방법으로는혈관특이적인유전자의프로모터에형광단백질유전자를붙여형질전환물고기를만드는방법이있다. 혈관특이적으로형광단백질을발현하는물고기를만드는데는발생초기부터혈관특이적으로발현하는 tie-1, flk, fli1과같은유전자의프로모터부위를이용한다. 이유전자들은발생초기부터발현되기때문에형질전환물고기를만들기에적합하다 ( 그림 6). 형질전환물고기를이용한이미지방법은발생초기부터혈관이만들어지는모든과정을살아있는상태에서관찰할수있다는장점이있다. 그러나형질전환물고기를만드는과정동안시간과많은노력이필요한것이사실이다.
8 그림 6 형질전환물고기를이용한이미지화혈관특이적인 fli1 유전자프로모터에녹색형광단백질 (egfp) 유전자를달아형질전환물고기를만들었다 (A,B,C,D) (Lawson et. al, 2002). 3. 결론 : 적용및전망 지금까지제브라피쉬혈관의발달과정과이미지화를통한연구방법을소개했다. 본론에서소개한이미징방법을이용하여혈관연구에많은도움을주었지만형광단백질의종류와기능에제한이있어살아있는상태에서여러다른세포의상호작용을동시에볼수는없었다. 그러나최근에는생체내에서여러가지파장대에서다른색깔을내면서도높은안정성을지닌개량된벡터가많이개발되어사용되고있다 ( 표 1). 제브라피쉬의장점을살려이러한여러형광단백질을이용하여연구한다면지금까지알려지지않은새로운사실들을밝힐수있으리라생각된다.
9 표 1 여러종류의형광단백질 (Shaner N.C. et al 2005) 그렇다면이런여러가지형광단백질을제브라피쉬를이용한혈관연구에어떻게적용할수있을까? 뇌혈관의경우, 뇌혈관을이루는혈관내피세포와그주위를둘러싸고있는성상세포 (astrocyte) 사이의상호작용이어떻게이루어지는지, 또는혈관내피세포와신경세포간에어떠한상호작용이이루어지는지는아직까지많은연구가되지않았다. 혈관은 fli1 프로모터를, 성상세포는 gfap 프로모터를, 신경세포는 tuba-1 프로모터를이용하여각각의세포를이미지화한다면세포간의상호작용을연구할수있을것이다 ( 그림 7). 이와같이이미지화를통한연구는혈관연구에있어새로운길을제시할수있을것이라
10 사료된다. 그림 7 여러형광단백질을이용한세포간상호작용에대한연구프로모터, 형광단백질, 세포특이적으로발현하는단백질을이용하여세포간의상호작용을연구할수있을것이다. (Park et. al, 2003) 4. 참고문헌 Childs, S., Chen, J.-N., Garrity, D.M., and Fishman, M.C. (2002) Patterning of angiogenesis in the zebrafish embryo. Development 129(4):973-982. Coffin JD, Poole TJ. (1991) Endothelial cell origin and migration in embryonic heart and cranial blood vessel development. Anat Rec. 231(3):383-95 Folkman J, Shing Y. (1992) Angiogenesis. J Biol Chem. 267(16):10931-4. Fouquet, B., Weinstein, B.M., Serluca, F.C., and Fishman, M.C. (1997) Vessel patterning in the embryo of the zebrafish: guidance by notochord. Dev. Biol. 183(1):37-48. Gee KR, Weinberg ES, Kozlowski DJ.(2001) Caged Q-rhodamine dextran: a new photoactivated fluorescent tracer. Bioorg Med Chem Lett. 11(16):2181-3.
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