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- 화주 돈
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1 Tel / Fax / , (genome project) ,,, / 1, 2, 3 ( 1)
2 35, in vitro assay cell-based assay..., Millennim, Abgenix Medarex.,,,. mrna, DNA,. knockout, knock-in, RNAi... (1) ,,,,,,, (mutation). FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer), BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) FP (Fluorescence Polarization). HCS (High-content Screening) 96-well, 384-well plate (2). HCS,, Ca++ influx 37
3 ... in vitro ex vivo luminometer....,. (charged coupled device: CCD) (3) nm, 2-3 ev CCD, CCD. CCD. CCD HCS (Bioluminescence). (Bioluminescence). (Firefly).. 50,.. 70 (4-7)..,,. (luciferin) (Fluorescence). (Stokes law).. FITC, Texas Red, Cy5, Cy3, DAPI. DAPI,,,. GFP, RFP (8, 9). 38
4 2-3. (Fluorescence Resonance Energy Transfer; FRET).. FRET 10 ( ) (10).. FRET 1940 Forster, ( 2). FRET. FRET G. Zlokarnik β-lactamase CCF2 β-lactamase FRET (11). CCF2/AM β-lactamase FRET 409nm 520nm 447nm. 2. FRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer: BRET) BRET.. FRET (autofluorescence), (photoresponsive), (photobleaching) BRET. BRET (Resonance Energy). BRET FRET (luminescent material) (12)., Perkin Elmer BRET2 Renilla luciferase (Rluc), GFP2, FRET, DeepBlueC., A B, Rluc GFP2 A, B, ( 3). A, B,,,,. assay. BRET, DeepBlueC (DBC) Rluc GFP2 emission, DBC 39
5 3. BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer). DBC membrane,,, (Fluorescence Polarization; FP) -,, - DNA,,. (, ). (Anisotropy).. ( 4).,,. FP,. FP,, FP (Fluorescence Polarization) HTS (13)... cell-based assay. in vitro cellbased assay. cell-based assay FITC. (14), (15), (16), β- (17), (18), β- (11), (fluorescent protein) (19), 40
6 (Secreted placental Alkaline Phosphatase, SEAP) (20).., HCS,. p53 VEGF.,,.. (background activity) Kb... mrna.., Firefly luciferase,,,.,. Photinus Pyralis firefly luciferase (Fluc), 560nm 600nm. Fluc D-luciferin oxyluciferin.,, ATP.. ATP -ATP H 3 PO 4. LH2. LH2+ATP LH2-AMP+2H 3 PO 4 LH2-AMP. AMP (hv). LH2-AMP+1/2 O2 L-AMP*+H2O L-AMP* L+AMP+hv ( ) L, L-AMP* -AMP. LH2-AMP (1/2 O2)., ATP. ATP. 2 Mg2, Mn2, Co2 41
7 . 1,.. Fluc -, in vivo luciferin. 20., 1. ATP (4) Renilla luciferase Renillar reniformis Fluc renilla luciferase (Rluc). coelenterazine. Fluc,, ATP ATP. Fluc - in vivo. coelenterazine. 480 nm, 600 nm (5, 6).. 480nm BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) Secreted placental alkaline phosphatase (SPAP) SPAP Placental alkaline phosphatase 30. SPAR (21). p-nitrophenol phosphate, CSPD (22). 65 C endogenous alkaline phosphatases. HTS (FBS, Fetal Bovine Serum)... HTS Green fluorescence protein Green fluorescence protein (GFP) Aequorea victoria. cofactor (excitation wavelength) nm nm.,, GFP. 30 EGFP., ( 5). 42
8 Red fluorescence protein (RFP) R. Tsien Discosoma DsRed nm nm ( 5). 600nm. DsRed tetramer monomeric red flurescence protein (9)..,,,,, (High Throughput Screening, HTS)., HTS (23). QC,, (% Activity) IC 50, Ki, Km curve- fitting. HTS 5. (Excitation) (Emission)..,, (CCL),. 1990,. HTS,. 1 HTS. :. :. :.. 43
9 :. 384-well well ( 6). :.. : HTS 50%.,,. :,,,,. : HTS. :.. HTS,,., (Chemical Inventory),..,.,.,. 6. HTS 96-well.,.. HTS,. HTS,, 1 (, ) 2 ( ) (HCS), (24). HCS,,. HCS 44
10 7. HCS, Evotec Opera,,,, -,,,,.,.,,. 21 HTS ( 7). HCS,,,,,,.,,, DNA ( ),,, (device).,., (DNA),.,, DNA Chip ( ), Protein Chip ( ), Cell Chip ( ), Neuron Chip ( ), Chip, Lab-on-a-Chip SPR (surface plasmon resonance) BIOCORE SPR (surface plasmon resonance). SPR Da (Dalton)., ( 8). SPR. SPR,,. SPR HTS SPR, 45
11 8. SPR Sensorgram 9. caspase 2 SPR SPR image system. SPR sensor system, HTS (25) (Chemical chip) 1 (26). ( 9).. Schreiber 3,780 Ure2p, Ure2p Uretupamine (27) ,.. (28).,.,,,
12 CPU 10. ( 10)..,,.,, (pharmacophore),., false-postivie hit. ~,. hit ,.. HTS, HCS. 1. Schreiber, S. L. (1998) Chemical genetics resulting from a passion for synthetic organic chemistry. Bioorg. Med. Chem. 6, Kapur, R. (2002) Fluorescence imaging and engineered biosensors: functional and activity-based sensing using high content screening. Ann N Y Acad Sci. 961, Massoud, T. F. and Gambhir, S. S. (2003) Molecular imaging in living subjects: seeing fundamental biological processes in a new light. Genes Dev 17,
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