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서헉 방
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1 종설 J Korean Neurol Assoc / Volume 24 / April, 2006 신경과학분야에서의광학적분자영상 동국대학교일산병원신경과 김동억 Dong-Eog Kim, M.D., Ph.D. Department of Neurology, Dongguk University International Hospital, Goyang, Korea 분자영상 (molecular imaging) 은동물이나인간의생체내에서일어나는분자 / 세포수준의현상 (molecular/cellular events) 을감지하고영상화하는기술이다. 1,2 이들중일부기술은이미임상시험 (clinical trial) 에서기존의기술에비해월등히뛰어난결과 ( 전립선암전이진단율 90% vs. 35%) 를보여환자의진단및치료를위해임상에도입되기시작했다. 3 하지만현재분자영상이활발하게이용되고있는또하나의영역은의-생명기초과학연구 (biomedical basic research) 분야라할수있다. 실험동물을죽여서조직을얻지않더라도관찰하고자하는분자, 유전자, 단백질, 세포현상및면역화학적정보를실시간으로, 비침습적으로, 그리고반복해서얻어낼수있게해주기때문에, 기존의연구실작업 (bench work) 만으로는공략하기어려웠던 " 생물학적으로중요한질문들 " 의해결에도움을주는새 본논문은학술진흥재단의선도연구자지원사업 연구비의지원으로이루어졌음 로운도구로서자리잡아가고있다. 1,2 분자영상이요구하는특성들이근원적으로내재되어있는 PET (positron emission tomography) 4 등과같은핵의학영상기기뿐아니라, 최근에는 MRI (magnetic resonance imaging), CT (computerized tomography), 또는생물발광 / 형광영상 (bioluminescent/fluorescent imaging) 기기들을이용한분자영상기술들이빠른속도로개발되고있다. 사용되는영상기기들을살펴보면고가의최첨단장비도많지만, 중저가장비나형광현미경 (fluorescent microscopy) 처럼거의모든연구소에비치되어있는기본장비도많이있다. 하버드의대의분자영상연구센터 (Center for Molecular Imaging Research, Harvard Medical School) 의경우, 보유하고있는동물전용영상장비로 4-T MRI, SPECT-CT, multi-channel fluorescent imaging machine, FMT (fluorescent molecular tomography), bioluminescent imaging machine, intra-vital confocal fluorescent microscopy 등을들수있다. 연구자들이생체내의의미있는정보를알아내기위한영상화기법에빛을이용하기 (optical imaging technique) 시작한것은최근에들어서이다. 하지만, 광학영상은그유용성으로인해분자영상분야중에서도떠오르는별로주목받고있다. 5,6

2 김동억 Figure 1. Strong luciferase optical signals. Three minutes after the intra-perioneal injection of the substrate luciferin, bright signal is coming out of the transplanted 9L-glioma cells containing firerly luciferse gene. Emitting photons were captured for 1 sec. This image was the baseline data of an experiment, which was performed to investigate whether the RNAi treatment to suppress the luciferase expression could decrease the luciferase optical signals. 수있는지에관해서술하고자한다. 광학영상은크게생물발광영상 (bioluminescent imaging) 과형광영상 (fluorescent imaging) 으로나눌수있다. 7 생물발광영상 8 은발광동물이빛을내는원리를이용하는것으로서, 가장대표적인반딧불이 (firefly) 의예를들면루시페린 (luciferin) 이라는발광물질이루시페라제 (luciferase) 라는효소에의해산화되면서빛을내게된다. 일반적으로루시페라제유전자를, 연구자가추적관찰하기원하는세포나조직또는동물의유전자에주입 (transfection) 시키고영상획득직전에효소작용에필요한기질인루시페린을투여하는방법이사용된다 (Fig. 1). 형광영상이란세포, 조직, 또는생체내의형광물질이외부에서조사한빛을흡수한후흥분 (excitation) 되어좀더긴파장의빛을방출할 (emission) 때이를감지하여영상화하는것이다 (Fig. 2). 이때방출되는특정파장대 (spectrum) 의빛을선택적으로탐지하기위해서는광학영상기계나현미경에적절한필터가부착되어있어야한다. 생물발광영상이나형광영상모두 CCD (charged coupled device) 카메라를이용해화상을얻는경우가대부분인데, 생물발광영상의경우특히 -100 이상냉각이요구되는매우예민한 (super-sensitive) CCD 카메라가사용된 Figure 2. Colocalization of in vivo near-infrared fluorescent signals representing FXIII (coagulation factor 13) activity and superior sagittal sinus thrombus (SSS). Intense fluorescence signal is observed in the intravital fluorescence microscopy image 25 min after FXIII imaging probe injection. The H&E stained axial sections of the superficial brain at the location of the frontal tip of the thrombus signal (vertical yellow and blue lines) shows corresponding thrombus (yellow and blue arrows, respectively) in the dural venous sinus. Note that the adjacent thrombus in the branching vessel is also found in the corresponding H&E section (compare two blue asterisks). In addition, indocyanine green (ICG) leaked out of the SSS and bridging cortical vessels with parenchymal staining peaking at 25 min after the ICG injection, which reflects BBB disruption due to the cerebral venous sinus thrombosis. (scale bar=1 mm) 본종설에서는주로광학적분자영상에관한내용과이러한기술이신경과학연구, 특히신경줄기세포연구에어떻게응용될 다. 7 실험동물의생체내에이식된신경줄기세포의이주 (migration) 를생물발광영상을이용해영상화한연구중하나 9 를살펴보자. 반딧불이루시페라제유전자를주입시킨 C17.2-Luc 신경줄기세포를생쥐의뇌에이식하였고, 루시페린을복강주사한후 supersensitive CCD 카메라를이용하여이식된신경줄기세포에서발산되는광자 (photon) 를탐지함으로써영상을얻을수있었다. 광학영상은해상도가떨어지는것이단점이나, 생쥐의좌뇌에이식시킨신경줄기세포가뇌졸중이발생한우뇌로 2-3 주간에걸쳐이동하는것을생체상에서영상화할수있었다 (Fig. 3). 9 또한, 후속실험에서허혈과숙주면역체계의영향력으로인한신경줄기세포의증식과고사 / 괴사및그에따른세포생존도를실험그룹간에정량비교할수있었다. 10 이처럼생물발광영상은정량화가용이하다는장점을가짐으로써, 기존의병리조직학적실험기법들을이용할경우많은시간과노력을들여서야얻을수있었던정보를쉽고또한보다정밀하게얻어낼수있는도구역할을할수있다. 그리고, 광학영상을포함한생체분자영상기술 (in vivo molecular imaging technique) 을이용한실험들은, 서로다른시간대의서로다른동물의조직절편에서얻은결과들을바탕으로하나의개체내에서일어났을것으로추정되는모종의추세 (assumptive time course) 를간접적으로판단하는기존의연구들과는달리실제로같은개체에서시간간격을두고반복적으로관심있는생명현상을

신경과학분야에서의광학적분자영상 Figure 3. Intraparenchymal injection of neural precursor cells, transfected with fire-fly luciferase reporter gene, contralateral to a site of superficial MCA infarction.

3 신경과학분야에서의광학적분자영상 Figure 3. Intraparenchymal injection of neural precursor cells, transfected with fire-fly luciferase reporter gene, contralateral to a site of superficial MCA infarction. Cells are initially seen at the injection site and then migrate to the infarct, crossing the midline by day 7 (D7), with subsequent increasing photon emissions at the infarct. 생체상에서직접관찰할수있다는것이차별화된장점이라할수있다. 또다른연구에서는, 신경교종세포주 (9L-glioma cell line) 가 Renilla 루시페라제를발현하도록조작한뒤생쥐의뇌에이식시켜자라게하고, 종양을고사시키는 TRAIL (Tumor Necrosis Factor Related Apoptosis-Inducing Ligand) 을분비하도록만든신경줄기세포가반딧불이루시페라제를발현하도록만든후이식된뇌종양의주변부뇌에주입시켰다. 기질인반딧불이루시페린을복강주사한후영상을얻어신경줄기세포가증식하면서병변인종양을향해이주하는모습을관찰할수있었고, Renilla 루시페린을정맥주사한후영상을얻어신경줄기세포에서분비되는 TRAIL 에의해종양의크기가줄어드는모습을얻을수있었다. 11 그리고후속실험에서고사의진행에중요한효소인 caspase 에의해펩타이드의특정부위가잘려야만루시페라제에의해빛을낼수있도록변형된새로운형태의기질인 DEVD- 루시페린을복강주사하여얻은 caspase 활성도영상을통해서크기가줄어들고있는종양에고사가광범위하게진행되고있는모습을영상화할수있었다. 12 광학영상과달리, MRI 와 iron oxide 나노입자를이용한세포표지기술 (cell labeling techniques) 13 을사용하면생체내에주입된세포의시간대별분포를적어도수일간에걸쳐 µm 수준의해상도로영상화할수있다. 13,14 Weissleder에의해개발된후상용화된 MION (magnetic iron oxide nanoparticle) 이나현재상용화과정을밟고있는 CLIO (cross-linked iron oxide nanoparticle) 등과같은나노입자들은 T2- 증강 MRI 에서저음영으로관찰되기때문에주로고음영으로보이게되는병변에대비되어뛰어난대조를보여준다. 정맥내로주입된세포독성 T-림파구가종양으로이주하는것을영상화하고, 그 MR 영상에서픽셀당몇개의세포가분포하는지를 3차원으로재구성할수있음을보여준연구가그예이다. 14 세포내로나노입자가들어가서표지 (labeling) 되도록하기위해, 나노입자를 dextran 으로코팅 (coating) 시킨후인간면역결핍바이러스 (HIV) 가세포에침투할때필수적인단백질인 TAT-peptide 를부착시켰다는것이흥미로운점이다. 그리고, 이표지자 (probe) 에 FITC (fluorescein isothiocyanate) 또는 Cy5 fluorochrome 을부착시켜 (fluorochrome labeled TAT-crosslinked iron oxide nanoparticle TAT-CLIO) 영상화실험을마친후해당동물을희생시켜얻은조직절편의면역조직화학 (immunohistochemistry) 연구를용이하게하였다. 이러한 MR-Fluorescence 이중보고자 (dual reporter) 의경우향후인체에적용될경우또다른장점을가질수있다. 즉, 이이중보고자가뇌종양세포를탐지한뒤세포내에침투하여 MRI 신호를생성함으로써뇌종양의정확한경계를영상화하여수술계획수립에도움을주게되고, 수술장에서는수술중실시간형광현미경 (intra-op live fluorescent microscopy) 를통해매우적은양의종양세포에서방출하는시그널까지실시간으로탐지가능케하여절제경계선 (resection margin) 의결정을정밀하게해줌으로써, 결과적으로수술후잔류뇌종양덩어리 (residual tumor foci) 를최소화할수있는새로운방법을제시할수도있을것이다. 15 뇌혈관의혈전형성에중요한효소중하나인 FXIII (coagulation factor 13) 의활성도와혈전증에수반되는뇌부종을대뇌정맥동혈전 (cerebral venous sinus thrombosis) 모델에서영상화하는데성공한연구 16 에서볼수있듯이 (Fig. 2), 형광영상도생물발광영상과더불어신경과학연구에있어매우유용한광학영상의또다른분야라하겠다. 이런형광영상의발전에크게기여한연구중하나가영상화를목표로하는특정효소에

4 김동억 의해서만활성화되는형광보고자 (fluorescent reporter) 의개발이었다. 17 Cathepsin probe 18 나 MMP (matrix metalloproteinase) probe 19 가그대표적인예이다. 항상시그널을발산하기때문에영상화를목표로삼은생리 / 병리학적현상이외에도혈류량과혈류분포에의해시그널분포가쉽게영향을받는소위켜있는 probe (on probe) 들과달리위 probe 들은 cathepsin 이나 MMP 같은특정단백분해효소 (protease) 가 probe 의특정부위를잘라주어야만 (proteolysis) 형광시그널을발산한다. 따라서종양과기타각종염증부위에집결한대식세포 (macrophage) 가생산하는 cathepsin 효소의활성도나종양의전이와허혈성심장뇌손상및동맥경화증등에서중요한역할을하는 MMP 효소의활성도를영상화할수있게되는것이다. 6 예를들어이런단백분해효소들은파열되기쉬운동맥경화반에서생산되어강한활성을보이기때문에, 이것들을영상화할수있으면심장마비나뇌졸중등을일으킬위험성이높은동맥경화반을선택적으로가려내거나새로이개발된약물의치료효과를보다의미있게측정할수있는지표로도사용할수있게되는셈이다. 20 이러한특정단백분해효소들이외에범용보고자 (universal reporter) 로널리사용되고있는 beta- galactosidase 21 의생체내활성도의영상화에도성공하였으며, 앞으로신경과학을포함한각종기초연구에널리사용될수있으리라생각된다. 최근에는 high-throughput robot system 을이용하여각종종양이나심-뇌혈관동맥경화같은질환에특이한표적 (target) 을탐지해내는펩타이드 (peptide) 를찾기위해 differential phage display 기법을이용한각종유전자서고선별법 (library screening) 이수행되고있다. 22 이런자동화대규모선별과정을통해새로이규명된펩타이드들중하나인 colon cancer specific cyclic RPMC peptide motif 에 fluorochrome 을부착시킨후대장암이있는생쥐에정맥주입하고나서, 최근개발된생쥐용소형형광내시경 (miniaturized multichannel near-infrared fluorescence endoscopes for mouse imaging) 을이용하여종양부위를쉽게탐지해낼수있었다. 22 의미있는분자수준의표적들을 in vitro 로찾아내는것에그치지않고, 그생체적용가능성을생체영상 (in vivo imaging) 기법들을이용하여쉽게검증해볼수있는연구체계를내재하고있다는점이분자영상기술을이용하여연구를수행할경우에얻을수있는장점중의하나라고생각된다. 또한가지주목해야할사실은이렇게해서얻어진 targeted imaging probe 들이진단을위한도구에그치지않고약물운반 (drug delivery) 의도구로사용될수있다는점이다. 23 상기의 RPMC 펩타이드표지자연구에서도종양을고사시키는펩타이드를붙임으로써 질병의영상진단과더불어치료제가병변에선택적으로도달했는지를모니터링할수있음을증명하였다. 22 결론 분자영상기술은생체내의다양한분자현상을영상화할수있도록해주고, 따라서기존의영상기술이주로제공해온해부학적데이터에또다른차원의정보를추가시킴으로써환자의진단과치료에혁신을가져올것으로기대된다. 그러나, 이런용도에못지않게, 분자영상은신경과학을포함한의-생명기초과학연구에서매우요긴하게사용할수있는혁신적인도구로서도빠르게자리잡아가고있다. 6 결론적으로, 분자영상은 genomics, proteomics 의발전을토대로한분자의학시대를이끌어가는데있어중추적역할을담당할것이다. REFERENCES

5 신경과학분야에서의광학적분자영상

Kaes010.hwp

Kaes010.hwp 갑상선자극호르몬이갑상선암세포의 VEGF, 신생혈관형성, 성장, 침윤및전이에미치는영향 Effects of TSH on the Production of VEGF, Angiogenesis, Growth, Invasion and Metastasis in Thyroid Cancer Cells Euy Young Soh, M.D., Hee Boong Park, M.D.,