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운경 증
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1 1 제브라피쉬 (zebrafish) 의망막에서시냅스계층형성과 표적화에대한최근연구동향 김규원 *, 안종찬, 이효종 서울대학교약학대학 To whom correspondence should be addressed. * 목차 1. 척추동물의망막구조와시냅스연결 2. 제브라피쉬의망막에서무축삭세포의계층화패턴 3. 망막세포의계층화기전 4. 참고문헌

2 1. 척추동물의망막구조와시냅스연결 척추동물의망막 (retina) 은중추신경계에서층상화가가장잘이루어진구조를갖고있으며, 신경회로 (neural circuit) 의형성과그특별한기능을연구하는데많이이용되고있다. 특히, 망막을이루고있는여러가지세포들과이들상호간의시냅스연결은뉴런의표적화를연구하는데유용하다 (Brown et al., 2000; Feldheim et al.

2 2 1. 척추동물의망막구조와시냅스연결 척추동물의망막 (retina) 은중추신경계에서층상화가가장잘이루어진구조를갖고있으며, 신경회로 (neural circuit) 의형성과그특별한기능을연구하는데많이이용되고있다. 특히, 망막을이루고있는여러가지세포들과이들상호간의시냅스연결은뉴런의표적화를연구하는데유용하다 (Brown et al., 2000; Feldheim et al., 2000; McLaughlin et al., 2003). 망막을구성하는세포는빛을받아들이는 photoreceptor로기능하는원추세포 (cone cell) 과간상세포 (rod cell), 양극세포 (bipolar cell), 무축삭세포 (amacrine cell), 그리고망막신경절세포 (retinal ganglion cell, RGC) 등의뉴런과이들을지지해주는 Muller glial cell로이루어져있다. 이렇게많은신경세포들은망막내에서정교한시냅스를통하여서로에게시각정보를전달한다. 망막내에서의시냅스연결은주로내망상층 (inner plexiform layer, IPL) 과외망상층 (outer plexiform layer, OPL) 에서이루어지며, 망막의출력세포 (output cell) 인망막신경절세포 (retinal ganglion cell, RGC) 는뇌로최종적인시각신호정보를전달해준다. 양극세포 (bipolar cell) 는광수용세포 (photoreceptor) 로부터정보를받아외망상층과내망상층을거쳐신경절세포로시각정보를전달해준다 (Mumm et al., 2005). 이때, 내망상층에서무축삭세포 (amacrine cell) 는여러개의신경다발을이용하여신경절세포로들어가는시각정보를조율해주는역할을한다 ( 그림 1). Pigment epithelium photoreceptors Outer nuclear layer Outer plexiform layer inner nuclear layer inner plexiform layer Ganglion cell layer 그림 1. 망막을구성하는세포의모식도 (

3 중추신경계에서정확한시냅스연결을형성하는것은그기능에있어서매우중요하다. 그러나발생과정동안에뉴런들이어떻게서로연결되는지에대해서는명확히알려지지않았다. 아마도광범위한형태학적, 분자적, 그리고생리학적인요인들이시냅스형성을조절하여총체적인 targeting에영향을줄것으로추측이된다.

3 3 중추신경계에서정확한시냅스연결을형성하는것은그기능에있어서매우중요하다. 그러나발생과정동안에뉴런들이어떻게서로연결되는지에대해서는명확히알려지지않았다. 아마도광범위한형태학적, 분자적, 그리고생리학적인요인들이시냅스형성을조절하여총체적인 targeting에영향을줄것으로추측이된다. 그중에서내망상층을이루고있는연접전뉴런 (presynaptic neuron) 인양극세포와연접후뉴런 (post-synaptic partner) 인신경절세포사이의결합은비교적연구가잘되어있다. 내망상층은크게두개의층으로구성되어있으며, 각각을 ON sublaminae와 OFF sublaminae 라고부른다 (Chalupa and Gunhan, 2004). 이러한두층은빛의강도에따라신호를조절하여시각정보를효과적으로전달하게해준다또한각각은다층 (multiple strata, s1~s5) 으로구성되어있다 ( 그림 2). 실제로, ON 과 OFF층에서는서로다른독특한시냅스가존재하며, 이러한시냅스의특이성은뉴런들이자신의하층 (sublaminae) 으로수상돌기 (dendrite) 나시냅스분지 (synaptic arbor) 를뻗어시냅스를형성하는과정에서이루어질것으로예상이된다. 본리뷰에서는투명하기때문에발생과정연구의 in vivo 모델로서적합한제브라피쉬를이용하여망막의내망상층에서일어나는층상회로 (laminar circuit) 형성에관해소개하고자한다. 그림 2. 내망상층을이루는두층 (ON/OFF) 과이를세분화하는 multiple strata (s1~s5). 내망상층안에있는두층 (On/Off) 에서양극세포 (bipolar cell) 와신경절세포 (ganglion cell) 가서로다른형태로시냅스를형성하고있다. (

4 4 2. 제브라피쉬의망막에서무축삭세포의계층화패턴 제브라피쉬는발생 3일까지어느정도의투명성을유지하기때문에내망상층에서층상구조형성을관찰하는데유용하게이용된다. 또한발생이빨리진행되는데, 발생 12시간에는형태학적으로눈의원시세포가관찰되고, 32시간에서 48시간에망막신경절세포의분화가시작되며, 점점안쪽경계면으로이동하게된다. 발생 50시간째에는무축삭세포의분화가끝나고, 60시간째에는양극세포가형성된다. 또한발생 48시간이후에는내망상층이점차형성되기시작해서 72 시간째에는명확하게 ON sublaminae와 OFF sublaminae의두층으로구분된다. 이러한사실은망막세포에서 GFP( 녹색형광단백질 ) 을발현하도록만들어진형질전환제브라피쉬에의해이용하여증명되었다. 그중에서무축삭세포를관찰하는데이용되는 Pax6-DF4:GFP transgenic을예로들수있겠다. DF4 sequence 는 pax6 locus의첫번째 intron내에위치한 58bp의 enhancer element이며이것을통해무축삭세포에특이적으로 GFP를발현시킬수있다. 그림 3 에서 Pax6- DF4:mGFP lines을이용하여내망상층에서무축삭세포의신경돌기가형성되는과정과주변세포와시냅스를이루어정보를전달하는모습을볼수있다. 발생 30시간에서부터망막의신경세포발생이일어나는데, 그림 3A에서보면신경세포발생이일어남에따라신경아세포에서 GFP의발현이점점감소되면서동시에무축삭세포로 GFP발현이제한적으로나타나는것을볼수있다. 그림 3B에서는 GFP를발현하는무축삭세포가점점내망상층의형성에기여한다는것을실시간공초점이미지로보여주고있으며, 그림 3C에서는내망상층의두층 (On/Off) 형성이이루어지는것을나타내고있다 (Kay et al., 2004). 또한제브라피쉬의형태적결함에기초를둔돌연변이생성유도에의한선별법을통해계층화패턴을알아볼수있다. 최근들어, 신경절세포가내망상층의형성에미치는영향을연구하는과정에서, lak mutant 사용한것이한예라하겠다. lakritz (lak) 유전자는신경절세포의형성에필수적인 bhlh 전사인자 Ath5 (Atonal homologue 5) 단백질을생성한다. lak mutant시스템을이용한결과를보면, 신경절세포가없는조건에서도무축삭세포상호간의긴밀한연결이형성되면서내망상층의구조가충분히만들어지는것으로나타났다. 이는망막의시냅스층이형성될때신경절세포가무축삭세포의계층화에일시적인역할을할것이라는기존의가설과상반되는것이다. 여기서우리는두가지가설을생각해볼수있는데, 첫째는무축삭세포서로간에계층화단서를주고받아서내망상층구조가형성될수있다는것이고, 둘째는, 주변세포와의영향이계층화를이루는데어떤단서를제공할수있다는것이다. 그림 4A 에서보면 lak mutant의초기내망상층형태가망가진것을볼수있으나, 시간이지날수록점차로내망상층이정상으로돌아오는것이관찰되었고, 일부분에서만비정상적인모습을보였다.

5 그림 3. Pax6-DF4:mGFP line의내망상층 (IPL) 에서무축삭세포가이동하는모습. (Kay et al., 2004). (A, B) GFP발현이신경아세포 (neuroblast) 층에서무축삭세포층으로이동하고있으며, 시간이지날수록 GFP발현이무축삭세포층으로제한됨을볼수있다.

5 5 그림 3. Pax6-DF4:mGFP line의내망상층 (IPL) 에서무축삭세포가이동하는모습. (Kay et al., 2004). (A, B) GFP발현이신경아세포 (neuroblast) 층에서무축삭세포층으로이동하고있으며, 시간이지날수록 GFP발현이무축삭세포층으로제한됨을볼수있다. (Arrowheads: 무축삭세포, Arrow: 내망상층이형성되는위치 ) (C) 두하층 (ON/OFF) 이형성되는모습을자세히보여주고있으며, 특히 74시간째에는내망상층으로서의모습을갖추면서완전히두층 (ON/OFF) 으로구분되는것을관찰할수있다. (Arrowheads: 시간대별로동일위치표시 )

6 그림 4. lak 돌연변이정상 (wt) 에비해내망상층구조가망가진 lak돌연변이의망막 (A). 발생 4~7일째 lak 돌연변이의내망상층계층화구조가거의정상으로돌아왔으며, 부분적으로만이상이있다 (B).

지금까지살펴본바와같이, 망막의발생에있어서처음생겨나는신경절세포가내망상층의계층화에필수적이지않고무축삭세포상호간의작용이내망상층의시냅스하층형성에충분하다면, 어떻게무축삭세포가계층화패턴을완성시킬수있을까?

초기에무축삭세포들은특정한방향성을갖지않지만, 시간이지나면서점차로신경절세포층으로활발한움직임을보이면서무축삭세포의신경돌기들은내망상층에서시냅스층상구조를형성한다.

6 6 그림 4. lak 돌연변이정상 (wt) 에비해내망상층구조가망가진 lak돌연변이의망막 (A). 발생 4~7일째 lak 돌연변이의내망상층계층화구조가거의정상으로돌아왔으며, 부분적으로만이상이있다 (B). (Kay et al., 2004). 지금까지살펴본바와같이, 망막의발생에있어서처음생겨나는신경절세포가내망상층의계층화에필수적이지않고무축삭세포상호간의작용이내망상층의시냅스하층형성에충분하다면, 어떻게무축삭세포가계층화패턴을완성시킬수있을까? 이에대해서는아직알려진바가없지만공초점라이브이미징을이용한무축삭세포의활동성에대해서는다음과같이연구가되어있다. 초기에무축삭세포들은특정한방향성을갖지않지만, 시간이지나면서점차로신경절세포층으로활발한움직임을보이면서무축삭세포의신경돌기들은내망상층에서시냅스층상구조를형성한다. 발생후 51 시간에는무축삭세포의분화가끝나게되는데, 그림 5에서는발생후 54시간째에무축삭세포가본격적으로신경절세포방향으로자신의신경돌기를뻗으며이동하는모습을공초점실시간이미징을통해볼수있다. 이때, 세포체에서뻗어나오는다발돌기들이얼마나활동적인지한눈에알수있으며, 마치갯벌에서낙지한마리가먹이를찾아헤매면서다리를여기저기쭉쭉뻗는모습을연상할수있으며 ( 그림 6), 이런활동적인움직임은아래사이트에서동영상으로확인해볼수있다. (

7 7 그림 5. 발생후 54 시간 0~100분, 공초점실시간이미징을통해본무축삭세포의이동무축삭세포의신경돌기가수축 (retraction, r) 과이완 (extension, e) 을통해내망상층에서분지를뻗어나가며자신의영역을만들고있다. (Godinho et al., 2005) 그림6. 무축삭세포이동에관한모델. 무축삭세포는아직알려지지않은신호를받아신경절세포층 (GCL) 쪽으로이동하면서이웃한다른무축삭세포들과함께신경돌기분지를내망상층 (IPL) 에뻗어간다. 그러나이러한 targeting에대한

이렇게초기에 OFF layer에편중되는현상은신경돌기들이처음접하는부분이 OFF layer이기때문일수도있다. 그리고 ON layer로계층화되는무축삭세포의신경분지들은어떠한단서가더필요할는지도모른다.

8 8 기작은아직명확히알려지지않았다. 무축삭세포가내망상층내에서특정한세포층 (ON 또는 OFF) 으로만수상돌기분지 (dendritic arbor) 를국한시키는기작은무엇일까? 그림 7에서보면무축삭세포가신경돌기분지를내망상층의 OFF layer로뻗어나가는것을볼수있으며, ON sublaminae보다는 OFF layer쪽에분지들이편중되는경향을보이고있고, 내망상층을따라양옆으로확장되는것을관찰할수있다. 이렇게초기에 OFF layer에편중되는현상은신경돌기들이처음접하는부분이 OFF layer이기때문일수도있다. 그리고 ON layer로계층화되는무축삭세포의신경분지들은어떠한단서가더필요할는지도모른다. 그림 8에서는 ON과 Off에각각계층화된무축삭세포들을보여주고있다 (Godinho et al., 2005). OFF 그림 7. OFF layer 로계층화된무축삭세포 (Godinho et al., 2005) OFF ON OFF ON 그림 8. ON/OFF layer 에각각계층화가이루어진무축삭세포 (Godinho et al., 2005)

9 9 3. 망막세포의계층화기전 지금까지살펴본바에따르면, 연결뉴런 (interneuron) 과투사뉴런 (projection neuron) 들은각각의시냅스연결대상에표적화하기위해다양한전략을사용하고있는것처럼보인다. 무축삭연결뉴런 (amacrine interneuron) 이시냅스연결대상인신경절세포수상돌기 (ganglionic dendrite) 와표적화를이루기위해, 신경절세포방향으로이동을하며, 어느정도신경절세포근처로이동을한후에는내망상층안으로수상돌기분지를국한시킨다. 이과정에서다발성수상돌기들은확장과수축을반복하며, 결국신경절세포쪽으로방향을잡게된다. 이러한과정을소위다발성분지화과정이라고부르는데, 무축삭세포의이러한과정은대뇌신경피질 (neocortex) 에서투사뉴런과거대한추상뉴런세포 (pyramidal neuron) 가세포체전좌 (somal translocation) 나신경교세포의유도에의한이동과유사하다. 이렇게무축삭세포의세포체가내핵층에자리를잡은후에도세포체로부터나오는신경돌기들이확장과수축을반복하며신경절세포쪽으로방향을잡는것은내망상층안이나, 그주변에서나오는어떠한단서를인지했기때문일지도모른다. 특히무축삭세포의신경분지가 ON 또는 OFF sublaminae에선택적으로분지를형성한다는사실은하층마다특이한요인이존재할가능성을시사한다 (Stacy and Wong, 2003). ( 그림 9) 그림 9. 각각의하층 (sublamina) 별로특이적인분지를형성하는무축삭세포들의계층화과정 그렇다면그단서가되는것들은무엇일까? 두가지가능성이존재하는데첫째는, 세포와세포간의직접적인물리적, 화학적상호작용이무축삭세포의계층화를유도한다는설이있고, 둘째는, 어떤핵심이되는분자의농도차때문에

10 10 계층화가일어난다는주장이있다. 예를들어, 중추신경계의중뇌좌우상구 (superior colliculus) 부분에서는 ephrin분자의농도차가전후방향 (anteroposterior) 과내외방향 (mediolateral) 에걸쳐형성되어, 결국시각정보망인망막지도 (retinotopic map) 를형성하는데중요한역할을한다고알려져있다. 이와같은경우는세포간격이생체내에서농도차가형성될수있는밀리미터 (mm) 단위이다. 그러나 retina 층은어떠한가? ON, OFF sublaminae와이를세분화하는다발계층의간격은단지마이크로미터 (um) 단위이다. 이러한환경에서는분자적인농도차가형성되는것이의미가있기보다는세포와세포간의상호작용이더의미있는단서가될것으로예상이된다. 세포간의상호작용에의미가있어보이면서무축삭세포신경돌기의표적화에영향을줄것으로기대되는것들중에는접착분자 (adhesion molecules) 들이유력한후보로떠오르고있다. 그중 sidekick (Sdk) 1과 2는각각발현되는부위가다르기때문에세포간의상호작용에관계될것으로생각된다. Sdk 1은 ON sublamina에, 그리고 Sdk 2는 OFF sublamina에서각각발현된다. 또한 cadherin 분자는내망상층내에서발현되기때문에시냅스특이성에영향을줄것으로생각된다. 또한그밖에신경절세포의수상돌기 (ganglion cell dendrites) 에서발현되는분자들역시시냅스형성과유지, 변화와소멸에필요한 post-synaptic protein으로서중요한의미가있어보인다. 최근관심의대상이되고있는골격단백질 (scaffold protein) 또는 post-synaptic density(psd) protein들은시냅스연접부위에서발현되어다양한역할을하는것으로보고되고있다 (Kim and Sheng, 2004). 이들의그물망은시냅스의기본골격을형성할뿐만아니라, 신경전달활동에도큰영향을주는것으로알려져있기때문에세포간상호작용을이용한무축삭세포의 targeting에도중요한의미가있을것으로사료된다. 이렇게직접적인접촉을이루고있는세포상호간의작용이시냅스의특이성를결정하는데중요하게작용하겠지만, 혹시그주변에있는다른세포들에게서부터오는영향은없는것일까? 예를들어양극세포와 Muller glial cell들역시내망상층에서주요한위치를차지하고있는것또한사실이다. 그러나이들의분화는늦게이루어지기때문에초기계층화에대한단서를제공한다고결론지을수는없을것이고, 계층화의유지및시각회로형성에관여할것으로생각이된다. 그리고신경세포발생초기에원래의무축삭세포집단에서떨어져나와신경절세포쪽에위치하고있는전위무축삭세포 (displaced amacrine cell) 가일부발견되고있는데, 이들에대한재조명이또한이루어지고있다. 전위무축삭세포들이정상적으로위치하고있는무축삭세포의신경돌기를표적화시킬기질로서역할을할것으로생각되고있기때문이지만, 아직확실하지는않다. 정상적인무축삭세포가신경절세포와상호작용을하던지, 또는전위무축삭세포와상호작용을하던지간에초기에형성된신경돌기분지 (neuritic arbor) 는후에계

11 11 층화과정을완성할수있도록뼈대를만들어주는골격으로서역할을할수있다. 이때역시유전적으로프로그램된내부요인들이 laminar의선택성에영향을줄것으로생각된다. 지금까지본리뷰에서는실시간공초점이미징을이용하여무축삭세포의수상돌기분지가내망상층에서계층화되는과정과, 제브라피쉬의망막에서회로형성을조절하는기작에대한여러가지가능성에대해알아보았다. 계층화를조절하는요인에대해서아직확실한설명을할수는없지만, 이러한실시간이미징을통한세포의변화를관찰하는것은내망상층에서시냅스표적화를연구하는데중요한역할을할것으로기대된다. 4. 참고문헌 1. Brown, A., Yates, P. A., Burrola, P., Ortuno, D., Vaidya, A., Jessell, T. M., Pfaff, S. L., O'Leary, D. D. and Lemke, G. (2000). Topographic mapping from the retina to the midbrain is controlled by relative but not absolute levels of EphA receptor signaling. Cell 102, Chalupa, L. M. and Gunhan, E. (2004). Development of On and Off retinal pathways and retinogeniculate projections. Prog. Retin. Eye Res. 23, Feldheim, D. A., Kim, Y. I., Bergemann, A. D., Frisen, J., Barbacid, M. and Flanagan, J. G. (2000). Genetic analysis of ephrin-a2 and ephrin-a5 shows their requirement in multiple aspects of retinocollicular mapping. Neuron 25, Godinho, L., Mumm, JS., Williams, PR., Schroeter, EH., Koerber, A., Park, SW., Leach, SD., Wong, RO (2005). Targeting of amacrine cell neurites to appropriate synaptic laminae in the developing zebrafish retina. Development 132(22): Kay, JN., Roeser, T., Mumm, JS., Godinho, L., Mrejeru, A., Wong, RO. and Baier, H. (2004). Transient requirement for ganglion cells during assembly of retinal synaptic layers. Development 131, Kim, E. and Sheng, M. (2004). PDZ domain proteins of synapses. Nature Rev. Neurosci. 5: Review 7. McLaughlin, T., Hindges, R. and O'Leary, D. D. (2003). Regulation of axial patterning of the retina and its topographic mapping in the

12 12 brain. Curr. Opin. Neurobiol. 13, Mumm, J. S., Godinho, L., Morgan, J. L., Oakley, D. M., Schroeter, E. H. and Wong, R. O. (2005). Laminar circuit formation in the vertebrate retina. Prog. Brain Res. 147, Stacy, R. C. and Wong, R. O. (2003). Developmental relationship between cholinergic amacrine cell processes and ganglion cell dendrites of the mouse retina. J. Comp. Neurol. 456, Disclaimer: "BioWave" is not political. The views and opinions expressed by its writers do not necessarily reflect those of the Biological Research Information Center(BRIC). c Copyright 2006, the Biological Research Information Center(BRIC), Pohang , Korea. 본글의저작권은 " 생물학연구정보센터 BioWave" 에있습니다. 일부내용인용시 " 생물학연구정보센터 BioWave ( Vol. 8 No. 3" 으로정보출처를밝혀야합니다. 전체내용에대한인용시생물학연구정보센터의사전허락 (mail: biowave@bric.postech.ac.kr Tel: ~8) 을받으신후전재가가능합니다. ( 단. 원저작자의경우는정보출처만밝히시면됩니다.)

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Microsoft Word - pv_0602.doc 1 씨감자 생산 체계와 바이러스병 검사 (화란체계를 중심으로) 함 영 일 대관령원예농협 기술자문위원 To whom correspondence should be addressed. E-mail :yih0512430@yahoo.co.kr 목 차 1. 서언 2. 화란 씨감자 생산단계와 검사 2.1. 보증된 씨감자의 중요성 2.1.1. 최소한의 질적 요구조건 2.1.2.