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정 감
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ISSN(print) 1226-5012 21(1):69-76, March 2016 < 초청논문 > http://dx.doi.org/10.14479/jkoos.2016.21.1.69 Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina Seo-young Kang 1,3, Ji Eun Hong 2, Eun jung Choi 1,2, and Jungmook Lyu 1,3 * 1 Dept.

1 ISSN(print) (1):69-76, March 2016 < 초청논문 > Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina Seo-young Kang 1,3, Ji Eun Hong 2, Eun jung Choi 1,2, and Jungmook Lyu 1,3 * 1 Dept. of Medical Science, Konyang University, Daejeon 35365, Korea 2 Dept. of Optometry, Konyang University, Daejeon 35365, Korea 3 Myung-Gok Eye Research Institute, Konyang University, Seoul 07301, Korea (Received October 24, 2015: Revised December 23, 2015: Accepted February 29, 2016) Purpose: The study was conducted to determine that photoreceptors of mouse having pigment in RPE(retinal pigment epithelium) can be damaged by blue-light and apoptosis of specific cells among photoreceptors are induced by blue-light, and to assist the investigation of AMD(Age-related macular degeneration) mechanisms and development of AMD drugs. Methods: C57Black mice were injured by irradiating 2800±10 lux of 463 nm LED for 6 hours after 24 hours dark adaptation and eyes were enucleated 1, 3, 7 days. Damage of retina induced by blue-light was determined by western blotting GFAP(Glial fibrillary acidic protein) expression. In the light-injured retina, cell death of photoreceptors was determined by TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling) assay. ERK(Extracellular signalregulated kinases), JNK, and SRC(sarcoma) expression were assessed by western blotting to determine regulated pathway. Blue light-injured retina were immunostained with antibodies against Opsin and Rhodopsin as markers of photoreceptors to compared the damage cone cells with rod cells. Results: After 1, 3 and 7 days from exposure to bluelight, thickness of retina was more decreased than control, and more decreased at nuclear layer than at outer plexiform layer and GFAP expression was increased day 1 after blue-light injured. While phosphorylated ERK and SRC protein expressions at day 1 were increased after blue-light injured, phosphorylated c-jun was decreased. Fluorescence intensity analysis showed that markers of cone and rod cells were decreased after blue-light injured and Opsin was more decreased than Rhodopsin. Conclusions: The study suggests possibilities that the blue-light promotes retinal damage and causes apoptotic cell death via ERK and SRC pathway in mouse retina, and blue-light retinal damage is more induced cone cells apoptosis than rod cells directly. Key words: Blue-light, Retinal photoreceptor cells, Apoptotic cell death, Opsin, Rhodopsin 서론망막에도달할수있는빛의파장대는 400 nm에서 1400 nm 이고, 이중우리가인식할수있는빛의파장영역 ( 가시광선 Visible light) 은약 400 nm에서 700 nm 파장대의빛이다. [1] 망막에는가시광선을인식하기위해빛을받아들이는광수용세포가존재하며특성화된발색단 (chromophore) 들이분포되어있다. 광수용세포중원뿔세포의발색단은 S-옵신 (S-Opsin), M-옵신 (M-Opsin), L-옵신 (L-Opsin) 이고, 막대세포의발색단은로돕신 (Rhodopsin) 이라불린다. [2] 망막은빛을받아들이기에최적화되어있지만, 망막에대한빛의독성연구도활발히이루어져왔다. 빛에대한독성은열손상, 기계적손상, 광화학손상등 3종류의손상으로분류할수있는데, 열손상은강한빛을망 막에서흡수하여국부의온도상승으로나타나며, 기계적손상은레이저등의짧은파장의빛을단시간동안조사함으로인해망막이기계적으로파괴되는것이고, 광화학손상은가시광선을장시간조사함에따라발생하는것이다. [2] 본연구에서는푸른빛을띠는가시광선인청색광의독성을망막의광화학손상과연결지어밝히고자하였다. 가시광선중에서도파장이짧고에너지가큰파장대의빛은망막에치명적인손상을입힐수있는데, 이에해당하는빛중 청색광 이라고불리는푸른색의 nm 파장대영역이망막에대한광독성연구에많이이용되었다. [1-5] 청색광은일반적으로디스플레이에포함된 LED(Light emitting diode) 에서많이방출되는데그범위는손바닥만한스마트폰에서부터차의전조등과대형 LED 전광판스크린까지다양한기기를통해접할수있 *Corresponding author: Jungmook Lyu, TEL: , lyujm5@gmail.com 69

2 70 Seo-young Kang, Ji Eun Hong, Eun jung Choi, Jungmook Lyu 다. [3,5] 심지어는해외에서교통신호로쓰이고있는이청색광이최근연구들에서노인성황반변성 (AMD: Agerelated macular degeneration) 의발생과정을촉진한다고보고된바있다. [2,5] 노인성황반변성은나이가들면서황반에드루젠, 망막색소상피위축, 맥락막신생혈관등변화가생겨시력상실을초래하는질환이며우리나라를포함한선진국에서 60 세이상성인의중심시력상실을초래하는가장흔한원인중하나이다. [1,3] 연구에따르면청색광으로인해증가된산화스트레스가망막색소상피세포를악화시키고사멸을유도하여밀접해있는광수용세포의사멸까지유도한다고보고하고있다. [1,3] 해부학적측면으로접근한논문들에서는청색광을조사했을때특히광수용세포가포함된외핵층의전체적인두께가감소한다고밝히고있어, [6] 안경원에서청색광을차단하는안경렌즈까지판매가되고있지만, 청색광이망막에손상을주는명확한기전은아직불분명하다. 빛을받아들이는세포인광수용세포는막대세포와원뿔세포로이루어져있는데, 원뿔세포는각각 Red(Long wavelength), Green(Medium wavelength), Blue(Short wavelength) 파장대를받아들이는발색단을가진세포로나누어진다. [3,4,5] 각원뿔세포의구성단백질중 L-옵신은 nm, M-옵신은 nm, S-옵신은 nm 파장대의빛에반응한다. [3,6,7,8] 이는청색광이망막색소상피세포의손상과는독립적으로광수용세포에직접적인손상을줄수있으며, 손상을입는정도는각광수용세포마다다를수있다는가능성을보여준다. 본연구에서는이와같은가설을망막색소상피층에색소가존재하는마우스의망막을사용하여증명하고자하였다. 대상및방법 구를적출하였다. 2. 면역염색산동제만점안한대조군과청색광조사후 1일, 3일, 7 일이지난실험군의안구를적출한후 eye cup상태로분리하여 4% paraformaldehyde(wako, Japan) 에 24시간고정하고, 15% sucrose 용액에서 4시간, 30% sucrose 용액에서 overnight하였다. 다음 OCT compound(sakura, Japan) 에 2시간정도넣어두었다가포메 (embedding) 과정후 18 o C에서 15 µm로절편 (section) 을만들었다. 절편들은 PBS로 washing하여 OCT compound를제거하고 4% paraformaldehyde에 20분고정한후 0.1% Triton X-100(Sigma, USA) 을처리하여 permeabilization 시켰다. 그리고 PBS로 washing후 1% BSA, 2.5% normal goat serum(jackson Immunoresearch, USA), 2.5% normal donkey serum(jackson Immunoresearch, USA) 이들어있는 PBS에 1시간 Blocking 후 Primary antibody인 mouse monoclonal anti-gfap(1:300, Merck Millipore, Germany), rabbit polyclonal anti-opsin red/green(1:500, Merck Millipore, Germany), mouse monoclonal anti-rhodopsin(1:500, Merck Millipore, Germany) 를 Blocking buffer 에넣어 4 o C에서 shaking 하며 overnight 하였다. Secondary antibody (Invitrogen, USA) 인 Cy2와 Cy3를 Blocking buffer에넣어상온에서 1 시간두고, Hoechst 33258(Sigma, USA) 과 PBS를 1:1000 으로만든용액을 15분처리하였다. TUNEL assay는 blocking 과정대신 TUNEL kit(roche, Germany) 를 1시간 30분처리하고 Hoechst 순서부터위와동일한과정으로진행하였다. 커버글라스로덮은뒤형광현미경 (Imager D2, Zeiss, Germany) 을사용하여관찰하였고, Zen blue edition(zeiss) 프로그램으로일정범위의 intensity와 positive-cell 개수를측정하였다. 1. 청색광조사실험동물은망막색소상피층에색소가존재하는생쥐 (C57black mice, 8주, 수컷, g) 를사용하였으며, 모든동물과관련된실험은건양대학교의 IRB 승인에따라시행되었다. Rhodopsin 양을일정하게하고다른광원의영향을최소화하기위해서실험군과대조군모두 (n=24) 를 24시간암순응시킨후산동제인아트로핀을 2방울씩점안하였다. 청색광이망막에미치는영향을알아보기위하여실험군만 463 nm 파장대의광원을 2800±10 lux 로 6시간조사하였고, 청색광의 lux와파장은 IM-1000(TOPCON, Japan) 로측정하였다. 청색광조사날을기준으로 24시간동안암순응을시킨후, 시간에따른망막의변화를확인하기위해암순응시킨날을포함하여 1일, 3일, 7일째안 3. 단백질동정안구를적출하여얻은망막조직을 RIPA lysis buffer(atto, Japan) 로분해시켜 PAGE gel에전기영동하였고, transfer 과정으로 polyvinylidenedifluoride membrane에이동시켰다. 이 membrane을 5% skim milk(duchefa, USA) 와 0.05% Tween-20(Georgiachem, USA) 이섞인 PBS 용액에 1시간동안 Blocking 하였다. 5% skim milk에 mouse monoclonal anti-gfap(1:300, Merck Millipore, Germany), mouse monoclonal anti-phosphorylated ERK1/2(1:1000, Santacruz, USA), rabbit polyclonal anti-erk1/2(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti-phosphorylated SRC (1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal anti- SRC(1:1000, Cellsignaling Technology, USA), rabbit polyclonal

Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina 71 anti-phosphorylated c-jun(1:1000, Cellsignaling Technology, 연구에서는 마우스를 24시간 동안 암순응 시키고 6시간 USA), rabbit polyclonal

3 Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina 71 anti-phosphorylated c-jun(1:1000, Cellsignaling Technology, 연구에서는 마우스를 24시간 동안 암순응 시키고 6시간 USA), rabbit polyclonal anti-c-jun(1:1000, Cellsignaling 동안 2800±10 lux의 청색광을 조사하였다. 청색광으로 Technology, USA), Actin HRP(1:2000, Santacruz, USA) 등 인해 망막에 손상자극이 가해지는지 확인하고 시간에 따 o 항체를 각각 처리한 후 4 C에서 overnight 하였다. 그 다음 른 변화를 알아보기 위해 청색광 조사 후 1일, 3일, 7일째 5% skim milk에 secondary antibody(invitrogen, USA)를 1시 망막의 GFAP 단백질을 면역염색을 하였다. Fig. 1에서 청 간 처리하여 washing 후 chemi-doc(bio-rad, Germany)으 색광 조사 후 1일째 망막에서 신경절세포층과 속얼기층에 로 분석하였다. GFAP가 확연히 증가하였고, 시간이 갈수록 감소하는 것 을 확인할 수 있었다. 4. 통계 GFAP 단백질 증감을 Western blotting을 이용하여 정량 본 실험에서의 모든 측정치는 평균±표준편차로 표기하 적 분석을 한 결과, 대조군을 기준으로 청색광을 조사 후 1 였다. 통계학적 분석은 Microsoft사의 EXCEL 2010버전을 일째 망막에서 GFAP 단백질 발현량이 1.44±0.07배 증가했 사용하여 t-test함수를 사용하였다. 고, 청색광을 조사 후 3일, 7일 째 망막은 대조군과 같은 수 준의 GFAP 발현량을 보였다. 이 결과는 망막에서 청색광의 결과 및 고찰 자극은 조사 후 1일째 가장 높다는 것을 보여준다. 세포가 감염되거나 손상을 받은 경우, GFAP의 증가뿐 1. 청색광 조사로 인한 망막의 손상 자극과 망막의 두께 감소 만이 아니라 세포 스스로에 의해 세포사멸(apoptosis)이 일 어난다. 이 과정 동안 DNA가 잘라지며, 세포 내 소기관들 신경아교증(gliosis)은 중추신경에 외상 등으로 손상을 과 세포질 성분이 조각나게 된다. 세포는 수축되고 갈라져 입었을 경우 복구나 손상기전에 관여하여 그 주위에 신경 막으로 둘러싸인 조각으로 나누어지며, 이들은 특수한 식 아교세포의 분열 증식이 일어나는 것을 가리킨다. 손상 주 세포에 의해 흡수되고 소화되어 흔적을 남기지 않고 사라 위에 증식하는 신경아교세포에는 성상교세포와 미세교세 지게 된다.[10] 이를 바탕으로 청색광에 의해서 세포가 손상 포가 있다. 보통 조직에 상처가 생기면 빈번히 나타나는 을 입는지 확인하기 위해 망막의 각 층의 두께를 측정하 것으로, 성상교세포의 표지인자인 GFAP의 증감을 확인하 였다. 24시간 암순응 후 2800±10 lux 를 조사하여 망막 여 조직에 손상자극이 주어졌는지 확인할 수 있다.[9] 본 의 두께를 확인한 결과, 산동제만 점안한 대조군보다 청색 Fig. 1. Blue-light promotes retinal gliosis. (A) GFAP expression in mouse retina is shown. Sagittal sections from non-exposed or blue-light exposed retina were immunostained with GFAP antibody. Scale bars are 50 µm. (B) GFAP protein expression was changed in blue-light exposed retina. GFAP protein level was increased at day 1 after blue-light injury, and reduced at day 7. Quantitative analysis of GFAP protein levels is shown in the bottom. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests.

(B) Quantitative analysis of retinal thickness in control and blue-light injured retina. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01. 광을조사한후 9일째망막의두께가평균적으로약 28.00 ±20.

4 72 Seo-young Kang, Ji Eun Hong, Eun jung Choi, Jungmook Lyu Fig. 2. Blue-light injury leads to the reduction of retinal thickness. (A) Representative immunostaining images of Hoechst in blue-light exposed retina and non-exposed retina as control. Scale bars are 500 µm (top) and 100 µm (bottom). (B) Quantitative analysis of retinal thickness in control and blue-light injured retina. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01. 광을조사한후 9일째망막의두께가평균적으로약 ±20.60 µm 감소하였다 (p<0.05)(fig. 2A). Fig. 2의 B를참고하여전체적인망막의두께는대조군보다청색광을조사한망막의두께가평균적으로 28.00± µm 감소하였고외핵층은대조군보다청색광을조사한망막에서평균적으로 16.00±9.82 µm 감소하였으며속핵층은 13.00±4.16 µm 감소하였다 (p<0.05)(fig. 2B). 바깥얼기층과속얼기층, 신경절세포층은 5.00±2.21 µm 내외의증감폭을보였다 (n=5, p<0.05). 이결과는외핵층에존재하는광수용세포의죽음이활발히일어났다는것을의미한다. 2. 세포사멸기전과관련된 western blotting과 TUNEL assay를통한망막광수용세포의사멸확인광수용세포의죽음이세포사멸 (apoptosis) 또는세포괴사 (necrosis) 에의한결과인지를확인하기위해세포사멸기전에관련한단백질들인 phosphorylated ERK, JNK, SRC의변화를확인하였다 (Fig. 3). 청색광자극을받은망막과그렇지않은대조군망막으로부터추출한단백질에서 phosphorylated ERK의발현을비교하였을때그림에는없지만청색광조사후 1일째에 phosphorylated ERK가약 1.89배증가하였다. phosphorylated SRC 또한약 1.59배증가하였다. 그러나 phosphorylated c-jun은반대로청색광조사후 1일째는미미하지만약 1.01배감소하였다. 따라서청색광에의한망막손상은 ERK와 SRC가포함된세포사멸기전과관련이있다는가능성을제시할수있다. Fig. 3. Blue-light can activates the apoptotic signaling pathways. (A) Western blot analysis showed changes in levels of phosphorylated ERK, SRC, and JUN. At day 1 after blue-light injury, the phosphorylated ERK and SRC was increased, whereas phosphorylated c-jun was decreased. TUNEL 면역염색은잘라진 DNA조각에항체가붙어형광물질을발광하게되는것으로, 세포사멸의최종단계라고할수있다. [10,11] 청색광을조사후 1일, 3일, 7일째망막에 TUNEL 면역염색을한결과 (Fig. 4A), 대조군에서는 TUNEL로염색된세포가보이지않지만, 청색광을조사후 1일째망막에서는오직외핵층의광수용세포에서만 TUNEL 면역염색된세포들이나타났다. 청색광조사후 3일, 7일째망막은대조군과비슷하게

The number of TUNELpositive cells was significantly increased one day after blue-light injury compared to control. Scale bars represent 100 µm. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests.

5 Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina 73 Fig. 4. Blue-light promotes the cell death of photoreceptors. (A) TUNEL-positive photoreceptor cells were detectable at day 1 after blue-light injury. Quantitative analysis of TUNEL-positive cells in µm 2 was shown in B. The number of TUNELpositive cells was significantly increased one day after blue-light injury compared to control. Scale bars represent 100 µm. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01. Fig. 5. Blue-light reduces the opsin expression. (A) Representative immunostaining of Opsin in sagittal sections from blue-light exposed retina and non-exposed retina, counterstained with and Hoechst Scale bars are 500 µm (top) and 100 µm (bottom). (B) Quantitative analysis of fluorescence intensity in µm 2. The fluorescence signal for opsin was significantly decreased in blue-light exposed retinas compared with that of control. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests. *, P<0.05

74 Seo-young Kang, Ji Eun Hong, Eun jung Choi, Jungmook Lyu TUNEL 면역염색된세포들이감소하였다. TUNEL 면역염색된세포들의수는청색광조사후 1일째망막만대조군과비교하여 215.00±10.02개증가를보였다 (n=3, P<0.01)(Fig. 4B).

6 74 Seo-young Kang, Ji Eun Hong, Eun jung Choi, Jungmook Lyu TUNEL 면역염색된세포들이감소하였다. TUNEL 면역염색된세포들의수는청색광조사후 1일째망막만대조군과비교하여 ±10.02개증가를보였다 (n=3, P<0.01)(Fig. 4B). 이는다른세포가아닌광수용세포가특정적으로세포사멸이일어난다는것을보여준다. 3. 광수용세포원뿔세포와막대세포의손상비교 TUNEL을이용하여청색광으로유도된순수한광수용세포의세포사멸을관찰할수있었는데, 이광수용세포는크게막대세포와원뿔세포로나뉜다. 막대세포는원뿔세포보다빛에대해굉장히민감하지만주로명암을구분하기때문에색상을구분하기는어렵고, 원뿔세포는막대세포보다민감도는떨어지지만황반부에서흡수하는파장대에따라빛의색상을구분하여민감하게인식할수있다. [7,8] 따라서청색광조사후원뿔세포와막대세포간세포사멸차이가있는지를밝히고자하였다. 이를위해암순응 24 시간후에청색광을 2800±10 lux로조사하여 1일, 3일 7 일째망막에서원뿔세포의표지인자인 Opsin 단백질과막대세포의표지인자인 Rhodopsin 단백질에대한항체를사용하여면역염색한후광수용세포층에서이들의 intensity를비교분석하였다. Opsin 단백질의발현에서 청색광조사후 1일째에서대조군과비교하여 intensity가 23.00±5.30% 감소했으며 3일째에서는미미하게증가하는것같아보였으나 7일째에서는대조군과비교하여 28 ±7.40% 까지감소한것을확인할수있었다 (n=3, P<0.05) (Fig. 5A, B). Rhodopsin 단백질의 intensity에서는대조군과비교하여청색광을조사한마우스의 1일째망막에서 20.00±7.30% 감소하였다 (n=3, P<0.05)(Fig. 6A, B). Opsin과 Rhodopsin 의감소량을비교한결과청색광조사후 1일까지는 Opsin과 Rhodopsin의 intensity는큰차이가없었지만 3일째에서 Opsin이약 4.00%, 7일째에서약 16.00% 만큼 Rhodopsin보다더감소하였다 (Fig. 6C). 이결과들은청색광이광수용세포중막대세포보다원뿔세포에더큰손상을줄수있다는가능성을보여준다. 기존연구에따르면청색광으로유도된산화스트레스가망막색소상피층을악화시켜부르크막에서드루젠과지방갈색소의축적이이루어지는데, 이것이광수용세포의세포사멸을야기한다고보고하고있다. [1,3,6] 연령관련황반변성의초기단계이기도한이과정을거치면망막색소상피세포의사멸때문에산화스트레스가광수용세포까지영향을미치게되므로광수용세포의세포사멸을유도하게한 Fig. 6. Blue-light can lead to selective damage between Opsin- and Rhodopsin-positive cells. (A) Rhodopsin expression in the sections described in Fig. 5A was determined by immunostaining analysis with Rhodopsin antibody. Scale bars are 500 µm (top) and 100 µm (bottom). (B) Quantitative analysis shows the significant decrease in the Rhodopsin fluorescence intensity in blue-light injured retina compared to that of control in µm 2. (C) Quantification of the fluorescence intensity shows a significant difference in the expression levels between Opsin(black) and Rhodopsin(grey) after blue-light injury. Error bars represent the mean±sd of triplicate tests. *, P<0.05, **, P<0.01.

7 Blue-light Induces the Selective Cell Death of Photoreceptors in Mouse Retina 75 다고보고하고있다. [3] 그러나본연구에서는망막색소상피세포의형태및분자적손상은관찰되지않았다. 특히, 청색광이조사된망막에서 TUNEL 반응세포는광수용세포가존재하는외핵층에서유일하게관찰되었다. 따라서청색광에의한망막손상은황반변성유발기전과는다른손상기전이존재할수있음을확인하였다. 그리고세포사멸기전과관련한단백질들로 ERK와 SRC 단백질동정결과를보았는데, ERK는산화스트레스에의해인산화가증가하는경향을보이기도한다. [3] 이에따라기존연구는청색광이산화스트레스를유도하여 ERK와 SRC가증가한다고보고한바있다. [2,3] 본연구결과에서도인산화된 ERK가증가한것으로보아빠른인산화증가로인해면역염색결과민감도가높은막대세포에우선반응한것으로볼수있다. 그러나기존연구처럼청색광이산화스트레스를유발하여망막색소상피세포악화의결과로광수용세포가감소한다면막대세포와원뿔세포가균등하게감소해야하는데, 전체적인표를봤을때는 Opsin의양이 Rhodopsin보다더감소한것을확인할수있다. 이결과는청색광에대한손상반응이광수용세포들사이제한적인특정세포에서더잘일어날수있음을의미한다. 본연구에서는청색광의유해성을증명하고그기전을밝히는데기여하고자심각한망막손상을야기하도록실험을설계하고진행하였으나, 실생활에쓰이는청색광이사람의망막에손상을줄수있다고정확하게밝히기위해서는일반적인환경에서청색광으로인한인간망막조직손상을확인하는연구가많이이루어져야할것이다. 결론청색광은가시광선중짧은파장대영역의빛으로, 우리가매일사용하는가전제품스크린에많이사용된다. 최근이청색광이망막에서산화스트레스를유도하여질병을야기한다는연구결과들이보고된바있다. 하지만정확한기전은밝혀지지않았으므로본연구는명확한기전규명과관련질환의치료제개발에도움을주고자청색광을이용하여마우스로망막손상실험을수행하였다. 그결과, 청색광손상을받은망막의광수용체세포가손실되었고, TUNEL 면역염색에서는망막색소상피세포보다광수용세포에특이적으로세포사멸이일어났다. 단백질동정분석은인산화 (phosphorylation) ERK의증가를보여주었다. 관련연구들과함께청색광에의한광수용세포의세포사멸은 ERK 신호전달경로를통해일어날수있으며망막색소상피의손상에영향을받는것이아니라광수용세포에직접적으로손상을미칠수있다는가능성을확인하였다. 막대세포와원뿔세포의손상을비교하기위해서각각의 발색단인로돕신과옵신단백질을면역염색한결과, 청색광으로인해막대세포보다원뿔세포의손상이크다는것을확인할수있었고청색광은막대세포보다원뿔세포에서큰광독성을야기할수있음을확인하였다. 망막에서청색광의유해성과이들의손상기전은아직까지명확하지않다는점에서본연구는망막색소상피세포의손상에의해서가아닌, 청색광이선택적으로광수용세포손상을유도하여망막손상을야기할수있다는새로운기전존재의가능성을확인하였다. 이연구결과를토대로청색광의광독성, 인간망막조직에서광화학손상반응, 명확한손상기전등의많은연구들이진행되어관련질환치료에보탬이될수있기를기대한다. 감사의글 이논문은 2015년도정부 ( 교육부 ) 의재원으로한국연구재단의지원을받아수행된기초연구사업임 (NO. 2015R1D1A1A ). REFERENCES [1] Nakanishiueda T, Majima HJ, Watanabe K, Indo HP, Suenaga S, Hisamitsu T. Blue LED light exposure develops intracellular reactive oxygen species, lipid peroxidation, and subsequent cellular injuries in cultured bovine retinal pigment epithelial cells. Free Radic Res. 2013;47(10): [2] Youssef PN, Sheibani N, Albert DM. Retinal light toxicity Eye. 2011;25(1):1-14. [3] Kuse Y, Ogawa K, Tsuruma K, Shimazawa M, Hara H. Damage of photoreceptor-derived cells in culture induced by light emitting diode-derived blue light. Sci Rep. 2014; 4:5223. [4] Sung CH, Chuang JZ. The cell biology of vision. J Cell Biol. 2010;190(6): [5] Kim CJ, Choi SW,Yang SJ, Oh SY, Choi EJ. Evaluation of blue-light blocking ratio and luminous transmittance of blue-light blocking lens based on international standard. J Korean Ophthalmic Opt Soc. 2014;19(2): [6] Wu J, Seregard S, Spangberg B, Oskarsson M, Chen E. Blue light induced apoptosis in rat retina. Eye. 1999; 4(1): [7] Hunt RWG. The Reproduction of Colour, 6th Ed. Chichester: Wiley. 2004; [8] Wyszecki G, Stiles WS. Colour 2nd Ed. New York: Wiley. 1982; [9] de Melo J, Miki K, Rattner A, Smallwood P, Zibetti C, Hirokawa K. Injury-independent induction of reactive gliosis in retina by loss of function of the LIM homeodomain transcription factor Lhx2. Proc Natl Acad Sci U

8 76 Seo-young Kang, Ji Eun Hong, Eun jung Choi, Jungmook Lyu S A. 2012;109(12): [10] Reece JB, Urry LA, Cain ML, Wassserman SA, Minorsky PV, Jackson RB. Campbell biology, 9th Ed. San Francisco: Benjamin Cummings, 2011; [11] Martnez-Fernndez de la Cmara C, Hernndez-Pinto AM, Olivares-Gonzlez L, Cuevas-Martn C, Snchez-AragM, Hervs D. Adalimumab reduces photoreceptor cell death in a mouse model of retinal degeneration. Sci Rep. 2015; 14(5): 청색광에의한마우스망막손상에서선택적광수용세포의사멸 강서영 1,3, 홍지은 2, 최은정 1,2, 류정묵 1,3 * 1 건양대학교의과학과, 대전 건양대학교안경광학과, 대전 건양대학교명곡안연구소, 서울 투고일 (2015 년 10 월 24 일 ), 수정일 (2015 년 12 월 23 일 ), 게재확정일 (2016 년 2 월 29 일 ) 목적 : 본연구는망막색소상피층에색소가존재하는 mouse 에서청색광으로인해광수용세포손상이일어날수있는지확인하고, 광수용세포중특이적세포에서세포사멸이유도되는지조사하여청색광에의해야기될수있는연령관련황반변성의기전규명과치료제개발에도움이되고자진행되었다. 방법 : C57black mice 를 24 시간암순응시켜 463 nm 의청색광을 2800±10 lux 로조사한후 1 일, 3 일, 7 일째에안구를적출하였다. 청색광의자극은 GFAP(Glial fibrillary acidic protein) 단백질의발현을이용하여확인하였고, 광수용세포의세포사멸은 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferase dutp nick end labeling) 을사용하여분석하였다. Western blotting 으로 ERK(Extracellular signal-regulated kinases), c- JUN, SRC(Sarcoma) 단백질발현을확인하였고, 막대세포와원뿔세포의손상정도를비교하기위해면역염색으로분석하였다. 결과 : 청색광을조사한후 1, 3, 7 일이지난망막은대조군보다전체적으로두께가감소하였고, 각얼기층보다핵층에서두께감소를확인할수있었다. 또한청색광을조사한후 1 일지난 Muller glia 에서 GFAP 단백질이증가하는것을확인하였다. TUNEL 염색에서는청색광을조사한후 1 일지난망막의광수용세포에서가장많은발현을보였다. 세포사멸기전과정중하나임을확인하기위해 ERK, c-jun, SRC 단백질활성을확인한결과청색광을조사한망막에서 phosphorylated ERK 는증가하였고 phosphorylated SRC 는조사후 1 일에서만증가를나타내었으며, 반대로 phosphorylated c-jun 은조사후 1 일에서만감소하였다. 청색광을조사한망막에서막대세포발색단인로돕신과원뿔세포의발색단인옵신이감소하였으며, 옵신의감소량은로돕신의감소량보다큰것을확인하였다. 결론 : 본연구는청색광이망막에손상자극을주고, ERK 와 SRC 신호전달과관련하여광수용세포의세포사멸을일으킬수있으며청색광이광수용세포중원뿔세포의세포사멸을직접적으로유도하여망막손상을야기할수있다는가능성을제시하였다. 주제어 : 청색광, 망막광수용세포, 세포사멸, 옵신, 로돕신

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Jksvs019(8-15).hwp Grade I Grade II Grade III 12 대한혈관외과학회지 : 제 20 권 제 1 호 2004 Control Group A Group B Fig. 4. Microscopic findings of vein wall in control, group A and group B on the day of 7 after venous occlusion. The