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공학석사학위논문 Metabolic Engineering for the Production of Isobutanol and 3- Methyl-1-butanol in Saccharomyces cerevisiae 효모의대사공학적방법을이용한이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올생산증대 2014 년 2 월 서울대학교대학원 공과대학화학생물공학부 박성희

Abstract Metabolic Engineering for the Production of Isobutanol and 3- Methyl-1-butanol in Saccharomyces cerevisiae Seong-Hee Park School of Chemical and Biological Engineering The Graduate School Seoul National University Higher alcohols including isobutanol and 3-methyl-1-butanol have received much attention as biofuels because of their higher energy density and lower moisture absorption property compared with ethanol. Saccharomyces cerevisiae naturally generates small amounts of isobutanol and 3-methyl-1-butanol via amino acid biosynthesis pathway and Ehrlich pathway involved in amino acid degradation. 2- ketoisovalerate and 2-ketoisocaproate, the intermediates of Val and Leu biosynthetic pathways are first converted into corresponding aldehydes by i

decarboxylation, and then converted into isobutanol and 3-methyl-1-butanol, respectively, by alcohol dehydrogenases. In this study, production levels of isobutanol and 3-methyl-1-butanol were increased by deleting ALD6 gene encoding aldehyde dehydrogenase and BAT1 involved in Val and Leu production from 2-ketoisovalerate and 2-ketoisocaproate. In addition, we overexpressed LEU3Δ601, a LEU3 mutant which is a transcriptional activator of genes in the Val and Leu biosynthesis pathway, but lacking the feedback inhibition by Leu, as well as ILV2, ILV5, ILV6, ARO10, and ADH2 genes. To increase 3-methyl-1-butanol production, LEU2 gene in the Leu biosynthetic pathway was also overexpressed. The engineered yeast strain produced 377 mg/l isobutanol and 250 mg/l 3- methyl-1-butanol from 10% glucose, resulting in 20- and 17-fold increases in production titers compared with wild type. Keywords: Metabolic engineering, isobutanol, 3-methyl-1-butanol Student Number: 2012-20945 ii

Contents Chapter 1. 서론... 1 1.1. 개요... 1 1.1.1. 바이오연료로서이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올... 1 1.1.2. 이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올의구조와특성... 3 1.1.3. S. cerevisiae 에서의이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올의생합성 경로... 6 1.1.4. 이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올생산연구동향...11 1.2. 실험목적... 16 Chapter 2. 재료및방법... 17 2.1. 사용된균주와배양조건... 17 2.2. BAT1 과 ALD6 결손균주의제작... 18 2.3. 플라스미드제작... 18 2.4. 발효조건과시료채취및검출방법... 23 Chapter 3. 결과및토의... 24 3.1. 이소부탄올생산... 24 iii

3.1.1. 경쟁경로의제거영향... 24 3.1.1.1. Aldehyde dehyrogenase 유전자 ALD6 의결손... 24 3.1.1.2. ALD6 와 BAT1 유전자의결손... 26 3.1.2. 전사조절인자와생합성유전자의과발현... 28 3.1.2.1. 전사조절인자 (LEU3Δ601) 의과발현... 28 3.1.2.2. 발린의생합성유전자와 Ehrlich 경로유전자의과발현... 30 3.1.3. 최종선별균주에서포도당농도에따른이소부탄올생산... 32 3.2. 3- 메틸 -1- 부탄올생산... 34 3.2.1. LEU2 유전자의발현에따른 3- 메틸 -1- 부탄올생산... 34 Chapter 4. 결론및고찰... 36 참고문헌... 39 국문요약... 43 iv

List of Tables Table 1. The characteristics of some liquid fuels.... 2 Table 2. Overview of studies for isobutanol production.... 15 Table 3. List of primer sequences used in this study.... 19 Table 4. List of plasmids used in this study.... 20 v

List of Figures Figure 1. Structure of isobutanol and 3-methyl-1-butanol.... 4 Figure 2. Amino acid degradation pathway.... 7 Figure 3. Illustration of amino acid biosynthesis and the Ehrlich pathway.... 8 Figure 4. Diagrams of the large internal deletion of LEU3 for construction of constitutive transcriptional activator.... 10 Figure 5. Schematic illustration of the biosynthetic pathways from glucose to isobutanol and 3-methyl-1-butanol constructed in Saccharomyces cerevisiae.... 12 Figure 6. Design of the construction plasmids for production of isobutanol and 3- methyl-1- butanol.... 21 Figure 7. The effect of deleting aldehyde dehydrogenase, ALD2 and ALD6.... 25 Figure 8. Improvement of the isobutanol production by deletion of BAT1 and ALD6 involved in competitive pathway.... 27 Figure 9. The effect of transcription factor that regulates branched chain amino acid synthesis on isobutanol production.... 29 Figure 10. The effect of overexpression enzymes involved in amino acid biosynthesis and the Ehrlich pathway.... 31 Figure 11. Isobutanol production depending on glucose concentration.... 33 Figure 12. Improvement of 3-methyl-1-butanol production by combination of overexpressing LEU2 and genes involved in amino acids biosynthesis and Ehrlich pathway.... 35 vi

Chapter 1. 서론 1.1. 개요 1.1.1. 바이오연료로서이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올 화석연료의고갈에따른에너지공급과기후변화라는미래에대한걱정은재생가능한에너지로서의바이오연로생산에대한연구를촉진하고있다. 미국은 2022년까지 160억갤런의셀룰로오스유래의에탄올을포함한 360억갤런의재생연료를생산한다는목표를세웠다. (http://energy.senate.gov/ public/files/rl342941.pdf) 세계적으로가장많이생산되는바이오연료는에탄올이지만바이오에탄올은이상적인연료로서의기능을하지못한다. 에탄올은물을흡수하는성질과부식성때문에현재산업기반에서저장과수송이힘들다. 뿐만아니라에너지밀도가낮기때문에가솔린과혼합하여사용할수가없다 (1). 따라서현재수송연료인가솔린과물리적성질이비슷한새로운바이오연료생산에대한연구가각광받고있다. 고급알코올 (higher alcohols) 은에탄올과달리높은에너지밀도와낮은흡습성에따른다양한이점을제공한다. (Table 1.) 흡습성이낮아현재기반시설을이용한수송과저장이용이하고에너지밀도가높아서가솔린과높은비율로혼합하여사용이가능하다 (2). 뿐만아니라가솔린과디젤연료의첨가물로사용할경우스모그의원인이되는질소산화물, 일산화탄소그리고황산화물과같은유독한가스발생을줄일수있다. 특히가지사슬고급 1

Table 1. The characteristics of some liquid fuels (4). Physical property Gasoline Ethanol 1-Butanol Isobutanol 3-Methyl-1-butanol Molecular weight 72-170 46 74 74 88 Boiling point at 1atm ( C) 32-210 78 118 108 132 Solubility Immiscible Miscible 7.7 8.0 Immiscible Energy density (MJ/kg) 44.5 29.7 36.1 36.1 37.7 Hygroscopicity Low High Low Low Low Compatible with current infrastructure Yes No Yes Yes Yes 2

알코올 (branched-chain higher alcohols) 인이소부탄올 (isobutanol) 과 3-메틸- 1-부탄올 (3-methyl-1-butanol) 은옥탄가가높아엔진의노킹현상을감소시킨다 (3). 현재상업적으로생산되는고급알코올은원유를분리정제한올레핀 (olefin) 의하이드로카복시화반응과연이은수소첨가반응을통해화학적으로합성, 분리정제하여생산해오고있다. 최근의치솟는석유가격에따라고급알코올의새로운생산방법의개발이필요한상황이다. 현재전세계적으로고급알코올의생물학적합성방법은초기기술개발단계로상업적으로성장하기위한효과적인균주의개발은바이오액체연료시장선점에서큰의미를가질것이다. 1.1.2. 이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올의구조와특성 부탄올은효모의알코올발효시에탄올과함께소량생산되는물질로일반적으로페인트의희석제, 접착제등으로사용되었으나, 높은에너지밀도를가지기때문에효과적인연료첨가제로이용이가능하다. 특히이소부탄올은무색의가연성액체로서다양한화학물질의용제, 식품첨가물, 플라스틱의가소제등으로사용될뿐만아니라 n-부탄올보다옥탄가가더높아더효율적인연료첨가제로사용이가능하다. 또한이소부탄올의탈수반응을통해생성되는이소부틸렌 (isobutylene) 은가솔린과디젤및제트연료의직접적인합성원료인이소옥탄 (isooctane) 으로전환이가능해그효용가치가더크다고볼수있다 (5). 이소아밀알코올 (isoamyl alcohol) 즉, 3- 메틸 -1- 부탄올은무색의독특한냄새를 3

Figure 1. Structure of isobutanol and 3-methyl-1-butanol. Isobutanol and 3-methyl-1-butanol are organic compounds with the formula (CH3)2CHCH2OH and (CH3)2CHCH2CH2OH, respectively. A. The chemical structure of isobutanol B. The chemical structure of 3-methyl-1-butanol 4

가진유기물질로아밀알코올의이성질체중하나이다. 이소아밀화합물의제조에사용될뿐만아니라물질자체로서그리고초산이소아밀 (isoamyl acetate) 의합성에사용될시에는그특유의바나나향덕분에착향료로이용되고있다. (Figure 1) 이소부탄올생산은산업적으로두가지방식이존재한다. 프로필렌 (propylene) 의히드로포르밀화 (hydroformylation) 와아세틸렌을이용한레페카르보닐화반응을이용하는방식으로전자가더일반적인방법이다. 히드로포르밀화를통해생성된이소부틸알데히드 (isobutyraldehyde) 혼합물을수소화를통해이소부탄올을생산하고이를분리정제하여사용한다. 이러한석유화학적방식은환경오염문제에따라더이상지속하기힘들다. 화학적합성법의대체방식으로미생물의탄수화물발효과정을이용해이소부탄올을생성하는것이주목을받고있다. 화장품처럼피부에직접닿거나식품첨가제처럼섭취하는용도로사용될경우, 합성법에따른물질의구조차이가없음에도불구하고화학적합성법보다는생물학적합성법이더선호된다. 2010년기준, 세계적으로생산판매되는연료 1640억갤런 / 년중이소부탄올의 410억갤런 / 년에해당하며, 현재화학적합성법으로만든이소부탄올가격은원화 1370 달러 / 톤이고바이오매스를이용하여만든이소부탄올의가격은 1600 달러 / 톤이다. 높은에너지효율을갖는고급알코올중이소부탄올은비교적그대사공학적생산과정이간단하기때문에화학적합성법에비해가격효율이떨어짐에도불구하고수요가급격히증가하고있다. 5

1.1.3. S. cerevisiae 에서의이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올의 생합성경로 효모는자체적으로포도당으로부터이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올을에탄올 발효과정에서부산물로생산한다. 이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올의생합성 경로는미토콘드리아에서일어나는 ketoisovalerate 합성을위한동화반응과세포질에서일어나는케톤산 (keto acid) 의이화반응인 Ehrlich 경로로구성된다. 1980년대후반에밝혀진 Ehrlich 경로를통해발린과류신으로부터각각이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올로전환되는과정에다양한효소가관여하는것을알수있다 (6). (Figure 2.) 발린의생합성경로에관여하는 ILV2, ILV3, ILV5 유전자가밝혀져있고류신생합성경로의경우 LEU4, LEU1, LEU2가추가적인작용을한다. ILV2, ILV3, ILV5의경우에는 N-말단에미토콘드리아타겟팅서열이존재하여미톤콘드리아에서발현되어작용한다. Ehrlich 경로에는다양한유전자가관여하는데그중에서도 ARO10과 ADH2가조금더우세적이라고밝혀졌다 (7, 8) (Figure 3.) Zinc cluster protein family에속하는 LEU3는 S. cerevisiae에서 886-아미노산-폴리펩티드를암호화하고있는유전자로써발린과류신과같은가지사슬아미노산의합성에관여하는유전자 (ILV2, ILV5, LEU4, LEU1, LEU2) 들의전사조절인자라고밝혀져있다 (9). 류신이풍부한환경에서는저해자로작용하고류신이고갈된상황에서축적되는류신생합성의첫단계중간물질인 α-isopropylmalate (α-ipm) 이다량존재하는상황에서는활성제로작용한다 (10, 11). LEU3는 5개의도메인으로구성되는데 zinc cluster DNA 결합 6

Figure 2. Amino acid degradation pathway. Yeast can generate higher alcohols via Ehrlich pathway. Ehrlich pathway consists of deamination, decarboxylation, and reduction process. Amino acids are altered to ketoacid forms by deaminase. Then the keto-acid forms are turned to fusel alcohols by decarboxylase and dehydrogenase. 7

Figure 3. Illustration of amino acid biosynthesis and the Ehrlich pathway. Isobutanol and 3-methyl-1-butanol are produced via amino acid biosynthesis pathway and Ehrlich pathway 8

도메인 ( 아미노산 37-87) (12), 링커부분 (13), alpha-helix/heptad 반복도메인 ( 아미노산 85-102) (12), acidic activation 도메인 ( 아미노산 678-697) (14), 마지막으로 α-ipm에의해 LEU3 단백질의조절에관여하는중간도메인으로구성된다 (12, 14). 이러한중간도메인의일부결손즉, LEU3 유전자의최대 68% 의내부암호화부분을제거하였을경우, 단백질의활성에는치명적인영향이없으면서대사산물에의한피드백저해 (feedback inhibition) 이일어나지않음이알려져있다 (15). (Figure 4.) 아미노산의분해에의해생성되는케톤산형태는 decarboxylation과정에따라알데히드형태로전환되는데연이은환원과정에따라퓨젤알코올 (fusel alcohols) 이생성된다. 이러한과정의경쟁경로인산화과정에의해알데히드는퓨젤알코올로전환되는데여기에는여섯가지의 aldehyde dehydrogenase (ALD genes) 이관여한다 (6). 그중 ALD2, ALD3, ALD6 유전자는세포질에서, ALD4, ALD5, HFD1은미토콘드리아상에서작용한다 (16-19). Isobutyraldhyde에서 isobutyrate가생성되는반응과 3-methyl-1-butyraldhyde에서 3-메틸-1- 부탄올이생성되는반응은세포질에서일어나기때문에가지사슬알데히드의산화과정에 ALD2, ALD3, ALD6 유전자가작용할것으로추측된다. (Figure 5.) 대장균과같은미생물보다알코올기를갖는화합물에대한저항성이높은효모의경우그대사공학적생산성조절을통해산업적으로활용할수있는가능성이크다. 효모는산업적인발효환경에서잘견디고낮은 ph에서도잘자라기때문에산업용생물반응기에서생장하는동안오염을방지하는데도움을줄뿐만아니라진핵생물이라박테리오파지에의한감염이없다는장점이있다. 특히효모균주중에서도 S. cerevisiae 경우그생물학이많이 9

Figure 4. Diagrams of the large internal deletion of LEU3 for construction of constitutive transcriptional activator. LEU3 is a transcription factor that regulates genes involved in leucine biosynthesis. LEU3Δ601 gene is a mutant of LEU3 in which 601 amino acids are truncated and has been known to be always active, regardless of metabolites. 10

밝혀져있어기술적인측면에서이를이용해가지사슬고급알코올의생산기술의구축이가능하다. 경제적, 산업적측면에서는화학적합성법보다인체에무해한이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올생산의시장성확보가가능할뿐만아니라에너지안보의확보및모든원유를수입해오는우리나라입장에서원유수입에대한의존성을감소시킬수있고, 환경적인측면에서는원유의분해와합성에의한환경오염을줄일수있는기술이될것이다. 1.1.4. 이소부탄올과 3- 메틸 -1- 부탄올생산연구동향 2011년을기준으로세계적으로연간 500,000톤의이소부탄올의시장이형성되어있고, 우리나라의경우 2002년기준으로연간 25,000톤의이소부탄올이생산되고있다. 이소부탄올합성에있어서회분식반응기를이용하여가장많은생성량을보인연구는대장균의대사공학적방법을이용한것으로미국 UCLA의 Liao 그룹에서는대장균에서발린생합성대사회로에관여하는유전자와대장균에는존재하지않는탈탄산효소 (decarboxylase) 인 Lactococcus lactis의 Kivd와알코올탈수소효소 (alcohol dehydrogenase) 인 S. cerevisiae의 ADH2를도입하고추가적으로임의돌연변이유발 (random mutagenesis) 를통해이소부탄올의생성량을 22 g/l까지늘렸다 (20). S. cerevisiae 에서의이소부탄올합성에관하여처음으로발표된연구는 발린의생합성에관여하는 ILV2, ILV5, ILV3 유전자들을과발현하여수율을 0.28 mg/g 에서 3.86 mg/g 까지높인것이다 (21). 일본의 Kondo 그룹에서는 11

Figure 5. Schematic illustration of the biosynthetic pathways from glucose to isobutanol and 3-methyl-1-butanol constructed in Saccharomyces cerevisiae. Pyruvate is converted to isobutanol and 3-methyl-1-butanol through respectively valine and leucine biosynthesis and the Ehrlich pathway. The enzymes that involved in valine and leucine synthesis pathway are: ILV2 and ILV6, acetolactate synthase; ILV5, acetohydroxyacid reductoisomerase; ILV3, dihydroxyacid dehydratase; LEU4, 2- isopropylmalate synthase; LEU1, isopropylmalate isomerase; LEU2, Beta-isopropylmalate dehydrogenase; LEU3, Zinc-knuckle transcription factor. The enzymes that catalysis the Ehrlich pathway are: ARO10, 2-keto acid decarboxylase; ADH2, alcohol dehydrogenase. 12

이소부탄올생산에있어가장마지막단계인 Ehrlich 경로의최적화를통한이소부탄올을생산하는연구를진행하였다. 앞서언급한바와같이 Ehrlich 경로에관여하는여러유전자들중에서 ketoisovalerate decarboxylase (KDC) 와 alcohol dehydrogenase (ADH) 를선별하여이소부탄올생성을최적화하였는데, KDC는 L. lactis의 Kivd를, ADH는 S. cerevisiae의 ADH6를이용한조합이가장효과적으로이소부탄올을생성하였고, 이를에탄올생산에가장크게관여하고있는 PDC1 (pyruvate decarboxylase) 가결손된균주에 ILV2와함께과발현하여수율을 6.6 mg/g까지올렸다 (22). 과거에는이소부탄올생산과정에관여하는유전자의과발현과경쟁경로의제거를통해생산량을최대화하고자했다면현재에는미토콘드리아와세포질에서환원력의수요와공급사이의불균형문제를해결하고자하는연구가더활발히진행되고있다. ILV2, ILV5, ILV3 효소를코돈최적화를통해세포질로발현을유도하고 KDC로 ARO10을, ADH로 ADH2의과발현을통해 S. cerevisiae에서 0.63 g/l의이소부탄올을생산했다 (23, 24). S. cerevisiae에서이소부탄올을최대치로생산한연구는 ILV2, ILV5, ILV3 효소를세포질로발현하는전략과달리 Ehrlich 경로에관여하는두효소인 KDC와 ADH를미토콘드리아로발현하는것이다. ILV2, ILV5, ILV3 효소의과발현과 ARO10, ADH7을미토콘드리아로발현하면서이소부탄올을 635 mg/l의농도로생산하였다 (25). 대표적으로 3 개의회사에서이소부탄올을미생물의대사공학을이용해 생산하고있다. 특히 Gevo 는바이오부탄올생산을앞장서온기업으로 셀룰로오스유래의당을이용한효모발효시스템으로이소부탄올생산을 13

허가받았다. Gevo의생산전략은미토콘드리아타켓팅서열을사용해서이소부탄올합성과관련된유전자를모두미토콘드리아로발현하거나, 미토콘드리아에서의보조인자의불균형을피하기위해관련유전자룰세포질로발현하는두가지로나눌수있다. 이를통해연간 1800만갤런의이소부탄올올을생산하고있고, 2015년까지 3억 5천만갤런을생산하겠다는계획을내놓았다. (Table 2.) 3-메틸-1-부탄올에있어서가장많은생산량을보이는연구는대장균의대사공학적방법을이용한것으로미국의 Liao 그룹에서피드백저해와경쟁경로의제거로 1.28 g/l의 3-메틸-1-부탄올을생산하였고, 추가적으로임의돌연변이유발과 2상발효를통해최종적으로 9.5 g/l의 3-메틸-1-부탄올을생산하였다 (26, 27). S. cerevisiae에서 3-메틸-1-부탄올의생산은류신을기질로하여 Ehrlich 경로를통한 3-메틸-1-부탄올의생산에대한연구가진행되어왔다. 에탄올생산과관련된 PDC 유전자인 PDC1, PDC5, PDC6 유전자가결손된균주에류신을단일질소원으로 1088 mg/l의 3-메틸-1-부탄올을생산하였다 (28). 효모균주중 S. cerevisiae는효율적으로이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올의생성이가능하고이를이용해고급알코올을생산하는연구가활발히이루어지고있다. 현재까지국내의바이오연료관련연구는대부분바이오에탄올, 바이오디젤등에초점이맞춰져있고알코올류에대한저항성이낮은대장균을이용한연구가더주를이루고있다. 따라서국내에서효모를이용한이소부탄올및가지사슬고급알코올생산에대한연구는기술선점의측면에서중요한의미를가진다 14

Table 2. Overview of studies for isobutanol production. Strain Strategy of isobutanol production Production Referance E.coli NV3r1 E. coli 균주에효모와 L. lactis 유전자 도입을통한이소부탄올, 생산 21.2 g/l (20) S. cerevisiae ILV2 ILV3 ILV5 overexpression strain 효모에서발린생합성과분해 대사경로를이용한이소부탄올생산 164.8 mg/l (21) S. cerevisiae YTD306 KDC 와 ADH, ILV2 의과발현과 PDC1 의 제거를통해효모에서이소부탄올생산. 143 mg/l (22) S. cerevisiae Isoy8 미토콘드리아에존재하는 ILV2, ILV3, ILV5의세포질로발현과코돈최적화, ARO10 와 ADH2 과발현을통한이소부탄올생산 630 mg/l (24) S. cerevisiae D-I253K Kivd 의과발현과 Ilv2p, Ilv3p, Ilv5p 의 세포질로의발현을통해효모에서 이소부탄올생산. 151 mg/l (23) S. cerevisiae JAy161 ILV2, ILV3, ILV5 과발현과 ARO10 와 ADH7 의미토콘드리아로의구획화 635 mg/l (25) 15

1.2. 실험목적 치솟는석유가격에따라원유의의존도를줄이려는노력으로써바이오연료에대한연구가주목을받고있다. 다양한분야에서효과적으로사용되고있는가지사슬고급알코올은원유에의존하지않는새로운생산방법의개발이필요한상황이다. 특히이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올은화학적용제와식품첨가물, 특히플라스틱의가소제로사용될뿐만아니라에탄올과비교하여높은에너지밀도를가지고옥탄가도높아효율적인연료첨가제로서차량연료에혼합하여사용이가능하다. 또한유용한화합물의중간물질로서다양한물질로전환이가능하기때문에그효용가치는더욱높다. 원유를이용한합성정제방법에의한환경오염문제를극복하고식품이나화장품처럼피부에직접닿는용도로사용할경우미생물을이용한생물학적합성법이더선호된다. 본연구는유전적으로재조합된효모를이용하여이소부탄올과 3-메틸-1- 부탄올의대사공학적생산방법에관한것이다. 인체에덜유해한이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올을낮은 ph에서저항성이높은효모의대사공학적생산성증가방법을통해효과적으로합성할수있는효모균주를제작하고자하였다. 이를통해기술적, 산업적측면에서효모를이용해가지사슬고급알코올생산기술의구축이가능할것이다.. 경제적산업적측면에서는화학적합성법보다인체에무해한이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올생산의시장성확보가가능할뿐만아니라에너지안보의확보및환경적인측면에서는원유의분해와합성에의한환경오염을줄일수있는기술이될것이다. 16

Chapter 2. 재료및방법 2.1. 사용된균주와배양조건 본연구에서모든유전자조작을 Escherichia coli strain DH5α[F-Φ80lacZΔM15 Δ(lacZYA-argF) U169recA1endA1hsdR17 (rk,mk+) phoasupe44λ thi-1 gyra96 rela] 을사용하여시행하였다. E. coli의경우 50 μg/ml 암피실린을첨가한 Luria- Bertani (LB) 배지 (10 g/l tryptone, 5 g/l yeast extract, 10 g/l NaCl) 에서배양하였다. 본연구에서 parental strain으로 S. cerevisiae CEN.PK2-1C (MATa ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 his3δ 1 MAL2-8 C SUC2) 를사용하였다. 실험에사용된모든효모는 YPD 배지 (20 g/l 포도당, 10 g/l yeast extract, 20 g/l bacto-peptone) 이나 SC 배지 (20 g/l 포도당, 아미노산이빠진 6.7 g/l yeast nitrogen base, 5.4 g/l NaH 2PO 4 H 2O and 0.85 g/l 아미노산 ) 에서배양하였다. 형질전환된효모를선별하는과정에서는적절한아미노산이제외된선별적인 SC 배지가사용되었다. 포도당농도에따른실험에서는각각포도당농도가 2% (20 g/l 포도당 ), 4% (40 g/l 포도당 ), 10%(100 g/l 포도당 ) 첨가된선별적 SC 배지에서배양하였다. 모든실험은 5 ml의배지에 1차접종후, 2차접종하여시행하였다. 17

2.2. BAT1 과 ALD6 결손균주의제작 유전자결손과정에서사용된프라이머와플라스미드를각각 Table 3과 Table 4에나타내었다. 단일유전자결손균주는 CEN.PK2-1C를 parental 균주으로하여 loxp::ura3::loxp/ Cre recombines system 을이용하여원하는유전자를제거하였다 (29). URA3를 marker로가지는 pug72 플라스미드를주형으로하여 bat1::ura3 cassette와 ald6::ura3 cassette를 PCR을통해증폭하여 CEN.PK2-1C에형질전환함으로써 BAT1 유전자와 ALD6 유전자를각각 URA3 로치환하였다. Cre recombinase 유전자를가지고있는 psh62 를 도입함으로써 loxp site 에의해 URA3 marker 를제거하였다. bat1δald6δ 이중결손균주의경우앞서제작한 ald6δ strain 에 bat1::ura3 cassette 를삽입하여 BAT1 유전자를 URA3 로치환하였다. Marker 복구를위해 psh62 를도입함으로써 loxp site 에의해 URA3 marker 를제거하였다. 2.3. 플라스미드제작 본연구에서사용된프라이머와제작된플라스미드를각각 Table 4과 Table 5에나타내었다. (Figure 6.) S.cerevisiae 균주 CEN.PK2-1C의 ILV2, ILV5, ILV3와 S.cerevisiae 균주 BY4741 의 LEU3, ARO10, ADH2의암호화된부분을원형으로하여 PCR을통해증폭하여 DNA 단편을얻었다. ILV2의경우증폭시킨단편을 Nhe1과 Xho1을제한효소자리로, prs425gpd vector는 Spe1과 Xho1을제한효소자리로하여복제하였다. ILV3 유전자는 DNA 단편의경우 Spe1과 Sal1을제한효소자리로, prs424gpd 벡터는 Spe1과 18

Table 3. List of primer sequences used in this study. Target DNA Primer Primers for deletion strain construction ALD6 BAT1 ald6_df ald6_dr bat1_df bat1_dr Primers for plasmid construction a LEU3 ILV2 ILV3 ILV5 ARO10 ADH2 LEU1 Sequence 5 -TTCAATTCGAAGTGTTCAGTCTTTTACTTCTCTTGTT TTATAGAACAGCTGAAGCTTCGTACGC -3 5 -TATTTATGACGTAAGACCAAGTAAGTTTATATG AAAG TATTTTGTGCATAGGCCACTAGTGGATCTG-3 5 -ATGGCACTATAAAGAGAGCTAGTGGTAACAACTACA TGTTTTCGTCAGCTGAAGCTTCGTACGC -3 5 - TATGTATCTATGTGAATAAAGTGAGAGAAAAACAGA TCCTCTGAGA GCATAGGCCACTAGTGGATCTG -3 Restriction enzyme LEU3_F 5 -CGCGGATCCATGGAAGGAAGATCAGATTT-3 BamH1 LEU3_R 5 -CGCCTCGAGTTAAACCTTGGGATTGAACG-3 Xho1 ILV2_F 5 -GCGGCTAGCATGATCAGACAATCTACGCT -3 Nhe1 ILV2_R 5 -GCGCTCGAGTCAGTGCTTACCGCCTGTAC -3 Xho1 ILV2_GPD_F 5 -GCGCTGCAG GGGAACAAAAGCTGGAGCTC-3 Pst1 ILV3_F 5 -GCGACTAGTATGGGCTTGTTAACGAAAGT -3 Spe1 ILV3_R 5 -GCGGTCGACTCAAGCATCTAAAACACAAC-3 Sal1 ILV3_CYC_R 5 -GCG GGATCC CTTTAATTTGCGGCCGGTACC-3 BamH1 ILV5_F 5 -GCGGCTAGCATGTTGAGAACTCAAGCCGC -3 Nhe1 ILV5_R 5 -GCGGTCGACTTATTGGTTTTCTGGTCTCA -3 Sal1 ILV5_GPD_F 5 -GCGGGATCCGGGAACAAAAGCTGGAGCTC-3 BamH1 ILV5_CYC_R 5 -GCGCTGCAGCTTTA ATTTGCGGCC GGTACC-3 Pst1 ARO10_F 5 -GCGCCCGGGATGGCACCTGTTACAATT-3 Sma1 ARO10_R 5 -GCGCTCGAGCTATTTTTTATTTCTTTT-3 Xho1 ARO10_CYC_R 5 -GCGGCTAGCGGTACCGGCCGCAAATTAAA GCCTT-3 Nhe1 ADH2_F 5 -GCGACTAGTATGTCTATTCCAGAAACTCAA -3 Spe1 ADH2_R 5 -GCGCTCGAGTTATTTAGAAGTGTCAACAAC -3 Xho1 ADH2_GPD_F 5 -GCGGAATTCGCTAGCGGGAACAAAAGCTGGAG CTC-3 EcoR1 Nhe1 LEU1_F 5 -GCGACTAGTATGGTTTACACTCCATCCAAGGGT CCA-3 Spe1 LEU1_R 5 - GCGCTCGAGCTACCAATCCTGGTGGACTTTATC GAAAG -3 Xho1 Primers for construction of LEU3Δ601 LEU3Δ601 LEU3F 5 -CGCGGATCCATGGAAGGAAGATCAGATTT-3 BamH1 LEU3R-1 5 -TTTGCATGATTCAGTTGTTCCGACGAGCTTAA GAGCGTT-3 LEU3F-1 5 -TAACGCTCTTAAGCTCGTCGGAACAACTGAAT CATGCAA-3 LEU3R 5 -CGCCTCGAGTTAAACCTTGGGATTGAACG-3 Xho1 a Restriction sites are shown in italics and underlined parts. 19

Table 4. List of plasmids used in this study. Plasmid pug72 psh62 prs413tef prs424gpd prs425gpd prs426gpd prs413tef-leu3 prs413tef-leu3δ601 prs424gpd-ilv3 prs425gpd-ilv2 prs426gpd-ilv5 prs424gpd-ilv235 prs425gpd -ARO10 prs426gpd -ADH2 prs426gpd ARO10 ADH2 prs425gpd LEU1 Relevant characteristics DNA-template for amplification of loxp-ura3-loxp gene auxotrophic marker gene Plasmid containing the Cre-recombinase; URA3 marker gene Plasmid with TEF promoter and CYC1 terminator; HIS3 marker gene Plasmid with GPD promoter and CYC1 terminator; TRP1 marker gene Plasmid with GPD promoter and CYC1 terminator;; LEU2 marker gene Plasmid with GPD promoter and CYC1 terminator;; URA3 marker gene Plasmid with the cloned LEU3 gene of S. cerevisiae under control of TEF promoter and CYC1 terminator, HIS3 marker gene Plasmid with the cloned LEU3Δ601 gene of S. cerevisiae under control of TEF promoter and CYC1 terminator, HIS3 marker gene Plasmid with the cloned ILV3 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, TRP1 marker gene Plasmid with the cloned ILV2 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, LEU2 marker gene Plasmid with the cloned ILV5 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, URA3 marker gene Plasmid with the cloned ILV2, ILV3, and ILV5 genes of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, TRP1 marker gene Plasmid with the cloned ARO10 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, LEU2 marker gene Plasmid with the cloned ADH2 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, URA3 marker gene Plasmid with the cloned ARO10 and ADH2 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, URA3 marker gene Plasmid with the cloned LEU1 gene of S. cerevisiae under control of GPD promoter and CYC1 terminator, LEU2 marker gene 20

Figure 6. Design of the construction plasmids for production of isobutanol and 3-methyl-1- butanol. A. Genetically manipulated construction of the LEU3Δ601 expression vector. B. Genetically manipulated construction of the ILV2, ILV5 and ILV3 expression vector. C. Genetically manipulated construction of the ARO10 and ADH2 expression vector. D. Genetically manipulated construction of the LEU1 expression vector.with LEU2 auxotrophic marker. 21

Xho1을제한효소로하여복제하였다. ILV5의경우 DNA 단편을 Nhe1과 Sal1 제한효소로, prs426gpd 벡터는 Spe1과 Xho1을제한효소자리로하여앞서제작한 prs424gpd-ilv3, prs425gpd-ilv2, prs426gpd-ilv5를원형으로하여각각을 ILV3_F와 ILV3_CYC_R, ILV2_GPD_F 와 ILV2_R, ILV5_GPD_F 와 ILV5_CYC_R를 primer 로사용하여 PCR로증폭한뒤에 prs424gpd 벡터에 Spe1, BamH1, Pst1, Xho1을제한효소로사용하여 prs424gpd-ilv235 를제작하였다. LEU3Δ601 플라스미드제작에있어서 S.cerevisiae 균주 BY4741을주형으로하여 4개의서로다른프라이머를사용하여두번의연속적인 PCR을수행함으로써 LEU3의 172번째부터 774번째까지 601개의아미노산을제거한 DNA 단편을얻은후, prs413tef 벡터에 BamH1과 Xho1을제한효소자리로삽입하여 E.coli에도입하여 LEU3Δ601 플라스미드를제작하였다. ARO10의경우제한효소 Sma1과 Xho1을이용하여 prs425gpd 벡터에복제하였다. ADH2는 Spe1과 Xho1을사용하여 prs426gpd 벡터에복제하였다. 복제된두개의플라스미드 prs425gpd-aro10와 prs426gpd- ADH2를주형으로하여 prs426gpd ARO10 ADH2 플라스미드를각각 ARO10_F 와 ARO10_CYC_R 그리고 ADH2_GPD_F 와 ADH2_R를프라이머로사용하여증폭한후에 prs426gpd에 BamH1, Nhe1, Xho1을제한효소로사용하여복제하였다. LEU1 유전자의경우 PCR 생산물을 Spe1 과 Xho1 을이용하여 prs424gpd 벡터에삽입한후, prs425gpd LEU1 플라스미드를제작하였다. 복제된 벡터를효모내로형질전환하는방법으로는리튬아세트산법 (Lithium acetate 22

method) 를이용하고완료된형질전환체를선별하기위해해당아미노산이 결여된선택적인 SC 배지를사용하였다. 2.4. 발효조건과시료채취및검출방법 본연구에서는형질이전환된효모를선택적배지에서 1차접종한후에이를 0.2의optical density (OD 600) 로 50 ml tube에 10 ml의양으로같은배지에접종하여 30 의 170 rpm으로회분식배양하였다. 배양액을각시간마다 2 ml씩채취하고원심분리기를이용하여세포를가라앉혀상등액 1 ml을대사물질검출에사용하였다. 이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올의농도측정의경우 auto sampler (CP-8410, Varian, Netherlands) 이장착된가스크로마토그래피 (model 450-GC, Varian) 를사용하였다. 분석용컬럼으로는 DB-WAX capillary column (lenght of 30 m, 0.32 mm of an inner diameter, 0,25 μm in strength of stationary phase film; Agilent, Waldbronn, Germany) 을이용하였고, 헬륨을이동상가스로 29 ml/min의속도로흘려주었다. 필터로여과한시료 0.8 μl 를가스크로마토그래피에주입하여 FID 검출기로검출하였다. 분석방법은다음과같다.: 주입구온도 : 250 C; 주입모드 : Split, ratio 20:1; 오븐온도프로그램 : 35 C (5 min간유지 ), 6 C/min 속도로 120 C 증가, 최종적으로 50 C/min 속도로 230 C 까지온도증가 (re-equilibration를위해 5 min간유지 ); 검출기온도 ; 270 C. 데이터정량은 Data Analysis tool 로 Galaxie chromatography Data system (Varian, Netherlands) 를사용하였다. 23

Chapter 3. 결과및토의 3.1. 이소부탄올생산 3.1.1. 경쟁경로의제거영향 3.1.1.1. Aldehyde dehyrogenase 유전자 ALD6 의결손 Ehrlich 경로에서 isobutyradehyde의생산량을높이는것은이소부탄올의생산량을높이는것과직결된다. Isobutyradehyde는환원과정을통해이소부탄올로전환되는데이의경쟁경로인산화과정에관여할것이라고예상되는 ALD2 및 ALD6 유전자의결손을통해 Isobutyradehyde의축적량을높이는균주를제작하였다. 야생형효모를 WT로나타내었고, ALD2 유전자가결손된효모를 ald2δ으로, ALD6 유전자가결실된효모를 ald6δ으로나타내었다. 이들을 2% (w/v) 의포도당을함유한 SC 배지에서배양하여샘플링하여이소부탄올생성량을측정하였다. 48시간배양한결과, 야생형의경우 20.77 mg/l의이소부탄올을생산하였고, 이에반해 ald2δ 균주의경우더적은 19.7 mg/l를생산하였다. ald6δ의이소부탄올생성량이 29.42 mg/l로야생형에비해 1.5배생산량이증가됨을확인하였다. (Figure 7.) 24

Figure 7. The effect of deleting aldehyde dehydrogenase, ALD2 and ALD6. WT, ald2δ and ald6δ cells were grown in SC medium with 2% glucose for 48 and 96 hours. 25

3.1.1.2. ALD6 와 BAT1 유전자의결손 가지사슬아미노산의 aminotransferase의유전자인 BAT1과 BAT2는아미노산의생합성에관여할뿐만아니라 Ehrlich 경로를통한가지사슬아미노산의분해과정에관여한다. 이중 BAT2의경우, 세포질에서작용하고 BAT1의경우미토콘드리아에서작용한다고보고되어있다 (30, 31). 이들중에서 BAT1의결손을통해 2-ketoisovalerate의축적량이늘어날것으로예상하고균주를제작하였다. 또한앞의결과를통해이소부탄올생성에효과적이라밝혀진 ald6δ을추가적으로도입한 bat1δald6δ 의이중결실균주를제작하여이소부탄올의생성량을확인하였다. 이들을히스티딘이첨가되지않은 2% (w/v) 의포도당을함유한 SC-His 배지에서배양하여이소부탄올의생성량을측정하였다. WT의생산량은 18.1 mg/l이고, BAT1 유전자가결손된 bat1δ의경우 34.18 mg/l의이소부탄올을, bat1δald6δ 효모의이소부탄올생성량이 61.23 mg/l로야생형에비해 48시간배양하였을때, 3.5배이상생산량이증가됨을확인할수있었다. (Figure 8.) 26

Figure 8. Improvement of the isobutanol production by deletion of BAT1 and ALD6 involved in competitive pathway. WT, bat1δ, ald6δ and bat1δ ald6δ cells were grown in SC-His medium with 2% glucose for 48 hours. 27

3.1.2. 전사조절인자와생합성유전자의과발현 3.1.2.1. 전사조절인자 (LEU3Δ601) 의과발현 발린의생합성과정에관여하는 ILV2, ILV5, LEU1, LEU2, LEU4 유전자의전사를활성화시킨다고알려진 LEU3 전사조절인자는특정환경에서만활성화된다. 대사산물의유무와관계없이항상활성을띄는것으로알려진 LEU3 유전자의돌연변이형태인 LEU3Δ601 유전자를효모의 DNA로부터 overlap-pcr을통해확보하여플라스미드를이용해과발현하였다. 야생형효모를 WT로나타내었고, LEU3 유전자가과발현된효모를 LEU3으로, LEU3Δ601 유전자가과발현된효모를 LEU3Δ601으로나타내었다. 이들을 2% (w/v) 의포도당을함유한 SC-His 배지에서배양하여샘플링하여이소부탄올생성량을측정하였다. WT의경우 48시간배양한결과 14.8 mg/l, LEU3 균주의경우 16.9 mg/l의이소부탄올을생산하였다. LEU3Δ601 유전자를과발현시킨효모의 isobutanol 생성량이 17.6 mg/l로야생형에비해약 1.2배생산량이증가되었고 LEU3에비해소량의 isobutanol이더생산되는결과를보였다. (Figure 9.) 28

Figure 9. The effect of transcription factor that regulates branched chain amino acid synthesis on isobutanol production. Wild type or cells overexpressing LEU3 or LEU3Δ601 were grown in SC-His medium with 2% glucose. 29

3.1.2.2. 발린의생합성 Ehrlich 경로유전자의과발현 L-발린의생합성에관여한다고알려진 ILV2, ILV3, ILV5 유전자의과발현과추가적으로 Ehrlich 경로에서 decarboxylation에관여하는 KDC로 ARO10을, 환원과정에관여하는 ADH로 ADH2를과발현하여이소부탄올생산에있어서효과를확인하였다. 여기에추가적으로전사조절인자인 LEU3Δ601를추가적으로과발현하여그결합효과를실험하였다. 앞서확인한 bat1δald6δ 균주를바탕으로유전자들을추가적으로과발현하였다. 야생형효모를 WT로나타내었고, 각각의유전자들을 bat1δald6δ 균주에과발현한효모를 bat1δald6δ ILV235, bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601, bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 로나타내었다. bat1δald6δ 균주에 ILV2, ILV3, ILV5 유전자를과발현한경우약 3배정도그생산량이증가하였다. 추가적으로 LEU3Δ601를과발현 (136 mg/l) 하면 1.5배더증가하고 WT (19.9 mg/l) 과비교하여약 5배정도이소부탄올의양이증가함을보았다. ARO10과 ADH2를더발현한경우는이소부탄올생성량이 137.3 mg/l로그효과가 bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 효모와비슷함을보였다. 이는미토콘드리아서생성된 α-ketoisovalerate가세포질로의수송이충분히이루어지지않아 ARO10와 ADH2의효과가미미한것으로보인다. 또다른가능성으로는 LEU3Δ601의과발현과배지상에존재하는류신의고갈로 LEU3 유전자가유도되어 LEU4 유전자의발현이조장되면서류신의생합성경로의중간물질인 α-ipm의축적으로 α-ketoisovalerate가소비될수있다는것이다. 최종적으로 bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 에서이소부탄올의생성량이약 7배정도증가함을확인할수있었다. (Figure 10.) 30

Figure 10. The effect of overexpression enzymes involved in amino acid biosynthesis and the Ehrlich pathway. WT, bat1δald6δ, bat1δald6δ ILV235, bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 and bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 were incubated in the SC-His-Trp-Ura medium with 2% glucose. 31

3.1.3. 최종선별균주에서포도당농도에따른이소부탄올 생산 이소부탄올생산에있어서가장효과적임이확인된 bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 균주를포도당농도를달리하여이소부탄올생성량을확인하였다. 기존에 2% (w/v) 의포도당을함유한 SC-His, Trp, Ura 배지와 4% (w/v), 10% (w/v) 의포도당이함유된 SC-His, Trp, Ura 배지를사용하였다. 야생형균주에 2% 포도당을함유한배지에서키운효모를 WT (2%) 로, 4% 포도당에서키운효모를 WT (4%) 로, 10% 포도당에서배양한효모를 WT (10%) 로나타내었다. 동일하게 bat1δ ald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 균주의배양액에함유된포도당농도를괄호안에표기하였다. bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2 (10%) 에서의이소부탄올생성량이 10% 포도당에서키운야생형 (53.06 mg/l 이소부탄올 ) 에비해 120시간배양하였을때, 그농도가 377 mg/l로써약 7배이상생산량이증가하였다. (Figure 11.) 32

Figure 11. Isobutanol production depending on glucose concentration. The strain with a combination of all the effects is batδald6δ LEU3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2. Parenthesized concentrations in all strain indicate glucose concentrations in media. All strains were cultivated in SC-His-Trp-Ura selection medium. 33

3.2. 3- 메틸 -1- 부탄올생산 3.2.1. LEU2 유전자의발현에따른 3- 메틸 -1- 부탄올생산 본실험에서 parental 균주로사용하는 CEN.PK2-1C의경우 LEU2 유전자의돌연변이로인해포도당으로부터의 3-메틸-1-부탄올생산이거의일어나지않는다. 이소부탄올생산에있어효과가확인된 bat1δald6δ LEU3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2 균주에 LEU2 유전자를 prs425gpd 플라스미드를통해발현한후 3-메틸-1-부탄올의생산증가를확인하였다. prs425gpd 벡터의 auxotrophic marker로 LEU2 유전자가사용된다. 야생형 (WT) 에 LEU3Δ601, ILV235, ARO10 과 ADH2 가차례로과발현될때마다 3-메틸-1-부탄올의생산량은소량증가하는경향을보이지만그양은아주미량이다. prs425gpd 플라스미드를이용한 LEU2 유전자의도입을통해막혔던경로가회복됨을 bat1δald6δ LEU3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2 LEU2 균주를통해확인하였다. 최종균주의경우, LEU2 유전자의발현이이소부탄올생산에있어서경쟁경로로작용하여이소부탄올의생성량은 3배이상감소하였다. 3-메틸-1-부탄올의경우그생산량이 246 mg/l로야생형에비해약 17배가량증가된농도를확인할수있었다. (Figure 12.) 이를통해최종균주에서이소부탄올생산은줄이고 3-메틸-1-부탄올을더욱높은농도로생산할수있었다. 34

Figure 12. Improvement of 3-methyl-1-butanol production by combination of overexpressing LEU2 and genes involved in amino acids biosynthesis and Ehrlich pathway. The bat1δald6δ LEU3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2 cells was transformed with prs425gpd vector containing LEU2 gene as a selection marker. WT, bat1δald6δ Leu3Δ601, bat1δald6δ Leu3Δ601 ILV235 and bat1δald6δ Leu3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2 were cultivated in SC-His-Trp-Ura medium with 10% glucose. The bat1δald6δ LEU3Δ601 ILV235 ARO10 ADH2 LEU2 was incubated in SC-His-Trp-Leu-Ura selection medium with 10% glucose. 35

Chapter 4. 결론및고찰 다양한분야에서효과적으로사용되고있는가지사슬고급알코올은최근의치솟는석유가격에따라원유에의존하지않는새로운생산방법의개발이필요한상황이다. 특히이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올은다양한화학물질의용제와식품첨가물, 특히플라스틱의가소제로사용될뿐만아니라에탄올과비교하여높은에너지밀도를가지고옥탄가도높아효율적인연료첨가제로서차량연료에혼합하여사용이가능하다. 또한이소부탄올은유용한화합물의중간물질로서다양한물질로전환이가능하기때문에그효용가치는더욱높다. 높은에너지효율을갖는고급알코올중이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올은그대사공학적생산과정이비교적간단하기때문에원유를통한합성정제방법에비해가격효율이떨어짐에도불구하고환경오염문제의극복과같은이점으로인해생화학적합성법의수요가증가하고있는추세이다. 효모는자연적으로포도당으로부터고급알코올를생성할수있다. 지금까지효모를통한고급알코올생산에관한연구들은 E.coli를이용한연구에비해그생산량이굉장히낮다. 하지만효모의산업적균주로의다양한이점덕분에효모를이용한고급알코올생산에관한연구는지속적으로각광받고있다. 본연구또한이러한시도중하나로써대사공학적방법을이용하여이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올을효과적으로생산하는효모균주를제작하고자하였다. 이소부탄올의합성과정의 α-ketoisovalerate 와 isobutyraldehyde 의경우각각 L- 발린의생합성에관여하는 BAT1 과알데히드의산화과정에관여하는 ALD6 36

유전자에의해그축적량이감소한다. 각반응에관여하는 BAT1 과 ALD6 유전자의결손을통해야생형에비해이소부탄올생성량이 3.5 배증가함을 보였다. 또한발린의생합성에관여하는 ILV2, ILV5, ILV3 유전자의과발현과전사조절인자인 LEU3Δ601을추가발현함으로써이소부탄올의생산량을더욱늘렸다. ARO10과 ADH2의과발현을통해야생형과비교하여약 7배가량증가한이소부탄올을생산할수있었다. 최종적인균주 bat1δald6δ ILV235 LEU3Δ601 ARO10 ADH2를 10% 의포도당을함유한배지에서배양함으로최대 377 mg/l 생산량으로로써야생형보다약 20배이상높은이소부탄올을얻을수있었다. Parental 균주로사용한 CEN.PK2-1C의경우 LEU2 유전자의돌연변이가도입되어있어포도당으로부터 3-메틸-1-부탄올의합성이힘들다. prs425gpd의 auxotrophic marker로존재하는 LEU2 유전자의도입시, 3- 메틸-1-부탄올이소량증가한다. LEU3Δ601 유전자의추가적인과발현은탄소의흐름을유도할뿐만아니라 LEU2의프로모터에결합하여유전자의발현을증가시키고추가적인경쟁경로의제거를통해 3-메틸-1-부탄올의생산량이 10배증가함을볼수있었다. 최종적으로 ILV2, ILV5, ILV3를과발현함으로써더많은탄소의흐름을이끌고 ARO10과 ADH2의과발현을통해생성량이 240.45 mg/l로 WT 대비약 17배가량증가한 3-메틸-1-부탄올을얻을수있었다. 이소부탄올의경우, 미토콘드리아에서 α-ketoisovalerate 의수송단백질이아직 밝혀지지않은상태로추가적인생산량의증가가능성이있어보인다. 또한 37

3- 메틸 -1- 부탄올의경우, 류신생합성에관여하는 LEU4 와 LEU1 의추가적인 과발현이도입된다면최종적으로더높은농도의 3- 메틸 -1- 부탄올의를얻을 수있을것으로예상된다. 본연구에서개발된균주는기존에밝혀진전략에추가적으로전사조절인자를도입하고 LEU2 유전자의발현을통해경로를재건함으로써좀더증가된가지사슬고급알코올을생산하였다. 이를통하여인체에덜유해한이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올을합성할수있을것이다. 또한현재까지바이오에탄올과바이오디젤에초점이맞춰져있는국내바이오연료관련연구에서효모를이용한고급알코올의생산기술의구축이기술선점의측면에서시장성확보가가능할뿐만아니라원유수입국의입장에서이에대한의존성을감소시킬수있을것으로전망된다. 38

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국문요약 이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올과같은고급알코올들은에탄올과비교하여높은에너지밀도와낮은흡습성으로인해최근큰주목을받고있다. S. cerevisiae는아미노산생합성경로와 Ehrlich 경로를통해자연적으로소량의이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올을생산한다. 이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올각각은아미노산의분해과정인 Ehrlich 경로를통해 2-ketoisovalerate와 2- ketoisocaproate를중간물질로생산하고연이은 decarboxylation과환원과정을통해최종적으로해당물질을생성한다. 본연구는이러한효모내에존재하는경로에작용하는효소들의제거또는과발현을통해이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올의생산을극대화시키고자하는것에관한것이다. 본연구에서는 aldehyde dehydrogenase를암호화하고있는 ALD6 유전자와 2- ketoisovalerate와 2-ketoisocaproate 각각으로부터발린과류신을합성하는 BAT1 유전자의결실을통해이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올의생산성을향상시킨균주를제작하였다. 또한발린과류신의생합성과정에관여하는유전자의전사조절인자인 LEU3의항상활성화된형태인 LEU3 돌연변이 (LEU3Δ601) 의제작과도입을통해대사산물에의한피드백저해를막고 ILV2, ILV3, ILV5, ILV6, ARO10, 와 ADH2 유전자를과발현하여최종적으로이소부탄올과 3-메틸-1-부탄올을생산하였다. 형질전환된효모를 10% 포도당을포함한배지에서배양한결과 이소부탄올은 377 mg/l, 3- 메틸 -1- 부탄올의경우 250 mg/l 로야생형보다각각 약 20 와약 17 배증가한생산량을얻었다. 43

감사의글 벌써 2년이라는시간이흘렀습니다. 2년이라는시간동안참으로많은생각을가졌던것같습니다. 처음대학원을결심했을때의초심을잊지는않았는지여러가지다짐들이지켜졌는지, 돌이켜생각해보면대견했던순간들과아쉬웠던순간들이스쳐지나갑니다. 우선 2년간부족한저에게많음배움을주신한지숙교수님감사드립니다. 교수님의가르침과믿음에보답할수있는제자가되도록하겠습니다. 학위기간동안가족보다더오랜시간을함께했던실험실선배님들께감사의마음을전하고싶습니다. 베드로오빠, 규성오빠, 태준오빠, 보람오빠, 수진언니, 승호오빠, 명섭오빠, 대희, 보수오빠감사드리고앞으로도잘부탁드립니다. 처음실험실왔을때, 교수님의빈자를채워주시고환영해주신것잊지않고있습니다. 2년간가르쳐주신모든것들을잊지않고박사과정동안의밑거름으로삼고열심히하는후배가되겠습니다. 후배인지수, 상정이, 윤정이, 광현이아직만난지얼마되지않았지만앞으로감사할일들이많이생길것같은후배들입니다. 그리고저를많이귀여워해주신아림이언니보고싶습니다. 상민오빠도감사드립니다. 저의곁에서항상힘이되어주고따뜻한응원의말들을아끼지않았던친구들에게도감사의마음을전하고싶습니다. 나의끼니를항상걱정해준수미, 많은추억을함께쌓은민숙이, 남자들만있는군대에서고생하는효주너무고맙고사랑해. 힘든시간함께보내며우리의마음들이더욱단단해졌으리라믿습니다. 그리고나의자랑스러운친구경은아, 너의 44

앞으로의길을응원할게. 부산대화공과이뿐이우리벤젠, 국희, 지은이, 예슬이, 정민이, 경아. 힘들때마다너희들의빈자리가컸고힘이됐어. 힘내자친구들. 내숭미희야, 올해는니가원하는일을꼭하길바랄게. 같이서울대에와서함께공부한유라야. 마무리잘하자. 그리고나의가장오랜벗이자이름만으로도그리운코스모스효진아. 너무보고싶다. 서울에서엄마처럼저를보살펴주신안양고모와이모에게도감사하고, 따뜻한밥정말맛있었습니다. 마지막으로항상저의든든한버팀목인우리오빠너무고맙고많이보고싶어. 철부지막내딸이 27살먹도록열심히뒷바라지해주시고아낌없이사랑해주신우리부모님, 감사드리고아주많이사랑합니다. 항상자신의일을즐겁게자랑스럽게여기는딸이되겠습니다. 석사졸업을앞두고 11월즈음, 앞으로얼마나긴시간을여기서머물러야할까라는걱정이앞서던순간에서울대학교캠퍼스의아름다운단풍과가을풍경을보면서이러한아름다움을앞으로더오랜시간볼수있는것에감사하는마음이들었습니다. 이런마음잊지않고앞으로의시간을더욱값지게보내겠습니다. 저를행복한사람일수있게해주신제곁의모든분들께감사드립니다. 45