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약학석사학위논문 전처리인삼의화학성분및 AMPK 활성 Identification of chemical constituents from processed Panax ginseng extract and their AMPK activity 2015 년 8 월 서울대학교대학원 약학과생약학전공 김국화

국문초록 인삼 (Panax ginseng) 은두릅나무과식물로우리나라에서오랫동안한약재로사용하여온약용식물이다. 인삼에함유되어있는성분으로는 dammarane계의 triterpenes인진세노사이드등이알려지고있으며, 면역기능증강, 중추억제및안정작용, 암세포전이억제등의다양한생리활성에대한많은보고가있다. 인삼의뿌리에열을가하여찌고익히는과정을통하여만들어진홍삼은예로부터피로회복, 면역력증진과함께혈소판응집억제를통해혈액흐름을원활하게하는효능이있다고알려지고있다. 홍삼의효능을나타내는주성분으로는 Rg3, Rh2 등이있는데두성분모두인삼의열처리과정에서늘어난인삼의구성성분이다 (Lee et al., 2009). AMPK 효소는 AMP/ATP의비율에따라생체내에서반응하여그활성이조절되는인산화효소로에너지대사과정에중요한역할을한다. AMPK 효소의활성화는현대에서많이발생하는비만, 당뇨등대사증후군의치료에사용될수있다. 특히인삼사포닌중홍삼의주성분으로알려진 Rg3가 AMPK 효소를활성화한다는보고가있다 (Hwang et al., 2009). 이에 Rg3를포함하여 AMPK 효소의활성을증가시키는인삼의구성물질을규명하고자본실험을진행하였다. 인삼에효소및열처리와같은전처리과정을통하여 AMPK 효소의활성물질로알려진 Rg3 등인삼의비극성부분을증가시켰다. 전처리시인삼에미량으로함유하는비극성화합물들의증가가관찰되었고이에관련된화합물을분리, 정제하여 C2C12 세포주를이용한 AMPK 활성실험을실시했을때, 전처리시늘어난인삼의화합물들이 AMPK 효소를활성화하는결과를확인할수있었다. i

인삼의건조된뿌리에물을넣어추출하고 HP-20를통과시켜당을포함한극성부분및 PPT 계열의화합물은제거하고 90% 메탄올부터 100%, 그리고아세톤부분을얻은후이에효소및열처리방법을사용하여비극성화합물을증가시켰다. 전처리반응을통하여얻어진분획을대상으로 silica gel column chromatography와 HPLC, LC-MS 등을 사용하여화합물의 UV, Q-TOF/ESI-MS, 1 H-NMR, 13 C-NMR, HSQC, HMBC와선광도, IR 등의정보를얻을수있었고, 이를통하여총 15종의화합물을분리하였다. 분리한화합물들은 20(S)-ginsenoside Rh2 (1), 20(R)-ginsenoside Rh2 (2), 20(S)-ginsenoside Rg3 (3), 20(R)-ginsenoside Rg3 (4), ginsenoside Rk2 (5), Isoginsenoside Rh3 (6), compound K (7), ginsenoside F2 (8), ginsenoside Rg5 (9), ginsenoside Rk1 (10), ginsenoside Rk3 (11), dehydroprotopanaxatriol (12), quasiprotopanaxatriol (13), 20(S)-protopanaxatriol (14), 20(R)-protopanaxatriol (15) 로각각동정하였다. 분리된화합물들은모두 dammarane계 triterpenoids 골격을하고있고, 인삼의효소처리및열처리에의해늘어난물질로규명되었다. 화합물 (1)~(10) 은 PPD계 triterpenes 골격구조의화합물이었으며, 화합물 (11)~(15) 는 PPT 계열의화합물임을확인하였다. C2C12 세포주를이용한 AMPK활성을측정한결과 compound (1) 과 (3) 이 AMPK의활성을현저하게증가시키는것으로나타났으며, 이러한 AMPK의활성은인삼의전처리과정에서늘어난화합물에의하여증가한다는것을보여주었다. keywords: Panax ginseng, Araliaceae, PPD 계 ginsenosides, C2C12, AMPK 활성증가, metabolic syndromes Student Number: 2013-23454 ii

목차 초록 ⅰ 목차 ⅲ List of Abbreviations xii List of Figures ⅷ List of Tables ⅹ List of Schemes ⅹ Ⅰ. 서론 1 1. Panax ginseng 1 2. 대사증후군 6 3. AMP-Activated Protein Kinase (AMPK) 8 3-1. AMPK의구조 10 3-2. AMPK의조절 11 3-3. AMPK의역할 13 3-4. AMPK 활성에대한생약의적용 15 3-5. 연구목표 18 Ⅱ. 실험재료및방법 19 1. 실험재료 19 2. 시약및기기 19 2-1. 시약 19 iii

2-2. 기기 20 3. Panax ginseng 뿌리의전처리 22 3-1. Panax ginseng의추출 22 3-2. Panax ginseng의전처리 24 4. 전처리한 Panax ginseng 으로부터화합물분리및정제 26 4-1. 전처리한 Panax ginseng 에서화합물분리 26 4-2. Dammarane 계 Triterpenoid Protopanaxadiol 계열화합물의분리 27 4-2-1. 화합물 1의분리 27 4-2-2. 화합물 2의분리 28 4-2-3. 화합물 3의분리 29 4-2-4. 화합물 4의분리 30 4-2-5. 화합물 5의분리 31 4-2-6. 화합물 6의분리 31 4-2-7. 화합물 7의분리 32 4-2-8. 화합물 8의분리 33 4-2-9. 화합물 9의분리 34 4-2-10. 화합물 10의분리 34 4-3. Dammarane계 Triterpenoid Protopanaxatriol계열화합물의분리 35 4-3-1. 화합물 11의분리 35 4-3-2. 화합물 12의분리 36 4-3-3. 화합물 13의분리 37 4-3-4. 화합물 14의분리 38 4-3-5. 화합물 15의분리 39 iv

5. C2C12 세포주에서 AMPK 활성검색 45 5-1. C2C12 세포주배양및분화 45 5-2. AMPK assay 45 5-3. 통계처리 46 Ⅲ. 결과및고찰 47 1. 인삼의전처리조건 47 1-1. 효소처리시간 47 1-2. Enzyme 양 49 1-3. ph 조절및열처리횟수 51 1-4. 산처리유무 53 2. 성분연구 54 2-1. 화합물 1의구조분석 54 2-2. 화합물 2의구조분석 58 2-3. 화합물 3의구조분석 61 2-4. 화합물 4의구조분석 65 2-5. 화합물 5의구조분석 68 2-6. 화합물 6의구조분석 72 2-7. 화합물 7의구조분석 76 2-8. 화합물 8의구조분석 80 2-9. 화합물 9의구조분석 82 2-10. 화합물 10의구조분석 86 2-11. 화합물 11의구조분석 89 2-12. 화합물 12의구조분석 93 v

2-13. 화합물 13의구조분석 96 2-14. 화합물 14의구조분석 99 2-15. 화합물 15의구조분석 101 3. Panax ginseng의반응물에서분리한화합물들의 AMPK 활성검사 105 Ⅳ. 결론 110 Ⅴ. 참고문헌 111 Abstract 122 vi

List of Abbreviations ACN [α] 20 D BuOH cc d DMEM ESIMS QTOFMS fr. HMBC HPLC Hz IR MeOH NMR AMPK R f RP s t TLC UV PPD PPT : acetonitrile : specific rotation : butanol : column chromatography : doublet : Dulbecco's Modified Eagle's Medium : electrospray ionization mass spectrometry : Quadrupole-time-of-flight mass spectrometers : fraction : heteronuclear multiple bond correlation : high performance liquid chromatography : hertz : infrared absorption : methanol : nuclear magnetic resonance : AMP activated protein kinase : migration distance relative to solvent front in TLC : reversed phase : singlet : triplet : thin layer chromatography : ultraviolet absorption : protopanaxadiol : protopanaxatriol vii

List of Figures Figure 1. Contents evaluation of saponins by ginseng types 1 Figure 2. Comparison of the constituent ratio based on ginseng types 2 Figure 3. Comparison of white ginseng and red ginseng by phenotypic properties, biomolecular contents, and major bioactivities 4 Figure 4. Pharmacological effects of ginsenoside in Panax ginseng 5 Figure 5. Metabolic syndrome and its related disorders 7 Figure 6. Regulation of energy homeostasis in the AMPK system 9 Figure 7. Roles of AMPK in the control of whole-body energy homeostasis 10 Figure 8. Genetic domains and protein subunit structures of AMPK 11 Figure 9. Regulation of AMPK activation based on Ca ++ level and AMP/ATP ratio 12 Figure 10. AMPK and the regulation of hepatic metabolism 13 Figure 11. AMPK and regulation of skeletal muscle metabolism 14 Figure 12. Structures of potential AMPK activators found in food sources 17 Figure 13. TLC pattern, LC-MS spectrum of p. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the pre-treatment time 48 Figure 14. Quantification of ginsenoside F2 49 Figure 15. TLC pattern, LC-MS spectrum of p. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the amount of the enzyme 50 Figure 16. TLC pattern, LC-MS spectrum of p. ginseng s heated treatment solution dependent on ph, heating condition 52 Figure 17. Quantification of ginsenoside Rh2 52 viii

Figure 18. TLC pattern of p. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the acid condition 53 Figure 19. Quantification of ginsenoside F2 54 Figure 20. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 1 56 Figure 21. HSQC and HMBC spectra of compound 1 57 Figure 22. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 2 60 Figure 23. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 3 63 Figure 24. HSQC and HMBC spectra of compound 3 64 Figure 25. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 4 67 Figure 26. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 5 70 Figure 27. HSQC and HMBC spectra of compound 5 71 Figure 28. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 6 74 Figure 29. HSQC and HMBC spectra of compound 6 75 Figure 30. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 7 78 Figure 31. HSQC and HMBC spectra of compound 7 79 Figure 32. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 8 81 Figure 33. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 9 84 Figure 34. HSQC and HMBC spectra of compound 9 85 Figure 35. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 10 88 Figure 36. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 11 91 Figure 37. HSQC and HMBC spectra of compound 11 92 Figure 38. 1 H, 13 C-NMR spectrum of compound 12 95 Figure 39. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 13 98 ix

Figure 40. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 14 100 Figure 41. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 15 103 Figure 42. Structure of the compounds isolated from processed P. ginseng 104 Figure 43. The effect of the compounds from processed P. ginseng roots on AMPK activity in C2C12 cells 106 Figure 44. The effect of the selected compounds from processed P. ginseng roots on AMPK activity in C2C12 cells 107 Figure 45. The comparison of the (R) form and (S) form of compound 1 and 3 on AMPK activity in C2C12 cells 108 Figure 46. The result of the compound 1 and 3 on effective pampk increase in C2C12 cells 109 List of Tables Table 1. 1 H-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 41 Table 2. 13 C-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 43 List of Schemes Scheme 1. Extraction and filtration of P. ginseng roots 23 Scheme 2. Pre-treatment of P. ginseng extract 25 Scheme 3. Isolation of the compounds from the processed P. ginseng roots 26 x

Ⅰ. 서론 1. Panax ginseng 인삼 (Panax ginseng) 은두릅나무과식물로주로 4~6년근인삼의뿌리를약용으로사용하고있다. 뿌리는도라지같고꽃은연한녹색이며, 열매는둥글고적색으로익는다. 뿌리는옛날부터강장제 (tonic) 로알려지고있으며, 최근의과학적연구에의해서도그약효가인정되어가고있는추세이다 (Liu et al., 1992, Kitts et al., 2000). 인삼은그원산지에따라일본인삼은죽절인삼 (Panax japonicus), 중국에서는삼칠인삼 (Panax notoginseng), 미국에서는화기삼 (Panax quinquefolius), 그리고한국에서는고려인삼 (Panax ginseng) 으로그종류가다양한데인삼의주성분인사포닌의종류는고려인삼에 30종으로미국삼 14종, 중국삼 15종에비해월등히많은종류가함유되어있는것으로보고되고있다 (Fig 1). 성분 / 종별 고려인삼화기삼전칠삼죽절인삼홍삼백삼 ( 미국삼 ) ( 중국삼 ) ( 일본삼 ) 총사포닌수 30종 23종 14종 15종 8종 PPD 계 19 15 9 6 3 PPT 계 11 7 4 9 4 Olean 계 1 1 1-1 Figure 1. Contents evaluation of saponins by ginseng types 인삼의주된약리성분으로알려진인삼사포닌은 ginsenoside 인데 dammarane 계 triterpenes 구조로다른식물에서발견되는사포닌과는다른 특이한화학구조뿐아니라그효능도매우다르다. 지금까지 30 종의 1

인삼사포닌의화학구조가밝혀졌고인삼사포닌성분은크게진정작용을하는파낙사디올계 (PPD) 와흥분작용을하는파낙사트리아올계 (PPT) 로나뉘는데고려인삼은다른외국삼보다사포닌의종류가더많이함유되어있을뿐만아니라 PPD계와 PPT계의구성이균형있는비율로존재해혈압과체온등몸의균형을조정하는역할을잘수행한다 (Fig. 2). Figure 2. Comparison of the constituent ratio based on ginseng types 인삼사포닌의주요약효성분에는항피로작용, 자양강장작용, 면역증강작용, 중추신경계작용, 심혈관계작용, 혈당강하작용등다양한활성이있다고알려져대표적인약재로이용되고있다 (Choi et al., 2013, Alraek et al., 2011). 가공유형에따라생삼 (4~6년근그대로의인삼 ), 백삼 ( 생삼을건조한것 ), 홍삼 ( 생삼을찐것 ) 등으로구분하여가공방법에따라사용하는데특히인삼의뿌리를수증기로쪄서말린홍삼에는사포닌배당체성분이훨씬다량함유하여기존에알려진인삼의효능이더 2

탁월하게된다. 특히생삼을홍삼으로만드는전처리과정에서성분변화를일으켜새로운사포닌이생성되는데홍삼사포닌중 ginsenoside Rh2는항암성이있어모든암세포를억제하며현재국제적으로인정되는항암약품시스플라틴 (Cisplatin, CDDP) 과함께사용하면적은부작용으로암세포를죽일수있는활력이 2배정도많이생긴다고알려져있다 (Choi et al., 2008). 또한생리적으로해독작용이있고항혈소판작용및항산화활성, 노화억제, 지방분해, 면역기능증강의효과를가지며지금까지 ginsenoside Rh2의부작용은발견되지않았다. 그밖에홍삼에만함유하는특유성분으로는암세포전이억제, 혈소판응집억제및항당뇨성분인 ginsenoside Rg3 등 8종이있다. 특히홍삼의주성분인 ginsenoside Rg3는 AMPK 신호경로를활성화하여비만이나당뇨와같은대사증후군에유효한효과가있다고많은문헌에서밝히고있다 (Hwang et al., 2009). 이러한성분들은인삼의전처리과정에서 ginsenoside의열분해에의한구조변화로주성분이변환되어생기게되는특수성분이라할수있다. 따라서인삼의증숙, 건조등전처리는그과정을거치는동안화학적구조변화가일어나고유효성분의함량이증가하여인체에훨씬유익하다는장점에착안하여 ginsenoside Rg3나 Rh2를비롯한유효성분의함량을증가시키려는전처리방법은소량의인삼으로다량의활성성분을얻을수있다는점에서의미있는시도라고할수있다 (Kwon et al., 2001), (Fig.3,4). 3

항목홍삼백삼 색상 담적갈색, 담황적갈색, 다갈색 유백색또는담황색 사포닌 Rh2, Rg3, Rh1, Rh4 등 Malonyl-ginsenoside-Rb1, 생성. Rb2, Rc 및 Rd 존재. 산성다당체 7~8% 존재 2~3% 존재 전분 호화된상태 생전분상태 효소 모두실활 ( 失活 ) 됨 α-amylase, invertase 등거의모든효소활성유지 폴리아세틸렌 0.6~1.0 mg/g 0.1~0.2 mg/g 갈변물질 백삼보다분자량이더큰갈변물질존재 천연색소존재 (melanoidin pigment) 수소공여성 ( 환원활성 ) 크다 작다 혈소판응집억제능 크다 작다 Figure 3. Comparison of white ginseng and red ginseng by phenotypic properties, biomolecular contents, and major bioactivities 4

항염증작용, 해독작용, 항트롬빈작용, 혈소판 Oleanolic acid 계 Ginsenoside Ro 응집억제작용, 항간염작용, 대식세포활성화작용 중추신경억제작용, 진통작용, 정신안정작용, 해열작용, 혈청단백질 Ginsenoside Rb1 합성촉진작용, 중성지방분해억제, 인슐린유사작용, 호르몬분비촉진작용 중추신경억제작용, Panaxadiol 계 Ginsenoside Rb2 부신피질자극호르몬분비촉진작용, 항당뇨작용 중추신경억제작용, Ginseng Saponin Ginsenoside Rc 혈청단백질합성촉진작용, 부신피질자극호르몬분비촉진작용 Ginsenoside Rd 부신피질자극호르몬분비촉진작용 중추신경억제작용, Ginsenoside Re 부신피질자극호르몬분비촉진작용 Ginsenoside Rf 뇌신경세포와관련한진통작용 Panaxatriol 계 Ginsenoside Rg1 중추신경흥분작용, 항피로작용, 피로회복작용, 기억및학습개선작용 Ginsenoside Rg2 혈소판응집억제작용, 플라스민활성화작용 Ginsenoside Rg3 암세포전이억제작용 홍삼류특유성분 Panaxadiol 계 Ginsenoside Rh2 암세포증식억제작용, 항종양작용 Figure 4. Pharmacological effects of ginsenoside in Panax ginseng ( 출처 : 금산인삼관 http://www.geumsan.go.kr) 5

2. 대사증후군 현대사회에서는고지방음식섭취와주로앉아서생활하는습관등복합적원인으로비만, 당뇨병, 고지혈증및심혈관계질환등과같은대사장애가급격히증가하고있다. 특히에너지항상성의불균형은근육, 간, 그리고지방세포의기능이상을초래하고, 그로인해대사성질환이발생한다 (Wing RR et al., 2001). 대사증후군 (Metabolic Syndrome) 이란각종심혈관질환과제 2형당뇨병의위험요인들이서로군집을이루는현상을한가지질환군으로개념화시킨것이다. 즉, 고혈압, 고지혈증, 당뇨병, 뇌졸중, 심근경색등각종성인병이한사람에게동시다발적으로나타나는증상이다. 이는기존의질병들과는다른특이적인개념으로심혈관질환과제2형당뇨병발생의위험요인들쌓이거나독립적인질환들이악화되어한개인에서동시에발생되고이들은부분적으로비슷한병태생리에기인한다 (Kim et al., 2012), (Fig.5). 6

Figure 5. Metabolic syndrome and its related disorders (Kim et al., 2012) 많은연구결과에의하면대사증후군은제 2형당뇨병이나심혈관질환의위험성을증가시키는것으로알려져있다. 특히대사증후군의존재는새로운당뇨병의발병을증가시킬수있다 (Grundy et al., 2004). 더불어대사증후군이있는경우당뇨병발생의위험은 5배까지증가하고대사증후군과인슐린저항성을함께가지고있는경우에는 6-7배까지증가하는것이관찰되었다 (Grundy et al., 2004; Laaksonen et al., 2002; Hanson et al., 2002; Ford et al., 2008). 대사증후군이비만, 특히내장비만과밀접한관련이있음은명확하고, 보다더심각한질병상태로진행하는전단계로생각될수있다. 하지만대사증후군의약물치료는아직까지그병태생리가완전히알려져있지않기때문에이에대한보다효율적인치료약의개발이시급하다. 7

3. AMP-Activated Protein Kinase (AMPK) 에너지항상성의불균형으로인한에너지대사조절의이상은인슐린저항성을초래하며, 이는대사장애의다양한병리생리학적인요인으로작용할것으로생각된다 (Saltiel et al., 2001). 최근연구결과들은 AMPK (AMP-activated protein kinase) 를대상으로생체내에너지인식및항상성조절이이루어지며, 당과지방의대사에있어서중요한역할을한다는사실을밝히고있으며, 이러한에너지균형의이상은대사성질환을비롯한심혈관계질환, 암발생까지그위험성을증가시킬수있는것으로나타나고있다 (Towler et al., 2007). 대사증후군관련인자로잘알려진 AMP-activated protein kinase (AMPK) 는세포내에너지상태를조절하는병리학적센서로체내지방과당의항상성을조절하는역할을한다. 따라서 AMPK는당뇨병과비만치료에잠재적인타겟으로제기되어왔다. 게다가 AMPK의활성화는혈관내벽과평활근뿐만아니라심장을보호하는효과가나타날수있다고알려져있다. 반대로 AMPK의신호에장애가생기면동맥경화증과고혈압을포함한만성심혈관질환의기원이될수있다고보고되어왔다. AMPK는세포내의에너지항상성유지에센서역할을하는효소로대사성스트레스나과격한운동에의해세포내 ATP가고갈되어 AMP/ATP 비율이증가하는경우에활성화되어 ATP를소비하는과정 ( 지방산합성과콜레스테롤합성 ) 을억제하고 ATP를생산하는과정 ( 지방산산화와해당과정 ) 을촉진한다 (Hardie DG, 2007). (Fig. 6). 8

Figure 6. Regulation of energy homeostasis in the AMPK system (Hardie DG, 2007) AMPK의활성화에대한효과는에너지대사조절과밀접하게연관되어있는표적장기 ( 간, 근육, 지방, 췌장 ) 에관여되어있다 (Zhang et al., 2009). 간에서 AMPK가활성화되면지방산의산화를촉진하고지방산과콜레스테롤의합성을억제한다. 골격근에서 AMPK가활성화되면지방산의산화와당흡수를촉진하며지방세포에서는지방분해와지방생성을억제한다. 또한췌장 β세포에서 AMPK가활성화되면인슐린분비를촉진시킨다. 이러한관점에서볼때, AMPK는대사성질환의발생에있어중요한역할을담당하고있다고볼수있다 (Kahn et al., 2005), (Fig.7). 9

Figure 7. Roles of AMPK in the control of whole-body energy homeostasis (Kahn et al., 2005) 3-1. AMPK 의구조 AMPK는 serine/threonine kinase의일원으로하나의 catalytic α subunit (α1 또는 α2) 과두개의 regulatory subunit β (β1 또는 β2) 와 γ (γ1, γ2 또는 γ3) 로 heterotrimeric complex를이루고있다 (Towler et al., 2007; Carling D et al., 2004). 각 subunit은조직내분포에따라그발현정도가다르다. α subunit의 N-terminal 부분에는 catalytic domain이있으며, 이 domain에는 upstream kinases에의한 AMPK의인산화및활성화에중요한역할을하는 threonineresidue Thr172가존재한다 (Hawley et al., 1996, Stein et al., 2000). α subunit의 C-terminal 부분에는 β와 γ subunits과의결합이일어나는자리가있다 (Crute et al., 1998). β subunit의 C-terminal 부분은 functional αβγ complex를이루는데중요한역할을하며, β subunit의중심부분에는 glycogen-binding domain (GBD) 이포함되어있지만아직까지그기능이 10

확실히알려져있지는않다 (Hudson et al., 2003). γ subunit은다양한 N- terminal regions과 4개의 cystathionine-β synthase (CBS) domain로이루어져있는데이는 AMP 또는 ATP 결합에필요하다 (Kemp et al., 2004). 이처럼서로다른 3개의 subunits이 heterotrimeric complex를이루어특이적인발현으로 AMPK에의한대사과정이이루어지는것으로여겨진다 (Fig. 8). Figure 8. Genetic domains and protein subunit structures of AMPK (Towler et al., 2007) 3-2. AMPK 의조절 AMPK의활성화는 AMP/ATP의비율이높아졌을때 allosteric activation이촉진되고 LKB1과 CaMKKβ와같은 upstream kinases에의한 AMPK의 threonine residue Thr172에인산화가되어이루어진다. 두기전의연합효과는 1,000배이상의 kinase 활성화를가능하게함으로써세포내에너지상태에매우민감하게반응한다 (Suter M et al., 2006). AMP에의한활성화작용은 ATP와길항작용을이루고있기때문에 AMPK의 11

활성화는오직 AMP 변화에의해서만결정되는것이아니라 AMP/ATP ratio에의해결정된다 (Hardie et al., 2004). 종양억제인자로알려진 LKB1은 AMP-dependent pathway를통해지속적인활성을나타내며 AMPK의활성화를촉진시킨다. 최근연구에따르면, 간에서 LKB1의아세틸화가 LKB1의세포내위치와활성에관여하는것으로나타났다 (Lan et al., 2008). In vivo 실험에서 48 hr starved rats의간에서 LKB1의아세틸화가 60% 정도감소되었고, 이는 LKB1과 AMPK의활성증가와관련이있는것으로보고되었다. 이로써 LKB1의탈아세틸화작용은AMPK를활성화시킨다는점을확인할수있다. 더나아가 NAD(+) 의존적탈아세틸화효소인 SIRT1의작용에의한 LKB1의탈아세틸화와 LKB1에의한 AMPK의활성화기전사이의연관가능성을보여주고있다 (Lan et al., 2008). 이로써항당뇨기작과항노화기작이어느정도연관성을가진다는점을시사하고있다 (Fig. 9).. Figure 9. Regulation of AMPK activation based on Ca ++ level and AMP/ATP ratio (Viollet et al., 2009) 12

3-3. AMPK 의역할 당대사는간에서의당생성과말초조직 ( 근육, 지방등 ) 에서의당흡수라는균형을통하여그항상성을유지하게된다. 대표적인예로당뇨병환자에서혈당증가는공복시고혈당을일으키는주요원인이된다 (Saltiel et al., 2001). AICAR 또는 metformin과같은 AMPK의활성화약물들이간에서당생산을억제시키는것이알려지면서간에서의당생성조절에 AMPK의역할이중요하다는것을입증하였다 (Bergeron et al., 2001, Zhou et al., 2001). 도표 11은 AMPK가간에서의당대사에중요한역할을수행함을보여준다 (Fig. 10). 근육은생체내의당흡수를담당하는기관이다. 인슐린은세포표면으로당수송체인 GLUT4의이동을촉진시켜근육내로당흡수를증가시킨다 (Fig. 11). Figure 10. AMPK and the regulation of hepatic metabolism (Viollet et al., 2009) 13

Figure 11. AMPK and regulation of skeletal muscle metabolism (Viollet et al., 2009) 당뇨군에서 AICAR의처리는근육내 GLUT4의양을증가시키고이러한기전으로당흡수를효과적으로증가시킨다 (Koistinen et al., 2003). 반면근육내 AMPK의활성화는제2형당뇨병환자에서보이는인슐린신호전달의저하를개선하여당흡수를증가시키기도한다. 이를종합해볼때근육에서의 AMPK는당수송을조절함으로써당대사항상성에중요한역할을담당하는것으로보인다. 당및지질대사조절의이상은여러대사성질환의발생에공통적으로관여하는기전으로알려져있다. 최근여러연구들은에너지대사의조절에중추적인역할을담당하는 AMPK (Zhang et al., 2009), (Fig. 8) 와대사성질환과의연관성에대해보고하고있으며이러한연구결과들은 AMPK의활성화를조절하는것이비만, 제 2형당뇨병, 고지혈증그리고심혈관계질환등과같은대사성질환의발생을예방하고치료를하는데중요한역할을할수있을것임을제시하고 14

있다. 이에따라앞으로 AMPK 를표적으로하는약물개발연구가 활발하게이루어지고있다 (Ha et al., 2010). 3-4. AMPK 활성에대한생약의적용 알칼로이드나여주 (Momordic acarantia) 추출물등을포함한많은생약들이 AMPK 활성화효과를증가시킨다고알려져있다. 특히녹차의주된카테킨성분인 Epigallocatechin-3-gallate은 AMPK를활성화하여간에서당신생과정을저해한다고알려진바있다 (Lee et al., 2012). 또한황련 (Coptidis rhizoma) 의대표적인알칼로이드인 Berberine은 oral antihyperglycemic agent인데 AMP/ATP 비율을증가시키는미토콘드리아의기능을억제한다. 이는 AMPK의활성화효과를갖는다고설명할수있고당뇨병이나비만치료에적용하여유의한효과를나타낼수있음을시사하고있다 (Yin et al., 2008). 또한상엽 (Morus alba) 의물추출물이쥐의골격근에서 AMPK와 ACC (acetyl CoA carboxylase) 의인산화를증가시키고이는근육의에너지변화없이인슐린독립적인 glucose transport와관련이있는것을밝히고있다. 즉상엽추출물은골격근조직에서 AMPK의활성효과를증가시켜제2형당뇨병이의위험을줄이는대사적환경에기여한다는것을확인하였다 (Ma et al., 2009). 또한황금 (Scutellaria baicalensis) 은이미심혈관및뇌혈관질환에 2000년동안사용되어왔는데특히주요유효물질인 flavanone 배당체 baicalein은다른당뇨병치료제보다부작용이적다는장점을가지고있다. baicalein은 in vivo와 in vitro에서항비만효과를포함하여대사증후군을예방할수있다는것이보고되었다. 이러한예방적효과는지질합성의 AMPKα2와매개된억제와관련된것으로보인다 (Pu et al., 15

2012). 그리고울금 (Curcuma longa) 의주요성분인 curcumin의항종양형성효과가 AMPK-COX-2의 cascade의조절과관련이있는것으로알려져있다. 위연구에서 curcumin은 cancer cell에서강력한아폽토시스효과가있었고이러한효과는 pampk의증가뿐만아니라세포증식역할을하는 Akt와암세포의생존을돕는주요단백질인 COX-2를억제하는기전과결부되어있다는점을밝히고있다. 최근연구에서 AMPK가아폽토시스관련분자로제기되고있고, AMPK의활성물질로알려진 EGCG, resveratrol 그리고 capcaicin과같은다양한식물성화학물질역시암세포에서의아폽토시스와관련된것임이밝혀지면서항암효과와 AMPK의활성효과와의연관가능성을시사하고있다. 이는기존에암세포의아폽토시스기전을통해항암효과를가졌던 curcumin이 pampk를증가하는기작과도연관이있다는점이알려지면서항암효과를가진생약성분들이 AMPK 활성물질후보가되어대사증후군치료제가될수있다는가능성을증명하고있다 (Lee et al., 2009). 그밖에과일, 야채그리고차등에많이함유되어있는 flavinoid인 quercetin은항당뇨, 항암, 항비만효과로잘알려져있는데 (Gerhauser C, 2008; Ahn et al., 2008; Fang et al., 2008), 최근지방세포의분화를억제하는것이 AMPK의활성화와연루되어있다는것을보여주었다 (Ahn et al., 2008). 이는또한 SIRT-1 활성기전과도맞물려있는것으로밝혀졌다 (Suchankova G et al., 2009). 16

Figure 12. Structures of potential AMPK activators found in food sources (Hwang et al., 2009) 17

3-5. 연구목표 이에본연구에서는이미 AICAR 또는 metformin과같은 AMPK의활성화약물들이당생산을억제시키는것을확인함으로써간에서의당생성조절에 AMPK의역할이중요하다는것을입증한여러문헌들과 (Bergeron et al., 2001, Zhou et al., 2001) 전처리한인삼의주성분인 Rg3가 AMPK 활성을높인다는문헌 (Hwang et al., 2009) 을참고하여인삼추출물을전처리하여이에의해생성되거나증가한물질을분리하고, 분리한각각의화합물을대상으로쥐의근육모세포인 C2C12 세포주를이용한 AMPK 활성실험을진행하여 AMPK 활성물질을탐색하고자하였다. 더나아가탐색한 AMPK 활성물질들의함량을증가시키는인삼추출물의전처리방법을고안해냄으로써비만, 심혈관질환, 고혈압, 당뇨병과같은대사성질환의예방또는치료제로개발할수있을것이라생각된다. 18

Ⅱ. 실험재료및방법 1. 실험재료 본연구에사용된 Panax ginseng 의뿌리 ( 건조중량 4.5 kg) 는 2013 년 3 월에충청남도금산에서재배한것을 한인홍으로부터구입하여 사용하였다. 2. 시약및기기 2-1. 시약 (1) 분석용시약 컬럼크로마토그래피용 silica gel -Silica gel 60 (40-63 μm, 230-400 mesh, Art. 9385, Merck, Germany) TLC 용 precoated plate -TLC Silica gel 60 F 254 (Art. 5715, Merck, Germany) -TLC Silica gel 60 RP-18 F 254s (Art. 15389, Merck, Germany) TLC 용발색시약 -Anisaldehyde-H 2 SO 4 시약 (2) 추출용매및기타시약 식물재료의추출과컬럼크로마토그래피용용매는시약용용매 19

(Daejung Chemical & Metals Co. Ltd., Korea) 를사용하였고, HPLC 용용매는 HPLC grade 용매 Burdick & Jackson (Honeywell International, Morristown, NJ, USA) 를사용하였다. (3) C2C12 세포주배양및 AMPK 활성검색용시약 세포배양에필요한 DMEM, penicillin/streptomycin은 Hyclone (Utah, USA) 제품을사용하였고, fetal bovine serum과 horse serum은 Gibco (Grand Island, NY) 제품을사용하였다. 세포세척시필요한 PBS는 Takara (Shiga, Japan) 제품을사용하였고 western blot 실험에사용했던 pampk, AMPK, pacc, ACC는 Cell Signaling Technology (Danvers, U.S.A.) 제품을, β-actin은 Abcam (Cambridge, UK) 제품을사용하였다. 또한 protein assay kit는 Bio-Rad (Laboratories Inc., USA) 제품을, SDS는 BiO shop (Canada) 제품을사용하였으며 polyacrylamide는 (Samchun Chemical, Korea) 제품을사용하였다. 그리고 polyvinylidene fluoride membranes는 Immobilon-P (PVDF 0.45 µm, USA) 제품을, western blot detection kit는 Termo sci (Rockford, IL, USA) 제품을사용하였고, 대조군으로필요한 Compound C 와 AICAR는 Sigma (St. Louis, MO, USA) 제품을사용하였고 Multiwell culture plate와 cell culture dish는 SPL (Korea) 제품을사용하였다. 2-2. 기기 Analytical balance : Sartorius AG, Göttingen, Germany Autoclave : LAC-5080S, LAB Tech Centrifuge (for filtration) : AVANTI J2 BECKMAN COULTER,USA (for bioactivity) : FLETA S, Hanil science industrial Co.Ltd. 20

Clean bench : Class Ⅱ Biological safety cabinet, ESCO CO 2 incubator : Forma Series Ⅱ water Jaketed CO 2 Incubator, HEPA CLASS 100, THERMO Drying Cooler : EYELA CA-1112 CE, Japan Drying bath : Sunil EYELA KSB-202 Evaporator : EYELA N-1100, Japan ESIMS : Agilent 1100 series LC/MSD Trap, USA HPLC column : Cosmosil, 5μm, C18, 250 20 mm, Nacalai tesque Optimapak, 10μm, C18, 250 10 mm HPLC system -Gilson 321 pump, USA -Gilson UV/VIS 172 detector, USA IR : JASCO FT/IR-4200, Japan LC-MS : Agilent Technologies 6130 Quadrupole LC/MS,USA LC-MS Column : INNOcolumn 5μm, C18, 150 4.6 mm C18, Youngjinbiochrom.Co, INNOcolumn 5μm, C18, 250 4.6 mm C18, Youngjinbiochrom.Co Microscope : Promo vert, China NMR -Bruker AVANCE digital 400 spectrometer, Germany -Bruker AVANCE digital 500 spectrometer, Germany -Bruker AVANCE digital 600 spectrometer, Germany Polarimeter : JASCO P-2000 polarimeter, Japan ph meter : ORION 3 STAR ph Benchtop, THERMO Shaking incubator : BF-60SIR, BioFree Sonicator : Power sonic 420 UV lamp : Vilber Lourmat VL-4.LC, France Water bath : FLETAS, Hanil science industrial Co. Ltd. 21

3. Panax ginseng 뿌리의전처리 3-1. Panax ginseng 의추출 Panax ginseng 의뿌리를분말분쇄기를이용해고운가루로갈아낸인삼가루 4.5 kg에 D.W. 30 L를가하여고압멸균기로 120 O C에서 2시간동안 3회추출하였다. 추출물은여과깔때기와 centrifuge를이용하여여과하고 HP-20 resin 6 kg을 Acetone, Water 순으로활성화시킨후 loading 하였다. 먼저 D.W. 로 elution 하여당을비롯한물에잘녹는극성물질을최대한제거하고, 이어서 30% MeOH로 elution 하여 Protopanaxatriol 계열의물질을분리시켰다. 그후 90% 의 MeOH과 Acetone으로 elution 하여얻어진용매는감압농축하여최대한의조사포닌중 Protopanaxadiol 계열물질 376.2 g ( 수율 : 8.36%) 을얻었다 (Scheme 1). 22

Scheme 1. Extraction and filtration of P. ginseng roots 23

3-2. Panax ginseng 의전처리 추출및전처리단계에서얻어진분획물은다시 D.W. 에녹여 10% 의농도로만들었다. 이때의 ph는 3.6으로산성을띄었다. 10% 의인삼용액에 β-glucosidase 계열의효소인 Viscozyme 을처리하는데여기서효소의양은전처리한인삼을 10% 의농도로만들기위해필요한용매의양과같은양 ( 약 3.8L) 으로처리하였다. 이어서 shaking incubator에 50 o C에서 5일동안반응시켰다. 5일후반응과정중인삼의비극성부분이증가하여물에녹지않아생긴잔여물에소량의 DMSO를처리하여초음파분쇄기로최대한녹이고고압멸균기로 120 o C에서 2시간동안 2회열처리하였다. HP-20에 loading한후다시한번 D.W. 로 elution 시켜인삼반응물의극성부분은제거한뒤 90% MeOH과 Acetone을순차적으로 elution하였고용매는감압농축하여대용량의인삼의비극성물질 131.2g ( 수율 : 2.92%) 을얻었다 (Scheme 2). 24

Scheme 2. Reaction of P. ginseng extract 25

4. 전처리한 Panax ginseng 으로부터화합물분리및정제 4-1. 전처리한 Panax ginseng 에서화합물분리 효소처리와열처리후늘어난인삼의비극성부분을대상으로 silica gel C.C (CH 2 Cl 2 : MeOH = 30 : 1 0 : 1) 를실시하여극성에따라 12 개의분획 (F1~F12) 으로나누었고, 소분획 F3, F5, F7, F8, F10, F11의분리를실시하여화합물 1~15를얻었다 (Scheme 3). Scheme 3. Isolation of the compounds from the processed P.ginseng roots 26

4-2. Dammarane 계 Triterpenoid Protopanaxadiol 계열화합물의분리 4-2-1. 화합물 1 의분리 소분획 F7과 F8을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-11 ~ F7-15, F8-4 ~ F8-5의 7 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 55 : 45) 를실시하여화합물 1 (139.4 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 62 O 8 [α] 20 D +40.82 (c 0.5, MeOH) IR (MeOH) ν max 3358, 2944, 1375, 1077, 1032 cm -1 R f 0.28 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 667 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) δ 1.48 (1H, m, H-la), 0.77 (1H, m, H-1b), 2.22 (1H, m, H-2a), 1.79 (1H, m, H-2b), 3.40 (1H, dd, J = 4.2 Hz, 11.3 Hz, H-3), 0.74 (1H, d, J = 12Hz, H-5), 1.48 (2H, m, H-6), 1.51 (1H, m, H-7a), 1.23 (1H, m, H-7b), 1.39 (1H, m, H-9), 1.58 (1H, m, H-11a), 1.08 (1H, m, H-11b), 3.94 (1H, m, H-12), 2.04 (1H, m, H-13), 2.04 (1H, m, H-15a), 1.06 (1H, m, H-15b), 1.87 (1H, m, H- 16a), 1.39 (1H, m, H-16b), 2.38 (1H, m, H-17), 0.90 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H- 19), 1.44 (3H, s, H-21), 2.07 (1H, m, H-22a), 1.68 (1H, m, H-22b), 2.61 (1H, m, H- 23a), 2.30 (1H, m, H-23b), 5.32(1H, t, J = 6.4 Hz, H-24), 1.66 (3H, s, H-26), 1.63(3H, s, H-27), 1.01(3H, s, H-28), 1.33 (3H, s, H-29), 0.81(3H, s, H-30), 4.97 (1H, d, J = 7.7, H-1 ), 4.06 (1H, m, H-2 ), 4.27 (1H, m, H-3 ), 4.23 (1H, m, H-4 ), 27

3.94 (1H, m, H-5 ), 4.61 (1H, d, J = 10, H-6 a), 4.42 (1H, dd, J = 5 Hz, 15 Hz, H- 6 b) 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) δ 39.6 (C-1), 27.5 (C-2), 89.2 (C-3), 40.4 (C-4), 56.8 (C-5), 18.9 (C-6), 35.8 (C-7), 37.4 (C-8), 50.8 (C-9), 40.1 (C-10), 32.5 (C-11), 71.4 (C-12), 49.0 (C-13), 52.1 (C-14), 31.8 (C-15), 27.2 (C-16), 55.2 (C-17), 17.5 (C-18), 16.8 (C-19), 73.4 (C-20), 27.3 (C-21), 36.3 (C-22), 23.4 (C-23), 126.8 (C- 24), 131.2 (C-25), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 16.3 (C-28), 28.6 (C-29), 17.2 (C-30), 107.4 (C-1 ), 76.2 (C-2 ), 79.2 (C-3 ), 72.3 (C-4 ), 78.8 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 4-2-2. 화합물 2 의분리 소분획 F7과 F8을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-11 ~ F7-15, F8-4 ~ F8-5의 7 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 55 : 45) 를실시하여화합물 2 (116.9 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 62 O 8 [α] 20 D +14.60 (c 0.5, MeOH) IR (MeOH) ν max 3360, 2943, 2873, 1387, 1077, 1022 cm -1 R f 0.25 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 667 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 500MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5, 125MHz) Table 2참조 28

4-2-3. 화합물 3 의분리 소분획 F11을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F11-10 ~ F11-12의 3 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 45 : 55) 를실시하여화합물 3 (38.4 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 42 H 72 O 13 [α] 20 D +29.32 (c 0.5, MeOH) IR (MeOH) ν max 3358, 2944, 2878, 1375, 1077, 1032 cm -1 R f 0.45 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 783 [M-H] - 1 H NMR (pyridine-d 5,600 MHz) δ 3.31 (1H, dd, J = 3.8 Hz, 11.2 Hz, 9.5 Hz, H-3), 0.69 (1H, d, J = 12 Hz, H-5), 1.49 (1H, m, H-6a), 1.36 (1H, m, H-6b), 3.90 (1H, m, H-12), 2.05 (1H, m, H-13), 1.50 (1H, m, H-15a), 1.06 (1H, m, H-15b), 2.37 (1H, m, H-17), 0.99 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, s, H-19), 1.45 (3H, s, H-21), 2.04 (1H, m, H- 22a), 1.71 (1H, m, H-22b), 2.62 (1H, m, H-23a), 2.31 (1H, m, H-23b), 5.33 (1H, t like, J = 6.4 Hz, H-24), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 1.32 (3H, s, H-28), 1.13 (3H, s, H-29), 0.97 (3H, s, H-30), 4.94 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-1 ), 4.26 (1H, m, H-2 ), 4.24 (1H, m, H-3 ), 4.14 (1H, m, H-4 ), 3.94 (1H, m, H-5 ), 4.56 (1H, m, H- 6 a), 4.34 (1H, m, H-6 b), 5.39 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1 ), 4.14 (1H, m, H-2 ), 4.27 (1H, m, H-3 ), 4.32 (1H, m, H-4 ), 3.95 (1H, m, H-5 ), 4.48 (1H, m, H-6 a), 4.47 (1H, m, H-6 b) 29

13 C NMR (pyridine-d 5,150 MHz) δ 39.6 (C-1), 27.2 (C-2), 89.4 (C-3), 40.1 (C-4), 56.8 (C-5), 18.9 (C-6), 35.6 (C-7), 40.4 (C-8), 50.8 (C-9), 37.4 (C-10), 31.8 (C-11), 71.5 (C-12), 49.0 (C-13), 52.2 (C-14), 32.5 (C-15), 27.3 (C-16), 55.2 (C-17), 16.3 (C-18), 16.8 (C-19), 73.4 (C-20), 27.5 (C-21), 36.3 (C-22), 23.4 (C-23), 126.8 (C- 24), 131.2 (C-25), 26.2 (C-26), 17.5 (C-27), 28.6 (C-28), 17.1 (C-29), 18.1 (C-30), 105.6 (C-1 ), 83.9 (C-2 ), 78.4 (C-3 ), 72.1 (C-4 ), 78.7 (C-5 ), 63.3 (C-6 ), 106.5 (C-1 ), 77.6 (C-2 ), 78.8 (C-3 ), 72.1 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.2 (C-6 ) 4-2-4. 화합물 4 의분리 소분획 F11을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F11-10 ~ F11-12의 3 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 45 : 55) 를실시하여화합물 4 (7.0 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 42 H 72 O 13 [α] 20 D +22.36 (c 0.1, MeOH) IR (MeOH) ν max 3734, 3360, 2943, 1387, 1022 cm -1 R f 0.42 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 783 [M-H] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5, 125 MHz) Table 2 참조 30

4-2-5. 화합물 5 의분리 소분획 F7과 F8을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-18~F7-21, F8-8~F8-9의 6 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 75 : 25) 를실시하여화합물 5 (5.5 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 60 O 7 [α] 20 D +15.89 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3735, 3393, 2940, 1456, 1032 cm -1 R f 0.22 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 649 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) Table 2참조 4-2-6. 화합물 6 의분리 소분획 F7과 F8을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-18~F7-21, F8-8~F8-9의 6 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 75 : 25) 를실시하여화합물 6 (10.6 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 60 O 7 31

[α] 20 D +7.87 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3734, 3396, 2947, 1456, 1032 cm -1 R f 0.21 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 649 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 600 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5,150 MHz) Table 2 참조 4-2-7. 화합물 7 의분리 소분획 F7과 F8을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-11 ~ F7-15, F8-4 ~ F8-5의 7 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 55 : 45) 를실시하여화합물 7 (10.0 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 62 O 8 [α] 20 D +18.36 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3734, 2943, 1732, 1456, 1026 cm -1 R f 0.31 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 667 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) δ 3.43 (1H, dd, J = 4 Hz, 10.5 Hz, H-3), 0.81 (1H, d, J = 15 Hz, H-5), 3.95 (1H, m, H-12), 0.96 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19), 1.64 (3H, s, H-21), 5.26 (1H, t, J = 6.6 Hz, H-24), 1.60 (3H, s, H-26), 1.60 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-28), 1.05 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-30), 5.21 (1H, d, J = 32

7.6 Hz, H-1 ), 4.02 (1H, m, H-2 ), 4.27 (1H, m, H-3 ), 4.18 (1H, m, H-4 ), 3.95 (1H, m, H-5 ), 4.52 (1H, m, H-6 a), 4.35 (1H, m, H-6 b) 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) δ 39.7(C-1), 28.6 (C-2), 78.4 (C-3), 39.9 (C-4), 56.7 (C-5), 19.1 (C-6), 35.5 (C-7), 40.4 (C-8), 50.7 (C-9), 37.7 (C-10), 31.1 (C-11), 70.5 (C-12), 49.9 (C-13), 51.8 (C-14), 31.3 (C-15), 27.0 (C-16), 51.9 (C-17), 16.7 (C-18), 16.4 (C-19), 83.6 (C-20), 22.7 (C-21), 36.5 (C-22), 23.5 (C-23), 126.3 (C- 24), 131.2 (C-25), 26.1 (C-26), 18.1 (C-27), 29.0 (C-28), 16.7 (C-29), 17.7 (C-30), 98.6 (C-1 ), 75.5 (C-2 ), 79.7 (C-3 ), 72.1 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.3 (C-6 ) 4-2-8. 화합물 8 의분리 소분획 F11을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F11-10 ~ F11-12의 3 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 45 : 55) 를실시하여화합물 8 (60.0 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 42 H 72 O 13 [α] 20 D +26.69 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3735, 3383, 2944, 1455, 1032 cm -1 R f 0.45 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 783 [M-H] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 400 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5,100 MHz) Table 2 참조 33

4-2-9. 화합물 9 의분리 소분획 F10을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 80 : 20 MeOH 100%) 를실시하여 F10-16~F10-18의 3 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (MeOH : H 2 O = 85 : 15) 를실시하여화합물 9 (11.3 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 42 H 70 O 12 [α] 20 D +11.06 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3734, 3396, 2944, 1456, 1032 cm -1 R f 0.34 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 765 [M-H] - ESI Q-TOFMS m/z 765.4815 [M-H] - (Calcd. for C 42 H 69 O 12 765.4795) 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) Table 2 참조 - 4-2-10. 화합물 10 의분리 소분획 F10을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 80 : 20 MeOH 100%) 를실시하여 F10-16~F10-18의 3 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (MeOH : H 2 O = 85 : 15) 를실시하여화합물 10 (18.7 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. 34

White amorphous powder C 42 H 70 O 12 [α] 20 D +9.89 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3735, 3393, 2941, 1455, 1032 cm -1 R f 0.37 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 765 [M-H] - ESI Q-TOFMS m/z 765.4805 [M-H] - (Calcd. for C 42 H 69 O 12 765.4795) 1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) Table 1참조 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) Table 2 참조 4-3. Dammarane 계 Triterpenoid Protopanaxatriol 계열화합물의분리 4-3-1. 화합물 11 의분리 소분획 F7을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F7-4의 1 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 48 : 52) 를실시하여화합물 11 (15.9 mg) 을얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면진한보라색으로되었다. White amorphous powder C 36 H 60 O 8 [α] 20 D +17.83 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3393, 2965, 1032 cm -1 R f 0.61 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 665 [M+HCOO] - 35

1 H NMR (pyridine-d 5, 600 MHz) δ 3.55 (1H, dd, J = 4.5 Hz, 11.5 Hz, H-3), 3.96 (1H, m, H-12), 2.12 (1H, m, H-13), 2.78 (1H, m, H-17), 1.26 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, s, H-19), 5.13 (1H, br.s, H-21a), 4.91 (1H, br.s, H-21b), 5.31 (1H, m, H-24), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 2.09 (3H, s, H-28), 1.61 (3H, s, H-29), 0.85 (3H, s, H-30), 5.06 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1 ), 4.10 (1H, m, H-2 ), 4.26 (1H, m, H- 3 ), 4.23 (1H, m, H-4 ), 3.94 (1H, m, H-5 ), 4.54 (1H, m, H-6 a), 4.38 (1H, m, H- 6 b) 13 C NMR (pyridine-d 5,150 MHz) δ 40.0(C-1), 28.4 (C-2), 79.0 (C-3), 40.8 (C-4), 61.9 (C-5), 80.5 (C-6), 45.8 (C-7), 41.7 (C-8), 51.1 (C-9), 40.2 (C-10), 33.2 (C-11), 72.9 (C-12), 52.5 (C-13), 51.6 (C-14), 33.0 (C-15), 31.2 (C-16), 48.7 (C-17), 16.8 (C-18), 17.2 (C-19), 155.9 (C-20), 108.6 (C-21), 34.2 (C-22), 27.5 (C-23), 125.8 (C-24), 131.6 (C-25), 26.2 (C-26), 18.2 (C-27), 32.2 (C-28), 16.8 (C-29), 17.8 (C- 30), 106.5 (C-1 ), 75.9 (C-2 ), 80.1 (C-3 ), 72.3 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 4-3-2. 화합물 12 의분리 소분획 F3을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F3-6~F3-7의 2 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 73 : 27) 를실시하여화합물 12 (10.5 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면어두운주황색으로되었다. White amorphous powder C 30 H 50 O 3 IR (MeOH) ν max 3406, 2926, 1387, 1026 cm -1 R f 0.44 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESI Q-TOFMS m/z 459.3792 [M+H] + (Calcd. for C 30 H 51 O 3 459.3833) 36

1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) δ 3.55 (1H, dd, J = 3.9 Hz, 12.5 Hz, H-3), 4.45 (1H, m, H-6), 3.96 (1H, m, H-12), 2.12 (1H, m, H-13), 2.84 (1H, m, H-17), 1.00 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H-19), 5.17 (1H, br.s, H-21a), 4.93 (1H, br.s, H-21b), 2.53 (1H, m, H-22a), 2.33 (1H, m, H-22b), 2.40 (1H, m, H-23a), 2.35 (1H, m, H- 23b), 5.32 (1H, t, J = 6.7 Hz, H-24), 1.69 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, s, H-27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.49 (3H, s, H-29), 1.19 (3H, s, H-30) 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) δ 39.8(C-1), 28.6 (C-2), 78.8 (C-3), 40.8 (C-4), 62.2 (C-5), 68.1 (C-6), 48.1 (C-7), 41.8 (C-8), 51.6 (C-9), 39.9 (C-10), 33.2 (C-11), 72.9 (C-12), 52.5 (C-13), 51.0 (C-14), 33.0 (C-15), 31.2 (C-16), 48.7 (C-17), 18.1 (C-18), 18.2 (C-19), 155.8 (C-20), 108.6 (C-21), 34.2 (C-22), 27.5 (C-23), 125.8 (C-24), 131.6 (C-25), 26.2 (C-26), 17.9 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.5 (C- 30) 4-3-3. 화합물 13 의분리 소분획 F3을 open column C 18 RP (MeOH : H 2 O = 75 : 25 MeOH 100%) 를실시하여 F3-6~F3-7의 2 개소분획으로나누었고, 이를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 73 : 27) 를실시하여화합물 13 (17.0 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한후가열하면어두운주황색으로되었다. White amorphous powder C 30 H 50 O 3 [α] 20 D +21.80 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3414, 2928, 1031 cm -1 R f 0.42 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESI Q-TOFMS m/z 459.3781 [M+H] + (Calcd. for C 30 H 51 O 3 459.3833) 37

1 H NMR (pyridine-d 5, 500 MHz) δ 3.54 (1H, dd, J = 4.8 Hz, 11.5 Hz, H-3), 1.27 (1H, m, H-5), 4.44 (1H, m, H-6), 3.96 (1H, m, H-12), 2.08 (1H, m, H-13), 2.77 (1H, m, H-17), 0.99 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H-19), 1.86 (3H, s, H-21), 5.51 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-22), 2.80 (2H, m, H-23), 5.24 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-24), 1.64 (3H, s, H- 26), 1.60 (3H, s, H-27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.47 (3H, s, H-29), 1.18 (3H, s, H-30) 13 C NMR (pyridine-d 5,125 MHz) δ 39.8 (C-1), 28.6 (C-2), 78.8 (C-3), 40.8 (C-4), 62.2 (C-5), 68.1 (C-6), 48.1 (C-7), 41.8 (C-8), 50.9 (C-9), 39.9 (C-10), 32.7 (C-11), 73.0 (C-12), 51.1 (C-13), 51.3 (C-14), 33.1 (C-15), 29.3 (C-16), 50.8 (C-17), 17.9 (C-18), 18.1 (C-19), 140.5 (C-20), 13.6 (C-21), 124.2 (C-22), 27.9 (C-23), 124.3 (C-24), 131.7 (C-25), 26.1 (C-26), 18.1 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.5 (C- 30) 4-3-4. 화합물 14 의분리 소분획 F5 를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 48 : 52) 를실시하여화합물 14 (22.0 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한 후가열하면어두운주황색으로되었다. White amorphous powder C 30 H 52 O 4 [α] 20 D +37.68 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3334, 2962, 1456, 1031 cm -1 R f 0.51 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 521 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 300 MHz) δ 3.57 (1H, dd, J = 5.3 Hz, 11.2 Hz, H-3), 1.22 (1H, d, J = 9 Hz, H-5), 4.44 (1H, m, H-6), 3.97 (1H, m, H-12), 2.06 (1H, m, H-13), 38

1.61 (2H, m, H-15), 2.37 (1H, m, H-17), 1.12 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19), 1.44 (3H, s, H-21), 2.06 (1H, m, H-22a), 1.72 (1H, m, H-22b), 2.65 (1H, m, H-23a), 2.31 (1H, m, H-23b), 5.34 (1H, t, J = 6.9 Hz, H-24), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 2.03 (3H, s, H-28), 1.48 (3H, s, H-29), 0.98 (3H, s, H-30) 13 C NMR (pyridine-d 5, 75 MHz) δ 39.7(C-1), 28.5 (C-2), 78.7 (C-3), 40.7 (C-4), 62.1 (C-5), 68.0 (C-6), 47.9 (C-7), 41.5 (C-8), 50.4 (C-9), 39.7 (C-10), 32.4 (C-11), 71.4 (C-12), 48.6 (C-13), 52.0 (C-14), 31.7 (C-15), 27.2 (C-16), 55.1 (C-17), 17.8 (C-18), 17.9 (C-19), 73.3 (C-20), 27.4 (C-21), 36.2 (C-22), 23.4 (C-23), 126.6 (C- 24), 131.1 (C-25), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.4 (C-30) 4-3-5. 화합물 15 의분리 소분획 F5 를 HPLC C 18 RP (ACN : H 2 O = 48 : 52) 를실시하여화합물 15 (10.9 mg) 를얻었다. 이화합물은 anisaldehyde-h 2 SO 4 발색시약으로처리한 후가열하면어두운주황색으로되었다. White amorphous powder C 30 H 52 O 4 [α] 20 D +30.46 (c 1.0, MeOH) IR (MeOH) ν max 3335, 2962, 1456, 1028 cm -1 R f 0.51 (RP TLC, MeOH : Water = 9 : 1) ESIMS m/z 521 [M+HCOO] - 1 H NMR (pyridine-d 5, 300 MHz) δ 3.56 (1H, dd, J = 4.6 Hz, 11.6 Hz, H-3), 1.25 (1H, d, J = 10, H-5), 4.45 (1H, t, J = 10 Hz, 20 Hz, H-6), 3.98 (1H, m, H-12), 2.07 (1H, m, H-13), 1.63 (1H, m, H-15), 2.41 (1H, m, H-17), 1.18 (3H, s, H-18), 1.05 (3H, s, H-19), 1.42 (3H, s, H-21), 1.74 (2H, m, H-22), 2.50 (1H, m, H-23a), 2.47 39

(1H, m, H-23b), 5.33 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-24), 1.71 (3H, s, H-26), 1.66 (3H, s, H- 27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.48 (3H, s, H-29), 1.02 (3H, s, H-30) 13 C NMR (pyridine-d 5, 75 MHz) δ 39.7 (C-1), 28.5 (C-2), 78.7 (C-3), 40.7 (C-4), 62.1 (C-5), 68.1 (C-6), 47.9 (C-7), 41.5 (C-8), 50.5 (C-9), 39.7 (C-10), 32.5 (C-11), 71.3 (C-12), 49.2 (C-13), 52.1 (C-14), 31.8 (C-15), 27.0 (C-16), 51.0 (C-17), 17.8 (C-18), 17.9 (C-19), 73.3 (C-20), 23.0 (C-21), 43.6 (C-22), 23.1 (C-23), 126.4 (C- 24), 131.1 (C-25), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 32.3 (C-28), 16.9 (C-29), 17.7 (C-30) 40

Table 1. 1 H-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 2 a 4 a 5 a 6 b 8 c 9 a 10 a position δ H (J in Hz) 3 3.40 (1H, dd, J=5.0,15) 3.31 (1H, dd, J = 4.1, 12.0) 3.41 (1H,dd, J = 3.5, 11.5) 3.39 (1H, dd, J = 4.4, 12.0) 3.37 (1H, dd, J = 4.5, 11.6) 3.29 (1H, dd, J = 4.0, 11.4) 3.31 (1H, dd, J = 4.6, 11.8) 5 0.76 (1H, d, J =12.0) 0.70 (1H, d, J = 10.0) 0.77 (1H, d, J = 10.0) 0.76 (1H, d, J = 12.0) 0.67 (1H, d, J = 10.0) 0.70 (1H, d, J = 10.0) 6a 1.52 (1H, m) 1.45 (1H, m) 1.47 (2H, m) 6b 1.37 (1H, m) 1.36 (1H, m) 12 3.94 (1H, m) 3.94 (1H, m) 3.92 (1H, m) 3.93 (1H, m) 3.94 (1H, m) 3.93 (1H, m) 3.93 (1H, m) 13 2.10 (1H, m) 2.79 (1H, m) 2.05 (1H, m) 15a 2.03 (1H, m) 1.56 (1H, m) 1.43 (1H, m) 1.93 (2H, m) 15b 1.08 (1H, m) 0.98 (1H, m) 1.09 (1H, m) 17 2.39, (1H, m) 2.40 (1H, m) 2.84 (1H, m) 2.00 (1H, m) 1.99 (1H, m) 1.39 (1H, m) 18 1.03 (3H, s) 1.03 (3H, s) 1.03 (3H. s) 1.03 (3H, s) 0.98 (3H, s) 0.96 (3H, s) 1.03 (3H, s) 19 0.84 (3H, s) 0.84 (3H, s) 0.83 (3H, s) 0.83 (3H, s) 0.82 (3H, s) 0.82 (3H, s) 0.83 (3H, s) 21a 21b 1.41 (3H, s) 1.41 (3H, s) 5.17 (1H, br.s) 4.93 (1H, br.s) 1.83 (3H, s) 1.82 (3H, s) 5.16 (1H, br.s) 4.92 (1H, br.s) 22a 5.52 (1H, t, 5.51 (1H, t, 2.47 (1H, m) 1.74 (2H,m) 1.74 (2H, m) 22b J = 7.6) J = 6.6) 2.40 (1H, m) 23a 2.55 (1H, m) 2.49 (1H, m) 2.40 (1H, m) 23b 2.24 (1H, m) 2.47 (1H, m) 2.33 (1H, m) 2.81 (2H, m) 2.79 (2H, m) 2.31 (2H, m) 24 5.34 (1H, t, J=5.0) 5.34 (1H, t, J = 6.3) 5.31 (1H, t- like, J = 5.5) 5.24 (1H, t, J = 6.2) 5.24 (1H, t, J = 7.3) 5.23 (1H, t, J = 5.9) 5.31 (1H, t, J = 6.7) 26 1.74 (3H, s) 1.71 (3H, s) 1.67 (3H, s) 1.64 (3H, s) 1.59 (3H, s) 1.63 (3H, s) 1.67 (3H, s) 27 1.67 (3H, s) 1.67 (3H, s) 1.61 (3H, s) 1.60 (3H, s) 1.59 (3H, s) 1.59 (3H, s) 1.61 (3H, s) 28 1.01 (3H, s) 1.32 (3H, s) 1.34 (3H, s) 1.33 (3H, s) 1.32 (3H, s) 1.30 (3H, s) 1.31 (3H, s) 29 1.34 (3H, s) 1.13 (3H, s) 1.02 (3H, s) 1.02 (3H, s) 1.01 (3H, s) 1.12 (3H, s) 1.13 (3H, s) 30 1.03 (3H, s) 1.00 (3H, s) 0.99 (3H, s) 0.99 (3H, s) 0.96 (3H, s) 1.02 (3H, s) 0.98 (3H, s) Table 1. 1 H-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 (continued) 41

2 a 4 a 5 a 6 b 8 c 9 a 10 a position δ H (J in Hz) 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 1 4.97 (1H, d, J= 7.5) 4.95 (1H, d, J = 6.7) 4.98 (1H, d, J = 7.9) 4.96 (1H, d, J = 7.6) 5.21 (1H, d, J = 7.6) 4.94 (1H, d, J = 7.2 ) 4.94 (1H, d, J = 7.6) 2 4.05 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4.09 (1H, m) 4.06 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4.28 (1H, m) 4.27 (1H, m) 3 4.28 (1H, m) 4.25 (1H, m) 4.28 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4.23 (1H, m) 4.24 (1H, m) 4.24 (1H, m) 4 4.25 (1H, m) 4.15 (1H, m) 4.24 (1H, m) 4.23 (1H, m) 4.17 (1H, m) 4.16 (1H, m) 4.15 (1H, m) 5 3.95 (1H, m) 3.93 (1H, m) 4.04 (1H, m) 4.03 (1H, m) 4.02 (1H, m) 4.25 (1H, m) 3.93 (1H, m) 6 a 4.62 (1H, d, J=10.0) 4.58 (1H, m) 4.63 (1H, d, J = 10.0) 4.61 (1H, dd, J = 6.0, 12.0) 4.60 (1H, m) 4.58 (1H, m) 4.57 (1H, m) 6 b 4.42 (1H, dd, J=5.0,10.0) 4.34 (1H, m) 4.43 (1H, dd, J = 5.0, 10.0) 4.42 (1H, dd, J = 6.0, 12.0) 4.34 (1H, m) 4.35 (1H, m) 4.32 (1H, m) 2 -o-β-d-glc 20-o-β-D-Glc 2 -o-β-d-glc 2 -o-β-d-glc 1 5.40 (1H, d, J = 7.5) 4.95 (1H, d, J = 7.9) 5.38 (1H, d, J = 7.2) 5.40 (1H, d, J = 7.5) 2 4.13 (1H, m) 4.15 (1H, m) 4.14 (1H, m) 4.13 (1H, m) 3 4.27 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4.31 (1H, m) 4.27 (1H, m) 4 4.32 (1H, m) 4.34 (1H, m) 4.36 (1H, m) 4.27 (1H, m) 5 3.94 (1H, m) 4.00 (1H, m) 3.94 (1H, m) 3.93 (1H, m) 6 a 4.49 (1H, m) 4.50 (1H, m) 4.49 (1H, m) 4.49 (1H, m) 6 b 4.50 (1H, m) 4.52 (1H, m) 4.49 (1H, m) 4.47 (1H, m) a Spectra obtained at 500 MHz in pyridine-d 5.. b Spectra obtained at 600 MHz in pyridine-d 5. c Spectra obtained at 400 MHz in pyridine-d 5 42

Table 2. 13 C-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 2 a 4 a 5 a 6 b 8 c 9 a 10 a position δ c 1 39.6 39.5 39.7 39.6 39.5 39.6 39.6 2 27.2 27.0 27.2 28.5 27.1 27.1 27.1 3 89.2 89.3 89.2 89.1 89.1 89.2 89.3 4 40.5 40.0 40.1 40.6 40.0 40.6 40.1 5 56.8 56.7 56.8 56.8 56.7 56.7 56.8 6 18.9 18.8 18.9 18.8 18.8 18.8 18.8 7 35.6 35.5 35.8 35.7 35.5 35.7 35.7 8 37.4 40.3 40.6 40.0 40.4 40.0 40.5 9 50.8 50.7 51.3 51.1 50.5 51.2 48.6 10 40.1 37.2 37.5 37.4 37.3 37.4 37.4 11 32.6 31.7 33.1 32.6 31.1 32.6 33.1 12 71.3 71.2 72.8 72.9 70.5 72.9 72.8 13 49.7 49.5 52.9 50.8 49.9 50.8 52.8 14 52.2 52.1 51.6 51.4 51.8 51.1 51.6 15 31.9 32.5 33.0 33.0 31.3 33.0 33.0 16 27.1 27.1 31.2 27.1 27.0 28.4 31.1 17 51.1 50.9 48.7 51.3 51.9 51.4 51.2 18 17.8 16.1 16.2 16.8 16.6 16.2 16.1 19 16.8 16.7 16.9 17.1 16.3 16.9 16.8 20 73.4 73.3 155.9 140.5 83.6 140.5 155.9 21 23.1 23.1 108.5 13.5 22.7 13.5 108.5 22 43.7 43.6 34.3 123.5 36.5 123.4 34.2 23 23.2 22.9 27.5 27.8 23.5 27.8 27.4 Table 2. 13 C-NMR data of compounds 2, 4, 5, 6, 8, 9 and 10 (continued) 43

2 a 4 a 5 a 6 b 8 c 9 a 10 a position δ c 24 126.5 126.4 125.7 124.2 126.3 124.2 125.7 25 131.2 131.1 131.6 131.6 131.2 131.6 131.6 26 26.3 26.1 26.2 26.0 26.1 26.0 26.1 27 18.2 17.6 18.2 18.1 18.1 18.1 18.1 28 16.3 28.4 28.6 29.2 28.5 29.2 28.5 29 28.6 16.9 17.2 16.2 17.1 16.8 17.0 30 17.2 18.0 17.4 17.4 17.7 17.4 17.3 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 3-o-β-D-Glc 1 107.4 108.5 107.4 107.3 107.3 105.5 105.5 2 3 76.3 93.7 76.2 76.2 76.1 83.8 83.8 79.2 78.3 79.2 79.1 79.1 78.6 78.3 4 72.3 72.0 72.3 72.3 72.0 72.0 72.0 5 78.8 78.6 78.8 78.7 78.7 78.3 78.6 6 63.5 63.2 63.5 63.5 63.3 63.2 63.2 2 -o-β-d-glc 20-o-β-D-Glc 2 -o-β-d-glc 2 -o-β-d-glc 1 106.4 98.6 106.4 106.4 2 77.5 75.5 77.5 77.5 3 78.7 79.7 78.7 78.7 4 71.9 72.2 72.0 72.0 5 78.5 78.7 78.5 78.5 6 63.0 63.4 63.0 63.1 a Spectra obtained at 125 MHz in pyridine-d 5. b Spectra obtained at 150 MHz in pyridine-d 5. c Spectra obtained at 100 MHz in pyridine-d 5. 44

5. C2C12 세포주에서 AMPK 활성검색 5-1. C2C12 세포주의배양및분화 쥐의근육모세포인 C2C12 세포는 ATCC에서분양받아 FBS 10%, 10,000 units/ml penicillin과 10 mg/ml streptomycin 1% 를포함하는 DMEM을배양액으로하여 37 배양기에서공기 (95%) 와 CO 2 (5%) 의혼합기체를지속적으로공급하여배양하였다. Western blot을진행하기위해세포를 6 well plate에이식하고세포가 80% 정도일정하게자랄때까지 2일동안배양하였다. C2C12 세포는 2% 의 horse serum을포함하는배양배지로교체하여근관세포로분화시켰다. 세포는성숙한근관세포가형성되기까지배양배지는 2일에한번씩교체하였다. 분화된성숙한근관세포는 AMPK 활성실험에사용하였다. 5-2. AMPK assay 측정하고자하는시료를일정한농도로만들어성숙한 C2C12의근관세포에처리하였다. (AMPK inhibitor인 compound C의경우시료처리전에처리하였다. 30분후에차가운 PBS로씻어내고 -80 o C에보관하였다. 그후세포는 100 µl lysis buffer [50 mm Tris-HCl (ph 7.6), 120 mm NaCl, 1 mm EDTA, 0.5% NP-40, 50 mm NaF] 에얼음위에서녹이고 4 C에서 12,000 rpm으로 20분동안원심분리하였다. 상층액은용해물로부터분리되고단백질의농도는 protein assay kit를이용하여측정하고각각의단백질을준비하였다. 각각의단백질은 10% SDS-polyacrylamide gel에서전기영동시키고 gel은 PVDF membrane (PVDF 0.45 µm) 로전기이동 45

시켰다. 그후 membrane은 1차항체 : AMPK, phospho-ampkα Thr 172 와 mouse monoclonal actin을혼합하여 incubation하였고그후 2차항체와혼합하여 incubation 한뒤 chemiluminescence Western blotting detection kit 로 Image Reader LAS-4000 software를사용하여단백질발현량을측정하였다. 5-3. 통계처리 통계적유의성을검토하기위해대조치로부터의변동을 Student s t test를통해판정하였다. p 값이 0.05 미만일때별 1개, p 값이 0.01 미만일때별 2개, p 값이 0.001 미만일때별 3개로표시하여통계적으로유의성이있다고판정하였다. 46

Ⅲ. 결과및고찰 1. 인삼의전처리조건 1-1. 효소처리시간 인삼의효소반응시목표로하는비극성부분이현저하게늘어나는시간대를탐색하기위해인삼용액에오미자추출액 ( 유기산 ) 을처리하여 ph를 4.5로맞춘후효소처리하여일정한시간에따라같은양의반응액을취하여이를 TLC와 LC-M로분석하였다. 시간이지남에따라 ginsenoside Rd가늘어나고이어서 F2가늘어남을확인할수있었다 (Fig. 13, 14). 47

Figure 13. TLC pattern, LC-MS spectrum of P. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the pre-treatment time 48

Control (No Enzyme) Conc. (μg/μl) Inj.Vol (μl) Amount (μg) Area (mau*min) 샘플중양 (μg) 함량 (%) 10.0000 10 100.0000 56.6 0.0617 0.0617 0 hr 10.0000 10 100.0000 179.3 0.0617 0.0617 3 hr 10.0000 10 100.0000 1157.5 2.2864 2.2864 11 hr 10.0000 10 100.0000 3905.4 7.8394 7.8394 23 hr 10.0000 10 100.0000 5802.7 11.6734 11.6734 31 hr 10.0000 10 100.0000 7029.9 14.1534 14.1534 51 hr 10.0000 10 100.0000 8013.8 16.1416 16.1416 107 hr 10.0000 10 100.0000 8902.3 17.9371 17.9371 Figure 14. Quantification of ginsenoside F2 1-2. Enzyme 양 인삼의효소반응시최소량의효소를사용하면서목표로하는반응물은충분히얻을수있는조건을정하기위해효소처리전인삼용액 : 효소의양을다르게하여효소반응을진행하고이를 TLC와 LC-M로분석하였다. 아래의결과로최소량의효소로유의한반응물을얻을수있는인삼용액 : 효소의양을 1 : 1로정할수있었다 (Fig. 15). 49

Figure 15. TLC pattern, LC-MS spectrum of P. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the amount of the enzyme 50

1-3. ph 조절및열처리횟수 인삼용액에오미자를처리하여 ph를 4.5로맞춘후효소처리한인삼반응액에열처리했을때, 최종반응물이생산되는데반응물이다량으로생산될수있는조건을정하기위해 ph와열처리횟수에따라만들어진반응물을 TLC와 LC-MS로분석하였다. 아래의결과로최종생산물 (ginsenoside Rh2) 이가장많이늘어나는조건이열처리를 2번하였을때로정할수있었다 (Fig. 16, 17). 51

함량평가 Figure 16. TLC pattern, LC-MS spectrum of P. ginseng s heated treatment solution dependent on ph, heating condition Area (mau*min) Rh2-S 샘플중양 (μg) 함량 (μg) Area (mau*min) Rh2-R 샘플중양 (μg) 함량 (μg) No Reaction - - ph3 Before AUC. 1286.1 1.4528 1.4528 444.6 0.5204 0.5204 ph3 AUC. 1 3716.7 4.2738 4.2738 2305.0 2.4834 2.4834 ph3 AUC. 2 3992.9 4.5944 4.5944 2701.9 2.9022 2.9022 ph AUC. 3 3206.9 3.6821 3.6821 2258.2 2.4340 2.4340 Figure 17. Quantification of ginsenoside Rh2 52

1-4. 산처리유무 인삼의효소반응전인삼용액의 ph는이미 3.6이었기때문에부가적으로산처리한경우효과를확인하기위해산처리의유무에따라효소반응을진행하였을때그결과가달라지는지 TLC와 LC-MS로분석하였다. 산처리를한경우와하지않은경우를비교해보았을때아래의결과를통해크게다른점을확인할수없었기때문에산처리는하지않는것으로정하였다 (Fig. 18). Figure 18. TLC pattern of P. ginseng s enzyme treatment solution dependent on the acid condition 53

함량평가 Control (No Enzyme) ph4.5 오미자 O Conc. (μg/μl) Inj.Vol (μl) Amount (μg) Area (mau*min) 샘플중양 (μg) 함량 (%) 10.0000 10 100.0000 56.6 0.0617 0.0617 10.0000 10 100.0000 5437.5 10.9354 10.9354 No 오미자 10.0000 10 100.0000 6122.1 12.3189 12.3189 Figure 19. Quantification of ginsenoside F2 2. 성분연구 2-1. 화합물 1 의구조분석 화합물 1 은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum 에서 m/z 667 [M+HCOO] - 의분자량 peak 를확인하였다. 1 H NMR spectrum 에서 δ 0.90 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19), 1.44 (3H, s, H-21), 1.66 (3H, s, H-26), 1.63 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-28), 1.33 (3H, s, H- 29), 0.81 (3H, s, H-30) 을통해 8개의메틸기와 δ 5.32 (1H, t, J = 6.4 Hz, H- 24) 를통해 H-24 위치에올레핀수소를확인하였다. 또한 δ 4.97 (1H, d, J = 7.7 Hz, H-1 ) 을통해방향족수소와 4~4.5ppm에서관찰되는당수소를확인하여하나의당이베타위치에서결합하고있음을확인하였다. δ 3.40 (1H, dd, J = 4.5 Hz, 12 Hz, H-3) 을통해당이다마란골격에치환되어있는구조를확인하였다. 13 C NMR spectrum에서총 36개의탄소를확인할수있었고, δ 17.5 (C- 18), 16.8 (C-19), 27.3 (C-21), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 16.3 (C-28), 28.6 (C-29), 17.2 (C-30) 을통해 8 개의메틸기의탄소를확인할수있었고, 126.8 (C- 54

24) 를통해 olefinic carbon을그리고 131.2 (C-25) 를통해 olefin carbon과이중결합을이루는 quaternary carbon을확인할수있었다. 또한 107.4 (C- 1 ) 에서발견되는하나의 anomeric carbon을비롯하여 76.2 (C-2 ), 79.2 (C- 3 ), 72.3 (C-4 ), 78.8 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 을통해 glucose가하나결합하고있음을알수있었다. 당을구성하는탄소외에산소와결합하는탄소는 89.2 (C-3), 71.4 (C-12), 73.4 (C-20) 인데 C-3은당과결합하고있고나머지두개의탄소가 hydroxyl group과결합하고있다는것을확인하여화합물 1을 PPD계열의화합물임을유추할수있었다 (Fig. 21). HMBC spectrum에서 H-1 (δ 4.97) 과 C-3 (δ 89.2) 의 correlation을통해 glucose의결합위치를확인하였다 (Fig. 22). 이상의결과를통해화합물 1을문헌치와비교하여 ginsenoside 20(S)- Rh2로결정하였다 (H. Yang et al., 2014). 55

Figure 20. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 1 56

Figure 21. HSQC and HMBC spectra of compound 1 57

2-2. 화합물 2 의구조분석 화합물 2는흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 667 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR에서 δ 1.03 (3H, s, H-18), 0.84 (3H, s, H-19), 1.41 (3H, s, H-21), 1.74 (3H, s, H-26), 1.67 (3H, s, H-27), 1.01 (3H, s, H-28), 1.34 (3H, s, H-29), 1.03 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고, δ 5.34 (1H, t, J = 5.0 Hz, H-24) 를통해 H-24 위치에 olefin 수소를확인하였다. 또한 δ 4.97 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ) 을통해 anomeric proton과 4~4.5ppm에서관찰되는 sugar proton을확인하여하나의당이베타위치에서결합하고있음을확인하였다. 또, δ 3.40 (1H, dd, J = 4.5 Hz, 12 Hz, H-3) 을통해당이다마란골격과연결되어있는위치를확인하였다. 13 C NMR spectrum에서총 36개의탄소를확인하였고, δ 17.8 (C-18), 16.8 (C-19), 23.1 (C-21), 26.3 (C-26), 18.2 (C-27), 16.3 (C-28), 28.6 (C-29), 17.2 (C- 30) 를통해 methyl group을이루는탄소를확인할수있었다. δ 126.5 (C- 24) 를통해 olefinic carbon을, 그리고 131.2 (C-25) 를통해 olefin carbon과이중결합을이루는 quaternary carbon을확인할수있었다. 또한 107.4 (C- 1 ) 에서발견되는하나의 anomeric carbon을비롯하여 76.3 (C-2 ), 79.2 (C- 3 ), 72.3 (C-4 ), 78.8 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 을통해 glucose가하나결합하고있음을알수있었다. 당을구성하는탄소외에산소와결합하는탄소는 89.2 (C-3), 71.3 (C-12), 73.4 (C-20) 인데 C-3은당과결합하고있고나머지두개의탄소가 hydroxyl group과결합하고있다는것을확인하여화합물 2를 PPD계열의화합물임을유추할수있었다 (Fig. 23). 이상의결과는 C-21의 chemical shift를제외하고앞서 20(S)-Rh2로동정하였던화합물 1과비슷하였다. 하지만화합물 2에서 20번위치의 58

알파포지션에서 hydroxy group이결합한영향으로 13 C NMR spectrum에서 δ 49.7 (C-13), 51.1 (C-17), 23.1 (C-21), 43.7 (C-22) 이화합물 1과다름을확인하였고, 이상의결과를통해문헌치와비교하여이를 ginsenoside 20(R)-Rh2로동정하였다 (H. Yang et al., 2014). 59

Figure 22. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 2 60

2-3. 화합물 3 의구조분석 화합물 3은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 783 [M-H] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 0.99 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, s, H-19), 1.45 (3H, s, H-21), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 1.32 (3H, s, H-28), 1.13 (3H, s, H- 29), 0.97 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고, δ 5.33 (1H, t like, H-24) 를통해 H-24 위치에 olefin 수소를확인하였다. 또한 δ 4.94 (1H, d, J = 8.6 Hz, H-1 ) 을통해 3-O-β-D-glucopyranosyl group의 anomeric proton을확인할수있었고, δ 5.39 (1H, d, J = 7.3 Hz, H-1 ) 을통해 2 -O-β-D-glucopyranosyl group의 anomeric proton을확인할수있었다. 또, δ 3.31 (1H, dd, J = 3.8 Hz, 11.2 Hz, H-3) 을통해당과결합하고있는 terpene 구조의탄소와연결된수소의위치를알수있었다. 13 C NMR spectrum에서총 42개의탄소를확인하였고, δ 16.3 (C-18), 16.8 (C-19), 27.5 (C-21), 26.2 (C-26), 17.5 (C-27), 28.6 (C-28), 17.1 (C-29), 18.1 (C- 30) 를통해 methyl group을이루는탄소를확인할수있었다. δ 126.8 (C- 24) 를통해 olefinic carbon을그리고 131.2 (C-25) 를통해 olefin carbon과이중결합을이루는 quaternary carbon을확인할수있었다. 또한 105.6 (C- 1 ), 106.5 (C-1 ) 를통해두개의 anomeric carbon을확인하여두개의당이연결되어있음을알수있었고, 이를비롯하여나머지당을이루는 δ 83.9 (C-2 ), 78.4 (C-3 ), 72.1 (C-4 ), 78.7 (C-5 ), 63.3 (C-6 ), 77.6 (C-2 ), 78.8 (C- 3 ), 72.1 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.2 (C-6 ) 의 peak를통해당의종류가 glucose임을확인하였다. 당을구성하는탄소외에산소와결합하는탄소는 89.4 (C-3), 71.5 (C-12), 73.4 (C-20) 인데 C-3은당과결합하고있고 61

나머지두개의탄소가 hydroxyl group과결합하고있다는것을확인하여화합물 3은 PPD계열의화합물임을유추할수있었다 (Fig. 24). HMBC spectrum에서 terpene 구조의 3번위치에당이하나결합하고, 2 과 1 위치에당끼리서로결합한것을확인하였다 (Fig. 25). 이상의결과를문헌치와비교해본결과, 화합물 3은앞서화합물 1로동정했던 20(S)-Rh2의구조에서 glucose가하나더결합한것으로이를 ginsenoside 20(S)-Rg3로결정하였다 (H. Yang et al., 2014). 62

Figure 23. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 3 63

Figure 24. HSQC and HMBC spectra of compound 3 64

2-4. 화합물 4 의구조분석 화합물 4는흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 783 [M-H] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H spectrum에서 δ 1.03 (3H, s, H-18), 0.84 (3H, s, H-19), 1.41 (3H, s, H-21), 1.71 (3H, s, H-26), 1.67 (3H, s, H-27), 1.32 (3H, s, H-28), 1.13 (3H, s, H-29), 1.00 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고, δ 5.34 (1H, t, J = 6.3 Hz, H-24) 를통해 H-24 위치에 olefin 수소를확인하였다. 또한 δ 4.95 (1H, d, J = 6.7 Hz, H-1 ) 을통해 3-O-β-D-Glucopyranosyl group의 anomeric proton을확인할수있었고, δ 5.40 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ) 을통해 2 -O-β-D-Glucopyranosyl group의 anomeric proton을확인할수있었다. 또, δ 3.31 (1H, dd, J = 4.1 Hz, 12.0 Hz, H-3) 을통해당과결합하고있는 terpene 구조의탄소와연결된수소의위치를알수있었다. 13 C NMR spectrum에서총 42개의탄소를확인하였고, δ 16.1 (C-18), 16.7 (C-19), 23.1 (C-21), 26.1 (C-26), 17.6 (C-27), 28.4 (C-28), 16.9 (C-29), 18.0 (C- 30) 를통해 methyl group을이루는 8개의탄소를확인할수있었다. δ 126.4 (C-24) 를통해 olefinic carbon을그리고 δ 131.1 (C-25) 를통해 olefin carbon과이중결합을이루는 quaternary carbon을확인할수있었다. 또한 δ 108.5 (C-1 ), 106.4 (C-1 ) 를통해두개의 anomeric carbon을확인하여두개의당이연결되어있음을알수있었고, 이를비롯하여나머지당을이루는 δ 93.7 (C-2 ), 78.3 (C-3 ), 72.0 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.2 (C-6 ), 77.5 (C- 2 ), 78.7 (C-3 ), 71.9 (C-4 ), 78.5 (C-5 ), 63.0 (C-6 ) 의 peak를통해당의종류가 glucose임을확인하였다. 당을구성하는탄소외에산소와결합하는탄소는 δ 89.3 (C-3), 71.2 (C-12), 73.3 (C-20) 인데 C-3은당과결합하고있고나머지두개의탄소가 hydroxyl group과결합하고있다는 65

것을확인하여화합물 3은 PPD계열의화합물임을유추할수있었다 (Fig. 26). 이상의결과는 C-21의 chemical shift를제외하고앞서 20(S)-Rg3로동정하였던화합물 3과비슷하였다. 하지만화합물 4에서 20번위치의알파포지션에서 hydroxy group이결합한영향으로 13 C NMR spectrum에서 δ 49.5 (C-13), 50.9 (C-17), 23.1 (C-21), 43.6 (C-22) 이화합물 3번과다름을확인하였고, 이상의결과를통해문헌치와비교하여이를 ginsenoside 20(R)-Rh2로결정하였다 (H. Yang et al., 2014). 66

Figure 25. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 4 67

2-5. 화합물 5 의구조분석 화합물 5는흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 649 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 HNMR에서 δ 1.03 (3H. s, H-18), 0.83 (3H, s, H-19), 1.67 (3H, s, H-26), 1.61 (3H, s, H-27), 1.34 (3H, s, H-28), 1.02 (3H, s, H-29), 0.99 (3H, s, H-30) 의 7개의메틸기가관찰되어하나의메틸기가치환된점과 δ 5.31 (1H, t- like, H-24) 을통해 olefin proton을확인할수있었고 δ 4.98 (1H, d, J = 7.9 Hz, H-1 ) 을통해하나의 anomeric proton이관찰되어하나의당이베타포지션에서결합하고있다는점, 그리고 δ 3.41 (1H, dd, J = 3.5 Hz, 11.5 Hz, H-3) 을통해당과 terpene 구조의연결위치를파악하였다. 마지막으로 δ 5.17 (1H, br.s, H-21a), 4.93 (1H, br.s, H-21b) 를통해 4급탄소와이중결합한 exomethylene proton이있음을확인하였다. 13 C NMR spectrum에서총 36개의탄소를확인하였고, δ 16.2 (C-18), 16.9 (C-19), 26.2 (C-26), 18.2 (C-27), 28.6 (C-28), 17.2 (C-29), 17.4 (C-30) 를통해 methyl group을이루는 7개의탄소를확인할수있었다. δ 125.7 (C- 24) 를통해 olefinic carbon을그리고 δ 131.6 (C-25) 를통해 olefin carbon과이중결합을이루는 quaternary carbon을확인할수있었다. 또한 δ 107.4 (C-1 ) 를통해하나의 anomeric carbon을확인하여하나의당이연결되어있음을알수있었고, 이를비롯하여나머지당을이루는 δ 76.2 (C-2 ), 79.2 (C-3 ), 72.3 (C-4 ), 78.8 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 의 peak를통해당의종류가 glucose임을확인하였다. 또 δ 155.9 (C-20) 의 peak를보고 25번탄소외에이중결합의영향을받은탄소 (C-20) 가하나더있다는것과동시에당의구조를책임지는 carbon을제외한산소와결합하는탄소 δ 89.2 (C-3), 72.8 (C-12) 가두개뿐이어서다른하나의탄소 (C-20) 에결합한 68

hydroxy group은떨어져나갔음을확인하였다. 그리고 δ 108.5 (C-21) 에서보이는 exomethylene carbon peak를모두종합하여 20번위치에결합했던 hydroxyl group이떨어져나가 21번탄소와이중결합을한것을알수있었다 (Fig. 27). 또한 HMBC data에서 terpene 구조의 3번위치에당이결합하고, 21번 proton이각각 17번탄소, 22번탄소와 correlation 하고있음을확인하였다 (Fig. 28). 이상의결과를문헌치와비교하여화합물 5를 ginsenoside Rk2로결정하였다 (Park et al., 2002). 69

Figure 26. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 5 70

Figure 27. HSQC and HMBC spectra of compound 5 71

2-6. 화합물 6 의구조분석 화합물 6은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 649 [M+HCOO] - 의 peak를확인하였다. 1 HNMR에서 δ 1.03 (3H, s, H-18), 0.83 (3H, s, H-19), 1.83 (3H, s, H-21), 1.64 (3H, s, H-26), 1.60 (3H, s, H-27), 1.33 (3H, s, H-28), 1.02 (3H, s, H-29), 0.99 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인할수있었고 δ 5.52 (1H, t, J = 7.6 Hz, H-22), 5.24 (1H, t, J = 6.2 Hz, H-24) 를통해두개의 olefin proton을확인할수있었다. 또한 δ 4.96 (1H, d, J=7.6,H-1 ) 하나의 anomeric proton으로하나의당이베타포지션에서결합하고있음을알수있었고, δ 3.39 (1H, dd, J = 4.4 Hz, 12 Hz, H-3) 를통해당과 terpene 구조의연결위치를파악하였다. 13 C NMR spectrum에서 δ 16.8 (C-18), 17.1 (C-19), 13.5 (C-21), 26.0 (C-26), 18.1 (C-27), 29.2 (C-28), 16.2 (C-29), 17.4 (C-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고 δ 107.3 (C-1 ) 에서 anomeric carbon이관찰되어하나의당이결합하고있음을알수있었고, 나머지 δ 76.2 (C-2 ), 79.1 (C-3 ), 72.3 (C-4 ), 78.7 (C-5 ), 63.5 (C-6 ) 를통해 glucose가결합하고있음을알수있었다. 그리고 δ 123.5 (C-22), 124.2 (C-24) 를통해두개의 olefin carbon을확인하였다. 또한 25번탄소외에평소보다훨씬 down field된 carbon peak δ 140. 5 (C-20) 로사급탄소가하나더있음을확인하였고, 화합물 5와같이당을구성하는탄소를제외한 oxygenated carbon δ 89.1 (C-3), 72.9 (C-12) 이평소보다하나부족한것으로 hydroxy group이하나떨어져나갔음을확인하였다. 마지막으로문헌치를참고하여 δ 13.5 (C-21) 에서보통보다훨씬 upfield 되어있는 methyl peak로 20번탄소와 22번탄소는 E form으로이중결합하고있음을확인하였다 (Fig. 29). 72

HMBC data로 terpene 구조의 3번위치에당이결합하고있음을확인하였다 (Fig. 30). 모든것을종합하여 20번위치에결합해있던 hydroxyl group이떨어지면서 22번탄소와이중결합을한 Isoginsenoside Rh3로결정하였다 (Wang et al., 2004). 73

Figure 28. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 6 74

Figure 29. HSQC and HMBC spectra of compound 6 75

2-7. 화합물 7 의구조분석 화합물 7은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 667 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 0.96 (3H, s, H-18), 0.90 (3H, s, H-19), 1.64 (3H, s, H-21), 1.60 (3H, s, H-26), 1.60 (3H, s, H-27), 1.24 (3H, s, H-28), 1.05 (3H, s, H- 29), 1.00 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인할수있었고, δ 5.26 (1H, t, J = 6.6 Hz, H-24) 을통해 olefin proton을확인할수있었다. 또한 δ 5.21 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1 ) 을통해 anomeric proton을관찰하여하나의당이베타포지션에서결합하고있음을확인하고, δ 3.43 (1H, dd, J = 4 Hz, 10.5 Hz, H-3) 의 peak로 3번위치는산소와결합하고있음을확인하였다. 13 C NMR에서 δ 16.7 (C-18), 16.4 (C-19), 22.7 (C-21), 26.1 (C-26), 18.1 (C- 27), 29.0 (C-28), 16.7 (C-29), 17.7 (C-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고 δ 126.3 (C-24) 의 peak로 olefinic carbon과 δ 131.2 (C-25) 의 peak로 quaternary carbon을확인하였다. 또한 δ 98.6 (C-1 ) 을통해 anomeric carbon이관찰되어하나의당이결합하고있음을확인할수있었고, 나머지당을구성하는탄소 δ 75.5 (C-2 ), 79.7 (C-3 ), 72.1 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.3 (C-6 ) 을통해 glucose가결합하고있음을알수있었다 (Fig 31). 화합물 7의경우특이적으로 3번탄소가 δ 78.4 (C-3) 로 upfield된것이관찰되었는데, 3번카본에서당이떨어졌을경우 90ppm에서 78ppm으로 upfield 된다는문헌을참고하여 HMBC를찍어본결과 3번탄소는 hydroxyl group과결합하고 20번탄소와당이베타위치에서결합하였음을확인하였다 (Fig. 32). 76

이상의결과를문헌치와비교하여화합물 7 을 compound K 로 동정하였다 (Quan et al., 2010) 77

Figure 30. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 7 78

Figure 31. HSQC and HMBC spectra of compound 7 79

2-8. 화합물 8 의구조분석 화합물 8번은흰색의부정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 783 [M- H] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR에서 δ 0.98 (3H, s, H-18), 0.82 (3H, s, H-19), 1.59 (3H, s, H-26), 1.59 (3H, s, H-27), 1.32 (3H, s, H-28), 1.01 (3H, s, H-29), 0.96 (3H, s, H-30) 을통해 7개의 methyl group을확인하였고, δ 5.24 (1H, t, J = 7.3 Hz, H-24) 을통해 olefin proton을확인하였다. 또한 δ 5.21 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1 ) 의 peak로 3-O-β-D-Glucopyranosyl의위치를확인하였고, δ 4.95 (1H, d, J = 7.9 Hz) 의 peak로 20-O-β-D-Glucopyranosyl의위치를확인하였다. 화합물 8의 1 H NMR에서는 δ 3.37 (1H, dd, J = 4.5 Hz, 11.6 Hz, H-3), 3.94 (1H, m, H- 12) 의 peak가뚜렷하게관찰되었는데이는 hydroxyl group과결합하여평소보다 downfield 되었음을보여주고있다. 13 C NMR spectrum에서 δ 107.3 (C-1 ) 을통해 3-O-β-D-Glucopyranosyl 위치로결합하는 anomeric carbon을확인할수있었고, 나머지당을구성하는 δ 76.1 (C-2 ), 79.1 (C-3 ), 72.0 (C-4 ), 78.7 (C-5 ), 63.3 (C- 6 ) 을통해 glucose 당임을확인하였다. 이와더불어 δ 98.6 (C-1 ) 을통해 20-O-β-D-glucopyranosyl 위치로결합하는 aomeric carbon을확인할수있었고, 나머지당을구성하는 δ 75.5 (C-2 ), 79.7 (C-3 ), 72.2 (C- 4 ), 78.7 (C-5 ), 63.4 (C-6 ) 을통해 glucose 당임을확인하였다. 또한 δ 126.3 (C-24) 를통해 olefin proton을확인하였고, δ 131.2 (C-25) 를통해 quaternary carbon을확인하였다 (Fig. 33). 이상의결과를모두문헌치와비교하여화합물 8을 ginsenoside F2로동정하였다 (Quan et al., 2010). 80

Figure 32. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 8 81

2-9. 화합물 9 의구조분석 화합물 9는흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 765 [M-H] - 의분자량 peak를확인하였고, ESI Q-TOFMS spectrum에서 m/z 765.4815 [M-H] - (Calcd.forC 42 H 69 O 12 765.4795) 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.63 (3H, s, H-18), 1.59 (3H, s, H-19), 1.30 (3H, s, H-21), 1.12 (3H, s, H-26), 1.02 (3H, s, H-27), 0.96 (3H, s, H-28), 0.82 (3H, s, H- 29), 1.82 (3H, s, H-30) 을통해 8개의 methyl group을확인하였고, δ 5.51 (1H, t, J = 6.6 Hz, H-22), 5.23 (1H, t, J = 5.9 Hz, H-24) 을통해두개의 olefin proton이있음을확인하였다. 또, δ 4.94 (1H, d, J = 7.2 Hz) 의 peak로 3-oβ-D-Glucopyranosyl 위치로결합하는 anomeric proton을확인할수있었고, δ 5.38 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ) 을통해 2 -o-β-d-glucopyranosyl 위치에서결합하는 anomeric proton을확인할수있었다. 또한 δ 3.29 (1H, dd, J = 4.0 Hz, 11.4 Hz, H-3) 을통해 terpene 구조와당의연결위치를확인하였다. 13 C NMR spectrum에서 δ 16.2 (C-18), 16.9 (C-19), 13.5 (C-21), 26.0 (C-26), 18.1 (C-27), 29.2 (C-28), 16.8 (C-29), 17.4 (C-30) 를통해 8개의 methyl group을확인하였고 δ 105.5 (C-1 ), 106.4 (C-1 ) 에서두개의 anomeric carbon이관찰되어두개의당이결합하고있음을알수있었고, 나머지 δ 83.8 (C-2 ), 78.6 (C-3 ), 72.0 (C-4 ), 78.3 (C-5 ), 63.2 (C-6 ) 와 δ 77.5 (C-2 ), 78.7 (C-3 ), 72.0 (C-4 ), 78.5 (C-5 ), 63.0 (C-6 ) 을통해 glucose가결합하고있음을알수있었다. 그리고 δ 123.4 (C-22), 124.2 (C-24) 를통해두개의 olefin carbon을확인하였다. 또한평소보다훨씬 down field된 carbon peak δ 140. 5 (C-20) 로 25번탄소외에사급탄소가하나더있음을확인하였고, 화합물 6과같이당을구성하는탄소를 82

제외한 oxygenated carbon δ 89.1 (C-3), 72.9 (C-12) 이평소보다하나부족한것으로 hydroxy group이하나떨어져나갔음을확인하였다 (Fig. 34). HMBC data로 terpene 구조의 3번위치에당이결합하고 2 과 1 위치에당끼리서로결합한것을확인하였다 (Fig. 35). 마지막으로문헌치를참고하여 δ 13.5 (C-21) 에서보통보다훨씬 upfield 되어있는 methyl peak로 20번탄소와 22번탄소는 E form으로이중결합하고있음을확인하였다. 모든것을종합하여 20번위치에결합해있던 hydroxyl group이떨어지면서 22번탄소와이중결합을한 ginsenoside Rh3에서당이하나더결합한 ginsenoside Rg5로동정하였다 (Wang et al., 2004). 83

Figure 33. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 9 84

Figure 34. HSQC and HMBC spectra of compound 9 85

2-10. 화합물 10 의구조분석 화합물 10은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 765 [M-H] - 의분자량 peak를확인하였고, ESI Q-TOFMS spectrum에서 m/z 765.4805 (Calcd. for C 42 H 69 O 12 765.4795) 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.03 (3H, s, H-18), 0.83 (3H, s, H-19), 1.67 (3H, s, H-26), 1.61 (3H, s, H-27), 1.31 (3H, s, H-28), 1.13 (3H, s, 29), 0.98 (3H, s, H- 30) 을통해 7개의 methyl group을확인하여하나의 methyl group이치환되었다는것을알수있었고, δ 5.31 (1H, t, J = 6.7 Hz, H-24) 을통해 olefin proton이하나있음을확인하였고, δ 4.94 (1H, d, J = 7.6 Hz, H-1 ) 의 peak로 3-o-β-D-Glucopyranosyl 위치로결합하는 anomeric proton을확인할수있었고, δ 5.40 (1H, d, J = 7.5 Hz, H-1 ) 을통해 2 -o-β-d-glucopyranosyl 위치에서결합하는 anomeric proton을확인할수있었다. 또, δ 3.31 (1H, dd, J = 4.6 Hz, 11.8 Hz, H-3) 을통해 terpene 구조와당의연결부위를확인하였다. 그리고 5.16 (1H, br.s, H-21a), 4.92 (1H, br.s, H-21b) 를통해 4급탄소와이중결합한 exomethylene proton이있음을확인하였다 13 C NMR spectrum에서 δ 16.1 (C-18), 16.8 (C-19), 26.1 (C-26), 18.1 (C-27), 28.5 (C-28), 17.0 (C-29), 17.3 (C-30) 을통해 7개의 methyl group을확인하였고, δ 125.7 (C-24) 를통해 olefin carbon을확인하였으며 δ 155.9 (C-20), 131.6 (C-25) 을통해 quaternary carbon이두개있음을확인하였다. 또한 δ 105.5 (C-1 ) 의 peak로 3-o-β-D-Glucopyranosyl 위치에서결합하는 anomeric carbon과 δ 106.4 (C-1 ) 의 peak로 2 -o-β-d-glucopyranosyl 위치에서결합하는 anomeric carbon의위치를파악하였다. 나머지당을구성하는 δ 83.8 (C-2 ), 78.3 (C-3 ), 72.0 (C-4 ), 78.6 (C-5 ), 63.2 (C-6 ), 77.5 (C-2 ), 78.7 (C- 3 ), 72.0 (C-4 ), 78.5 (C-5 ), 63.1 (C-6 ) 을통해 Glucose 당이 86

두개결합되어있음을확인하였다. 당을구성하는탄소외에산소와결합하는탄소가 δ 89.3 (C-3), 72.8 (C-12) 두개뿐인것으로다른하나의탄소 (C-20) 에결합한 hydroxy group은떨어져나갔음을확인하였다. 그리고 δ 108.5 (C-21) 에서보이는 exomethylene carbon peak를확인하였다 (Fig. 36). 이상의결과를문헌치와대조하여화합물 10을 20번위치에결합했던 hydroxyl group이떨어져나가 21번탄소와이중결합을한 ginsenoside Rk2에서당이하나더결합한 ginsenoside Rk1로동정하였다 (Park et al., 2002). 87

Figure 35. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 10 88

2-11. 화합물 11 의구조분석 화합물 11은흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 665 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.26 (3H, s, H-18), 1.06 (3H, s, H-19), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 2.09 (3H, s, H-28), 1.61 (3H, s, H-29), 0.85 (3H, s, H- 30) 을통해 7개의 methyl group을확인하여하나의 methyl group이치환되어있음을확인하였다. 또한 δ 5.31 (1H, m, H-24) 을통해 olefin proton을확인하였고, δ 5.06 (1H, d, J = 7.2 Hz, H-1 ) 을통해하나의당이베타위치에서결합하고있음을확인하였다. 그리고, δ 3.55 (1H, dd, J = 4.5 Hz, 11.5 Hz, H-3) 를통해 3번위치에산소가결합하고있음을확인하였다. 또한 δ 5.13 (1H, br. s, H-21a), 4.91 (1H, br. S, H-21b) 를통해사급탄소와이중결합하는 exomethylene proton을확인하였다. 13 C NMR spectrum에서 δ 16.8 (C-18), 17.2 (C-19), 26.2 (C-26), 18.2 (C-27), 32.2 (C-28), 16.8 (C-29), 17.8 (C-30) 을통해 7개의 methyl group을확인하였고, δ 155.9 (C-20), 131.6 (C-25) 을통해 2개의 quaternary carbon이있음을확인하였다. 그리고 δ 106.5 (C-1 ) 의 peak를통해 anomeric carbon을확인하여하나의당이결합하고있음을알수있었고, 나머지당을구성하는탄소 δ 4.10 (1H, m, H-2 ), 4.26 (1H, m, H-3 ), 4.23 (1H, m, H-4 ), 3.94 (1H, m, H-5 ), 4.54 (1H, m, H-6 a), 4.38 (1H, m, H-6 b) 을통하여 Glucose 당이결합하고있음을확인하였다. 화합물 11은특이적으로 3번탄소가훨씬 upfield 되어있는것으로 3번탄소에는당이없고 OH기와결합했음을확인하였고, 20번탄소가아닌 6번탄소가 downfield에나타난것으로보아 6번위치에당이결합하고있음을확인하였다 (Fig. 37). 89

HMBC data에서흔하지않게보이는 QC spot에서 anomeric carbon과 proton의 J-value값역시 154.3으로 6번위치에당이베타포지션에서결합하고있음을확인하였다 (Fig. 38). 이상의결과를문헌치와비교하여 20번탄소의 hydroxyl group이떨어져나가 21번탄소와이중결합하고 6번위치에 glucose가결합한 ginsenoside Rk3로동정하였다 (Park et al., 2002). 90

Figure 36. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 11 91

Figure 37. HSQC and HMBC spectra of compound 11 92

2-12. 화합물 12 의구조분석 화합물 12번은흰색의무정형가루로 ESI Q-TOFMS spectrum에서 m/z 459.3792 [M+H] + (Calcd. for C 30 H 51 O 3 459.3833) 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.69 (3H, s, H-26), 1.65 (3H, s, H-27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.49 (3H, s, H-29), 1.19 (3H, s, H-30), 1.00 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H- 19) 를통해 7개의 methyl group을확인하여하나의 methyl group이치환되었음을확인하였고, 5ppm 근처에 anomeric proton이없는것으로당이없는것을확인하였다. 그리고 δ 5.32 (1H, t, J = 6.7Hz, H-24) 를통해하나의 olefin proton을확인하였고, δ 5.17 (1H, br. s, H-21a), 4.93 (1H, br. s, H-21b) 을통해사급탄소와이중결합하는 exomethylene group을확인하였다. 또한 δ 3.55 (1H, dd, J = 3.9 Hz, 12.5 Hz, H-3), 4.45 (1H, m, H-6), 3.96 (1H, m, H-12) 를통해 hydroxy group가결합하는탄소와연결된세개의 proton을확인하였다. 이것으로화합물 12번은 PPD 계열이아닌 PPT계열의화합물임을유추할수있었다. 13 C NMR spectrum에서총 30개의탄소를확인할수있었고, δ 18.1 (C- 18), 18.2 (C-19), 26.2 (C-26), 17.9 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.5 (C-30) 을통해 7개의 methyl group을확인하였으며, δ 155.8 (C-20), 131.6 (C-25) 을통해이중결합의영향을받는 quaternary carbon을확인하였다. 또한 δ 125.8 (C-24) 을통해 olefin carbon을확인하였고, 105ppm 근처에 anomeric carbon이없는것으로다시한번당이없음을확인하였다. 그리고 δ 78.8 (C-3), 68.1 (C-6), 72.9 (C-12) 를통해산소와결합하는수소의개수로 PPT 계열의화합물임을확인하였다 (Fig. 39). 이상의결과를통해화합물 12를 20번위치에서결합해있던 hydroxyl group이떨어져나가 21번탄소와이중결합한 Rk2에서하나의당이 93

떨어져나간 Dammara-20, 24-diene-3, 6, 12-triol, (3β, 6α, 12β) 로동정하였다 (Kang et al., 2012). 94

Figure 38. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 12 95

2-13. 화합물 13 의구조분석 화합물 13번은흰색의무정형가루로 ESI Q-TOFMS spectrum에서 m/z 459.3781 [M+H] + (Calcd. For C 30 H 51 O 3 459.3833) 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 0.99 (3H, s, H-18), 1.04 (3H, s, H-19), 1.86 (3H, s, H-21), 1.64 (3H, s, H-26), 1.60 (3H, s, H-27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.47 (3H, s, H- 29), 1.18 (3H, s, H-30) 을통해 8개 methyl group을확인하였고, 5ppm 근처에 anomeric proton이없는것으로당이없는것을확인하였다. 그리고 δ 5.24 (1H, t, J = 7.2 Hz, H-24), 5.51 (1H, t, J = 6.5 Hz, H-22) 을통해두개의 olefin proton을확인하였고, δ 3.54 (1H, dd, J = 4.8 Hz, 11.5 Hz, H-3), 4.44 (1H, m, H-6), 3.96 (1H, m, H-12) 를통해 hydroxy group와결합하는탄소에연결된세개의 proton을확인하였다. 이것으로화합물 12번은 PPD 계열이아닌 PPT계열의화합물임을유추할수있었다. 13 C NMR spectrum에서총 30개의탄소를확인할수있었고, δ 17.9 (C- 18), 18.1 (C-19), 13.6 (C-21), 26.1 (C-26), 18.1 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.5 (C-30) 를통해 8개의 methyl group을확인하였으며 δ 124.2 (C-22), 124.3 (C-24) 을통해두개의 olefin carbon을확인하였다. 그리고 δ 131.7 (C-25) 외에 δ 140.5 (C-20) 의 peak가보통보다 downfield에서나타난것으로이중결합의영향을받는 quaternary carbon이두개임을확인하였으며 δ 13.6 (C-21) 의 peak가보통보다훨씬 upfield 되어나타난것으로 20번탄소와 22번탄소가서로 E form에서이중결합하고있음을확인하였다. 또 δ 78.8 (C-3), 68.1 (C-6), 73.0 (C-12) 의 peak를통해산소와결합하는탄소의개수로화합물 13을 PPT 계열의화합물임을유추할수있었다 (Fig. 40). 96

이상의결과를문헌치와비교하여 20번탄소에결합해있던 hydroxyl group이떨어져나가고 22번탄소와이중결합한 ginsenoside Rh3에서당이하나떨어져나간 Dammara-20(22), 24-diene-3, 6, 12-triol, (3β, 6α, 12β, 20E) 로동정하였다 (Kang et al., 2012). 97

Figure 39. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 13 98

2-14. 화합물 14 의구조분석 화합물 14는흰색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 521 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.12 (3H, s, H-18), 1.02 (3H, s, H-19), 1.44 (3H, s, H-21), 1.67 (3H, s, H-26), 1.64 (3H, s, H-27), 2.03 (3H, s, H-28), 1.48 (3H, s, H- 29), 0.98 (3H, s, H-30) 를통해 methyl group을확인하였고, 5ppm근처에 anomeric proton이없는것으로당이없음을확인하였으며 δ 5.34 (1H, t, J = 6.9 Hz, H-24) 의 peak를통해 olefin proton을확인하였다. 그리고 δ 3.57 (1H, dd, J = 5.3 Hz, 11.2 Hz, H-3), 4.44 (1H, m, H-6), 3.97 (1H, m, H-12) 의 peak를통해산소와결합한탄소에연결되어있는수소의개수가 3개임을확인하여화합물 14는 PPT 계열의화합물임을유추하였다. 13 C NMR spectrum에서총 30개의탄소를확인할수있었고, δ 17.8 (C- 18), 17.9 (C-19), 27.4 (C-21), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 32.4 (C-28), 16.9 (C-29), 17.4 (C-30) 를통해 8개의 methyl group을확인하였으며 105ppm 근처에 anomeric carbon이없는것으로당이없음을파악하였고 δ 126.6 (C-24) 을통해 olefin carbon을확인하였다. 또한 δ 131.1 (C-25) 을통해 quaternary carbon을확인하였고, δ 78.7 (C-3), 68.0 (C-6), 71.4 (C-12), 73.3 (C-20) 의 peak를통해산소와결합하는탄소의개수로 PPT계열의화합물임을유추하였다 (Fig. 41). 이상의결과를문헌치와비교하여화합물 14를 ginsenoside 20(S)- Protopanaxatriol로동정하였다 (Usami Yoshihide et al., 2008). 99

Figure 40. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 14 100

2-15. 화합물 15 의구조분석 화합물 15는희색의무정형가루로 ESIMS spectrum에서 m/z 521 [M+HCOO] - 의분자량 peak를확인하였다. 1 H NMR spectrum에서 δ 1.18 (3H, s, H-18), 1.05 (3H, s, H-19), 1.42 (3H, s, H-21), 1.71 (3H, s, H-26), 1.66 (3H, s, H-27), 2.02 (3H, s, H-28), 1.48 (3H, s, H- 29), 1.02 (3H, s, H-30) 를통해 8개의 methyl group을확인하였고, δ 5.33 (1H, t, J = 7.4 Hz, H-24) 의 peak를통해 olefin proton을확인하였으며 5ppm 근처에 anomeric proton이없는것으로당이없음을확인하였다. 그리고 δ 3.56 (1H, dd, J = 4.6 Hz, 11.6 Hz, H-3), 4.45 (1H, t, J = 10 Hz, H-6), 3.98 (1H, m, H-12) 를통해산소와결합하는탄소와연결된수소의개수로 PPT 계열의화합물임을확인하였다. 13 C NMR spectrum에서총 30개의탄소를확인하였고, δ 17.8 (C-18), 17.9 (C-19), 23.0 (C-21), 26.2 (C-26), 18.1 (C-27), 32.3 (C-28), 16.9 (C-29), 17.7 (C- 30) 을통해 8의 methyl group을확인하였고, 105ppm 근처에 anomeric carbon이없는것으로당이없음을확인하였다. 그리고 δ 126.4 (C-24) 의 peak를통해 olefin carbon을확인하였으며 δ 131.1 (C-25) 을통해이중결합의영향을받은 quaternary carbon을확인하였다. 또한산소와결합하는탄소 δ 78.7 (C-3), 68.1 (C-6), 71.3 (C-12), 73.3 (C-20) 의 peak 개수를통해 PPT 계열의화합물임을유추하였다 (Fig. 42). 이상의결과는 C-21의 chemical shift를제외하고앞서 ginsenoside 20(S)- Protopanaxatriol로동정하였던화합물 14과비슷하였다. 하지만화합물 15에서 20번위치의알파포지션에서 hydroxy group이결합한영향으로 13 C NMR spectrum에서 δ 49.2 (C-13), 51.0 (C-17), 23.0 (C-21), 43.6 (C-22) 이 화합물 14 번과다름을확인하였고, 이상의결과를통해문헌치와 101

비교하여화합물 15 를 Ginsenoside 20(R)-Protopanaxatriol 로동정하였다 (Usami Yoshihide et al., 2008). 102

Figure 41. 1 H and 13 C-NMR spectra of compound 15 103

Figure 42. Structure of the compounds isolated from processed P. ginseng 104

3. Panax ginseng 의반응물에서분리한비극성화합물의 AMPK 활성검사 P.ginseng의반응물로부터분리한총 15개의화합물에대해쥐의근육모세포 C2C12 세포주를검색계로하여 AMPK assay를진행하였다. 배양한 C2C12를성숙한근관세포로분화시켜분리한화합물을각각 10 μm 또는 20 μm로투여하여 protein을준비하고 western blot을실시하여 protein의발현량을통해 AMPK의활성을평가하였다. 초기 screening 단계에서화합물 1, 3, 8, 14가유의적인 AMPK 활성효과를보여주었고 (Fig. 43), 뒤늦게분리한화합물 7과함께다시확인해본결과화합물 1, 3, 7, 8, 15가현저한 AMPK 활성효과를보였다. 특히화합물 1, 3의경우기존에이미 AMPK 활성물질로알려진 AICAR보다 50배이상의활성이있는것을확인하였다 (Fig. 44). 가장높은활성을보였던화합물 1과 3을대상으로각각의 R form의활성과비교해보았을때, S form의활성이더좋았음을알수있었다 (Fig. 45). AMPK가인산화되는과정을억제하여 AMPK 저해제로알려져있는 compound C를처리하고난후화합물 1과 3을처리하였을때앞서보였던 AMPK 활성효과가보이지않았지만 compound C를처리하지않았을때에는 AMPK 활성효과가보이는것으로화합물 1과 3은 AMPK가인산화되어실질적으로작동하는데에기여한다는것을확인하였다 (Fig. 46). 105

Figure 43. The effect of the compounds from processed P. ginseng roots on AMPK activity in C2C12 cells C2C12 myotubes were incubated with the appropriate concentrations of the compounds for 30 min. after prepare each protein from the cell, western blot was performed. Representative Results from three independent experiments is presented and first screening data are expressed as the mean ±S.D. (n=3); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the differentiated ctl. 106

Figure 44. The effect of the selected compounds from processed P. ginseng roots on AMPK activity in C2C12 cells C2C12 myotubes were incubated with the compounds have significant effect about screening assay for 30 min. after prepare each protein from the cell, western blot was performed. Representative Results from three independent experiments is presented and data are expressed as the mean ±S.D. (n=3); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the differentiated ctl. 107

Figure 45. The comparison of the (R) form and (S) form of compound 1 and 3 on AMPK activity in C2C12 cells C2C12 myotubes were incubated with the compound 1, 3 and each of the R form for 30 min. after prepare each protein from the cell, western blot was performed. Representative Results from three independent experiments is presented and data are expressed as the mean ±S.D. (n=3); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the differentiated ctl. 108

Figure 46. The result of the compound 1 and 3 on effective pampk increase in C2C12 cells The C2C12 myotubes were pre-treated with compound C (an AMPK inhibitor) at 10 µm for 30 min, and then C2C12 myotubes were incubated with the compound 1 and 3 have highest activity for 30 min. after prepare each protein from the cell, western blot was performed. Representative Results from three independent experiments is presented and data are expressed as the mean ±S.D. (n=3); *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the differentiated ctl. 109