Chapter 6. 효소 (enzye) 이순간에도수천개의생화학반응이생체내에서일어나며효소는이반응들의생화학적촉매이다. 효소는대부분단백질이나 RNA (ribozyes) 인경우도있다. RNA 효소는 ribosoe (peptidyl transfer) 과 splicesoe (splicing of intron) 이있다. 효소는대사기능의주요요소이다. 효소는세포내에서반응의속도조절, 반응의 coupling, 그리고순간적으로세포의대사적필요성을감지한다.
효소반응속도론 ( Enzye Kinetics) 화학반응속도론 (Kinetics) 은화학반응의속도를다룬다. 효소반응속도론 (Enzye inetics) 은촉매로서의효소의생화학적기능을논하고생체효소의기능에대하여정량적인접근을한다. 효소반응속도론의정보는대사과정을조절하며통제하는데사용될수있다. 치료제나약품들은많은경우에특정효소의저해제 (inhibitors) 인경우가많다. 따라서신약의개발은효소에관한연구결과와밀접한연관이있다.
tructure based drug design Trypsin Ligands Target
속도상수와활성화에너지 Arrhenius Equation: DG RT 속도상수, Ae 효소는반응의포텐셜 ( 자유에너지 ) 를변화시키지않지만반응의속도를증가시킨다. 즉효소는반응의활성화에너지를낮추어생체반응의속도를증가시킨다. 효소는기질에대해특이적결합을한다 (high specificity for substrates) 효소반응 : 효소 + 기질 생성물 + 효소 A X DG P DG (non catalyzed) DG (catalyzed)
효소반응과비효소반응 H 2 O 2 H 2 O + O 2 Reaction Conditions No catalyst Platinu surface Catalas e Actiation e nergy (J/ol) (cal/ol) 75.2 8.0 48.9.7 23.0 5.5 Relatie rate* 2.77 x 0 4 6.5 x 0 8 * Rate s are gie n in arbitrary units relatie to a alue of for the uncatalyzed reaction at 37 캜 효소는반응속도를최대 0 6 만큼가속시킨다.
Enzye, apoenzye, holoenzye, cofactor - 단백질자체만으로활성 ( 대부분효소 ) - 단백질자체만으로비활성 + cofactor --> actie enzye (apoenzye) holoenzye cofactors ( 조효소 ) @etal ions: Zn 2+, Fe 2+, Cu 2+.., 예 ) etallo-enzye (alcohol dehydrogenase-zn 2+ ) @ 유기물 (coenzye) : loosely bound ( 반투막투과기준 ) 예 ) 비타민 C : proline hydroxylase 의조효소 tightly bound : 주로공유결합 (prosthetic group)
History of Enzye Discoery -835 Jons Berzelins : starch + potato ---> starch 의분해 -850 ~ 60 Louis pasteur : sugar + liing cell(yeast)--> EtOH + CO 2-897 Eduard Buchner : yeast cell 을 grind + filter(sand) 한 Juice 발효속도증가확인 Harden & young : yeast Juice = heat unstable(enzye) + heat stable (inorganic) - 927 Jaes suer : urease 효소의결정화에성공 (X-ray 구조 ), 효소 = 단백질논란시작... - 930 John Northrup : trypsin, pepsin 발견, 효소 = 단백질결론
Enzye Kinetics 다음반응에서 A + B P 반응속도는, Rate = _ D[A] Dt Rate = [A] f [B] g D[B] = _ = Dt D[P] Dt : 반응속도상수 f + g : 반응차수반응속도 (rate, ) 는단위시간당생성물 P의생성속도혹은반응물 A나 B의소멸속도이다. 다음반응에서 만약반응속도가다음과같으면, A + B C + D Rate = [A] [B] A 와 B 에대해각각 차반응이다. 반응속도 (rate, ) 는단위시간당생성물 C 나 D 의생성속도혹은반응물 A 나 B 의소멸속도이다.
Enzye Kinetics : waring up 차반응 (the first order reaction) 의예비가역적방사능붕괴의예 : ( 정반응속도상수 ) A ---------------> P (reactant) (product) = - d[a]/dt = [A] = d[p]/dt ( : - ) [A] = -d[a]/dt; dt = -d[a]/[a]; d[a]/[a]= -dt; 양변적분하면, ln [A] t - ln[a] o = - t ; ln ( [A] t /[A] o ) =-t [A] t /[A] o = exp (-t) 이고, [A] t =[A] o exp (-t) 이다. at t = / 에서 A 의잔여량계산 ; [A] / =[A] o exp (-(/)) =. [A] o exp (-) = 0.37 [A] o @at t = / 에서 A 의잔여량은초기량의 37%
이분자반응의속도식 다음반응식에서, A B P Q 반응속도 (rate, ) 는단위시간당생성물 P 나 Q 의생성속도혹은반응물 A 나 B 의소멸속도이다 : : d[ P] dt d[ Q] dt or d[ A] dt d[ B] dt 반응속도는 : d[ A] dt [ A][ B] 는 2 차속도상수, 는 [A][B] 의 2 차식이다.
기질 - 효소결합의두모델 : loc and ey & Induced fit odels induced-fit odel : The shape of the actie site changes when the substrate binds to the enzye, creating a shape into which the substrate fits.
효소 - 기질복합체형성과반응에너지변화
효소동력학 (Enzye Kinetics) 단분자반응의속도는반응물의농도 [A] 에직선적으로비례. d[ A] dt A P [ A] 하지만만약위반응을효소가촉매인경우포화현상을보임 [A] A Enzye P [A]
For enzye-catalyzed reactions The substrate,, and enzye, E, cobine to for a coplex, E P E + E E + P Leonor Michaelis Maude Menten
The Michaelis-Menten Equation Michaelis-Menten 식의유도배경 : E 는효소, 는기질, P 는생성물 Michaelis-Menten 식은기질의농도와속도의관계를규정. Michaelis-Menten 의가정 : ) 초기속도가정 (Initial elocity assuption) * Initial elocity assuption: easure actiity before appreciable P accuulates, ignore -2, R 2) 정상상태가정 (tate steady assuption, approxiation); * 문제를쉽게하기위해 teady-state assuption( 평형 - 상태가설 ) 을도입. 이는평성상태에서는반응물과생성물의농도들이변하고있다고하더라도중간체의농도는변하지않는다는것. 즉, 이경우에서는 [E] 는불변이된다. [E] 의농도가불변이려면 E 의형성속도와분해속도가같다.
What about the reerse reaction? 2 E + E E + P - -2 [ R = -2 [E][P] ] Initial elocity assuption: easure actiity before appreciable P accuulates, ignore R 0 = 2 [E]
정상 ( 류 ) 상태가정 (teady tate Approxiation) 정상상태는효소 - 기질결합물 [E] 의농도가일정한상태를말한다 : d[ E] dt 0 정상상태이전은 (Pre-steady state) [E] 가 ( 주로 ) 매우빠르게쌓이는상태이다 ; MM 식은반응계가정상상태에도달했을때의반응동력학을나타낸다. 생성물 (P) 의생성속도는전단계보다느리므로이과정이전체속도결정
E 2 K - E K -2 E P 반응초기에는생성물 ([P]) 이거의없으므로 E+P 에서 E 가다시생성되는 양은거의무시해도된다. 따라서 MM 식은다음과같이간략히표현될수있다 : E E 2 E P K -
Michaelis-Menten 식의유도 E E 2 E P K - 반응속도식을적용하면, 정반응의속도 f 은 ( 혹은 E 의생성속도 ), f E 역반응 ( 혹은 E 의소멸 ) 의속도 d 는, E E E d ) 2 ( 2 정상상태에서는 [E] 의변화가없으므로 : ([E]<<[] : saturation) f d
반응계의총효소농도, [E t ] 는효소 - 기질복합체농도 ( [E]) 더하기자유효소 ( 비결합효소 ) 농도 ([E]) 이므로 : 정상상태 (at steady state) 에서는이므로 생성물의생성속도 ( 속도법칙 ), = 2 [E] 이므로 : t K t t t t t t K E E E E E E E E E E E E E E E E 2 ) ( 2 2 2 2 2 2 ) ( )) ( ( )) ( ( ) ( ) ( ) ( ) ( E E E t E E E t f ) ( t K E 2 Michaelis-Menten 식의유도 f d
MM Equation 의고찰 생성물의생성속도는주로생성물이점차생기는것을측정하여 실험적으로결정할수있다. 반응의최대속도는기질의농도 [] 가포화상태혹은최대로존재시도달하므로 ([s] ), [ ] MM식은다음과같이도표시할수있다 : 여기서 K 은 Michaelis 상수라고함. E 2 K t [ ] 2Et ax ax K
Michaelis Menten 상수 K K 은속도상수들로표시 : K 은 - >> 2 일때 E 의해리상수이다 : E - K 이작으면기질과강한결합을크면기질과약한결합을나타냄. K 은또한최대속도의 ½ 에서의기질농도이다. K E 2 K d [ E] [ E] [ ] [ E] E
Initial elocity Michaelis-Menten Model 만약 []= K M 이면다음이된다, V = V ax [] KM + [] = V ax [] [] + [] = V ax 2 V ax 2 V ax K M 기질농도, []
K (K M ) 의의미 최대속도의 /2 에서의기질농도
최대속도 ax 란? V ax 는기질농도가최대로증가시접근하는최대속도이나진짜로최대치는얻지못함 ( 효소가 00% 기질에결합하지는못하므로 ) E - ax cat [ Et ] 전환수 ( Turnoer nuber): 효소가기질에포화되어있거나혹은기질의농도가효소에비해매우높을때 ([]>>[Et]), 단위시간 ( 초 ), 단위효소농도 ( 몰 ) 당생성물로전환되는기질의몰수이다 : ( 기질 ol) // (s* ol enzye) E 2 ax [ E t ] cat
Question on turnoer nuber. 5.5 ug of enzye (Mr 30,000 gies a Vax of 3 uol product produced per inute.. What is the turnoer nuber for this enzye? 2. What is the turnoer nuber if the enzye is trieric with 3 identical subunits? 3. What is the turnoer nuber if the enzye is dieric with 2 nonidentical subunits? What is the turnoer nuber if 3 ug enzye gae a Vax of 3 uol/in.?
Turnoer Nubers and K M Table 5.2 Values for soe typical enzyes Enzye Catalase Carbonic anhydrase Acetylcholinesterase Function Conersion of 4 x 0 7 25 H 2 O 2 to H 2 O + O 2 Hydration of CO 2 x 0 6 2 Regeneration of ace tylcholine.4 x 0 4 9.5 x 0-2 Chyotrypsin Proteolytic enzye.9.x 0 2 6.6 x 0 - Lysozye Hydrolysis of bacterial ce ll wall polys accharides Turnoer nubr [(ol )?ol E) - 븉 - ] K M (ol 뷿 iter - ) 0.5 6 x 0-3
MM 식의반응차수 :2 nd, st, 0 th orders 기질의농도가낮을떄, [], 의일차식 [ ] K 2[ Et ][ ] 2 [ Et ][] K 이때 [E t ] [E] 이고반응식은 [E] 와 [] 의 2차식이다. cat /K 은유사 2차속도상수이다 : 2[ Et ][] 2[ E][] K K 기질의농도가높을때, MM 식은 [] 의 0 th 차식이다 : ax [ E t [ ] K ][ ] ax [ E t ]
촉매의효율 (Catalytic Efficiency): cat /K cat /K 값은효소가얼마나완벽한가의척도이다 : cat /K 값의최대치는확산한계 (diffusion liit) 이다. ( 효소 (E) 와기질 () 이서로확산해서만나는속도 )
MM Equation 의 plot 방법 ( 쌍곡선 s 직선 ) MM 공식은다음과같이쌍곡선으로그릴수있다 : ax ax [ ] [ ] K K [] 여기서 K 은 ½ ax 값일때의기질농도
Lineweaer-Bur Plot of MM Equation (double reciprocal Plot) MM 식은다음과같이직선형으로그려질수도있다 ( 원하는변수쉽게얻을수있음 ( 양변의역수를취하여 ) : ax [ ] [ ] K [ ] K ax [ ] ax K ax [ ] slope = K M V ax x intercept = - K M V V = K M V ax [] + V ax y = x + b y interce pt = V ax []
효소저해 (Enzye Inhibition) 효소는저해제에의해서활성이억제될수있다. 저해제와효소의활성관계는연구는질병을제어하는약품개발로서의의미도있다 ; 저해제는효소에결합함으로써효소활성을억제한다. 효소와의결합은가역적혹은비가역적이다 ; 가역적저해제 (Reersible inhibitors) 는효소와비공유성결합형태로서로작용한다. 가역적저해제에는 3 가지가있다 : Copetitie inhibitors; ( 경쟁적저해 ) Non-copetitie inhibitors; ( 무경쟁적저해 ) Un-copetitie inhibitors ( 비경쟁적저해 ) 비가역적저해제 (Irreersible inhibitors) 는효소와공유결합을통해서결합한다. 비가역적저해제의효소결합은결과적으로유효효소농도의감소를초래한다. 예 ) penicllin coalently react with an essential serine residue in the actie site of glycoprotein peptidase,an enzye that acts to cross-lin the peptidyglycan chains during synthesis of bacterial cell walls.
효소저해 (Enzye Inhibition) Reersible inhibitor: (a)copetitie inhibitor: binds to the actie (catalytic) site and blocs access to it by substrate (b)noncopetitie inhibitor: binds to a site other than the actie site; inhibits the enzye by changing its conforation. Actie site 기질결합에상관없이결합. -- (c)uncopetitie inhibition 오직 E coplex 에만 "I" 결합 Reersible inhibition Irreersible inhibitor: a substance that causes inhibition that cannot be reersed. Usually inoles foration or breaing of coalent bonds to or on the enzye.
Copetitie Reersible Inhibitors 기질과 inhibitor 가경쟁 ( 농도경쟁 ) E I K I EI K - [ ] K E ax [ ] ( [ I] ) K I 2 E P K increases ax unchanged / +inhibitor ax lope=k / ax lope= K (+[I]/K I )/ ax K K ( +[I]/K I ) [] -/K / ax -/(K (+[I]/K I )) /[]
Copetitie Reersible Inhibitors 기질과 inhibitor 가경쟁 ( 농도경쟁 ) E I K - E 2 K I E P K I- K I EI E + I <----> EI ; Ki ( 해리상수 ) K I- Ki = [E][I] / [EI] = KI - /K I [EI] = [E][I] / K i ---() teady-state 에서 d[e]/dt = 0 = [E][] - - [E] - 2[E] 이고,-(2) 효소총량은, [E] = [Et] - [E] - [EI]-- (3) 이다. ()-->(3) 으로대입, [E] = [Et] - [E] - [E][I] / Ki [E] + [E][I] / Ki= [Et] - [E] ;
Copetitie Reersible Inhibitors 앞에서, [E] + [E][I] / Ki= [Et] - [E] ; [E] 로묶으면, [E] { + [I]/Ki} = [Et] - [E] [E] = ([Et] - [E])/( +[I]/Ki) ---(4) (4)-->(2) 로대입, d[e]/dt = 0 = *(([Et] - [E])/( +[I]/Ki))*[] - -[E] - 2[E] [E] 로정리하면, [E] = [] [Et] / *{[] + (+[I]/Ki)*(- + 2)}, 으로나누면, [E] = [] [Et] / {[] + (+[I]/Ki)*(- + 2)} = [] [Et] / {[] + (+[I]/Ki)*(- + 2)/} 여기서, = (- + 2)/ 이고, = 2[E] 이므로, 경쟁적저해제 (copetitie inhibitor) 존재시의효소반응속도, 는 = 2*[] [Et] / {[] + (+[I]/Ki)*} 이다.
Copetitie Reersible Inhibitors 다시쓰면, = K2*[Et][] / {[] + KM'} = Vax[] / {[] + KM'} ---(5) (KM' = (+[I]/Ki)*) (Michaelis-Menten 식과거의유사함 ) [ ] K ax [ ] ( [ I] ) K I 여기서, [I] = 0 --> KM' = K [I] > 0 ---> KM' > K; [I] < 0 --> KM' < K (x).
Copetitie Reersible Inhibitors (5) 식을 double reciprocal plot 으로표시하면, / = /ax + (KM'/ax)*(/[]) (KM' = (+[I]/di) = (/di)*[i] + ) No inhibition V = K M V ax + V ax y = x + b [ ] K ax [ ] ( [ I] ) K I In the prese nce of a copetitie inhibitor V = K M V ax + [I] K I + V ax y = x + b
Copetitie Reersible Inhibitors slope = K M V ax x intercepts + [I] K I V - - K M K M + [I] K I Copetitie inhibition y interce pt = [] No inhibition slope = V ax K M V ax K M 변화 ; Vax 불변
Noncopetitie Reersible Inhibitors E I K I EI - E I K I EI 2 ] [ ] K E ( [ ax K unchanged ax decreases / P [ I] ) K I +inhibitor ax V ax /(+[I]/K I ) (+[I]/K I )/V ax lope=k / ax lope= K (+[I]/K I )/ ax K K [] -/K / ax /[]
Noncopetitie Reersible Inhibitors because the inhibitor does not interfere with binding of substrate to the actie site, K M is unchanged increasing substrate concentration cannot oercoe noncopetitie inhibition y = x + b In the prese nce of a noncopetitie inhibitor V No inhibition = V = K M V ax K M V ax + [I] K I + V ax + V ax ] [ ] K + [I] K I ( [ ax [ I] ) K I y = x + b
Noncopetitie Reersible Inhibitors slope = y intercept = K M V ax V ax + [I] K I + [I] K I x intercept y intercept = V Noncopetitie inhibition No inhibition K slope = M V ax V ax - K M [] 은불변, ax는 Vax'(=ax/(+[I]/di)) 으로감소
Uncopetitie Reersible Inhibitors E E 2 E P - I K decreases ax decreases lope unchanged K I EI [ ] ] K ( K I ( ) [ I] [ ax K I ) [ I] ax / +inhibitor lope=k / ax K /(+ K I /[I]) K V ax /(+K I /[I]) [] (+ K I /[I])/V ax lope= K / ax -/K - (+ K I /[I])/K / ax /[]
Mixed Inhibitions / +inhibitor lope=k / ax -/K / ax /[] / +inhibitor lope=k / ax -/K / ax /[]
uary : Inhibitors Copetitie inhibition - 저해제 (I) 는 E 가아니라 E 에결합 Noncopetitie inhibition 저해제 (I) 는 E 와 / 혹은 E 에결합 Uncopetitie inhibition - 저해제 (I) 는 E 가아니라 E 에결합. ( 이것은가상적상황으로실제관측되지는않지만경쟁적저해와대조해서비교하기는효과적이다.) Mixed inhibition- 저해제 (I) 의 E 와 E 에대한해리상수가다름. 저해방법이서로섞임.
Exercise What is the /V ax ratio when []=5K? [ ] ax [ ] K ax [ ] [ ] K 5K 5K K 5 6 Draw a Lineweaer-Bur plot if V ax =00 ol/l, K =2M. Draw the new lineweaer-bur plot on the sae plot as aboe if a copetitie inhibitor is added. [I]=0.5 M, K I =M. In the prese nce of a copetitie inhibitor V = y = K M V ax + [I] K I x + V ax + b [ ] K ax [ ] [ I] ( ) K I
Exercise 2 다음반응에대하여답하시오. 2 E + ----> E -----> E + P <---- <---- - -2 = 0 9 M - s -, - = 0 5 s -, 2 = 0 2 s - ; -2 = 0 7 M - s -, [E] t =0.nM a) K? b) V ax? c) cat :? d) initial elocity ([]o = 20 μm) : e) = d인가설명해보시오. [ ] E 2 K t [ ] 2Et ax ax K K 2
Exercise 3 -Michaelis-Menten 식을유도하고 double-reciprocal plot 을그려보라. -Hyperbolically 반응하는효소에서 0% V ax ( 0. ) 일떄와 90% V ax ( 0.9 ) 일때의기질의농도 ([]) 를 K 으로표시하고 0.9 / 0. 을구하라. (b) (5 점 ) Hill coefficient 가 2 일때 (n=2) 는 0.9 / 0. 값은얼마인가? (c) (0 점 ) 이두값의차를 allosteric 효소의조절관점에서설명해보라 ( 이문제는 6 장을배운후풀것!) - 다음의초기효소반응속도자료를참고해서대답하시오. [](μol/l) V(μol/L)in - 5 22 0 39 20 65 50 02 00 20 200 35 500 47 ) Lineweaer-Bur 그래프를그려서 Vax 와 K 을추정하시오. b) 만약효소의총농도가 nol/l 이면, Kcat 값은? pecificity constant 값은? d) 이효소는꽤효율적이라할수있나? 설명하라.
Exercise 4 저해제 A의존재시다음의효소반응자료를참고해서답하시오. V (oll - in - ) ------------------------------------------- [](ol/l) no inhibitor inhibitor A.25.72 0.98.67 2.04.7 2.50 2.63.47 5.00 3.33.96 0.00 4.7 2.38 a) 저해의종류는? 그래프를그려서이유를설명하시오. b) 저해제가있을때와없을때각각의 KM 과 VMAX 값들을구하시오. In the prese nce of a copetitie inhibitor V = K M V ax + [I] K I + V ax y = x + b
Question on turnoer nuber. 5.5 ug of enzye (Mr 30,000) gies a Vax of 3 uol product produced per inute.. What is the turnoer nuber for this enzye? 2. What is the turnoer nuber if the enzye is trieric with 3 identical subunits? 3. What is the turnoer nuber if the enzye is dieric with 2 nonidentical subunits? What is the turnoer nuber if 3 ug enzye gae a Vax of 3 uol/in.?
Answer..5 ug = 5 x 0-5 uol enzye = Et. Vax = 3 uol/in ; Vax = Kcat x Et and cat = Vax / Et = turnoer nuber = 3 / 5 x 0-5 = 0.6 x 05 uol/in/uol = 000 uol/sec/uol turnoer nuber = 000 sec- 2. if trieric, ol of enzye = 3 ol of catalytic site therefore turnoer nuber per catlaytic site = 000 / 3 = 333 sec- 3. if dieric with nonidentical subunits Mr per catalytic site = 30,000 and turnoer nuber/catalytic site = 000 sec- 4. 3 ug enzye gies Vax = 3 uol/in. -twice as uch enzye gies sae Vax therefore: Vax per ol of enzye is half that of the original question and turnoer nuber = 500 sec-
Calculate the cat of Enzye, gien the following data. Vax = 40,000 μoles/sec, in an assay ixture of L Aount of enzye used in one assay ( L) = 5 μl of a g/l solution of enzye MW of the enzye = 50,000 g/ol K of the substrate = 3 M Kcat= V ax /E t E t is the concentration of enzye in oles/l. You start with 5µL of a g/l solution of enzye, and dilute this in L. What is the concentration now in ters of g/l? What is that concentration when you conert it to oles/l?
다음자료를보고물음에답하시오. 단저해제의농도는 5M 이다. 단위명시!!!. a) V s [], /V s /[] 그림을그리시오. b) 저해제가없는경우의 K 과 Vax 를구하시오. c)a, B 의경우저해의종류는? 이유는? d)a, B 의각경우저해제의 Ki 값을구하시오. [] Vo A:Vo B: Vo M (Ms - )*0 7 (Ms - )*0 7 (Ms - )*0 7 0.33.65.05 0.80 0.40.86.2 0.89 0.50 2.3.43.02 0.66 2.49.74.9.0 2.99 2.22.43 2.0 3.72 3.08.79 In the prese nce of a copetitie inhibitor V = K M V ax + [I] K I + V ax y = x + b
다음자료를보고물음에답하시오. 단저해제의농도는 5M 이다. 단위명시!!!. a) V s [], /V s /[] 그림을그리시오. b) 저해제가없는경우의 K 과 Vax 를구하시오. c)a, B 의경우저해의종류는? 이유는? d)a( 경쟁 ), B( 비경쟁 ) 의각경우저해제의 Ki 값을구하시오. [/] /Vo A:/Vo B: /Vo M- (M - s)*0-7 (M - s)*0-7 (M - s)*0-7 3.0 0.606 0.952.26 2.5 0.538 0.826.2 2.0 0.469 0.699 0.980.5 0.400 0.575 0.840.0 0.334 0.450 0.699 0.5 0.269 0.325 0.559 K = 0.67M, Vax = 5.0*0-7 Ms -, x: 교점 : /(K(+[I]/i)) = 0.67M [I]=5uM- i = um Y intercept : 0.42*07Ms- = ( + I/i)/Vax i = 9.uM