Multiple Reaction Monitoring (MRM) 을이용한고효율단백질정량 응용자료 저자 Ning Tang, Christine Miller, Joe Roark, Norton Kitagawa, Keith Waddell Agilent Technologies, Inc. Santa Clara, CA USA 이자료는 2009 년 57 회 ASMS 질량분석컨퍼런스에서포스터발표를통해전시되었습니다. 과학컨퍼런스에서포스터발표된연구는상용화되기전의기기또는제품의결과를포함할수있습니다. 개요 Multiple Reaction Monitoring(MRM) 을이용한정량 Proteomics는바이오마커검증을위한중요한방법으로떠올랐습니다. 삼중사중극자 (QQQ) 질량분석기의 MRM은복잡한샘플내표적펩티드에대해우수한감도와선택성을제공합니다. MRM은또한정량에서의높은정밀성과빠른스캔속도를제공하기때문에고효율방식의바이오마커검증에이상적인기술입니다. 이응용자료에서는애질런트테크놀로지스가제공하는 MRM 및통계분석소프트웨어를함께이용하는바이오마커검증의전체워크플로를기술하고있습니다. Agilent Q-TOF 및 Spectrum Mill MRM selector를이용해수천가지의펩티드전이 (transition) 를생성하였습니다. 전이리스트는다이나믹 MRM 기능이장착된 MassHunter Acquisition 소프트웨어로불러오기하여한번의 LC/MS 실행내에서모니터링하였습니다. 마지막으로, MRM 정량결과는주성분분석 (PCA), 계층적군집분석및 ANOVA 분석을위해 Mass Profiler Pro를이용하였습니다.
소개 Multiple reaction monitoring (MRM) 을이용한펩티드정량은바이오마커검증을위한중요한분석법으로확립되어왔습니다. 정량 Proteomics 에서는종종각샘플당수백개의표적펩티드를모니터링하고, 수천개의생물학적샘플을분석해야하기때문에높은처리량을필요로합니다. 다이나믹 MRM 알고리즘은시스템으로하여금오직각펩티드용리시머무름윈도우내에서만전이이온데이터를수집하도록합니다. 이는동시적이온전이의개수를줄임으로써정량성능과감도를향상시킵니다. 본연구에서는바이오마커발굴부터검증에이르는전체워크플로우를시연하기위해인간혈장에각기다른농도의과산화효소 (peroxidase) 를첨가하였습니다. 피크존재비의재현성및 nanoflow 범위에서의머무름시간재현성은 443, 2,000 및 3,293 개의이온전이에대하여 nanoflow LC/MS 시스템에서다이나믹 MRM 분석법으로검토하였습니다. 실험 시료전처리 인간혈장샘플은 Sigma(St. Louis, MO) 에서구입하였습니다. 샘플은표준프로토콜에따라 Hu-14 immunoaffinity 컬럼 ( 애질런트 ) 을이용해 14 개의다량존재단백질 (high abundant proteins) 을제거하였습니다. 그다음, 샘플을 bicarbonate 용액으로완충액교환하고, 환원시키며, 알킬화 (IAA) 한뒤, 변성조건하에서트립신으로소화하였습니다. 호스래디시과산화효소 (HRP) 는 Sigma(St. Louis, MO) 에서구입후, 환원및알킬화한뒤트립신으로소화하였습니다. 과산화효소소화액을인간혈장소화액 0.5µg 당 500amol(A) 또는 5fmol(B) 로첨가하였습니다. LC/MS 분석 전자분무 LC/MS 에서는크로마토그래피의용리부피가적을수록피크높이가향상되어더우수한감도로이어집니다. 이를위해 nanoflow LC/MS 를위한독보적인미세유체 Chip, 즉 HPLC-Chip 을개발하여샘플농축, 분리컬럼, 마이크로밸브및 nanospray 팁을생체에적합한폴리아미드 Chip 내에서통합하였습니다. 이장치를 Triple Quadrupole 질량분석기와연결하면사용이쉽고, 믿을수있는고감도 LC/MS 분석을할수있습니다. 이작업을위해 HPLC-Chip 을 Agilent 6410 Triple Quadrupole(QQQ) LC/MS 및 Agilent 6520 Accurate-Mass Quadrupole Time-of-Flight (Q-TOF) LC/MS 와연결하였습니다. HPLC-Chip 파라미터 : Chip 및컬럼 : 150 x 0.075mm 분석컬럼과 40nL 농축컬럼으로구성된단백질 ID Chip 시료로딩 : 서로다른양의과산화효소소화물을첨가한인간혈장소화물 0.5µg 주입량 : 1µL 유량 : 300nL/ 분분석펌프, 3µL/ 분로딩펌프. 이동상 : A. 0.1% formic acid(fa), B. 90% acetonitrile(acn), 0.1% FA. 그레디언트 : 0 분에 3% B, 3 분에 10% B, 8 분에 12% B, 42 분에 30% B, 45 분에 45% B, 50 분에 70% B, 55 분에 90% B, 55.1 분에 3% B. 정지시간 : 60 분 사후시간 : 10 분 MS 조건 : 건조기체 : 5mL/ 분, 325 C 충돌에너지 : 기울기 3.6, 오프셋 -4.8 캐필러리전압 : 1,800V 2
소프트웨어 Agilent Spectrum Mill MS Proteomics Workbench 를이용한 SwissProt 데이터베이스에서 Q-TOF 데이터를검색하였습니다. Spectrum Mill 내의새로운도구인 MRM Selector 를이용하여 Q-TOF 데이터베이스검색결과에기반을둔다이나믹 MRM 분석법을직접생성하였습니다. LC/MS 분석후결과는 MassHunter Quantitative Analysis 소프트웨어를이용해분석하였습니다. 여기에서획득한 quant 배치보고서 XML 파일을질량분석데이터용으로특별설계된계량분석화학소프트웨어패키지인 Mass Profiler Professional 소프트웨어로불러들였습니다. 첨가된펩티드의특성은주성분분석 (PCA) 분석을통해인간혈장펩티드의관점에서분석하였습니다. 또한나이브 (naïve) 계층적군집분석을수행하였습니다. 결과및토의 바이오마커검증워크플로우는그림 1 에묘사되어있습니다. 첫단계에서샘플은데이터종속적 MS/MS 모드의 HPLC-Chip/ Q-TOF 에서분석하였습니다. HPLC-Chip 은 5 회반복주입의 BPC(base peak chromatograms) 오버레이 ( 그림 2) 가보여주듯이우수한재현성을나타냈습니다. 그림 1. 바이오마커검증워크플로우 3
1 단계 : Q-TOF 그림 2. HPLC-Chip/Q-TOF 의감손된 (depleted) 인간혈장트립신소화물 5 회반복분석으로부터의 BPC 오버레이. 샘플은단백질식별을위한데이터종속적 MS/MS 모드내에서분석됨 2 단계 : Spectrum Mill Q-TOF 데이터는 Spectrum Mill 을이용해검색하였습니다. 다이나믹 MRM 리스트는입증된펩티드결과에기반을둔 MRM Selector 를이용해생성하였습니다. MRM Selector 는사용자로하여금 MS/MS 실험데이터로부터 MRM 전이를선택할수있도록해주는 Spectrum Mill Workbench 의유용한도구입니다. 사용자는여러파라미터 ( 아래에정리 ) 를입력하여 QQQ 에서모니터링하기위한이온전이들을필터링할수있습니다. MRM Selector 결과에는단백질서열등록번호와펩티드시퀀스, 이온전이값, 머무름시간 (RT), 피크너비, 충돌에너지및 fragmentor 값등이포함되어있습니다. 저장된리스트는 QQQ 수집소프트웨어에직접붙여넣기할수있습니다. 그림 3. MRM Selector 는 Q-TOF 발굴데이터로부터다이나믹 MRM 분석법을생성함 MRM Selector 파라미터 : 단백질당펩티드수 펩티드당생성이온수, 위의전구이온및 y-이온선택 펩티드점수및 %SPI 필수 AA 및허용되지않는 AA 펩티드등전점 (pl) 단백질서열등록번호 4
3 단계 : QQQ 수백에서수천개의이온전이다이나믹 MRM 리스트를 QQQ 수집분석법으로불러왔습니다. 주기시간은하나의피크전체에걸쳐최소 15 개의데이터포인트를얻도록설정하였습니다. 이온전이의수가증가할때의 MS 및 RT 의재현성을평가하기위해, MRM Selector 를사용하여각분석법당 443, 2,000 및 3,293 개이온전이에대한 4 회의다이나믹 MRM 실험을설정하였습니다. 이온전이모니터링을위한머무름시간 (RT) 윈도우또한 1~2 분사이에서변화하여, 이에따라최소측정시간 (dwell time) 및최대동시 MRM 수또한다르게나타났습니다. 12 개과산화효소펩티드전이에대한 MS 감응및 RT 의상대표준편차 (RSD) 를계산하여표 1 에정리하였습니다. MS 감응의 %RSD 가 5% 미만, RT 의 RSD 는 60 분분석에서 0.04 분미만이었습니다. 그림 4. 다이나믹 MRM 분석법의예 그림 5. 다이나믹 MRM 을이용하여단일분석으로얻어진 2,000 개의 MRM 크로마토그램오버레이 그림 6. 과산화효소펩티드의 MRM 크로마토그램오버레이가머무름시간및 MS 감응의탁월한재현성을보여줌. M: 인간혈장매질 ; A: 인간혈장에첨가된 500amol 과산화효소 ; B: 인간혈장에첨가된 5fmol 과산화효소 # MRM RT 윈도우 주기시간 최소측정 (dwell) 최대개수 % RSD RSD RT ( 분 ) (ms) (ms) 동시 MRM 면적 ( 분 ) 443 2 1,000 16.5 50 2.5 0.038 443 1 1,000 29.83 30 3.2 0.016 2,000 2 1,000 2.75 160 4.5 0.030 3,293 1 1,050 2.18 185 4.7 0.025 표 1. MS 감응및 RT 재현성 5
4 단계 : MassHunter Mass Profiler Pro Mass Profiler Professional 은강력한통계및수학적모델을결합하여쉽게샘플그룹을분류, 비교, 분석함으로써복잡한 MS 데이터세트를분석할수있습니다. 그림 7 은모든샘플에걸친 443 개이온전이의존재비를보여줍니다 (3 개의 B 샘플, 3 개의 A 샘플및 2 개대조샘플 ). 각라인은 1 개의이온전이를나타내며, 색깔은이온전이의상대적강도를보여줍니다 ( 붉은색은높은수준, 회색은낮은수준 ). 과산화효소에서유래한 4 개의펩티드이온전이를녹색으로하이라이트처리하였습니다. 443 개존재비의평균 ( 검은색 ) 은혈장에서유래한펩티드가샘플마다다르지않음을보여주기위해표시하였습니다. 주성분분석 (PCA) 은비지도방식 (unsupervised, 그룹할당을알지못한상태에서분류 ) 또는지도방식 (supervised, 분석전반드시그룹분류필요 ) 으로그룹간차이를알아내는데사용할수있습니다. 그림 8 에서보이듯과산화효소가첨가된혈장 2 개의농도가모두대조샘플혈장과명백하게구분되었습니다. 샘플그룹에의한군집분석은성분존재비프로파일유사성에기반하여관계를조직합니다. Mass Profiler Professional 의계층적군집분석으로생성한수형도 ( 트리다이어그램 ) 는한차원의질량성분간관계및다른차원의샘플간의관계를보여줍니다. 그림 9 에서는다른과산화효소농도의기술적반복분석이계층적군집분석을이용하여올바르게그룹화되었습니다. 그림 7. 443 이온전이의모든샘플에걸친존재비의프로파일. 과산화효소의 4 개펩티드는녹색으로하이라이트처리. 443 개존재비의평균 ( 검은색 ) 은혈장에서유래한펩티드가샘플마다다르지않음을보여주기위해표시하였음 그림 8. 다른샘플들에대한 PCA 분석. 서로다른과산화효소농도의샘플이올바르게그룹화됨 6
결론 Q-TOF 발굴에서부터 QQQ 검증까지의완전한바이오마커워크플로우를인간혈장의첨가 (spike-in) 연구를이용하여시연하였습니다. Q-TOF 발굴데이터로부터얻어진단백질데이터베이스검색결과를 Spectrum Mill 에서개발된새로운도구, MRM Selector 를통해다이나믹 MRM 분석법을생성하는데사용하였습니다. 이다이나믹 MRM 분석법은수백에서수천개에이르는펩티드를한번의 LC/MS 실행안에서모니터링하면서도 MS 존재비와머무름시간에서여전히우수한 RSD 를제공하였습니다. Mass Profiler Professional 소프트웨어는샘플간유의한차이의확인을위한정량결과의계량분석화학적분석을가능하게하였습니다. 탁월한재현성의 HPLC- Chip/MS 시스템은생체분자에대한고효율및고감도분석의핵심요소입니다. 그림 9. 계층적군집분석이다른과산화효소농도의샘플을성공적으로군집화함. 그림 8 에서와같이, 수형도가지에색상으로과산화효소농도를표시하는조건이생성되었으며펩티드특징이각열에레이블됨. 열지도는푸른색에서붉은색의색깔로표현되었으며, 푸른색은낮은존재비, 붉은색은높은존재비를나타냄. 모든특징의전체보기는왼쪽에, 확대보기는오른쪽에있음 화합물보정 p 값 p 값머무름시간 과산화효소 _DTI 0 0 15.952 과산화효소 _GFP 0 0 16.999 과산화효소 _YYV 0 0 14.034 과산화효소 _SSD 0 0 19.595 표 2. 분산분석. 농도에대한일원분산분석 (one-way ANOVA) 을펩티드존재비에대해수행. Benjamini-Hochberg 다중검정보정을적용하였으며, 추가적으로배율변화 (fold change) 5.0 필터를리스트에적용함. 4 개과산화효소펩티드는각각 0.0 의보정 p 값을나타냄 7
www.agilent.com/chem/proteomics 이아이템은연구용으로만사용하실수있습니다. 진단용도로는사용하실수없습니다. 이발행물의정보, 설명및사양은사전공지없이변경될수있습니다. 애질런트테크놀로지는이발간물에포함된오류나이발간물의제공, 이행또는사용과관련하여발생한부수적인또는결과적인손해에대해책임을지지않습니다. Agilent Technologies, Inc. 2009 2009 년 9 월 10 일, 한국에서발행 5990-4276KO 서울시용산구한남대로 98, 일신빌딩 4층우 )04418 한국애질런트테크놀로지스 ( 주 ) 생명과학 / 화학분석사업부고객지원센터 080-004-5090 www.agilent.co.kr