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의학박사학위논문 췌장암에서 Emodin 및 Inflexinol 과 Gemcitabine 병합요법의효과 Effects of Combination Therapy with Emodin, Inflexinol and Gemcitabine in Pancreatic Cancer 2013 년 2 월 서울대학교대학원 임상의과학과박사과정 안동원

A thesis of the Degree of Doctor of Philosophy Effects of Combination Therapy with Emodin, Inflexinol and Gemcitabine in Pancreatic Cancer 췌장암에서 Emodin 및 Inflexinol 과 Gemcitabine 병합요법의효과 February 2013 The Department of Clinical Medical Sciences, Seoul National University College of Medicine Dong-Won Ahn

췌장암에서 Emodin 및 Inflexinol 과 Gemcitabine 병합요법의효과 지도교수김병관 이논문을의학박사학위논문으로제출함 2012 년 10 월 서울대학교대학원 임상의과학과 안동원 안동원의의학박사학위논문을인준함 2012 년 12 월 위원장 ( 인 ) 부위원장 ( 인 ) 위 원 ( 인 ) 위 원 ( 인 ) 위 원 ( 인 )

Effects of Combination Therapy with Emodin, Inflexinol and Gemcitabine in Pancreatic Cancer by Dong-Won Ahn, M.D. A thesis submitted to the Department of Clinical Medical Sciences in partial fulfillment of the requirements for the Degree of Doctor of Philosophy in Clinical Medical Sciences at Seoul National University College of Medicine December, 2012 Approved by Thesis Committee: Professor Professor Professor Professor Professor Chairman Vice chairman

초 록 서론 : 췌장암에대한표준치료제인 gemcitabine 의낮은반응률을 극복하기위해최근에는다양한천연화합물을병합하고자하는 시도가이루어지고있다. 그중 emodin 과 inflexinol 은각각 survivin 과 NF-κB 의억제를통해종양세포의증식을억제하는 효과가있을것으로기대되고있으나 inflexinol 의췌장암에서의 항암효과에대해서는아직밝혀진바가없다. 본연구에서는 췌장암에서 emodin 및 inflexinol 과 gemcitabine 병합요법이 항암효과에미치는영향에대해서연구해보고자하였다. 방법 : 췌장암세포주 (Panc-1, MiaPaCa-2) 에 gemcitabine 과 emodin, inflexinol 을병합투여하여세포증식및세포자멸사에 미치는영향을측정하고, 그기전을살펴보기위하여관련된 단백질의발현의변화를측정하였다. 췌장암동물모델에서도 병합치료의종양억제효과와기전을측정하였다. 결과 : 췌장암세포주에서 gemcitabine 과 emodin, inflexinol 의 병합투여는 survivin 과 NF-κB 의억제와 Bax 의활성화를 통하여세포증식을억제하고세포자멸사를촉진시키는효과를 보였다. 또한췌장암동물모델에서도병합투여는같은기전을 i

통해종양증식을억제하는효과를보였다. 하지만, gemcitabine 과 emodin, inflexinol 세가지약제의병합투여는 gemcitabine 에 emodin 또는 inflexinol 을병합한두가지약제의병합투여에 비해더많은종양증식의억제효과를보이지는못했다. 결론 : 췌장암에서 emodin 및 inflexinol 과 gemcitabine 병합요법은 survivin 과 NF-κB 의억제와 Bax 의활성화를통하여항암효과를 증진시키는효과를보였다. ---------------------------------------------------------------------------------------------- 주요어 : 췌장암, gemcitabine, inflexinol, emodin, NF-κB, survivin 학번 : 2011 30642 ii

목 차 초록... i 목차... iii 표및그림목록... iv 서론...1 실험재료및방법...4 결과...12 고찰...33 참고문헌...37 초록 ( 영문 )...43 iii

표및그림목록 그림 1...14 그림 2...15 그림 3...16 그림 4...19 그림 5...20 그림 6...24 그림 7...26 그림 8...28 그림 9...30 그림 10...32 iv

서론 췌장암은매우침습적인악성종양으로예후도매우불량하여생존기간이평균 6 개월에불과한것으로알려져있다 (1). 진단당시이미진행된경우가많아수술적치료를받을수있는경우는 15-20% 에불과하며, 이중약 20% 만이 5년까지생존할수있다 (2). 수술적으로제거할수없는국소진행암이나전이암의경우치료는고식적인목적으로방사선치료나항암치료를시행하고있다. 현재까지췌장암의전신적치료의표준요법은 gemcitabine을이용한항암화학요법이나반응률이 20% 미만이고생존율의연장이수개월에불과한것으로알려져있다 (3). 그러므로, 췌장암의치료성적을향상시키려면조기진단과함께항암치료에대한낮은반응률을극복하는것이요구된다. 분자생물학의눈부신발전으로췌장암은여러가지유전자의변이가비교적잘밝혀져있으며, 각종발암유전자와종양억제유전자가대부분의췌장암에서관여하는것으로알려져있다. 이러한분자생물학적특성을이용하여최근췌장암에서는 matrix metalloproteinase inhibitor (Bay 12-9566) (4), farnesyltransferase inhibitor (tifipanib) (5), anti-epidermal growth factor monoclonal antibody (cetuximab) (6) 등의분자생물학적치료제와 gemcitabine 과의병합요법이시도되었지만생존율의향상은현재까지입증되지못하고있다. 반면에자연에존재하는천연물중암예방효과및항암효과가있다고알려진물질을이용한연구가시도되고있으며기존의항암제와병합하는 1

실험도진행되고있다. 그중 Rheum palmatum에서추출한자연산의 anthraquinone derivative로알려진 emodin은여러종양세포에서세포의증식을억제하는것으로알려져있으며 (7-10), 또한, 세포의증식과세포자멸사, 종양세포의침윤및전이와관련된유전자를조절하는것으로알려져있다 (11-16). 또한, 항암효과가있다고알려진천연물로최근제시되고있는것이오리방풀이라고불리는 Isodon excisus에서추출한 kaurane diterpenoid 화합물중하나인 inflexinol 이다 (17). Isodon 속의식물에서여러가지종류의 kaurane diterpenoid 화합물이추출되고있는데, 이들은여러연구들에서세포자멸사를유도하고 (18) NF-κB의작용을억제하는것 (17,19) 으로알려져있다. NF-κB는최근연구들을통해특유의신호전달체계를통해종양의진행과정에긴밀히관여하는것으로알려져있어 (20,21), kaurane diterpenoid 화합물이 NF-κB의억제를통한잠재적인항암효과를가지고있을것이라는가정을할수있게된다. 대장암세포주를이용한 in vivo 및 in vitro 연구에서 inflexinol의투여가 NF-κB 활성의억제를통해세포증식을억제하고세포자멸사를유도하며대장암동물모델에서도종양의증식을억제할수있음이보고되었다 (22). 이연구는 inflexinol의종양세포에대한효과를입증한유일한연구로췌장암을대상으로한연구는아직없으며, 더욱이기존치료제인 gemcitabine과병합하였을경우의병합효과에대한연구또한없는실정이다. 따라서, 본연구에서는첫째, 췌장암에서 gemcitabine에 inflexinol를병합투여할경우부가적인항암효과가있는지를 2

살펴보고, 둘째, 예전의연구를통해효과가있음이밝혀진 gemcitabine과 emodin 병합요법에 inflexinol을추가적으로병합할경우부가적인항암효과가있는지를살펴보고자한다. 그리고, 셋째, 만약부가적인항암효과가있다면그기전에대해서도규명하고자한다. 3

실험재료및방법 췌장암세포주의배양과수확 췌장암세포주로 Panc-1, MiaPaCa-2 세포주를서울대학교의과대학암연구소에서구입한다. 10% 우태아혈청 (fetal bovine serum) 을포함한 Dulbecco s modified Eagle s medium (DMEM) 배양액 10 ml을배양용기 (10 cm culture dish, Falcon, Franklin Lakes, New Jersey, USA) 에넣고 5% 농도의이산화탄소가유지되는 37 o C의배양기에서배양하였다. 세포의밀도가배양용기의 80% 이상이되면세포를수확하여 Nunc plate (Nunc company, Rochester, New York, USA) 에분주하였다. 배양용기의배양액을버리고우태아혈청으로세척후트립신- EDTA 용액을 2 ml 넣고세포가배양용기에서떨어진것을육안으로확인한후원뿔형원심분리관에넣고원심분리하여상층액을버리고침전물에 10% 우태아혈청을포함한 2 ml의 DMEM 배양액을넣고균질화시켰다. 혈구계 (hemocytometer) 를 이용하여세포의농도를측정하여 4 X 10 3 cells/well 농도로 희석하여 96 well plates 에각각분주하고 37 o C 에서 24 시간 배양하였다. 약제재료 Gemcitabine 은 Ely Lilly (Indianapolis, IN, USA) 에서구입하고 4

0.9% 생리식염수로용해하여 50 g/l stock solution 으로보관하였고, emodin은 Sigma (St. Louis, MO, USA) 에서구입하고 dimethylsulfoxide (DMSO) 에용해하여 0.2 mmol/l stock solution 으로보관하였다. Inflexinol은충북대학교약리학교실에서공급받았다. Emodin, inflexinol 과 gemcitabine 에의한세포증식 억제효과측정 췌장암세포주를 96 well 용기에 well 당 5 X 10 3 개분주하고 100 ul 배양액에서 24 시간배양후 emodin 을다양한농도 (10, 20, 40, 80, 160 um) 로넣고 24, 48, 72 시간후 MTS (3-(4,5- dimethylthiazole-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2- (4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium) 방법을이용하여세포증식억제정도를측정하였다. Inflexinol 을다양한농도 (10, 20, 30, 40 um) 로넣고 24, 48, 72 시간후같은방법으로세포증식억제정도를측정하였고, gemcitabine 또한다양한농도 (0.5, 1, 2, 5, 10 um) 로넣고 24, 48, 72 시간후같은방법으로세포증식억제정도를측정하였다. 배양액은 48 시간마다교환하였다. CellTiter 96 AQueous non-reactive cell proliferation assay kit (Promega, Madison, WI, USA) 를사용하는데 MTS/PMS 혼합액을 20 ul 각 well 에분주하고 37 o C, 5% CO 2 환경의 incubator 에서 4 시간배양후 spectrophotometer 를이용하여 490 nm 에서흡광도를 측정하였다. 대조군의흡광도를 1 로하고이에대한상대적인 5

비율을계산하여세포증식억제정도를평가하였다. 72 시간후 20-25% 세포증식을억제하는 emodin, inflexinol 과 gemcitabine 의농도를구하여세가지약물병용투여시 세포증식억제효과를비교하였다. Emodin, inflexinol 과 gemcitabine 에의한 세포자멸사측정 췌장암세포주를 6 well 용기에배양하고 72 시간후에 15%, 30% 세포증식을억제하는 emodin, inflexinol 및 gemcitabine 의농도를 구하여첨가하고 48 시간배양후세포자멸사정도를측정하였다. 부유되어있는세포와 plate 에부착되어있는세포를트립신을 처리하여모으고 FITC-labeled annexin-v assay 를이용하여 phosphatidylserine 의 externalization 을초기세포자멸사의지표로평가하였다. 즉, 트립신처리된검체를윈심분리하여상층액을버리고 annexin V binding 완충액 1 ml 로부유시키고이중 100 ul 를취해 FITC-labeled annexin V (Boehringer Ingelheim Bioproduct Partnership, Heidelberg, Germany) 와 propodium iodide 를차례로첨가하고실온에서 15 분간방치후 annexin V binding 완충액을첨가하여 flow-cytometry 를이용한 FACS 분석 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, Becton, Dickinson and Company, Franklin Lakes, New Jersey, 6

USA) 을이용하여세포자멸사가진행중인세포의비율을 정량화하였다. 단백질의추출과 Western blot 분석 췌장암세포주를 6 well 용기에배양하고 48 시간후에 15%, 30% 세포증식을억제하는농도의 emodin, inflexinol, gemcitabin 을 넣고 48 시간후에용해완충액을이용하여총단백을추출하였다. 용해완충액은 50 mm Tris-HCl, ph 7.4, 1% Nonidet P-40, 0.25% sodium deoxycholate, 150 mm NaCl, 1mM EDTA, 1mM PMSF, 1ug/mL, aprotinin, leupeptin and pepsatin, 1 mm Na3VO4, 1mM NaF 을이용하였다. 4 o C 에서 20 분간세포를용해하고 14,000 g 에서 10 분간원심분리하여단백질을추출하고 BCA protein assay kit 를이용하여 ELISA 방법으로단백질을정량화하였다. 20 μg /lane 의검체를젤에올린다음 12% SDS polyacrylamide gel 에전기영동하였다. 젤을떼어내고니트로셀룰로스막을부착하여 20V, 4 o C 에서하루밤동안전기영동하여단백질을젤로부터니트로셀룰로스막으로전이시켰다. 1X TBS, 0.1% Tween-20, 1% w/v 탈지분유에일차항체를 1:1000 의농도로희석한용액에니트로셀룰로스막을담고실온에서 1 시간동안서서히흔들면서방치한후세척하였다. 세포자멸사와관련된단백질인 survivin, NF-κB, Akt, Bax 에대한항체 (SantaCruz Biotechnology, California, USA) 를일차 7

항체로사용하고, 이차항체로는 HRP (horse radish peroxidase) 접합항묘혹은항마우스 immunoglobulin G 를사용하였다. 이차항체를 1X TBS, 0.1% Tween-20, 1% w/v 탈지분유에 1:2000 으로희석한용액에니트로셀룰로스막을담그고실온에서 1 시간동안서서히흔들면서방치한후 1X TBS, 0.1% Tween-20 용액으로 5 분씩 4 회세척하였다. Amersham enhanced chemiluminescence kit (Amersham Bioscience, New Jersey, USA) 에들어있는용액 1 과 2 를 1:1 로섞은후 blot 위에붓고 1 분간실온에방치하였다. 용액을제거하고공기방울을모두제거한후비닐랩으로씌워즉시카세트에 X-선필름과함께넣고실온에방치한후현상하였다. 실험동물 4주령의수컷 BALB/c 누드마우스를실험에사용하였다 ( 오리엔트바이오주식회사, 경기도, 대한민국 ). 누드마우스는실험시작 1 주전동안 12 시간간격의명암주기를가지고상온으로유지되는사육실에서순응기를갖게하였다. 이기간동안사료나물은자유롭게섭취하도록하였다. 실험동물의관리와실험은서울대학교병원의생명연구원전임상실험부의 IACUC (Institutional Animal Care and Use Committee) 의승인을획득하고시행하였다. 종양세포이식및실험 RPMI-1640 0.1 ml에부유시킨 1 X 10 6 개의 Panc-1 췌장암 8

세포주를마우스의우측배부에피내주사하였다. 주입한종양세포의생착을촉진시키기위해췌장암세포주부유액을 Matrigel (BD Biosciesnces, Bedford, MA) 에 4:6의비율로섞은다음에마우스에주사하였다. 암세포주사 2주후피하종괴가관찰되고촉지되면 25마리마우스들을각각 5마리씩 1개의대조군과 4개의치료군으로무작위로나누어약물의복강내투여를시작하였다. 대조군 ( 제1군 ) 은 normal saline 0.1 ml를, 4개의치료군은 gemcitabine (125 mg/kg), emodin (40 mg/kg), inflexinol (12 mg/kg) 을조합 ( 제2군 : gemcitabine 단독, 제3군 : gemcitabine + emodin, 제4군 : gemcitabine + inflexinol, 제5군 : gemcitabine + emodin + inflexinol) 하여 1주일에두번씩 4주간복강내투여하였다. 매주마다마우스의무게를측정하였고, 종괴의크기를캘리퍼로측정하고다음과같은공식을이용하여종양의부피를측정하였다. 종양부피 = ( 길이 x 넓이 2 ) x π/6. 복강내투여가끝나는 4주째실험을종료하여각군의마우스에서종괴를외과적으로절제한후크기를측정하고일반염색과면역화학염색을위해포르말린에고정한뒤일부신선조직은냉동절편으로보관한후에단백추출및 immunoblot을위해남겨두었다. 면역화학염색및 TUNEL assay 조직은 4 μm 간격으로 microtome을이용하여절개하였다. 종양세포에서 survivin와 NF-κB의발현을평가하기위해 survivin과 NF-κB에대한일차항체를적절히희석해서 9

면역화학염색을시행하였다. Survivin과 NF-κB 발현정도를평가하기위해, 발현된범위에따라 0, +1, +2, +3 (+1: 0-25%, +2: 25-50%, +3: > 50%) 으로구분하였고, 4 μm 두께의조직절편에서 5 개의무작위적현미경시야 (x200) 에서 +2 이상을보인시야의비율을계산해서정량화하였다 (23). 세포자멸사의정도를평가하기위해 TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated deoxyuridine triphosphate nick-end labeling) 염색법을사용하였으며, 4 μm 두께의조직절편에서 10 개의무작위적현미경시야 (x400) 에서 100 개의종양세포당관찰되는 TUNEL 양성종양세포의숫자를세어정량화하였다. 종양조직세포핵단백질추출 절개된조직절편은 30 분동안 0.5 ml ice-cold buffer (10mmol/L Hepes (ph 7.9), 1.5 mmol/l KCl, 10mmol/L MgCl2, 0.5 mmol/l DTT, 0.1% IGEPAL CA-630, and 0.5 mmol/l PMSF) 배양하였다. 절개된절편은 Donce homogenizer를이용하여 4 에서 15 분간원심분리하였다. 정제된핵입자는 200 μll of buffer B [20 mmol/l Hepes (ph 7.9), 25% glycerol, 1.5 mmol/l MgCL2, 420 mmol/l NaCl, 0.5 mmol/l DTT, 0.2 mmol/l EDTA, 0.5 mmol/l PMSF, and 4 μmol/l leupeptidin에띄운후 30 분간얼음에배양하였다. 용해된물질은 4 에서 14,000 rpm으로 15 분간원심분리후 the BCA assay kit 을이용하여측정하였다. 핵단백질의 Anti-Rb immunoblotting은 loading contol으로사용하였다. 10

통계적분석 모든실험과정은세번에걸쳐반복하였으며, 종양의부피를포함한자료는평균 +/-표준오차형태로제시하였다. 시간에따른각군간의종양의부피의차이를분석하기위해 mixed effects model을이용한 repeated measure analysis를시행하였고, 각군간의 TUNEL 양성종양세포비율의비교는 two-tailed Student s t-test for unpaired samples으로시행하였다. P value는 0.05 미만일때통계적으로의미있다고판단하였다. 11

결과 췌장암세포주에대한 emodin 과 inflexinol 의세포증식억제효과 Panc-1 및 MiaPaCa-2 췌장암세포주를각기다른농도 (0-80 um) 의 emodin 과 inflexinol 에 48 시간동안폭로시킨후 MTS assay 를시행하였을때, 농도의존적인세포증식억제 효과가관찰되었다 ( 그림 1). 췌장암세포주에대한 inflexinol 의세포자멸사유도효과 세포자멸사유도효과를살펴보기위하여 Panc-`1 췌장암세포주를 0-60 um 의 inflexinol 에폭로시킨후 FITC-labeled annexin V assay 를시행하였을때용량의존적인세포자멸사유도효과가관찰되었다 ( 그림 2). 세포자멸사관련단백질들의발현양상 MiaPaCa-2 췌장암세포주를 0-60 um 의 emodin 과 inflexinol 에폭로시킨후세포자멸사와관련된단백질의발현 양상을살펴보았을때, 항세포자멸사단백질인 survivin 과 Akt 의 발현은대조군에비해 emodin 처리후농도의존적으로 감소하였으며, 세포자멸사단백질로알려진 Bax 는대조군에비해 12

inflexinol 처리후농도의존적으로증가하였다 ( 그림 3A). Panc- 1 및 MiaPaCa-2 췌장암세포주를 gemcitabine 과 emodin, inflexinol 을병합하여폭로시켰을때에도 survivin 의발현은대조군에비해 emodin 처리군에서감소하였고, Bax 의발현은대조군에비해모든치료군에서증가하였다 ( 그림 3B). Panc-1 세포주를 gemcitabine 과 emodin, inflexinol 을병합하여폭로시켰을때, inflexinol 치료군에서대조군에비해 NF-κB 의활성도가현저하게감소되는소견이관찰되었다 ( 그림 3C). 13

(A) (B) 그림 1. Panc-1 (A) 과 MiaPaCa-2 (B) 췌장암세포주에 emodin 과 inflexinol 을 48 시간동안처리하고 MTS assay 를 시행한결과농도의존적인세포증식억제효과가관찰된다. 14

그림 2. Panc-`1 췌장암세포주에 inflexinol 을처리하고 FITClabeled annexin V assay 를시행한결과용량의존적인 세포자멸사유도효과가관찰된다. 15

(A) (B) (C) 그림 3. Panc-1 과 MiaPaCa-2 췌장암세포주에 emodin 과 inflexinol 을처리한후의세포자멸사와관련된단백질의발현양상. (A) Survivin 과 Akt 의발현은 emodin 처리후농도의존적으로 감소하고 Bax 의발현은 inflexinol 처리후농도의존적으로 증가하는소견이관찰된다. (B) Gemcitabine 과 emodin, inflexinol 을병합하여처리할경우 survivin 의발현은대조군에비해 emodin 처리군에서감소하고 Bax 의발현은대조군에비해 16

모든치료군에서증가하는소견이관찰된다. (C) Gemcitabine 과 emodin, inflexinol 을병합하여처리할경우 inflexinol 치료군에서 대조군에비해 NF-κB 의활성도가현저하게감소되는소견이 관찰된다. 17

췌장암세포주에서 emodin 과 inflexinol 병합요법의세포증식억제효과 Panc-1 췌장암세포주에서각기다른농도의 emodin 10 um, 20 um 을역시여러농도의 inflexinol (0-40 um) 과병합하여전처치한후 48 시간째에 MTS assay 를시행한결과 inflexinol 의농도의존적세포증식억제효과가 emodin 에의하여농도의존적으로증강되었다 ( 그림 4). 췌장암세포주에서 gemcitabine 에의해유발된세포자멸사유도에대한 inflexinol 의영향 Panc-1 및 MiaPaCa-2 췌장암세포주에서각기다른농도의 gemcitabine 5 um, 10 um 을 inflexinol (5 um) 과병합하여전처치한후 FITC-labeled annexin V assay 를시행하였을때용량의존적인세포자멸사유도효과가관찰되었다. Inflexinol 을병합하였을경우 gemcitabine 단독으로투여하였을때와비교하여유의하게높은정도의세포자멸사유도가관찰되었다 ( 그림 5). 18

그림 4. Panc-1 췌장암세포주에 emodin 과 inflexinol 을병합하여처리한후 48 시간후에 MTS assay 를시행한결과 inflexinol 의농도의존적세포증식억제효과가 emodin 에의하여농도의존적으로증강되는효과가관찰된다. 19

(A) (B) 20

그림 5. Panc-1 (A) 과 MiaPaCa-2 (B) 췌장암세포주에 gemcitabine 과 inflexinol 을병합하여처리하고 FITC-labeled annexin V assay 를시행한결과 inflexinol 을병합할경우 gemcitabine 단독으로투여할경우와비교하여유의하게높은정도의세포자멸사유도가관찰된다. 통계적으로유의한차이가있는경우 * 로표시하였다 (P < 0.05). 21

누드마우스를이용한췌장암의이종이식모델에있어서 gemcitabine 의종양증식억제효과에대한 emodin 과 inflexinol 의영향 Panc-1 췌장암세포주를누드마우스에피하접종하여췌장암을유발한후종양의부피변화를측정하여 gemcitabine 과 emodin, inflexinol 병합투여의종양증식억제효과를살펴보았다 ( 그림 6A, B). 그결과치료군 (2-5 군 ) 모두에서대조군 (1 군 ) 에비해통계적으로유의한종양증식억제효과를나타내었고, 시간에따라각군간의종양증식정도의차이가다르게나타났다. 시간별로군간의차이를분석하였을때병합치료군 (3-5 군 ) 에서대조군 (1 군 ) 에비해통계적으로유의한종양증식억제효과를보였고, gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 과비교해도통계적인유의성은 없었으나종양증식억제효과가더큰경향을보였다. 두가지약제를병합한치료군 (3, 4 군 ) 과세가지약제를병합한치료군 (5 군 ) 사이에는종양증식에있어서거의차이를보이지않았다 ( 그림 6A, B). 시간에따른마우스의무게변화를분석한결과각군간에거의차이를보이지않았다 ( 그림 6C). 적출한종양조직에대해면역화학염색을시행한결과 survivin 의발현은 emodin 을병합한군 (3, 5 군 ) 에서 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해감소되어있었고 ( 그림 7A, B), NF-κB 의발현은 inflexinol 을병합한군 (4, 5 군 ) 에서 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해감소되어있었다 ( 그림 8A, B). 22

종양세포의세포자멸사정도를확인하기위해 TUNEL 염색을 시행한결과병합치료군 (3-5 군 ) 에서대조군 (1 군 ) 이나 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해세포자멸사의정도가 유의하게증강되어있었다. 병합치료군 (3-5 군 ) 사이를비교하였을때세가지약제를병합한치료군 (5 군 ) 에서두가지약제를병합한치료군 (3, 4 군 ) 에비해세포자멸사정도가약간높은경향을보였지만통계적인유의성은없었다 ( 그림 9A, B). 세포자멸사와관련된단백질에대하여 Western blot 을시행한결과 gemcitabine 에의해활성화된 survivin 의발현이 emodin 을병합한군 (3, 5 군 ) 에서억제된소견을보였고, gemcitabine 에의해활성화된 NF-κB 의발현이 inflexinol 을병합한군 (4, 5 군 ) 에서억제된소견이관찰되었다. 세포자멸사단백질인 Bax 의발현은병합치료군 (3-5 군 ) 에서증가된소견을보였다 ( 그림 10). 모든실험대상누드마우스는실험시작일부터희생일까지생존하였다. 23

(A) (B) 24

(C) 그림 6. 췌장암세포주를이용한누드마우스모델에서각군에서의 마우스와종양세포의육안적소견 (A) 과시간에따른종양의부피 (B) 및마우스무게 (C) 의변화. Gemcitabine 과 emodin, inflexinol 병합치료시종양증식억제효과가증강되는소견이 관찰된다. 통계적으로유의한차이가있는경우 * 로표시하였다 (P < 0.05). 25

(A) 26

(B) 그림 7. 누드마우스에서적출한종양조직에대한 survivin 면역화학염색소견. (A) 현미경소견 (x200), (B) 각군에서의 survivin 발현비율. Survivin 의발현이 emodin 을병합한군 (3, 5 군 ) 에서 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해감소되어있는소견이관찰된다. G gemcitabine, E emodin, I inflexinol. 27

(A) 28

(B) 그림 8. 누드마우스에서적출한종양조직에대한 NF-κB 면역화학염색소견. (A) 현미경소견 (x200), (B) 각군에서의 NF-κB 발현비율. NF-κB 의발현이 inflexinol 을병합한군 (4, 5 군 ) 에서 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해감소되어있는소견이관찰된다. G gemcitabine, E emodin, I inflexinol. 29

(A) 30

(B) 그림 9. 누드마우스에서적출한종양조직에대한 TUNEL 염색 소견. (A) 현미경소견 (X200), (B) 각군에서의 TUNEL 발현의 정량적소견. 병합치료군 (3~5 군 ) 에서대조군 (1 군 ) 이나 gemcitabine 단독치료군 (2 군 ) 에비해세포자멸사의정도가 유의하게증강되어있는소견이관찰된다. 통계적으로유의한 차이가있는경우 * 로표시하였다 (P < 0.05). G gemcitabine, E emodin, I inflexinol. 31

그림 10. 누드마우스에서적출한종양조직에서단백질을추출해서 시행한 Western blot 소견. Gemcitabine 에의해활성화된 survivin 과 NF-κB 의발현이 emodin 투여 (3, 5 군 ) 와 inflexinol 투여 (4, 5 군 ) 로억제되는소견이관찰된다. Bax 의 발현은병합치료군 (3-5 군 ) 에서증가되는소견이관찰된다. 32

고찰 진행성췌장암치료에서 gemcitabine 투여는표준치료로알려져있지만완전관해는거의이룰수없고생존기간연장효과도미비하여 gemcitabine과다른항암제의병합요법에대한많은임상연구가시도되었다. 그중일부연구에서는 gemcitabine 병합투여군의장점이임상시험을통해입증되고있으나 (24), 아직까지도환자의활동능력이양호해야하며항암제의독성을잘이겨낼수있는환자군에서만유용하며그생존율향상은미비한것으로알려져있다. 따라서, 이러한항암제병합요법의단점을극복하기위해세포독성이작고 gemcitabine의약리효과를증강시킬수있는물질의발견이필요한상황이다. 최근에는자연에존재하는천연물질을통해종양세포의기존의항암제에대한감수성을증진시켜치료효과를얻고자하는새로운방법들이주목을받고있어췌장암에대해서도 flavonoid나 curcumin, guggulsterone과같은천연물질을이용한연구들이시행되어왔다 (25-29). 본연구는그중 emodin과 inflexinol에주목하여이들약제가세포자멸사효과를증진시켜 gemcitabine의항암효과를극대화할수있다는가정하에시작되었고, 연구결과병합요법의효과를입증함으로써, 추후이들병합요법에대한임상연구를위한근거를마련하였다는데에의미가있다고하겠다. Emodin을 gemcitabine과병합하였을경우췌장암에대한항암효과에미치는영향을보고한최근의연구에서 emodin은 survivin level의 down-regulation을통해 gemcitabine의 33

항암효과를증강시킨다고보고하였다 (30). Survivin은세포분열의조절과세포자멸사의억제에관여하는 apoptosis gene family 중하나로다수의악성종양에서발현되는것으로알려져있고 caspase 활성및진행을방해하여세포자멸사를억제하고궁극적으로항암제에대한내성을발현하게하는것으로알려져있다 (31,32). 이연구에서는췌장암세포주에서 gemcitabine에 emodin을병합할경우 gemcitabine을단독투여하는경우보다세포증식의억제및세포자멸사의유도효과가유의하게높다고보고하였고 gemcitabine 단독투여시증가된 survivin의발현이 emodin을병합하게되면유의하게억제됨을보고하였다. 또한 in vivo 연구에서도같은기전을통해췌장암의증식을억제함을보고하였다 (30). 최근연구들을통해 NF-κB는특유의신호전달체계를통해혈관생성과세포자멸사, 세포증식, 전이등의종양의진행과정에긴밀히관여하는것으로알려져있어 (20,21), 이러한 NF-κB를차단하는것도항암효과를극대화하기위한새로운표적으로각광받고있다. 본연구에서주목한 inflexinol은여러연구를통해 NF-κB를억제하고있음이잘알려져있고 (17,19) 실제대장암세포주를이용한 in vitro 및 in vivo 연구에서 inflexinol으로인해종양의증식이억제됨이보고되었다 (22). 본연구는 inflexinol이췌장암에서도같은기전을통해효과를발휘하고 gemcitabine과병합투여시부가적인효과가있음을보고한최초의연구로그의미가크다고하겠다. 본연구에서 emodin과 inflexinol은각각 survivin과 NF-κB의 34

억제를통해세포자멸사를유도하고췌장암세포주의증식을억제시켰고이러한결과는누드마우스를이용한실험에서도그대로재현되었다. 누드마우스실험에서 emodin이나 inflexinol을병합하였을경우종양증식의억제효과가증강되었고이러한기전은 survivin과 NF-κB의억제로인한세포자멸사의유도에의한것임이확인되었다. 여러연구들에서천연물질들이췌장암의증식을억제하는효과가있음이보고되고있으나이러한천연물질들중임상시험에서효과및독성이평가된경우는드물다. 또한, 예상치못한독성의가능성을최소화하면서항암효과를극대화하기위해서는가능하면낮은용량으로여러항암제의조합을시도하는것이의미가있을것으로보여진다. 따라서, 이러한점에주목하여본연구에서는작용기전이다른천연물질들을조합할경우항암효과를극대화할수있다는가정하에기존의표준치료제인 gemcitabine 항암제에 emodin 과 inflexinol 두가지의천연 물질을함께병합하는병합요법을시도하였다. 본연구결과작용 기전이다른 emodin 과 inflexinol 을함께병합하였을경우 gemcitabine 단독투여시보다종양증식의억제효과가 증진되었지만 emodin 이나 inflexinol 중한가지만을병합한 경우와는큰차이가없었다. 하지만, 본연구의결과는두가지이상의천연물질을병합하는병합요법의효과가기존의병합요법에비해떨어지지않는다는것을보여주었고, 시간에따른마우스의무게변화가각군간에차이가없어두가지이상의천연물질을병합해도부작용이크지않음을보여줌으로써, 35

항암효과는극대화하면서잠재적인독성을최소화하기위한낮은용량의여러약제의조합의가능성을열었다는점에서그의미가있다고하겠다. 결론적으로 gemcitabine과 emodin, inflexinol의병합투여는 survivin 및 NF-κB의억제를통한세포자멸사유도를통해췌장암에대한항암효과를증진시키는효과를보였다. 본연구결과는여러약제의다양한병합요법에대한임상연구를위한근거를제시하였고이러한병합요법이추후임상에서췌장암의치료에있어유용한치료전략이될수있음을보여주고있다. 36

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Abstract Introduction: Emodin and inflexinol are natural compounds possessing therapeutic potential against cancer via survivin and NF-κB inhibitory effects, respectively. However, the antitumor effect of inflexinol on pancreatic cancer has not been determined yet. This study was designed to whether the combination therapy with emodin, inflexinol and gemcitabine enhanced antitumor efficacy in pancreatic cancer. Methods: The effect of combination treatment of emodin, inflexinol and gemcitabine on cell proliferation and apoptosis was examined in pancreatic cancer cell lines (Panc-1 and MiaPaCa-2). And then, the mechanisms responsible for the effect of the combination treatment were investigated. Finally, the xenograft model of pancreatic cancer was employed to notice the effect in vivo. Results: In vitro, the combination treatment resulted in more growth inhibition and apoptosis through the down-regulation of survivin and NF-κB with suppression of Akt and through the activation of Bax in pancreatic cancer cell lines (Panc-1, MiaPaca-2). In vivo, the combination therapy augmented tumor growth inhibition through the same mechanisms in tumor tissue. However, the triple combination therapy (emodin, inflexinol and gemcitabine) did not show more tumor growth inhibition than the combination therapy with gemcitabine plus emodin or inflexinol. Conclusions: The combination therapy with emodin, inflexinol and gemcitabine enhanced antitumor efficacy through survivin and NF-κB suppression and Bax activation. ---------------------------------------------------------------------------------------------- 43

Key words: pancreatic cancer, gemcitabine, inflexinol, emodin, NF-κB, survivin Student number: 2011 30642 44