대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호, 2010 백혈구연층법으로분리제조한농축적혈구, 혼합혈소판및동결혈장제제의품질평가 홍덕진 1 ㆍ최승준 1 ㆍ김신영 1 ㆍ김현옥 1 ㆍ박규은 2 = Abstract = 연세대학교의과대학진단검사의학교실 1, 대한적십자사혈액관리본부 2 Quality Assessment of Red Blood Cells, Pooled Platelets and Frozen Plasma Processed by the Buffy Coat Method Duck Jin Hong 1, Seungjun Choi 1, Sinyoung Kim 1, Hyun Ok Kim 1, Quehn Park 2 Department of Laboratory Medicine, Yonsei University College of Medicine 1, Blood Service Headquarters, Korean Red Cross 2, Seoul, Korea Background: Buffy coat method is one of the blood components processing methods widely used in many countries including Europe and Canada. For the first time in Korea, we evaluated the qualities of blood components manufactured by buffy coat method. Methods: We collected 400 ml whole bloods using the quadruple top and bottom blood bag from thirty-five donors. Whole bloods were processed into leukoreduced RBC, leukoreduced pooled platelet, and 24 hr frozen plasma by the buffy coat method with blood bags and instruments of Fenwal and Fresenius. The qualities of each blood component were analyzed at each scheduled day, and compared with the standard guidelines of quality control in Korean Red Cross. Results: The volume and hemoglobin of RBCs were lower than the standard guidelines. Comparing with the standard of apheresis platelets, leukoreduced pooled platelets showed higher total platelet yield with the median 3.70 10 11 /unit. Frozen plasma showed increased volume recovery than the standard guideline, but the activity of factor VIII at Day 35 was decreased to 0.66±0.14 IU/mL. Conclusion: We have found that the yields of pooled platelet and the frozen plasma processed by buffy coat method were higher than the standard guidelines. To introduce the buffy coat method to routine blood component separation process in Korea, further evaluations about the cost-effectiveness of buffy coat method are required. (Korean J Blood Transfus 2010;21:254-65) Key words: Buffy coat method, Blood separation, Pooled platelet, 24 hr frozen plasma 접수일 :2010년 10월 15일, 수정일 :2010년 10월 20일, 승인일 :2010년 10월 22일책임저자 : 김현옥 120-140 서울시서대문구신촌동 134 연세대학교의과대학진단검사의학교실 TEL: 02) 2228-2444, FAX: 02) 364-1583, E-mail: hyunok1019@yuhs.ac - 254 -
Blood Components Processed by Buffy Coat Method 서론혈액제제는헌혈을통해서만구할수있는유한한인체자원으로, 최근인구구조의고령화와수혈연관급성폐손상 (transfusion related acute lung injury) 의예방을위해임신력이있는여성헌혈자의헌혈을배제 1) 하는등의원인들에의해앞으로는혈액제제공급이감소하는반면, 진단기술과의학기술의발전으로임상에서좀더적극적인치료가가능해짐으로써혈액제제의수요량은더욱증가할것으로예상된다. 그가운데에서도국내혈액원에서가장많은비율로제공받는 400 ml 전혈 ( 여성의경우 320 ml 전혈 ) 의분리제조방법의선택은혈액이용의효율성증대뿐만아니라더나아가국가혈액사업의운영에도큰영향을미칠수있는요소라고할수있다. 우리나라는혈소판풍부혈장법 (platelet rich plasma method) 으로전혈로부터농축적혈구, 농축혈소판그리고신선동결혈장등의혈액성분제제를분리하여생산하고있다. 혈소판풍부혈장법은 1960년대말미국에서처음소개되었으며, 이방법은채혈 8시간이내에혈액제제분리가완료되어야하기때문에혈액원에서는야간업무부담이생기고, 혈소판과혈장의회수율이다른방법에비해낮으며, 혈소판활성도가높다는단점이있다. 2) 반면 1980년대후반 Pietersz 등에의해처음소개된백혈구연층법 (buffy coat method) 은일차혈액백의위쪽와아래쪽에각각혈장백과적혈구백이연결된 top and bottom 방식의사중백 (quadruple blood bag) 에헌혈을받은후, 혈소판풍부혈장법과는다르게채혈후 24시간내에강한 1차원심분리로혈장과적혈구를분리하고, 남겨진백혈구연층을 4 6개정도혼합하여약한 2차원심분리를하여혼합혈소판 (pooled platelet) 을제조한다는것과신선동결혈장이아닌 24시간내에 제조된동결혈장이만들어진다는점이특징이다. 3-6) 현재까지백혈구연층법으로제조한혈액제제의성상및품질관련항목들의변화에대한연구는유럽을중심으로활발하게이루어져왔으며, 독일, 프랑스, 캐나다등은농축혈소판제제를백혈구연층법으로제조공급하고있는대표적인국가이다. 하지만국내에서는백혈구연층법에대한연구와 top and bottom 방식의자동화기기를이용한혈액제제분리제조경험은전혀보고된바없다. 이에본저자들은백혈구연층법으로농축적혈구, 혼합혈소판및혈장제제를제조한후기존의혈소판풍부혈장법과비교하여성분제제생산에서의그장점과특징을평가하고우리나라에서의백혈구연층법의도입가능성여부에대한기초자료를제공하고자하였다. 대상및방법 1. 전혈기증자본연구참여에동의한총 35명의건강한헌혈자로부터전혈을채혈하였다. 모든실험참가자들은본연구의목적과방법, 혈액제제의향후관리, 채혈과정에서발생할수있는부작용, 연구과정에서의피험자의안전성, 연구참여의자발적동의및취소에대한내용을충분히이해하고연구에자발적으로참여한다는내용이포함된동의서를작성하였다. 헌혈자는국내 400 ml 전혈헌혈자기준에따라서헌혈전말초혈액의혈색소농도가 12.5 g/dl 이상인체중 50 kg 이상의건강한만 17세이상의남녀로제한하였다. 2. 혈액백혈액백은 1차전혈분리용으로백혈구여과필터가장착된 top and bottom 방식의 450 ml 전혈 - 255 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 Fig. 1. Top and bottom quadruple blood bag and octopus-type platelet pooling and storage bag for buffy coat method. (A) Top and bottom quadruple blood bag. 1 Primary bag containing 63 ml of CPD solution, 2 Plasma bag, 3 RBC transfer bag connected to in-line WBC filter and RBC bag, 4 RBC bag containing 100 ml of SAGM. (B) Octopus-type platelet pooling and storage bag. 1 Platelet pooling bag connected to in-line WBC filter and platelet storage bag, 2 Platelet storage bag, 3 Pouch for platelet component sampling and air removal. 용 4-Optipure RC (Fenwal, Round Lake, IL, USA) 과 Composelect T&B (Fresenius HemoCare, Emmer- Compascuum, the Netherlands) 를사용하였다 (Fig. 1). 국내기준의항응고제량을맞추기위해 63 ml의항응고제 CPD 액 (citrate-phosphate-dextrose solution) 에서 7 ml를채혈직전에버리고전혈 400 ml를채혈하였다. 혼합혈소판제제제조는 2차혼합백혈구연층분리용으로백혈구여과필터가장착된혈소판백 PL2410 (Fenwal, Round Lake, IL, USA) 을사용하여시행하였다 (Fig. 1). 3. 혈액제제자동분리기기및원심분리혈액제제분리제조를위한자동화기기로 Optipress II (Fenwal) 와 Compomat G4 (Fresenius HemoCare) 를이용하였다 (Fig. 2). 혈액백은원심분리기 RC3C (Sorvall, Newtown, CT, USA) 를사용하여, 4,293 g에 8분간 1차강한원심분리를하였고 2차약한원심분리는 419 g에 9분간시행하 - 256 -
Blood Components Processed by Buffy Coat Method Fig. 2. Automated blood components separating devices. (A) Optipress II. 1 Press plate, 2 Back plate, 3 Optic sensor, 4 Blood bag hanger, 5 Hb detector, 6 Clamp and sealer. (B) Compomat G4. 1 Upper press plate, 2 Lower press plate, 3 Optic sensor, 4 Blood bag hanger, 5 Hb detector, 6 Clamp and sealer. 였다. 4. 성분제제의제조및품질측정전혈채혈일 (Day 0) 에혈소판제제의혼합을위해혈액형이같은 5명단위로채혈하였다. 채혈직후전혈은 4 o C 냉장고또는냉각판을이용하여 20 o C까지온도를내린다음, 실온 (20 o C) 에서다음날오전까지보관하였다. 제조당일 (Day 1) 에는채혈후 24시간이지나기전에두회사의자동화혈액분리기기를이용하여전혈을농축적혈구, 혼합혈소판및혈장제제로분리하였다. 농축적혈구는 1차분리후중력을이용하여백혈구여과제거하였고, 혼합혈소판은백혈구연층을 5단위씩혼합하여 2차분리와동시에백혈구여과제거하면서제조하였다. 농축적혈구는냉장보관하면 서제조직후 (Day 1), 15일 (Day 15) 과 35일 (Day 35) 에부피, 적혈구수, 혈색소, 적혈구용적률그리고백혈구수를자동혈액분석기 Advia 2120 (Bayer Diagnostics, Tarrytown, NY, USA) 을이용하여측정하였고그결과를대한적십자사의혈액제제의제조및품질관리지침 7) 의백혈구여과제거농축적혈구의품질관리기준과비교하였다. 여과후의혈액내잔여백혈구수는 Nageotte chamber (Ballast chamber Koch Products, Friedeichsdorf, Germany) 를사용하여수기로산정하였다. 혼합혈소판은실온에서혈소판교반기 Helmer (Helmer Inc., Noblesville, IN, USA) 에서보관하면서제조 2시간후 (Day 1), 3일 (Day 3) 과 5일 (Day 5) 에부피와혈소판수, 적혈구수, 백혈구수그리고혈소판대사지표로써 ph, po 2, pco 2, - 257 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 젖산, 포도당, potassium 농도를혈액가스분석기인 NOVA CCX (Nova Biomedical, Waltham, Miami, USA) 를이용하여측정하였다. 부피및혈액관련항목은대한적십자사의백혈구여과제거성분채집혈소판의품질관리기준과비교하였다. 여과후의혼합혈소판내의잔여백혈구수는 Nageotte chamber를사용하여구하였다. 혈장은혈액냉동고에보관하면서제조직후 (Day 1) 와제조 35일 (Day 35) 에해동하여부피, prothrombin time (PT), activated partial thromboplastin time (aptt), V와 VIII응고인자의활성도, 그리고섬유소원농도를 ACL TOP (Instumentation Laboratory, Milan, Italy) 을이용하여측정하였다. 5. 국내혈액제제품질관리기준자료수집혈소판풍부혈장법으로제조한혈액에대한자료는대한적십자사의혈액제제품질관리기준및자료를대상으로비교분석하였으며, 대한적십자사의연구윤리심의위원회의승인을받았다. 6. 통계분석통계분석은 Analyze-it for Microsoft Excel (version 2.22, Analyze-it Software Ltd., Leeds, UK) 을이용하였고, 통계적유의수준은 P value 0.05를기준으로하였다. 결과 1. 헌혈자의혈액학적검사소견전혈기증자의평균연령 ( 범위 ) 은 24.4±6.2 (18 54) 세였고, 남녀비율은남자 29명 : 여자 6명이었다. 기증받은전혈의부피는 400±5 (386 413) ml로, 혈색소와적혈구용적률은각각 14.3± 1.0 (12.5 16.0) g/dl와 42.2±2.6 (38.0 46.5) % 였고, 혈소판수는 270.3±61.6 (182 452) 10 3 /μl였다. PT (INR), aptt, 섬유소원의농도역시각각 0.98±0.06 (0.88 1.15) INR, 30.2±2.6 (23.3 36.6) Table 1. The characteristics of donors and hematologic parameters in whole blood collected Parameters Total Fenwal group* Fresenius group* No. of collection 35 25 10 Age (years) 24±6 (18 54) 24±7 (18 54) 25±3 (19 30) Sex (Male : Female) 29:6 21 : 4 8 : 2 Blood type (Non-O : O) 30:5 20 : 5 10 : 0 Whole blood volume (ml) 400±5 (386 413) 399±5 (386 409) 402±5 (397 414) Hb (g/dl) 14.3±1.0 (12.5 16.0) 14.3±1.0 (12.5 16.0) 14.3±1.1 (12.6 16.0) Hct (%) 42.2±2.6 (38.0 46.5) 42.2±2.5 (38.0 46.5) 42.0±3.0 (38.2 46.5) RBC count ( 10 6 /μl) 4.75±0.4 (3.93 5.37) 4.76±0.4 (3.93 5.23) 4.72±0.4 (4.15 5.37) WBC count ( 10 3 /μl) 5.89±1.0 (2.98 8.33) 6.07±0.1 (4.44 8.33) 5.43±1.1 (2.98 7.02) PLT count ( 10 3 /μl) 270±62 (182 452) 265±57 (182 435) 283±73 (196 452) PT (INR) 0.98±0.06 (0.88 1.15) 0.98±0.07 (0.88 1.15) 0.96±0.03 (0.92 0.99) aptt (second) 30.2±2.6 (23.3 36.6) 30.0±3.0 (23.3 36.6) 30.6±1.5 (28.2 32.6) Fibrinogen (g/dl) 245±36 (182 333) 249±37 (182 333) 232±30 (191 278) Data are shown as means±sd (range). *There was no parameter showing statistically significant difference between Fenwal and Fresenius group. - 258 -
Blood Components Processed by Buffy Coat Method 초, 244.5±36.0 (182 333) g/dl로정상범위였다. Fenwal사의혈액백과자동화혈액분리기기를이용한전혈기증자군은 25명, Fresenius사의기증자군은 10명이포함되었고, 검사항목들에서두군사이에통계학적으로유의한차이는없었다 (Table 1). 2. 농축적혈구제제의품질백혈구연층법으로제조한백혈구여과제거농축적혈구의품질을대한적십자사의백혈구여과제거적혈구의품질관리기준과비교하였다. 부피의평균은 239±12 ml이었고최대용량이 260 ml로대한적십자사의기준 (75% 이상의혈액이 300±30 ml에포함되어야함 ) 과비교했을때통계적으로유의하게낮았다 (P<0.001). 하지만적혈구용적률의평균은 58.6±2.4% 였지만, 75% 이상의혈액이 60±10% 에해당되어야하는대한적십자사의기준과비교해서는통계학적인차이를나타내지않았다. 혈색소의평균은 42.4±2.4 g/dl였으며, 헌혈전기증자의혈액백내적혈구수를감안한제조당 일 (Day 1) 의적혈구회수율은 74.0±3.0% 였다. 백혈구여과제거농축적혈구의잔존백혈구수는 0.3 10 6 / 단위미만이었으며, 잔존혈소판수는모두 4.0 10 3 /μl 이하로매우낮았다. 제조당일 (Day 1), 15일 (Day 15), 35일 (Day 35) 에측정한적혈구용적률, 혈색소및적혈구수에서는시간경과에따른통계학으로유의한차이는관찰되지않았다 (Table 2). 3. 혼합혈소판제제의품질백혈구연층법으로제조한혼합혈소판제제의부피는최소 290 ml에서최대 456 ml까지다양하였는데, 2차원심분리시적혈구오염을줄이기위해혼합혈소판부피를 400 ml 이상으로만든 2개제제를제외하면, 혼합혈소판제제의부피는 290 369 ml로모두성분채집혈소판부피의품질관리기준인 400 ml 이하에해당하였다. 혈소판수획량의중앙값은 3.70 (3.21 4.63) 10 11 / 단위로 75% 이상의제제에서 3.0 10 11 / 단위이상이어야한다는대한적십자사기준을모두만족시켰다. 혈소판수의헌혈전기증자의혈액백 Table 2. The change of hematologic parameters in stored leukoreduced red blood cells processed by buffy coat method (n=35) Parameters Day 1 Day 15 Day 35 Volume* (ml) 239±12 (213 260) Initial RBC yield ( 10 12 /unit) 1.41±0.1 (1.08 1.64) Initial RBC recovery (%) 74.0±3.0 (67.9 80.7) Hematocrit (%) 58.6±2.4 (52.4 62.3) 58.4±2.7 (52.0 62.4) 58.2±2.8 (51.1 62.4) Hb (g/unit) 42.4±2.2 (37.6 47.2) 42.6±2.4 (36.9 47.4) 42.4±2.4 (37.6 47.0) RBC count ( 10 9 /μl) 5.87±0.3 (5.08 6.46) 5.84±0.3 (5.03 6.44) 5.78±0.4 (4.91 6.30) Residual WBCs All<0.5 10 6 /unit Residual PLTs All 4.0 10 3 /μl Data are shown as means±sd (range). *Leukoreduced red blood cells processed by buffy coat method showed statistically significant decrease in volume comparing with the standard guidelines of Korean Red Cross (P<0.001). Initial RBC recovery (%) = Initial total RBCs in RBC bag 100. Total RBCs in primary whole blood bag - 259 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 내혈소판수와비교한제조 5일째의최종혈소판회수율의중앙값은 69.8 (65.5 75.3)% 였다. 혈소판대사와관련한항목들은기존의보고와비슷한양상을나타냈는데, 8) 혈소판의보관시간이 경과함에따라포도당농도와 pco 2 는감소하고, ph, 젖산, po 2, potassium 농도는통계학적으로유의하게상승하였다 (P<0.05) (Table 3). Table 3. The change of hematologic and biochemical parameters in stored leukoreduced pooled platelets processed by buffy coat method (n=7) Parameters Day 1 Day 3 Day 5 Volume* (ml) 349 (290 456) Initial PLT yield ( 10 11 /unit) 3.70 (3.21 4.63) Initial PLT recovery (%) 69.8 (65.5 75.3) PLT count ( 10 9 /μl) 1,059 (848 1393) 1,014 (812 1,216) 1,007 (867 1,198) Residual WBCs All<0.5 10 6 /unit ph 7.12 (7.01 7.20) 7.30 (7.20 7.34) 7.36 (7.20 7.40) Glucose (mg/dl) 429 (296 479) 391 (286 463) 373 (257 400) Lactate (mmol/l) 7.6 (5.9 11.3) 10.0 (7.5 14.3) 12.7 (9.5 16.0) po 2 (mmhg) 106.4 (90.6 124.3) 121.7 (99.4 143.4) 135.4 (106.8 156.4) pco 2 (mmhg) 59.2 (49.8 65.8) 38.2 (29.0 41.8) 23.0 (20.1 34.0) Potassium (mmol/l) 4.17 (3.68 4.40) 4.24 (3.82 4.43) 4.29 (3.91 4.52) Data are shown as medians (range). *Two pooled platelets of Fresenius with 400 ml or more volume was intentionally processed in order to increase the total volume of platelet storage bag. Initial PLT recovery (%) = Initial total PLTs in PLT bag 100. Total PLTs in primary whole blood bag These biochemical parameters showed statistically significant change from Day 1 to Day 5 (P<0.05). Table 4. Coagulation factor values in 24 hour frozen plasma processed by buffy coat method Parameters Day 1 Day 35 Volume* (ml) 236±14 (214 267) Factor VIII (IU/mL) 0.78±0.15 (0.52 1.18) 0.66±0.14 (0.39 1.15) Factor V (IU/mL) 0.90±0.12 (0.66 1.20) 0.82±0.12 (0.62 1.11) PT (INR) 0.98±0.06 (0.86 1.10) 1.03±0.06 (0.92 1.16) aptt (sec) 33.9±3.5 (26.0 42.3) 35.7±3.8 (27.2 44.2) Fibrinogen (mg/dl) 242±52 (168 458) 255±56 (167 420) Residual WBCs All 0.06 10 3 /μl Residual RBCs All 0.01 10 6 /μl Data are shown as means±sd (range). *24 hour frozen plasmas processed by buffy coatmethod showed statistically significant increase in volume comparing with the standard guidelines of Korean Red Cross (P<0.001). Quality standard of fibrinogen concentration in cryoprecipitate is more than 133 mg/ml in 3/4 of tested blood components. - 260 -
Blood Components Processed by Buffy Coat Method 4. 동결혈장제제의품질비교 백혈구연층법으로제조한동결혈장제제의부피는 235±14 ml로신선동결혈장의품질기준인 145 ml와신선동결혈장 200 단위의품질관리결과의평균인 166±10 ml보다 40 80 ml 이상많았다 (P<0.001). 반면, VIII응고인자의활성도는제조당일 (Day 1) 에 0.78±0.15 IU/mL, 제조 35일 (Day 35) 에 0.66±0.14 IU/mL로신선동결혈장의품질기준인 0.7 IU/mL와 200 단위의신선동결혈장의품질관리결과인 1.2±0.3 IU/mL보다통계적으로유의하게낮았다 (P<0.05). V응고인자의활성도는제조당일에 0.90±0.12 IU/mL, 제조 35일에 0.82±0.12 IU/mL였다. PT (INR), aptt, 섬유소원의농도는모두검사실내참고치에해당하는범위였고, 잔존백혈구와적혈구수도각각 0.5 10 6 / 단위미만과 0.3 10 9 / 단위미만으로매우낮았다 (Table 4). 고찰 우리나라는혈소판풍부혈장법을이용하여전혈로부터농축적혈구, 농축혈소판그리고신선혈장제제를분리생산하고있다. 반면, 1970년대중반유럽에서는백혈구연층을제거할경우수혈시농축적혈구에포함된백혈구에의해서발생하는발열성비용혈성수혈부작용등의합병증을줄일수있다는사실과백혈구연층 60 ml에는 30 ml의적혈구, 30 ml의혈장, 일차혈액백내 2/3 의백혈구와대부분의혈소판이포함되어있다 9) 는점에주목하여, 1980년대말부터백혈구연층법을개발하여전혈유래성분제제의분리제조법으로이용하고있다. 3-6) 대다수의유럽국가를비롯하여남아메리카국가, 호주, 인도및동남아시아등의여러나라에서백혈구연층법을이용한 혈액제제제조가이루어지고있고, 특히캐나다의혈액사업을담당하는 Canadian Blood Service (CBS) 는백혈구연층법으로제조한혈액제제의수획량증가, 24시간상온보관으로인한혈액원의업무감소및혈액제제의물류개선등의경제성을고려하여 2005년부터 2008년에걸쳐서전혈분리방법을기존의혈소판풍부혈장법에서백혈구연층법으로완전히전환하였다. 10) 저자들은국내에서는처음으로백혈구연층법을이용해서성분제제제조를시도하였는데, 본연구에서제조한농축적혈구제제의부피는대한적십자사의품질관리기준보다약 60 ml 적고, 일차혈액백내적혈구수를기준으로계산한적혈구회수율의평균이 74% 로기존의백혈구연층법관련연구에서의결과인약 75 85% 와비교할때낮은편에속했다. 11-13) 이것은백혈구연층법의경우백혈구연층분리과정에서일정량의적혈구가제거될수밖에없으므로혈소판풍부혈장법에비해상대적으로적혈구의소실이많기때문이며, 저자들이사용한자동화혈액분리기기는 450 ml 전혈용으로프로그램이내장되어있어 1차분리과정에서적혈구가충분히적혈구백으로나누어지기전에분리가중단됨으로써필요이상의적혈구가일차혈액백의백혈구연층에남아있을수있고, 또한농축적혈구를백혈구제거필터로여과하는과정에서약 10% 정도의추가적인부피소실 14) 이생긴결과로해석하였다. 저자들이제조한혼합혈소판의수획량은대한적십자사의품질관리기준을모두상회하고일차혈액백내혈소판과비교한회수율의중앙값이 69.8% (65.5 75.3%) 에이를정도로높았다. 기존의연구에서보고된혼합혈소판수획량을백혈구연층 5개를혼합하여제조했다고가정하여계산하면 3.02 3.68 10 11 / 단위 8,13) 로본연구와유사한결과값을나타낸다. 백혈구연층법의장점중하 - 261 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 나인혈소판수획량의최대화를위해서는 2차원심분리조건을적절하게조절하는것이매우중요하다. 2차원심분리가지나치게강할경우, 백혈구연층과첨가된혈장안에존재하는적혈구만이아니라혈소판역시가라앉아서위쪽의혈소판백으로분리되지않고아래쪽의폐기층에남아있게된다. 반대로원심분리속도가약할경우에는혈소판회수율은높아지지만, 육안으로는관찰되지않는적혈구부유가발생하면서혈색소감지장치 (Hemoglobin detector) 의임계치이하에해당하는농도의적혈구도소량포함된다. 실제로저자들의사전실험에서 2차원심분리를 1,073 g 에 7분간시행했을때의혈소판회수율은 28.4 51.9% 밖에되지않았고, 원심력을낮추어 386 g 에 6분간시행했을때에는혈소판회수율은 79% 로높았지만, 잔존적혈구수가 34.4 44.2 10 9 / 단위로혼합혈소판또는성분채집혈소판제제의기준인 5 10 9 / 단위보다높았고, 독일적십자사의품질관리자료에서보고된중앙값 0.51 10 9 / 단위와상당한차이를보였다. 15) 하지만 1,073 g, 7분의 2차원심분리조건에서도잔존적혈구수가많았으므로원심력의부족에의한결과는아닌것으로생각했고, 이에따라저자들은 450 ml 용으로제작된혈소판백이전체의약 3/4 정도밖에채워지지않으면서혈액백의구겨진부분사이에제대로분리되지않고육안적으로남아있는적혈구가혈색소감지기의임계치보다낮은수준으로혈소판백에같이섞여서분리되었기때문으로가정하였다. 그래서최종 2개의혼합혈소판제조시에는백혈구연층혼합시사용하는린스용혈장의부피를늘여서혈소판백을가득채운후혈소판의원심분리를시행했는데, 그결과잔존적혈구수는 21.5 27.4 10 9 / 단위로감소했지만, 2개의결과값만으로통계학적유의성여부를판단하기는어려웠다. 농축적혈구와마찬가지로혼합혈소 판역시백혈구여과제거후잔존백혈구는모두 0.5 10 6 / 단위미만으로뛰어난여과효율을증명하였다. 동결혈장제제의부피는실제대한적십자사신선동결혈장 200 단위의품질관리결과보다약 70 ml 정도더많았는데, 이것은기존의 450 ml 전혈을대상으로한연구에서의동결혈장의부피를 400 ml로변환하여계산했을때의값과유사한결과였다. 11,13) 제조 35일의동결혈장제제에서 0.7 IU/mL 이상의 VIII응고인자의활성도를갖는비율은 28.6% (10/35) 로대한적십자사의채혈 8시간내에분리제조한신선동결혈장의기준인 75% 에는훨씬미치지못하였고, 제조당일의활성도에비해통계적으로유의하게낮았다. 이것은검사를위해여러개의검체를분주하고실제로검사를시행하기까지상온에노출되는시간이늘어났기때문으로판단된다. 또한실제혈액원에서와같이분리제조가끝남과동시에급속냉동을시키지못하고 35 o C 혈액냉동고에보관함으로인해급속냉동에의한응고인자의활성도보존효과를보지못한점, 그리고제조당일의검체는혈장제제를냉동하지않고바로검사하므로해동과정이없는반면, 제조 35일의동결혈장은이혈액가온기를이용하여 15분간해동후응고인자활성도를측정하기때문에이과정에서의활성도저하역시이러한결과가나타난원인으로생각된다. 하지만 0.52 IU/mL 이상의활성도를나타내는제제의비율은 88.6% (31/35) 로 75% 이상의혈액에서 0.52 IU/mL 이상의활성도를보여야하는캐나다 CBS의 VIII 응고인자의활성도기준을상회하였다. 신선동결혈장과 24시간동결혈장의 VIII응고인자와 V응고인자의활성도에관해서는이미많은연구가되어있고, 16,17) 본연구에서의결과값과유사하였다. 24시간동결혈장은신선동결혈장과비교할때 VIII응고인자의활성도가낮 - 262 -
Blood Components Processed by Buffy Coat Method 다고알려져있지만, 이미백혈구연층법을이용하는국가에서는냉동혈장제제를혈장수혈에사용하고있고, 우리나라와같은신선동결혈장을사용하고있는미국내에서도 24시간동결혈장을임상적으로사용할수있는가대해서는논의가진행중이다. 18) 신선동결혈장제제의임상적적응증은혈우병과같은단독적인응고인자결핍질환이아닌, 항응고제사용과연관된출혈상황또는침습적인시술전의출혈방지, 파종성혈관내응고질환 (disseminated intravascular coagulation disorder) 의심시, 대량수혈이필요할경우그리고간이식술시수술중지혈장애등의상황이다. 즉다양한응고인자의보충이필요할경우에만신선동결혈장이유용하므로, 이런일반적인목적하에서는 II, V, VII, X응고인자와섬유소원등의다른응고인자가충분한상태이고 VIII응고인자의활성도가 0.3 0.4 IU/mL 이상이면정상적인지혈작용을보조하는데임상적으로는큰영향을미치지않기때문에, 동결혈장제제가신선동결혈장을대체하여사용할수있다는주장이최근제기되고있다. 19) 본연구의가장큰한계점은우선전혈분리를위해사용한혈액백이국내에서는사용하지않는 450 ml 용이었다는점이다. 450 ml 혈액백에 400 ml 만큼의전혈이포함되어상대적으로혈액백안의여유공간이많아지게되고, 이로인해서혈액백을일정한압력으로누르는원리로작동하는자동화혈액제제분리기기가이미프로그램되어있는대로혈액을분리할경우, 감소한혈액을정확하게분리할수없다. 농축적혈구의회수율감소, 혼합혈소판의적혈구오염등의결과도상대적으로큰혈액백의사용에서기인했음을예상할수있다. 결론본연구는국내에서는백혈구연층법을이용한첫시도인점은있으나, 추가적인백혈구연층법관련연구에서는혈액백과혈액량의통일, 자동화장비의정확한프로그램세팅과더불어서좀더많은수의혈액을분석하여추가적인혈소판활성화표지자검사등의항목들이시행되어야할것이다. 그리고본연구가백혈구연층법의국내도입을위한기초자료의역할을하여, 앞으로는일반적인혈액제조공정으로서의적용가능성및새로운기술도입시요구되는비용과그로인해얻을수있는효율측면에서의분석이필요하다. 요약배경 : 백혈구연층법은전혈분리제조방법가운데하나로유럽과캐나다를포함한여러국가에서널리사용되고있다. 저자들은국내에서는처음으로백혈구연층법으로성분제제제조하고, 그품질을평가하였다. 방법 : 총 35명의기증자로부터 400 ml의전혈을 top and bottom 방식의사중백에채혈하고, Fenwal사와 Fresenius사의자동화기기를이용하여백혈구연층법으로농축적혈구, 혼합혈소판및동결혈장제제를분리제조하였다. 농축적혈구는제조당일, 15, 35일에, 혼합혈소판은제조당일, 3, 5일에, 그리고동결혈장은제조당일과 35일에각품질관리항목을검사하였고, 그결과를대한적십자사품질관리기준과비교하였다. 결과 : 농축적혈구제제의부피및혈색소는대한적십자사품질관리기준보다낮았다. 혼합혈소판제제의수획량은중앙값이 3.70 10 11 / 단위로성분채집혈소판의품질관리기준보다높았다. 동 - 263 -
대한수혈학회지 : 제 21 권제 3 호 결혈장제제의부피는대한적십자사의신선동결혈장부피기준과품질관리결과보다컸지만, 제조 35일에 VIII응고인자의활성도가 0.66±0.14 IU/mL로낮았다. 결론 : 백혈구연층법을이용해서분리제조한혼합혈소판과동결혈장제제의수획량은기존의혈액제제의기준보다높았다. 그러나국내에백혈구연층법을혈액분리제조공정에도입하기위해서는비용-효율적측면에서의추가적인연구와논의가더필요하다. 참고문헌 1. Triulzi DJ, Kleinman S, Kakaiya RM, Busch MP, Norris PJ, Steele WR, et al. The effect of previous pregnancy and transfusion on HLA alloimmunization in blood donors: implications for a transfusion-related acute lung injury risk reduction strategy. Transfusion 2009; 49:1825-35 2. Metcalfe P, Williamson LM, Reutelingsperger CP, Swann I, Ouwehand WH, Goodall AH. Activation during preparation of therapeutic platelets affects deterioration during storage: a comparative flow cytometric study of different production methods. Br J Haematol 1997;98: 86-95 3. Pietersz RN, Loos JA, Reesink HW. Platelet concentrates stored in plasma for 72 hours at 22 degrees C prepared from buffycoats of citrate-phosphate-dextrose blood collected in a quadruple-bag saline-adenine-glucose-mannitol system. Vox Sang 1985;49:81-5 4. Pietersz RN, Reesink HW, Dekker WJ, Fijen FJ. Preparation of leukocyte-poor platelet concentrates from buffy coats. I. Special inserts for centrifuge cups. Vox Sang 1987;53:203-7 5. Pietersz RN, Reesink HW, Dekker WJ. Preparation of leukocyte-poor platelet concentrates from buffy coats. II. Lack of effect on storage of different plastics. Vox Sang 1987; 53:208-13 6. Pietersz RN, de Korte D, Reesink HW, van den Ende A, Dekker WJ, Roos D. Preparation of leukocyte-poor platelet concentrates from buffy coats. III. Effect of leukocyte contamination on storage conditions. Vox Sang 1988;55:14-20 7. Guidelines for manufacture and quality control of blood components. 3rd ed. Seoul: Blood Services Headquarters, Korean Red Cross, 2009: appendix 1, 2-4 8. Levin E, Culibrk B, Gyöngyössy-Issa MI, Weiss S, Scammell K, LeFresne W, et al. Implementation of buffy coat platelet component production: comparison to platelet-rich plasma platelet production. Transfusion 2008; 48:2331-7 9. Janetzko K, Klüter H, van Waeg G, Eichler H. Fully automated processing of buffy-coatderived pooled platelet concentrates. Transfusion 2004;44:1052-8 10. Sheffield WP, Bhakta V, Jenkins C, Devine DV. Conversion to the buffy coat method and quality of frozen plasma derived from whole blood donations in Canada. Transfusion 2010; 50:1043-9 11.van der Meer P, Pietersz R, Hinloopen B, Dekker W, Reesink H. Automated separation of whole blood in top and bottom bags into components using the Compomat G4. Vox Sang 1999;76:90-9 12. Gulliksson H, van der Meer PF. Storage of whole blood overnight in different blood bags preceding preparation of blood components: in vitro effects on red blood cells. Blood Transfus 2009;7:210-5 13. Hurtado C, Bonanad S, Soler M, Mirabet V, - 264 -
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