임상검체전처리가이드 Version 1.3
Introduction 임상검체전처리가이드는사용자들의전처리과정의이해를돕기위해제작되었습니다. 제공된가이드를이용하여다양한임상검체의처리과정을거친후 ExiPrep Extraction Kit 군, ExiStation Extraction Kit 군또는 AccuPrep Extraction Kit 군을이용하여정제된핵산을추출할수있습니다. 위와같은전처리를통하여검사하고자하는실험에서정확한결과를얻을수있도록도와드립니다. 최상의결과를얻기위하여, 제공해드리는전처리가이드에따라실험을진행해주시기바랍니다. 또한이임상검체전처리가이드는사용자의편의를위하여작성되었음을알려드립니다. Safety Warnings and Precautions BIONEER s Customer Service Center를통하여물질안전보건자료 (MSDS) 를제공받으시기바랍니다. 임상검체전처리가이드의설명에따라검체, 시약, 전용배지등을다루기전에관련된법규및지침에따르도록합니다. 또한임상검체는분자생물학실험과임상실험에자격이있거나잘훈련된자들만이다루어야합니다. 본안내서를철저하게숙지하시고사용되는시약들을점검한후에실험을수행하시기바랍니다. 임상검체를다룰시에는항상장갑을착용하며신체와직접적인접촉이없도록하여야합니다. 만약직접적인접촉이발생한경우병원 ( 기관 ) 의감염관리지침에따라신속하게조치하십시오. 또한실험에사용되는모든소모품들 (tip, tube 등 ) 은항상멸균된상태인것을사용하셔야합니다. 1
[CONTENTS] 1. Processing Sputum.....3 2. Processing Fluids. 4 3. Processing Tissue.... 5 4. Processing FFPE 6 5. Processing Urine..... 7 6. Processing Bacterial Swabs 8 7. Processing Viral Swabs. 9 8. Processing Stool... 10 9. Index....... 11 2
1. Processing Sputum 1.1 검체량 : 1 ml이상 1.2 보관조건및기간 : 냉장 (7일), 냉동 (7일이상 ) 1.3 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, 10N NaOH, 1X PBS buffer (ph 6.8~7.2) 1.4 검체전처리방법 1 Sputum 검체가들어있는용기에 sputum의 1/10 volume의 10 N NaOH를첨가후강하게 3분간 vortex한다 2 상온 (25 C) 에서 15분간 incubation 한다. 주 ) 검체의끈적임이심할경우첨가하는 NaOH양을 2배까지늘리거나 incubation 시간을 30분까지늘릴수있다. NaOH양을늘려도끈적임이풀리지않는경우 conical tube로옮겨검체량과동량의 PBS 혹은 DEPC water를추가하여 vortex 한다. 3 검체를 1분간강하게 vortex한후 1.5 ml을멸균된 1.5 ml microcentrifuge tube에옮긴다. 4 9,000 rpm에서 5분간원심분리후파이펫을이용하여상층액을완전히제거한다주 ) 상층액제거시 pellet 윗부분에하얗게층이형성된경우상층액과함께모두제거하여 cell pellet만남긴다. 5 1X PBS buffer 1 ml을넣은후 30초간 vortex하여 cell pellet을 washing한후 9,000 rpm에서 5분간원심분리하여파이펫을이용하여상층액을완전히제거한다. (2~3회반복) 주 ) 상층액제거시 pellet 윗부분에하얗게층이형성된경우상층액과함께모두제거하여 cell pellet만남긴다. 6 400μl의 Resuspension Buffer 혹은 1x PBS, normal saline 등을첨가한후파이펫을이용하여잘풀어준다 7 6,000 rpm에서 5초간 spin-down 후상층액을추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 3
2 Processing Fluids 2.1 검체종류 : BAL, Pleural fluid, Saliva 등 body fluid 2.2 검체량 : 5 ml이상 2.3 보관조건및기간 : 냉장 (7일), 냉동 (7일이상 ) 2.4 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, 10N NaOH, 1X PBS buffer (ph 6.8~7.2) 2.5 검체전처리방법 1 Fluid type의검체가들어있는 tube를강하게 vortex한후 5~10mL의검체를 Conical tube에옮긴다. 주 ) 검체가끈적할경우 10N NaOH 200μl를첨가하여액상화한후상온에서 15분간 incubation 한다. Fluid에부유물이떠있는경우제거하고사용한다. 2 3,000rpm에서 20분간원심분리후파이펫을이용하여상층액을완전히제거한다 3 1X PBS buffer 1 ml을넣은후 30초간 vortex 한후 1.5ml microcentrifuge tube에옮긴다. 검체를 9,000 rpm에서 5분간원심분리한후파이펫을이용하여상층액을완전히제거한다. 주 ) 상층액제거시 pellet 윗부분에하얗게층이형성된경우상층액과함께모두제거하여 cell pellet만남긴다 4 400μl의 Resuspension Buffer 혹은 1x PBS, normal saline 등을첨가한후파이펫을이용하여잘풀어준다 5 6,000 rpm에서 5초간 spin-down 후상층액을추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 4 (Sample loading well or tube)
3 Processing Tissue 3.1 검체량 : 50 mg ~ 100 mg 3.2 보관조건및기간 : 냉장 (7일), 냉동 (7일이상 ) 3.3 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, shaking incubator(60 ) 3.4 검체전처리방법 1 Tissue 검체 50 mg-100 mg을취하여멸균된 1.5 ml microcentrifuge tube에넣는다. 2 20μl의 proteinase K (20 mg / ml, 별도구매 ), 400μl의 Tissue lysis buffer ( 별도구매 ) 를넣고 60 shaking incubatior에서 tissue가완전히 lysis될때까지 incubation한다. 주 ) 보통 1시간정도소요되며, 필요에따라서는 overnight incubation도가능하다. 3 8,000 rpm에서 2분간원심분리한후상층액을추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 주 ) Pellet 윗부분에하얗게층이형성된경우건드리지말고상층액만취한다 (Sample loading well or tube) 5
4 Processing FFPE(Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissue) 4.1 검체량 : 20 mg이상 4.2 보관조건 : 실온 4.3 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, shaking incubator (56, 60 ) 4.4 검체전처리방법 1 FFPE 검체 20 mg을취하여멸균된 1.5 ml microcentrifuge tube에넣는다. 2 1200ul의 xylene 을첨가하여 vortex 후 56 에서 1시간 Heating 한다. 3 Paraffin이녹은것이확인되면가볍게 vortex 후 13,000rpm/RT/5min 원심분리한다. 4 상층액제거후 1mL의 100% ethanol 을첨가하여 vortexing 한다. 5 13,000rpm/RT/5min 원심분리후상층액을제거하고 1mL의 80% ethanol을첨가하여 vortexing 한다. 6 13,000rpm/RT/5min 원심분리후상층액을제거하고 1mL의 60% ethanol을첨가하여 vortexing 한다. 7 13,000rpm/RT/5min 원심분리후상층액을완전히제거한다. (Tube-Cap을열어실온 10분방치 ) 8 1X PBS buffer 1mL 첨가하여 vortex 후 13,000rpm/RT/5min 원심분리후상층액을제거한다 9 20μl의 proteinase K (20 mg / ml, 별도구매 ), 400μl의 Tissue lysis buffer ( 별도구매 ) 를넣고 60 shaking incubatior에서 tissue가완전히 lysis될때까지 incubation한다. 주 ) 보통 3시간정도소요되며, 필요에따라서는 overnight incubation도가능하다. 10 8,000 rpm에서 2분간원심분리한후상층액을추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 주 ) Pellet 윗부분에하얗게층이형성된경우건드리지말고상층액만취한다. 6 (Sample loading well or tube)
5 Processing Urine 5.1 검체량 : 10 ml이상, 아침첫소변이가장농축된상태이므로권장 5.2 보관조건및기간 : 냉장 (7일), 냉동 (7일이상 ) 5.3 준비물 : Swing rotor centrifuge (3,000 rpm 가능 ), vortex mixer 5.4 검체전처리방법 1 검체가들어있는 tube를 3,000 rpm에서 20분간원심분리한후상층액을모두제거한다 2 400μl의 Resuspension Buffer 혹은 1x PBS, normal saline 등을첨가한후파이펫을이용하여잘풀어준다음추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 주 ) 검체의침사층이많아뻑뻑한경우 buffer의양을침사량의 3배까지늘릴수있다. (Sample loading well or tube) 7
6 Processing Bacterial Swabs 6.1 검체단위 : 1 개 6.2 검체채취방법멸균된전용 brush를이용하여요도 ( 비뇨기과용 brush 사용 ), Vaginal/Cervical 및기관지 ( 호흡기용 brush 사용 ) 등채취하고자하는부위에 2 cm ( 약 1 인치 ) 정도까지넣어부드럽게회전시켜검체를채취후, 전용용기에넣어보관한다. 6.3 보관조건및기간 : 냉장 (7일), 냉동 (7일이상 ) 6.4 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, 1X PBS buffer (ph 6.8~7.2) 6.5 검체전처리방법 1 검체가들어있는 tube를 3분간강하게 vortex한후 500μl를멸균된 1.5 ml microcentrifuge tube에옮긴다주 ) Buffer가들어있지않아건조된 swab 검체는진단에사용할수없다. 주 ) 검체의점성이심하여 Tip에부드럽게딸려오지않는경우 PBS 버퍼를 2mL 추가하여 Vortex하여사용한다. 2 13,000 rpm에서 5분간원심분리한후상층액을완전히제거한다. 3 400μl의 Resuspension Buffer 혹은 1x PBS, normal saline 등을첨가한후파이펫을이용하여잘풀어준다음추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) 주 ) Resuspension이마지막까지잘되지않는고체성입자들은핵산추출중 tip 막힘현상이유발될수있으므로 suspension이된 pellet만사용할것. (Sample loading well or tube) 8
7 Processing Viral Swabs 7.1 검체단위 : 1 개 7.2 검체채취방법멸균된전용 brush를이용하여채취하고자하는부위에 1 인치정도까지넣어부드럽게회전시켜검체를채취후, 전용용기에넣어보관한다. (Nasal swab 경우 ) swab을돌리면서가능한콧속깊숙이넣어분비물이눈에보일정도로채취 ( 코와귀사이길이의 1/3) (Throat swab 경우 ) 목구멍내부편도선표면이나인후두안쪽에 swab을돌리면서가능한깊숙이넣어분비물이눈에보일정도로채취 ( 목젖은건드리지않도록주의한다 ). 7.3 보관조건및기간 : 냉장 (3 일 ), 냉동 (3 일이상 ) 7.4 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer 7.5 검체전처리방법 1 Swab에묻어있는 virus가수송배지혹은 1x PBS, normal saline 등으로잘옮겨나올수있도록 vortex mixer를이용하여강하게섞어준다. 2 1.5 ml microcentrifuge tube에검체 500μl를옮기고 6,000 rpm에서 5초간가볍게원심분리한다. 3 상층액을취하여추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200μl사용 ) (Sample Loading well or tube) 9
8 Processing Stool 8.1 검체량 : 1~2 g 8.2 검체채취방법변에서농, 혈액, 점액이있는부위를 1~2 g 정도깨끗하고건조한용기에담는다. 8.3 보관조건및기간 : 냉장 (3 일 ), 8.4 준비물 : Table top centrifuge (13,000 rpm 가능 ), vortex mixer, shaking incubator (60 ), PBS, Stool lysis buffer ( 별도구매 ), Proteinase K ( 별도구매 ) 8.5 Stool for Virus 검체전처리방법 1 15 ml tube 에약 1 g 의검체를옮겨담은후 9 ml의 PBS 를첨가한다. 2 Tube 를강하게 3 분간 vortexing 해준다. 3 3,000 rpm, 4 에서 20 분간원심분리후상층액을취하여추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400 μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200 μl사용 ) 8.6 Stool for Bacteria 검체전처리방법 1 1.5 ml tube 에 50~200 mg의검체를옮겨담은후 400 μl의 Stool lysis buffer 와 10 μl의 proteinase K (40 mg / ml ) 를첨가한다. 2 Tube 를강하게 1 분간 vortexing 해준후 60 shaking incubator 에서검체가완전히풀어질때까지 incubation 한다. (30 분가량소요 ) 3 검체가완전히 lysis 된후 12,000 rpm 에서 5 분간원심분리후상층액을취하여추출에이용한다. (ExiPrep 16 Dx: 400 μl / 기타 ExiPrep 16 장비 : 200 μl사용 ) 10
9 Index 검사항목검체종류검사항목검체종류 Sputum 결핵 (Tuberculosis) BAL Fluids Influenza/ Adenovirus Tissue 성병 (STD) Urine 폐렴 Swab (Pnuemonia) Nasal Swab Throat swab Sputum Fluids 장내세균 Stool Swab Norovirus Stool Swab HSV Swab CSF HPV Swab 검체 적용검사 관련페이지 Sputum (1 ml이상 ) Tuberculosis, Pneumonia Page 3 Fluids (5 ml이상 ) Bacteria - Tuberculosis, Pneumonia Page 4 Tissue (50 ~ 100 mg ) Tuberculosis, Pneumonia Page 5 FFPE (20 mg이상 ) Tuberculosis Page 6 Urine Tuberculosis, C.trachomatis, N.gonorrhoeae, (10 ml이상 ) M.genitalium, U.urealyticum, STI, etc. Page 7 Bacteria C.trachomatis, N.gonorrhoeae, Swab M.genitalium, U.urealyticum, STI, etc. Page 8 (1 개이상 ) Virus Respiratory virus, Adenovirus, Norovirus, HSV, HPV Page 9 Stool (50 ~ 200 mg /200 μl ) Virus Norovirus, Enterovirus, Enterovirus 71 Page 10 Bacteria V.parahaemolyticus, S.aureus, B.cereus, H.pylori, Y. enterocolitica, S.typhimurium, C.jejuni, Page 10 E.coli O157:H7 11
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