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한국환경분석학회지제 15 권 ( 제 4 호 ) 292~300, 2012 J. of the Korean Society for Environmental Analysis 실시간이온화소스 (DART) 및오비트랩질량분석방법을연계한농약류의신속 정확한정성방법 최원석 장제헌 김윤덕 최재원 K water 수질분석연구센터 Fast and Accurate Identification of Pesticides by Real Time Ionization (DART) with Orbitrap Mass Spectrometry Wonseok Choi, Jeheon Jang, Yunduck Kim, and Jaewon Choi Water Analysis & Research Center, K water, Daejeon 306-711, Korea Received October 21, 2012/Revised December 21, 2012/Accepted December 31, 2012 It must be immediate ready for possible chemical terrorism that might range from water or food contamination. In April 2012, there has been real pesticide attack in small scale drinking water facility at Hongsung area. Early detection of any terrorism is dependent on a strong public health system. The objective of this study was to develop a high-speed and accurate analytical method to identify pesticides in water using direct analysis in real time (DART) ionization and accurate mass scanning by Orbitrap mass spectrometry. Ionization temperature and time for DART were set at 300 o C and 30 s, respectively. Resolution, scan range and mass accuracy for Orbitrap mass spectrometry were operated at 50,000, 100~500 and 5 ppm, calculted parts per million unit of monoisotope, respectively. Xcalibur 2.1 was used for identification and mass accuracy test. Protonated molecular ions and carbon or chlorine isotopes for tested compounds were identified within 1 ppm mass accuracy. Acetochlor (C 14 H 20 ClNO 2 ) was randomly selected for sensitivity test. Protonated molecular ion m/z 270.1258 and chlorine isotope for identification m/z 272.1231 were detected with ratio of 3:1 for 100 to 1 ng/ml. This indicated that this approach is a sensitive and available direct analysis without sample preparation in case of urgent accidents. Key words: real time ionization, Orbitrap mass spectrometry, pesticides, water 1. 서론최근화학물질에의한수질, 토양오염사고및이에대응한신속확인방법이요구되고있다. 2012년 4월 20일홍성마을상수도에서일어난농약류투입사고 1) 의경우와같이실시간주민의음용과직결되는경우, 매우신속한원인물질진단이요구된다. 현시점에서실시간기반의개별화학물질센서가존재하지않는한, 실험실에서의원인물질확인방법은물시료의추출과농축을거쳐목적물질 (target compounds) 위주로기기분석을하게되는데번거로운시험절차가동반되 고혼입성분을확정하는데어려움이있다. 가장이상적인성분규명중한가지는전범위스캐닝질량분석기술 (full scanning mass spectrometry) 을활용하는것이나기존의사중극자방식의스캐닝은분해능측면에서정확한성분을확정하는데난점이있다. 이방법은아주높은농도로사고가일어난경우에대해한정적으로사용할수있을것으로생각되나일반적으로사고사례는 µg/l 범위이기때문에기기분석전에시료의농축단계가필수이다. 한편시료중의목적물질은농축을포함한전처리시에소실될우려가있는데, 예를들어액-액추출의경우, 극성물질들의소실가능성과고 To whom correspondence should be addressed. Tel: +82-42-629-2041, Fax: +82-42-629-2079, E-mail: choijw@kwater.or.kr

실시간이온화소스 (DART) 및오비트랩질량분석방법을연계한농약류의신속 정확한정성방법 293 상추출 (solid-phase extraction, SPE) 의경우, 대상물질과흡착재사이에물리화학적성질에선택성의한계로인해원인물질의흡착, 농축에대한보장이어렵다. 최근에시료를처리없이바로이온화하여질량분석기로도입하는기술이활발하게소개되고있으며근년들어다양한적용사례가소개되고있다 2-7). 이러한기술들은모두공기중이온화방법 (ambient ionization) 또는대기압탈착방법 (desorption atmospheric ionization) 이라고불리는이온화방법을근간에두고있으며가장대표적인방법들은 2004년에소개된탈착전자분무이온화방법 (desorption electrospray ionization, DESI) 8) 과이듬해인 2005년에발표된실시간이온화방법 (direct analysis in real time, DART) 9) 이래다양한시도가이뤄지고있다. 기존미량유해물질의성분확인및정량시고전적으로사용되어지던고성능액체크로마토그래피 (high performance liquid chromatograph, HPLC) 를이용한분리및정제후질량분석검출기로분석하던방법에서 HPLC를포함한정제-농축과정을생략하고실시간으로시료의전처리가없이직사분사방식의이온화를가능하게하는방법이다. 이방법들은시료의성상을변화시키지않고전처리도요구하지않으므로고속대량스크리닝 (High Throughput Screening, HTP) 의요구에적합하여법의학, 국방과학, 의약, 식품분야에서활용중이다 10). 또한 DESI나 DART 방법들은기존의삼중사중극자 (triple quadrupole) 방식의 MS/MS와연계된측정사례도많지만 11,12) 미지물질의확인은고분해능의 full scanning 질량분석기 (high resolution and accurate mass spec., HRAM) 가결합된방법 13-15) 이확률적으로높은가능성을제시할것으로판단된다. 본연구는시료의실시간이온화방법인 DART를 오비트랩고분해능질량분석법과연계하여매우짧은시간에분석종료및원인물질을정확히확인할수있는방법을검토하여수질에서의활용가능성을제안하고자한다. 이번실험에서는예비검토를위해국내에서유통량및사용빈도가높은농약들의수질오염 을가정하여우선검토대상물질은 fenpropathrin, azinphos methyl, dichlorovos, phorate, hexazinone, edifenfos, diazinon, tefluthrin, bromacil, prothiofos, trichlorfon, prometryn, iprobenfos, fenitrothion, isoproturon, isoxathion, procymidon, metribuzin, acetochlor, propiconazole, terbutryn, terbufos, pyrazophos 로 23종을선정하였다. 또한수질오염에서실제로일어날수있는낮은 µg/l 수준의저농도시료에대한정성가능성을검토하였다. 2. 재료및방법 2.1. 시약및기구분석대상인농약류는 Dr. Ehrenstorfer(Augsburg, Germany) 에서구매하였으며, 메탄올에용해된 10~100 µg/ml 범위의단품을이용하였으며, 검토물질은 fenpropathrin, azinphos methyl, dichlorovos, phorate, hexazinone, edifenfos, diazinon, tefluthrin, bromacil, prothiofos, trichlorfon, prometryn, iprobenfos, fenitrothion, isoproturon, isoxathion, procymidon, metribuzin, acetochlor, propiconazole, terbutryn, terbufos, pyrizophos로총 23화합물로구성하였다. 각표준물질에대한화학구조와분자량등에관한정보를 Table 1 에요약하였다. 표준물질은메탄올로희석하여 50~100 ng/ml 범위에서미세마이크로피펫으로 10 µl 분취하여실시간이온화방법의검토에사용하였다. Table 1. Chemical formula, molecular weight and structure of target pesticides Compound CAS number Formula Molecular weight Chemical structure Fenpropathrin 39515-41-8 C 22 H 23 NO 3 349.4 Azinphos-methyl 86-50-5 C 10 H 12 N 3 O 3 PS 2 317.3 Diazinon 333-41-5 C 12 H 21 N 2 O 3 PS 304.3

294 최원석 장제헌 김윤덕 최재원 Table 1. Continued Compound CAS number Formula Molecular weight Chemical structure Phorate 298-02-2 C 7 H 17 O 2 PS 3 260.3 Bromacil 314-40-9 C 9 H 13 BrN 2 O 2 261.1 Trichlorfon 66758-31-4 C 4 H 8 Cl 3 O 4 P 257.4 Isoxathion 18854-01-8 C 13 H 16 NO 4 PS 313.3 Prometryn 7287-19-6 C 10 H 19 N 5 S 241.3 Procymidone 32809-16-8 C 13 H 11 Cl 2 NO 2 284.1 Iprobenfos 26087-47-8 C 13 H 21 O 3 PS 288.3 Metribuzin 21087-64-9 C 8 H 14 N 4 OS 214.2 Fenitrothion 122-14-5 C 9 H 12 NO 5 PS 277.2 Acetochlor 34256-82-1 C 14 H 20 ClNO 2 269.7 Isoproturon 34123-59-6 C 12 H 18 N 2 O 206.2 Propiconazole 60207-90-1 C 15 H 17 Cl 2 N 3 O 2 342.2 Dichlorovos 95828-55-0 C 4 H 7 Cl 2 O 4 P 220.9

실시간이온화소스 (DART) 및오비트랩질량분석방법을연계한농약류의신속 정확한정성방법 295 Table 1. Continued Compound CAS number Formula Molecular weight Chemical structure Hexazinone 51235-04-2 C 12 H 20 N 4 O 2 252.3 Edifenfos 17109-49-8 C 14 H 15 O 2 PS 2 310.3 Pyrazophos 13457-18-6 C 14 H 20 N 3 O 5 PS 373.3 Tefluthrin 79538-32-2 C 17 H 14 ClF 7 O 2 418.7 Prothiofos 34643-46-4 C 11 H 15 Cl 2 O 2 PS 2 345.2 Terbutryn 886-50-0 C 10 H 19 N 5 S 241.3 Terbufos 13071-79-9 C 9 H 21 O 2 PS 3 288.4 2.2. 실시간이온화 (Direct Analysis in Real Time) 방법본연구에서는시료의전처리과정을최소화하고분석시간을단축하기위해실시간이온화방법을적용하였다. 실시간이온화방법의구조등개략도는 Fig. 1에도시하였다. 시료의이온화는 DART(Direct Analysis in Real Time) 방식의 SVP 모델 (Ion Sense TM, MA, USA) 을사용하였으며, 이온화에사용가능한온도범위는 50~500 o C이며본연구에서는 300 o C를적용하였고, 이온화및기기분석시간은 30초를적용하였다. Fig. 1. Structure and ionization flow of DART. Table 2. Operating condition of desorption ionization probe Instrument DART-SVP Temperature 300 o C Sample loading vol. 10 µl Carrier gas, pressure helium, 75 psi DART 의운영조건을 Table 2 에요약하였다. 2.3. 기기분석기기분석은고분해능 full range scan 방식을적용한 Orbitrap Exactive(Thermo-Fisher, Bremen, Germany) 모델을사용하였다. 장비의분해능과측정질량의정성 (identification) 기준인질량정확도 (mass accuracy) 는각각 50,000 및 5 ppm 이하조건에서측정하였다. Orbitrap 질량분석기의운영세부조건을 Table 3에제시하였다.

296 최원석 장제헌 김윤덕 최재원 Table 3. Operating condition of DART-Orbitrap mass spectrometer Instrument Orbitrap Exactive (Thermo, CA, USA) Scan range 100~500 Resolution 50,000 Polarity positive Run time 0.5 min Ionization source DART-SVP model Spray voltage 1.5 Kv Capillary temp. 250 o C Capillary voltage 25 V Tube lens voltage 170 V Skimmer voltage 36 V 3. 결과및고찰 3.1. 표준물질인퀴논의질량스펙트럼과정확도본연구에서시도한탈착이온화방식인 DART에서이온화메커니즘은 Penning 이온화 16) 라고하는신규이온화방법을채택한것으로서전자적들뜬상태에있는원자 ( 또는분자 ) M이다른원자나분자 S와충돌하였을때전자의들뜸에너지가후자에인도되고그에너지를사용하여후자가이온화되는아래와같은이온화기작을따르게된다. 또한운반기체인헬륨은공기중의물분자와충돌하여물분자에서전자를방출하게되고들뜬상태의물분자는다른물분자와충돌을반복하면서반응성이높은전하를띄게되어대상분자와충돌시주로수소만치환되는단순한이온화가유도된다. LC/MS분석에서가장많이사용하는전자분무방식 (Electrospray, ESI) 의경우, 분석하고자하는물질을 HPLC를필수로장착하여용매를혼합하여시료를이온화하며이경우, 수소외에도 Na +, K + +, NH 4 등의이온과분석물질과의반응이가능하므로분석성분의 정량전에이온화형태에대한특성확인이필수적임에비하여본연구에서적용한이온화방법은이러한과정을필요로하지않는장점이있다고할수있다. M * +S S + +M+electron He(2 3 S)+H 2 O H 2 O + + He(1 1 S) + electron H 2 O + +H 2 O H 3 O + +OH H 3 O + + n H 2 O [(H 2 O) n H] + [(H 2 O) n H] + +M MH + + n H 2 O 검토대상농약들의정성분석에앞서예비테스트를위한표준물질로서퀴닌 (quinine, C 20 H 24 N 2 O 2 ) 을선정하여 DART-Orbitrap MS에서이온스펙트럼을검토하였다. 예비시험농도는 1ng/µL 농도의 1차희석액을마이크로피펫으로 10 µl 메탈메쉬에도포하여 Table 2의운용조건에서 Orbitrap MS의스캔범위를 100~500 amu에서설정하였다. 퀴닌의이온화스펙트럼은 Fig. 2에나타내었다. 측정결과는 full scan 스펙트럼중퀴닌의분자량인 324 amu 부근의스캔범위를확대하여 Xcalibur 2.1의원자조성 (elemental composition) 을이용하여추정한결과, [M+H] + 및탄소동위원소들이확인되었다 (Fig. 2). 이때측정된질량정확도 (mass accuracy) 는 0.632 ppm(monoisotope 계산값과실측의오차를백만배로환산한단위 ) 로서 1ppm 정확도이내에서성분확인이가능하였다. 퀴닌의이온화스펙트럼에서보듯이 [M+H] + 를기준으로탄소동위원소들이규칙적으로분포하며이는시뮬레이션결과에서도높은유사성이관찰되었다. 따라서본방법은탈착이온화방법을통해서분석컬럼을거치치않고도 1분이내의매우짧은시간에단순한이온화스펙트럼을이용한성분확인이가능하며, 이온화된성분은고분해능 MS 측정을통해정성에대한높은신뢰도를얻을수있는방법으로판단되었다. Fig. 2. Preliminary expanded ionization spectrum of Quinine (C 20 H 25 O 2 N 2 ).

실시간이온화소스 (DART) 및오비트랩질량분석방법을연계한농약류의신속 정확한정성방법 297 3.2. 대상물질들의질량스펙트럼측정결과 23종의각농약표준물질희석액을 500 ng/ml씩준비하여 3.1에서검토한 DART-Orbitrap MS조건에서 3 회씩측정하였다. 각데이터는질량스펙트럼을관찰하여성분별주요검출이온에대해원소조성시뮬레이션프로그램을이용하여측정질량의정확도를비교, 확인하였다. 대상성분의주요질량스펙트럼과질량정확도를 Table 4 및 Fig. 3에요약하였다. 농약들은 3.1의퀴논과같이모두분자구조에수소가치환된 [M+H] + 형태로검출되었고나트륨 (Na) 및암모니아 (NH 4 ) 가치환된이온의형태는검출되지않아 3.1의 penning 이온화메커니즘을따르는것으로나타났다. 또한고분해능질량분석데이터의스펙트럼을확대하여분자이온근처에탄소동위원소들이규칙적으로분포하고있음을확인하였다. 대상농약중염소원자를포함하는 procymidone, acetochlor, propiconazole, dichlorovos, tefluthrin, prothiophos는염소동위원소인 35와 37의자연존재비율인 3:1, 브롬원자를포함하는 bromacil는브롬동위원소인 79와 81의자연존재비율인 1:1로질량스펙트럼이분포하였고, 동위원소이외의조각이온들 은거의무시할수있는수준이었다. 한편, 질량정확도 (mass accuracy) 의범위는 0.053~0.870 ppm으로관찰되어 1ppm 이내를만족하였으며, 이는유럽연합 (EU) 에서고분해능질량분석방법으로식품류의농약을분석할때성분확인의정도관리기준으로제시한 5ppm 이하를충분히만족하였다. 따라서, 고분해능질량분석방법과조합을이룬 DART의탈착이온화방식은정성 (identification) 분석방법으로큰장점을가지는것으로판단하였다. 3.3. 수질오염을고려한저농도테스트본연구에서검토한분석방법은수분이내에정확한정성분석을가능하게하는방법으로서수질사고시원인규명과결과통보를통한신속한현장대응과같은분야에높은활용도가예상된다. 그러나화학물질에의한대부분의수질사고는다이옥산, 유류오염, 농약살포등의사례에서보듯 µg/l 수준으로발생하고있어서저농도시료에대한정성분석의성능이요구된다. 여기서는수질오염에서실제로일어날수있는낮은 µg/l 수준의저농도시료에대한검출가능성을검토하기위해 3.2에서검토한농약중하나인 acetochlor Table 4. Protonated or molecular and isotopes for identification within 5 ppm mass accuracy Compound [M+H] + Qual ion1 Qual ion2 Qual ion3 Qual ion4 Fenpropathrin 350.1754 351.1784 352.1815 353.1843 Azinphos-methyl 318.0131 319.0166 320.0088 321.0122 322.7027 Diazinon 305.1083 306.1114 307.1038 308.1071 309.2028 Phorate 260.9805 261.9837 262.9761 Bromacil 261.0235 262.0266 263.0209 264.0240 Trichlorfon 256.9301 258.9271 260.9241 262.9208 Isoxathion 314.0610 315.0639 316.0564 317.0595 318.0609 Prometryn 242.1436 243.1459 244.1386 245.1417 Procymidon 286.0297 287.0275 288.0253 Iprobenfos 289.1022 290.1054 291.0978 292.1010 Metribuzin 215.0962 216.0989 217.0914 218.0946 Fenitrothion 278.0247 279.0278 280.0202 281.0232 282.027 Acetochlor 270.1255 271.1288 272.1226 273.1262 Isoproturon 207.1494 208.1522 209.1554 Propiconazole 342.0772 344.0739 346.0708 Pyrazophos 374.0932 375.0101 376.3505 Dichlorovos 222.9497 221.9448 224.9465 Hexazinone 253.1660 254.1688 255.1725 Edifenfos 311.0326 312.0306 313.0282 314.0317 315.2685 Tefluthrin 419.0645 420.0664 421.0615 Prothiofos 346.9667 348.9633 350.1746 Terbutryn 242.1435 243.1462 244.1387 245.1420 Terbufos 289.0515 290.0550 291.0572

298 최원석 장제헌 김윤덕 최재원 Fig. 3. Molecular and isotopes of expanded spectrum of target pesticides.

실시간이온화소스 (DART) 및오비트랩질량분석방법을연계한농약류의신속 정확한정성방법 299 (C 14 H 20 ClNO 2 ) 를선정하여실험실의수돗물에단계적으로 100, 50, 20, 10, 5, 1 ng/ml까지희석하여금속메시표면에각각 10 마이크로리터를도포하여분석하였다. 분석후 acetochlor의농도별질량스펙트럼을 Fig. 4에나타내었다. Acetochlor의 isotopic mass 는 269.271 amu이고정성으로이용한정밀질량은 [M+H] + 및 [M+H] + 의염소동위원소인 270.1258 amu와 272.1231 amu로서이들은최저농도인 1ng/ ml에서도약 3:1의비율로관찰되었다. 따라서 DART- Orbitrap MS에의한신속정확한정성방법은고농도에서뿐만아니라실제수질오염에서일어날수있는저농도의미량성분에대한분석가능성을제시하였다. 3.4. 실시간이온화방법의생산성및활용도최근에일어났던소규모상수시설에대한농약투입사고및노인정시설의농약중독사고사례에서보는바와같이불특정집단을대상으로한음용수, 식품에대한화학물질테러에대한긴급대응의필요성이제기되고있다. 본연구진이농약등에대한기존의일반적인미량분석을통한원인물질판단시에소요되는시간은시료 5개를고려시이상적인조건에서 0.5-1 L 정도의시료양을이용한여과, 액-액 (LLE) 또는고상추출 (SPE) 및농축에약 2.5~3시간과기기분석약 1.2시간소요만고려하더라도본연구에서적용한방법이불과시료양 10 µl와시료당 0.5분의분석시간을필요로하므로기존방법과비교하면신속성측면에서실시간이온화방법은매우활용도가높은방법이라고판단되 었다. 한편, 본연구에서는검토하지않았지만최근 DART- 질량분석방법을적용한정량성검토사례 17,18) 가보고되고있어서이들처럼시료주입방법을자동화하여검정곡선을작성하여미량정량성까지보장된다면원인물질의규명과농도확인을동시에수행할수있는방법으로서수질, 식품, 토양등의분야에매우높은활용도가기대된다. 또한 DART를포함한탈착이온화방법은 3.1에서언급한바와같이이온화메커니즘이단순하여최적화에필요한시간을줄일수있고, HPLC를이용시에필요한용매, 컬럼, 조건확립시간등의비용부담에대한효과도있어서정량성을포함하여향후환경분석에다양한적용이이뤄질것으로예상된다. 4. 결론본연구는수질사고등과같은사례에신속대응을위하여최근소개되고있는탈착이온화방법 (desorption ionization method) 중에서실시간이온화방법인 DART와고분해능질량분석법 (HRMS) 을조합하여시료의전처리없이극소량의시료양을적용하여주요농약류을대상으로수질의미량측정방법으로서의성능을검토한결과, 다음과같은결론을얻었다. 1. DART-Orbitrap MS 조합을이용하여농약류를분석한결과, 시료의전처리없이매우짧은시간내에질량정확도 1ppm 이내의정확한정성결과의확인이가능하였으며, 특히탈착이온화방법은고분해 Fig. 4. Sensitivity test of acetochlor spiked in tap water.

300 최원석 장제헌 김윤덕 최재원 능질량분석장치와의조합에서우수한정성성능을보여줄것으로판단된다. 2. 본방법은 acetochlor를이용한감도테스트에서 1 ng/ml 수준까지검출성능을보여주어미량검출방법으로서의가능성을보여주었고향후정량성 (quantitation) 이함께검토된다면기존의시간과노동력을요구하였던정성, 정량방법을보완할수있을것으로판단되었다. 3. 탈착이온화방법은분석시간, 노동력측면에서큰절감효과가있는것으로나타났으며, 다량의용매, 분석컬럼도사용하지않는등환경측면을고려한간편분석기술로서도적용성이기대되며특히환경사고등시급성을요구하는분석에서높은활용도가기대된다. 참고문헌 1. http://www.daejonilbo.com/news/newsitem.asp?pk_no =1001981. 2012.4.24 2. J.P. Williams, V.J. Patel, R. Holland and J.H. Scrivens, Rapid Commun. Mass Spectrom 2006, 20, 1447-1456. 3. I. Cotte-Rodriguez, H. Hernandez-Soto, H. Chen and R.G.Cooks, Anal. Chem 2008, 80, 1512-1519. 4. T.J. Kauppila, V. Arvola, M. Haapala, J. Pol, L. Aalberg, V. Saarela, S. Franssila, T. Kotiaho and R. Kostiainen, Rapid Commun. Mass Spectrom 2008, 22, 979-985. 5. J. Dalhleish, M. Wleklinski, J. Shelley, C. Mulligan, Z. Ouyang and R.G. Cooks, 60th ASMS, 2012, MP 681, Vancouver, Canada. 6. P. Dwivedi, J. Keelor, P. Holmes and F. Fernandez, 60th ASMS, 2012, MP 684, Vancouver, Canada. 7. M. Wells, M. Goodwin, M. Stump, M. Fico, M. Gildersleeve and B. Solomin, 60th ASMS, 2012, TP 649, Vancouver, Canada. 8. Z. Takats, J.M. Wiseman, B. Gologan and R.G. Cooks, Science 2004, 306, 471-473. 9. R.B Cody, J.A. Laramee and H.D. Durst, Anal. Chem 2005, 77, 2297-2302. 10. J. Gross, Mass Spectrometry 2011, 2nd ed., DOI 10.1007/978-3-642-10711-5_13, 11. A.R. Lachapelle and S. Sauv, 60th ASMS, 2012, WOA, Vancouver, Canada. 12. M. Solliec, D. Masse, D. Lapen and S. Sauv, 60th ASMS, 2012, MP 545, Vancouver, Canada. 13. A.G. Escudero and C. Thompson, 60th ASMS, 2012, TP 623, Vancouver, Canada. 14. S.W. Cha, 60th ASMS, 2012, WP 338, Vancouver, Canada. 15. J.M. Wiseman, D.R. Ifa, A. Venter and R.G. Cooks, Nature Protocols 2008, 3, 517-524 16. L. Song, C.G. Stephen, D. Bhandari, D.C. Kelsey and J.E. Bartmess, Anal. Chem 2009, 81, 10080-10088. 17. L. Yan-Jing, W. Zhen-Zhong, B. Yu-An, D. Gang, S. Long-Sheng, Q. Jian-Ping, X. Wei, L. Jia-Chun, W. Yong-Xiang and W. Xue, 60th ASMS, 2012, ThP 644, Vancouver, Canada. 18. M. Haunschmidt, C.W. Klampfl, W. Buchberger and R. Hertsens, Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397, 269.