1 2 3 4 55 66 84 86 89 90 91 95 96-1 -
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λ α - 10 -
λ α 연구목표내용달성도 (%) 채집장소선정및사전현장조사 ( 답사 ) 100% 채집방법및실내조건사육체계의확립 100% 얼룩날개모기종분류기술확립및실제분류과정에적용 100% 연구대상지역 (4 곳 ) 내얼룩날개모기群의살충제감수 ( 저항 ) 성평가 80% - 11 -
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약제명 ( 빨간집모기군의반수치사농도 ppm a ) 약제저항성진단농도 (ppm a ) ( 적하액의농도 b ) 빨간집모기군의진단기준 레벨 1 레벨 2 레벨 3 레벨 1 레벨 2 Fenitrothion (0.007) 0.03 (7.5) 0.1 (25) 1.0 (250) 0.08 (20) 0.3 (75) Fenthion (0.002) 0.008 (2.0) 0.03 (7.5) 0.3 (75) 0.03 (7.5) 0.1 (25) Temephos (0.008) 0.003 (0.75) 0.001 (2.5) 0.1 (25) 0.015 (3.75) 0.05 (12.5) Permethrin (0.008) 0.03 (7.5) 0.1 (25) 1.0 (250) 0.015 (3.75) 0.05 (12.5) Ethofenprox (0.01) 0.04 (10) 0.15 (37.5) 1.5 (375) 0.02 (5.0) 0.07 (17.5) Pyriproxyfen (0.00005) 0.005 (1.25) 0.001 (0.25) 0.01 (2.5) 0.002 (0.5) 0.001 (0.25) - 34 -
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원제및제제명 시용량 /ton ( 유제, 분제 /m 2 ) 상품명 Temephos (5%) 수화제 10-20 g Abate 수화제 Chlorpyrifos-methyl dichlorvos(0.5/0.3%) 油劑정체수역 5-10 ml/m 2 자테르 VP 油劑 Chlorpyrifos-methyl (10%) 乳劑 5-10 g 자테르乳劑 Chlorpyrifos-methyl (3%) 입제 15-30 g 자테르입제 Chlorpyrifos-methyl dichlorvos(5/2%) 乳劑 30 ml 자테르 VP 乳劑 Fenitrothion (10%) 乳劑 20 ml 스미치온乳劑 Fenitrothion (1.0%) 油劑정체수역 5-10 ml/m 2 스미치온油劑 Fenitrothion (1.5%) 분제 7 g 스미치온분제 Fenitrothion (10%) 플로아블제 20 ml 스미치온 10 FL Fenitrothion (10%) 수용제 5-10 g 스미치온수용제 Fenitrothion (1.0%) 부유분제 0.2-1.0 g/m 2 스미치온플로우팅분제 Fenitrothion phthalthrin (5/0.5%) 乳劑 20 ml 스미치온 NP 乳劑 Fenitrothion phthalthrin (5/0.5%) 플로아블제 20 ml 스미치온 NP*FL Fenitrothion phthalthrin (5/0.5%) 수용제 10 배희석 25-50 ml 스미치온 NP 수용제 Fenitrothion dichlorvos (5/2%) 乳劑 30 ml 스미치온 VP 乳劑 Fenthion (5%) 乳劑 20-40 ml 바이텍스乳劑 Fenthion (5%) 水性乳劑 20-40 ml 바이텍스水性乳劑 Fenthion (5%) 수용제 20-40 g 바이텍스수용제 Fenthion (1%) 부유제 10 g 바이텍스부유제 Fenthion (5%) 입제 20-40 g 바이텍스입제 - 37 -
원제및제제명 시용량 /ton ( 유제, 분제 /m 2 ) 상품명 Fenthion 발포정 4 정바이텍스발포정 Fenthion dichlorvos (5/2%) 乳劑 30 ml 바이텍스 VP5/2 乳劑 Fenthion dichlorvos (3/2%) 乳劑 40 ml 바이텍스 VP3/2 乳劑 Fenthion dichlorvos (0.5/0.3%) 油劑 5-10 ml/m 2 바이텍스 VP 油劑 Diazinon (5%) 乳劑 40 ml 다이아지논乳劑 Diazinon (5%) 水性乳劑 40 ml 다이아지논水性乳劑 Diazinon (1.0%) 분제 1.0 g/m 2 다이아지논분제 Diazinon dichlorvos (5/2%) 乳劑 10-20 ml 다이아지논 VP 乳劑 Diazinon dichlorvos (0.5/0.3%) 油劑 5-10 ml/m 2 다이아지논 VP 油劑 Trichlorfon (20%) 水性乳劑 7.5-10 ml 디프테렉스水性乳劑 Trichlorfon (2%) 분제 10 g/m 2 디프테렉스분제 Dichlorvos (5%) 乳劑 40 ml VP 乳劑 Dichlorvos (0.3%) 油劑정체수역 5-10 ml/m 2 VP 油劑 Pyridaphenthion (10%) 乳劑 10 ml 오후나크乳劑 Pyridaphenthion (10%) 입제 10-20 g 오후나크입제 Pyridaphenthion dichlorvos (5/2%) 乳劑 15-30 ml 오후나크 VP 乳劑 Propetamfos (3%) 乳劑 30-50 ml 사후로친乳劑 Propetamfos dichlorvos (3/2%) 乳劑 30-40 ml 사후로친 VP 乳劑 Propetamfos dichlorvos (0.3/0.2%) 油劑 5-10 ml/m 2 사후로친 VP 油劑 Ethofenprox 5% S-421 11% 乳劑 10-20 ml 레나톱乳劑 Methoprene (10%) 현탁제 b) a) 200배희석액 1-2 L 500배희석액 1.25~2.5 L 알토시드 10F Pyriproxyfen (0.5%) 입제 10 g 스미라브입제 Pyriproxyfen (0.5%) 발포입제 2-4 g 스미라브발포입제 Pyriproxyfen (0.5%) 발포정 a) 1-2 정 b) 0.5-1 정스미라브발포정 Diflubenzuron (25%) 수화제 2-5 g 디밀린수화제 - 38 -
살충제 유형 a 유효성분 약량, (g/ha) 제형 b 효과지속 기간 ( 週 ) 경구독성 ( 쥐 ) LD 50 (g/kg) B. thuringiensis H-14 MI 100-6000 AQ, BR, GR, WP 1-2 >30,000 B. sphaericus MI 500-5000 BR, EC, GR 2-8 >5,000 Chlorpyrifos OP 11-25 EC, GR, S, WP 3-17 135 Chlorpyrifos-methyl OP 30-100 EC, WP 2-12 >3000 Diflubenzuron IGR 25-100 GR, WP 2-6 >4640 Fenitrothion OP 100-1000 EC, GR 1-3 503 Fenthion OP 22-112 EC, GR 2-4 586 Fuel oil - c soln 1-2 negligible Jodgenphos OP 50-100 EC, GR, S 7-16 U Malathion OP 224-1000 EC, GR, S 1-2 2100 Methoprene IGR 100-1000 BR, S, SRS 2-6 34,600 Phoxim OP 100 EC 1-6 1975 Pirimphosmethyl OP 50-5-00 EC, GR, S 1-11 2018 Pyriproxyfen IGR 5-10 EC, GR 4-12 >5000 Temephos OP 56-112 EC, GR, S 2-4 8600 Triflumuron IGR 40-120 EC, WP 2-12 >5000-39 -
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그림 4. 살충제의독작용과정 ( 자료출처 ; Narahashi 등 (1977)) - 49 -
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μ μ - 51 -
μ μ 표 13. 살충제저항성의수준 μ μ μ - 52 -
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그림 9. 얼룩날개모기의채집과개체분리 - 61 -
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피레스로이드 (Pyrehtorid) 계 (2종) 살충제인 λ-cyhalothrin과 deltamethrin, 유기인 (Oragnophosphate) 계 (2종) 살충제인 pirimiphos-methyl과 temephos, 카바메이트 (Carbamate) 계 (1종) 살충제인 bendiocarb, 네오니코티노이드 (Neonicotinoid) 계 (1종) 살충제인 imidacloprid. 피라졸 (Pyazole) 계 (1종) 살충제인 chlorfenapyr 모두 7종의살충원제를사용하였다. 이들살충원제의순도및구입처를표 14와그림9에나타내었다. 기타화합물은시약등급의것을사용하였다. λ-cyhalothrin deltamethrin pirimiphos-methyl temephos bendiocarb imidacloprid chlorfenapyr - 63 -
λ-cyhalothrin deltamethrin pirimiphos-methyl temephos bendiocarb imidacloprid chlorfenapyr - 64 -
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경기도파주지역에서채집된얼룩날개모기개체중에서는 - 74 -
경기도연천지역에서채집된얼룩날개모기개체중에서의종간비중의경우도동일한경기지역인파주에서마찬가지로잿빛얼룩날개모기 잿빛얼룩날개모기 - 75 -
기존의채집된개체를대상으로살충제감수성및저항성을평가하기위해서는살아있는상태로종을동정하기때문에형태적종동정만진행하거나또는개체의일부조직을적출하여분자생물학적방법으로종동정을실시해야하기때문에형태적종동정에따른분류상의오류나개체의조직을적출하는과정에서각개체의치사와같은손실을가져올수있다. 그러나표준화된계통분리체계를활용할경우개체의확보및분자생물학적방법을위한신속하고정확한개체별종동정이가능한장점을가지고있다. 또한콜로니별로동일종을그룹화하기때문에채집된개체를직접적으로살충제감수성및저항성평가생물검정에사용하는것보다유전적으로동일성을가지게됨으로계통간의유전적차이에의한살충제감수성및저항성의오차를비교적줄일수있어살충제감수성과저항성에대한통계적평가에보다용이한장점을가지고있다고생각된다. 살충제감수성및저항성평가를위해모기성충이아닌유충을대상으로생물검정을실시하게되면먼저암수구별없이실험을진행할수있어암수구별에따른실험대상개체손실을줄일수있고유충을대상으로하는직접접촉살충생물검정 (direct-contact mortality bioassay) 방법의경우국소미량점적법 (micro topical application method) 보다살충원제에대한노출이일정하고실험수행적측면에서도 - 76 -
성충을다루는것보다유충을다루는것이비교적수월하기때문에실험수행에능숙하지않은실험자도 충분히쉽게모기의살충제감수성및저항성을평가할수있는장점을가지고있다. 그림 22. 단일세대사육및계통분리체계모식도 피레스로이드계살충제인 λ-cyhalothrin의지역별살충제감수성을표 15과같이나타났다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 경기도연천을제외한인천강화, 경기파주, 강원철원 3곳중에서경기도파주에서채집된모기군집의반수치농도가 0.0012 ppm으로가장높은감수성을나타내었으며, 인천강화에채집된개체군의반수치사농도 0.1685 ppm으로가장낮은감수성을나타내었다. 가장낮은경기도파주를기준으로인천광역시강화지역은 140.4배의저항성을나타냈으며, 21.8배의저항성을보이는것으로나타났다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우도중국얼룩날개모기와유사하게경기도파주지역에서채집된모기개체군이반수치사농도 0.001 ppm으로가장높은감수성을나타내었으며, 반면인천광역시강화지역에서채집된모기개체군이반수치사농도 0.3677 ppm으로가장낮은살충감 - 77 -
수성을나타내었다. 가장높은감수성을나타낸경기도파주지역개체군을기준으로인천광역시강화 지역개체군은 367.7 배의저항성을나타내는것으로산출되었으며, 경기도연천에서채집된개체군은 26.2 배, 강원도철원에서채집된개체군은 19.7 배의저항성을보이는것으로평가되었다. 표 16. λ-cyhalothrin ( 피레스로이드계 ) 의지역별살충감수성 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 와잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의종간살충저항성은인천강화지역개체군의경우, 잿빛얼룩날개모기가중국얼룩날개모기보다 2.2배가량저항성을보이는것으로나타났다. 경기파주지역개체군의경우두종간의살충감수성이거의유사하였다. 강원철원지역개체군의경우는인천강화지역개체군과반대로잿빛얼룩날개모기가중국얼룩날개모기보다 5.7배가량살충감수성이높은것으로나타났다. λ-cyhalothrin과마찬가지로피레스로이드계살충제인 deltamethrin의지역별살충제감수성을표 16과같이나타났다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 경기도연천과강원도철원을제외한인천강화, 경기파주 2곳중에서경기도파주에서채집된모기개체군이반수치사농도 0.0015 ppm으로인천강화지역에서채집된모기개체군의반수치사농도 0.0602 ppm보다 40배이상높은살충감수성을보이는것으로나타났다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우, 인천강화를제외하고경기파주, 경기연천, 강원철원 3곳중에서경기파주에서채집된개체군의반수치사농도 0.0012 ppm으로가장높은살충감수성을나타냈고강원도철원지역에서채집된개체군이반수치사농도 0.1239 ppm로가장낮은살충감수성을나타내었다. 가장높은감수성을보인경기파주지역을기준으로경기연천지역개체군은 24배의저항성을나타내었으며, 강원철원개체군의경우 103.3배의저항성을나타내는것으로평가되었다. - 78 -
표 17. Deltamethrin ( 피레스로이드계 ) 의지역별살충감수성 표 18. Pirimiphos-methyl ( 유기인계 ) 의지역별살충감수성 유기인계살충제인 pirimiphos-methyl 의지역별살충제감수성을표 17 에나타내었다. 중국얼룩날개 모기 (An. sinensis) 의경우, 경기도연천을제외한인천강화, 경기파주, 강원철원 3 곳중에서경기도 파주에서채집된모기군집의반수치농도가 0.0396 ppm 으로가장높은감수성을나타내었으며, 인천강 - 79 -
화지역에서채집된개체군의반수치농도 0.7276 ppm으로가장낮은살충감수성을나타내었다. 가장높은살충감수성을나타낸경기파지지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 18.4배의살충저항성을나타내었고, 강원철원지역개체군은 3.6배의저항성을나타내는것으로평가되었다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우, 경기도연천지역에서채집된개체군의반수치사농도 0.0244 ppm으로가장높은살충감수성을나타내었고, 경기도파주지역의개체군이반수치사농도 0.4037 ppm으로가장낮은살충감수성을보이는것으로평가되었다. 가장높은살충감수성을보인경기도연천지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 9.7배의살충제저항성을보였고, 경기도파주지역개체군은 16.5배의살충저항성을보인반면강원도철원지역개체군은 1.1배로유사한살충제감수성을나타내는것으로평가되었다. 표 19. Temephos ( 유기인계 ) 의지역별살충감수성 Pirimiphos-methyl과함께유기인계살충제인 temephos의지역별살충제감수성을표 18에나타내었다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 경기도연천을제외한인천강화, 경기파주, 강원철원 3곳중에서경기도파주에서채집된모기군집의반수치농도가 0.0706 ppm으로가장높은감수성을나타내었으며, 인천강화지역에서채집된개체군의반수치농도 2.6283 ppm으로가장낮은살충감수성을나타내었다. 가장높은살충감수성을보인경기도파주지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 37.2 배의저항성을보이는것으로나타났고, 강원도철원지역개체군의경우 1.7배의저항성을보이는것으로나타났다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우, 인천강화지역을제외한경기파주, 경기연천, 강원철원 3곳중에서경기도연천지역에서채집된개체군의반수치사농도가 0.0396 ppm 으로가장높은살충감수성을나타내었고, 경기도파주지역에서채집된개체군의반수치사농도가 - 80 -
0.2569 ppm으로가장낮은살충감수성을보였다. 가장높은살충감수성을보인경기연천지역개체군을기준으로경기도파주지역개체군은 6.5배, 강원철원지역개체군은 1.4배의저항성을나타내는것으로평가되었다. 두종간살충감수성의차이는경기파주지역개체군에서 3.6배중국얼룩날개모기가살충감수성이높은것으로나타났고, 강원철원지역개체군에서는잿빛얼룩날개모기가 2.1배높은살충감수성을보이는것으로나타났다. 표 20. Bendiocarb ( 카바메이트계 ) 의지역별살충감수성 카바메이트계살충제인 bendicoarb의지역별살충제감수성을표 19에나타내었다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 경기도연천을제외한인천강화, 경기파주, 강원철원 3곳중에서경기도파주에서채집된모기군집의반수치농도가 2.7468 ppm으로가장낮은감수성을나타내었으며, 강원철원지역에서채집된개체군의반수치농도 0.0424 ppm으로가장높은살충감수성을나타내었다. 가장높은살충감수성을나타낸강원철원지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 5.1배, 경기파주지역개체군은 64.8배의살충제저항성을나타내는것으로평가되었다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우경기파주지역개체군이반수치사농도 0.0615 ppm을가장높은살충감수성을나타내었고반면인천강화지역개체군이반수치사농도 0.7754 ppm을가장낮은살충감수성을보였다. 가장높은살충감수성을보인경기파주지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 12.6배, 경기연천지역개체군 3.2배, 강원철원지역 5.2배의살충제저항성을나타내는것으로평가되었다. 두종간살충감수성의차이는경기파주지역개체군에서 44.7배잿빛얼룩날개모기가살충감수성이 - 81 -
높은것으로나타났으며다른지역의경우 7.5배, 3.5배중국얼룩날개모기가살충감수성이높은것으로평가되었다. 네오니코티노이드계살충제인 imidacloprid의지역별살충제감수성을표 20에나타내었다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 인천강화에서채집된모기군집의반수치농도가 0.4277 ppm으로나타났으며, 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우반수치사농도 0.0153 ppm을나타낸강원철원지역개체군의가장높은살충감수성을보였다. 인천강화지역개체군의경우반수치사농도 0.6882 ppm으로가장낮은살충감수성을나타내었다. 가장높은살충감수성을나타낸강원철원지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 45.0배, 경기파주지역개체군은 1.1배, 경기연천지역개체군은 1.6배의저항성을나타내는것으로평가되었다. 표 20. Imidacloprid ( 네오니코티노이드계 ) 의지역별살충감수성 피라졸계살충제인 chlorfenapyr의지역별살충제감수성을표 21에나타내었다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우, 경기파주와경기연천을제외하고강원철원지역에서채집된모기군집의반수치농도가 0.0002 ppm으로가장높은살충감수성을냈으며, 인천강화지역개체군은 0.0161 ppm의반수치사농도를나타내었다. 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우반수치사농도 0.0003 ppm을나타낸경기파주지역개체군의가장높은살충감수성을보였다. 경기연천지역개체군이반수치사농도 0.0271 ppm으로나타나가장낮은살충감수성을보였다. 가장높은살충감수성을나타낸경기파주지역개체군을기준으로인천강화지역개체군은 22.3배, 경기연천지역개체군은 90배, 강원철원지역개체군은 13.7배의저항성을나타내는것으로평가되었다. - 82 -
표 21. Chlorfenapyr ( 피라졸계 ) 의지역별살충감수성 - 83 -
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구 분 비 목 금액구성비비고 인건비소계 책임연구원 미지급 연구원 연구보조원 보조원 경비소계 여 비 유 인 물 비 전 산 처 리 비 시약및연구용재료비 회 의 비 임 차 료 교 통 통 신 비 감 가 상 각 비 위 탁 정 산 수 수 료 일반관리비 이윤 계 - 90 -
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Standard Operating Procedure ( 표준처리절차 ) 삼일열말라리아매개얼룩날개모기살충제저항성평가에관한가이드라인 Guidline for evaluation of insecticide resistance of vivax malaria vector mosquitoes 2011 년 11 월 20 일 서울대학교 안용준 질병관리본부국립보건연구원 - 97 -
A. 범위와적용 (Scope and Applicability) 본실험가이드라인은우리나라에서삼일열말라리아를매개하는주요매개종인중국얼룩날개모기 (Anopheles sisnensis), 재빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의살충제저항성발현을평가하기위한표준적인실험평가방법이다. B. 실험방법요약 (Summary of Methods) 본실험방법은우리나라에서삼일열말라리아주요매개모기 2종에대한지역별살충제저항성발달여부를평가하기위한표준화된실험방법이다. 주요구성은얼룩날개모기성충의채집, 보관및이동, 산란및모기유충사육, 모기종동정, 살충제감수성실험방법, 프라빗 (Probit) 분석방법등으로구성되어있다. C. 외적방해요인 (Interferences) 본실험방법과관련하여알려진외적방해요인은없다. 그러나실험을위한야외모기종의채집에서기상의변화는중요한외적방해요인으로작용할가능성이높다. 특히높은강수량과낮은최저기온은모기유충발생및서식과성충의활동에제한을주어실험에요구되어지는충분한개체의공시모기개체의채집을어렵게할수있다. D. 안전성 (Safety) 실험에사용되는살충제는미량의경우라도어느정도독성을가지고있기때문에살충제를취급하거나이를이용하여실험을수행할시에각별한주의가요구된다. 실험수행시에는항상실험가운, 보호안경, 마스크, 장갑을착용하고실험수행중에살충제또는살충제희석표준시료가피부에닿지않도록주의한다. 살충제를취급하는실험은 1일 4시간이상하지않으며, 실험후에는손과얼굴을비눗물로깨끗이씻는다. 실험수행중에살충제가피부에묻었을경우즉시실험을중단하고비눗물로깨끗이세척한다. 실험수행중현기증과피곤감및두통, 구토, 위경련, 설사, 발한이후호흡장애, 사지경련및의식불명등의현상이발생할경우즉시실험을중단하고전문의의진찰을받는다. 살충제를보관할경우식품의약품안전청고시에따라살충제용기에표기를하고통풍이잘되는곳에보관해야한다. 용기의마개는 2 중마개를사용하거나마개외부에별도의봉합작업을하여쉽게개폐되지않도록주의하여보관한다. 다음과같은살충제취급안전시설을구비한다. 1 비상용세척급수대를설치한다. - 98 -
2 폐기된용기와장비를처분전보관함을비치한다. 3 살충폐수보관용기를설치한다. 4 배기용후드장치를설치한다. E. 기구장비와재료 (Apparatus and Materials) 1. 모기성충채집을위한장비및기구모기성충채집을위하여필요한장비및기구에는 1 ( 전동 ) 흡충관, 2 유문등 (night trap), 3 12온즈 ( 또는 9온즈 ) 종이컵, 4 고무밴드, 5 곤충망등이있다. 전동흡충관일반흡충관고무밴드 12 온즈종이컵곤충망 2. 채집된모기성충의운반을위한장비및기구 채집된모기성층의운반에필요한장비및기구에는 1 수건, 2 대형아이스박스, 3 아이스 팩, 4 사각솜, 5 10% 설탕물등이있다. - 99 -
수건아이스박스아이스팩 사각솜 아이스박스 3. 산란과모기유충사육을위한장비및기구 산란과모기유충사육에필요한장비및기구에는 1 사육트레이, 2 공기방울생성기, 3 항 온항습장치등이있다. 사육트레이 기포생성기 4. 생물검정을위한장비및기구 - 100 -
생물검정에필요한장비및기구에는 1 9 온즈종이컵, 2 마이크로파이펫, 3 원형뜰채, 4 계수기, 5 유리막대, 6 스포이드 9 온즈종이컵마이크로파이펫계수기 유리막대 스포이드 F. 시약과화합물 (Reagents and Chemicals) 1. 유기용매 - 유기용매는 ACS reagent grade ( 99.5%) 를사용한다. 2. 표준살충제 - 표준살충제는 analytical standard용의살충제를사용한다. 3. 기타시약및화합물들은 reagent grade를사용한다. G. 모기의채집, 보관, 이동 (Collection, Preservation and Transportation) 모기성충개체의채집을위해서는일반적으로유문등 (night trap) 을사용하며, 개체별로채집의경우에 ( 전동 ) 흡충관을이용하여흡혈이후에벽면에휴식중인모기성충개체를채집한다. 모기성충개체를채집할때에는얼룩날개모기속의모기들의형태적특징과벽면에앉았을때꼬리부분을 45 각도로세우는자세특징등을고려하여얼룩날개모기속에속하는모기만을채집한다. 채집된모기성충개체는각각의단일개체별로준비된 19온즈종이컵에옮기고곤충망 - 101 -
을씌운뒤고무밴드를이용하여곤충망을고정시킨다. 1 2 3 채집된모기의운반하기위해일정한온도유지가가능하도록아이스박스에아이스팩을채워온도가 10~15 가유지되도록준비한다. 모기성충개체가옮겨져있는종이컵을준빈된아이스박스에옮기고종이컵의상단의곤충망에 10% 설탕물을적신사각솜을올려준다. 그런다음물에적당히적셔진수건을컵위에덮어주어습도를유지한상태로실험실로운반하여온다. 1 2 3 H. 산란과모기유충사육 (Laying eggs and Larvae Rearing) 실험실로운반되어온모기성충개체들은종이컵에담기상태로항온항습설비 ( 온도 : 27 ± 2, 상대습도 : 60 ± 10%, 광주기 : 명12시간, 암12시간 ) 가갖추어진곤충사육실로옮긴다. 각각의컵에는모기성충에게피해가가지않도록조심스럽게미리침전시켜둔물을높이가 2cm가되게채우고모기성충이산란하도록둔다. 매일산란여부를확인하여산란이확인된종이컵에서모기성충개체를꺼내어종동정을실시한다. 종동정이완료되면동일한종끼리산란 - 102 -
된모기알을함께모아부화할수있도록사육트레이로옮겨준다. 그이후에는실험이가능한 3 령유충단계까지사육을실시한다. 먹이는건조효모와치어사료를 50:50 비율로혼합한인공 사료를유충의령기에따라먹이량을조절하여공급한다. 1 2 3 4 5 I. 종동정 (Species Identification) 모기의종동정방법은크게두가지로모기성충의형태적특성을분류키로동정하는형태적종동정와모기의 ribosome DNA 서열분석을통한분자적종동정으로구분할수있다. 형태적종동정의경우비교적비용이적게들고특별한기구나장비없이손쉽게종동정이가능하지만숙련된전문가가아니면정확한종동정이어렵고경우에따라실험자의주관적인견해로인해오류가발생하거나결과에대한객관성을증명하기어렵다. 반면분자적종동정의경우실험방법과결과가명확하고결과에대한객관성을확보하기쉬우나실험을위한고가의장비와시약이필요하고따라서비교적비용도높은편이다. - 103 -
1. 형태적종동정 중국얼룩날개모기 (Anopheles sinensis) 의형태적특징 중국얼룩날개모기의가운데다리기절 (midcoxa) 에독특하게옅은비늘이위쪽에발견되는특 징이있으며또한 5.2 날개시맥의끝부분에옅은연모 (fringe) 얼룩이이존재하는특징을가 지고있다. 잿빛얼룩날개모기 (Anopheles pullus) 의형태적특징 - 104 -
재빛얼룩날개모기는입술수염 ( 순, palpus) 에서흰색밴드가있으며, 끝연모 (apical fringe) 얼 룩이존재하지않는특징을가지고있다. 2. 분자적종동정분자적종동정을하기위해서는 PCR( 중합효소연쇄반응 ) 과 DNA전기영동등과같은기본적인분자생물학적장비들과시약이필요하다. 먼저 DNA 추출키트 (QIAGEN, cat 69504) 등을이용하여모기성충개체에서템플레이트 DNA를추출한다. 추출된 DNA와종특이적으로 28S rdna에증폭할수있는프라이머를이용하여 PCR( 중합효소연쇄반응 ) 을통해모기성충개체의 28S rdna를얻는다. 얻어진 28S rdna는전기영동을통해 DNA의크기를밴드상에서확인하고밴드크기를통해해당모기성충개체의종을동정한다. 표. PCR 을위한프라이머서열 구분서열 Universal forward An. sinensis Species-specific reverse An. pullus Species-specific reverse 5 -TGTGAACTGCAGG ACACATGAA-3 5 -AGGGTCAAGGCATACAGAAGGC-3 5 -AATCGGACAGACGGATGCCAC-3 PCR( 중합효소연쇄반응 ) 은 PreMIx (Bioneer AccuPower PCR PreMix) 제품을이용하여수행하였고수행조건은최초 94 에서 3분간유지를 1회실시하고, 94 에서 30초, 55 에서 30 초, 72 에서 2분조건을 30회반복수행한다음최종적으로 72 에서 7분간유지하고반응을종료한다. 획득한반응물은 1.5% 아가로즈 (Agarose) 에서전기영동을실시하여반응물 (DNA) 의크기를확인하였다. 중국얼룩날개모기 (An. sinensis) 의경우밴드크기가 1077-1080bp로나타나며, 잿빛얼룩날개모기 (An. pullus) 의경우밴드크기가 685bp로나타나게된다. J. 살충원제표준시료의준비 (Insecticide Sample Preparation Procedure) 살충제저항성을평가는살충제가대상모기개체군에대하여가지는반수치사농도 (LC 50 ) 를기준으로해당모기개체군의처리된살충제에대한살충제저항성여부를판단할수있다. 이를위해서우선살충제의표준시료를준비하여각표준농도에대한살충활성을평가자료 - 105 -
를근거로프로빗 (Probit) 분석을통한반수치사농도 (LC 50 ) 을계산한다. 표준시료에포함되는살충원제의함량은일반적으로피피엠 (ppm; part per million) 단위를사용하며 100만분의 1를의미한다. 살충제에따라차이가있으나실험대상모기개체의살충제감수성스펙트럼을확인하기위하여표준시료의농도는 0.1ppm을최고농도로설정하고반복적으로 10배희석하여최소 5개에서 6개의농도별표준시료를준비한다. 표준시료를만들때살충원제를녹이는데사용되는용매는에탄올을주로사용하며경우에따라에탄올에잘용해되지않는살충제의경우다른용매를사용할수도있다. 사용되는용매에는살충원제의용해를보다용이하도록 Castor oil을용매에 200ppm이되도록미리처리한다. 표준시료의농도는다음과같이계산하여준비한다. 0.1ppm 표준시료 = 살충제 0.1μg + 용매 1ml 혼합 K. 직접접촉살충생물검정 (Direct-contact Mortality Bioassay) 생물검정을위해준비한 9온즈종이컵에 2% Tration-X 100이포함된물을 200 ml 까지채운다. 모기유충사육트레이에서 3령기의유충을스포이드로 20에서 25개체씩비이커로옮긴다. 비이커에옮긴모기유충은작은뜰채를통해걸러함께있는물과모기유충을분리한다. 분리된모기유충은준비한생물검정용종이컵으로옮긴다. 미리희석하여준비한살충제표준시료를각각의생물검정종이컵처리한다. 대조군의경우살충제가포함되지않은용매만을처리한다. 살충제표준시료가처리된생물검정종이컵들은온도및상대습도 27 ± 1, 60 ± 10% 가유지되고광주기는주간 12시간, 야간 12시간을유지되는항온항습조건에서 24시간동안유지한후죽은모기유충을실셈하여치사율을계산한다. 1 2 3-106 -
4 5 6 L. 자료의분석및보고 (Calculations and Data Reporting) 살충제저항성발달여부를판단하기위하여채집된모기유충의살충제대한반수치사농도 (LC 50 ) 값을기준으로한다. 반수치사농도 (LC 50 ) 은프라빗 (Probit) 분석을통해산출이가능하다. 프라빗 (Probit) 분석방법은 1~99% 사이에부분혹은치사율자료가 1개이하인경우에분석이가능하다. ( 예, 6.25, 12.5, 50, 100 ppm 조건실험결과, 치사율이 1, 10, 20, 20, 20인것으로나타난경우분석할수없다.) 또한 Chi-square test ( 데이터가올바를경우 ) 를통해자료가프라빗 (probit) 모델에적합한지를판단한후분석이가능하며, 반수치사농도 (LC 50 ) 과함께 95% 신뢰구간을도출할수있다. 먼저프라빗 (Probit) 분석을위해서는 Probit Program을다운받아야한다. 프로그램은미국환경보호청 (US EPA) (URL: http://www.epa.gov/eerd/stat2.htm) 홈페이지에서다운로드받을수있다. 예제 ) 살충제표준시료 (ppm) 노출시킨모기유충수 죽은모기유충수 0 20 0 6.125 20 1 12.5 20 2 25 20 1 50 20 9 100 20 20-107 -
다운로드받은압축파일은압축을해제한뒤프로그램을실행하면아래와같은도스창형태 로프로그램이실행된다. 첫번째사용자설정을묻는질문으로 축약된형태로자룔를받을것인가아니면전체를받을것인가? 라고프로그램이질문을던지면 <F> 를선택하여전체자료를받는것으로선택한다. 두번째프린트를할지여부를묻는질문이나오면프린트를할경우 <P> 를선택하고그냥저장할경우 <D> 를선택한다. 저장하기를선택했을때는파일이름 ( 예 : 090617) 과제목 ( 예 :toxa) 이름순으로입력하여저장한다. 다음단계에서대조군, 즉살충제표준시료의농도가 0 일때죽은모기유충의수를요구하 - 108 -
는질문이나오면예제대로 0 을입력한다. 다음으로실험농도는몇개를했는지에대한질 문에는예제대로 5 를입력한다. 다음단계는실험데이터를입력하는단계로농도가낮은순서대로입력하고 <Enter> 다음 으로죽은모기유충의수를입력하고 <Enter> 마지막으로노출된모기유충수를입력하고 <Enter> 하여모든결과데이터를입력한다. 데이터입력이완료되면화면에각실험농도별로반복수와노출된모기유충의수를출력하 고 입력한데이터를수정하시겠습니까 라는질문이나타난다. 수정하려면 <Y> 를수정하지않 으려면 <N> 를입력한다. 다음질문으로 대조군반응개수데이터를수정하시겠습니까?, 다 - 109 -
른데이터와일치시키겠습니까? 라는질문에대해수정하지않을경우 <N> 을입력하여다음 단계를진행한다. 입력이끝나면분석이완료되고폴더에사전에입력했던파일이름으로파일이생성된다. 생 성된파일을 word 로문서를열면아래와같이결과를확인할수있다. - 110 -
결과에는입력된데이터값과입력된데이터를분석하여도출된 Chi-Square 값그리고 Chi-Square 값에대한평가기울기및표준오차등의분석결과를볼수있으며아래부분에는반수치사농도 (LC 50 ) 값과 95% 신뢰구간을확인할수있다. ( 본예제에서는 Chi-square 값에대한평가로입력된데이터가부정확하여 95% 신뢰구간이산출되지않았다 ) - 111 -
산출된반수치사농도 (LC50) 값을기준으로모기종간, 또는채집된지역간의살충제감수성을 평가할수있으며, 궁극적으로살충제에대한저항성을평가할수있다. M. 참고문헌 (Refereneces) 1. Lee K.W. (1998) A revision of the illustrated taxonomic keys to genera and species of female mosquitoes of Korea (Diptera: Culicidae). 5 th Mediacl Detachment, 168 th Medical Battalion 18 th Medical Command, U.S. Army, Korea APO APO AP 96205-00200. 2. US EPA (2006) Ecological Exposure Reserach, Statistical Analysis for biological methods (http://www.epa.gov/eerd/stat2.htm). US EPA. 3. US EPA (2007) Guidance for Preparing Standard Operating Procuedures (SOPs). US EPA QA/G-6 4. 이동규 (2008) 2008 살충살균구서를위한방역소독지침-위생해충방제편. 질병관리본부 5. 질병관리본부 (2010) 주요전연병매개모기방제관리지침. 질병관리본부 6. 한국응용곤충학회 & 한국곤충학회 (1998) 곤충용어집. 한국응용곤충학회 & 한국곤충학회 - 112 -