질량분석법기초 이론 과학발전을돕습니다 (BUILDING BETTER SCIENCE) 여러분과함께하는애질런트 1
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소개 질량분석법 (MS) 은질량대전하비 (m/z) 및기체상이온의존재비를측정하여시료에존재하는화학물질의양과유형을확인하는데도움을주는분석화학기법입니다. 질량스펙트럼은이온의질량대전하비와세기로표시됩니다. 스펙트럼에표시된분자이온과조각이온 (fragment ion) 의질량과화합물의원소조성이나동위원소비율을확인하고이를이용하여, 농약이나펩타이드와같은분자의화학적인구조를밝히기위해사용됩니다. 질량분석법은화합물의이온화를통해하전분자나분자조각을생성하고해당질량대전하비율을측정합니다. 출처 : 위키피디아 3
소개노벨상수상기술 John Fenn 과 Koichi Tanaka 는두가지연성 (Soft) 이온화기법을개발하여 2002 년노벨상을수상받았습니다. 전자분무기술, Fenn 박사 연성레이저이탈, Tanaka 박사 스웨덴스톡홀름 - 콘서트홀, 2002 년 12 월 스웨덴국왕으로부터노벨상을받는 Fenn 박사 4
(ToC) 소개 기본고려사항 질량분석법에서의질량 기본과정작동방식 이온화 전자충돌 (EI) 화학적이온화 (CI) 시료고려사항 (LC-MS) 전자분무이온화 (ESI) 대기압화학이온화 (APCI) 대기압광이온화 (APPI) 멀티모드이온화 (MMI) MALDI ICP 작동방식 질량분석기 결과 Single Quadrupole Triple Quadrupole Ion Trap Time-of-Flight(TOF) 질량스펙트럼 Single Quad 대 TOF 다중하전이온및 Deconvolution 추가정보 Agilent Academia 웹페이지 발행물 5
소개기본고려사항 각원소는고유한질량을가집니다. 질량분석법은분자량이나원자량을측정하기위한분석법입니다. 여러원소로구성된화합물은각자의질량에따라구별될수있습니다. 글루코스 C 6 H 12 O 6 MW: 180,1559 g/mol 페니실린 C 16 H 18 N 2 O 4 S MW: 334,39 g/mol 출처 : 주기율표, 포스터 SI-0186 6
소개질량분석법에서의질량 분자의평균질량은구성원소의평균원자량의합입니다. 물 (H 2 O) 의평균질량 : 1.00794 + 1.00794 + 15.9994 = 18.01528 Da 단일동위원소 (monoisotopic) 질량은분자내각원자량의합으로, 동위원소평균질량이아닌주요 ( 가장풍부한 ) 동위원소의미결합, 기저상태, 정지질량을사용하여계산합니다. 단일동위원소질량은일반적으로통일원자질량단위 (AMU) 로표시됩니다. 정확한질량 ( 더적절히표현하면, 측정된정확한질량 ) 은원소조성을결정할수있는실험을통해측정된질량입니다. 질량이 200u 이하인분자의경우, 5ppm 의정확도는고유한원소조성을결정하기에충분합니다. 출처 : 위키피디아 7
소개기본과정 일반적인 MS 과정 : 시료 ( 고체, 액체, 기체 ) 가이온화됩니다 시료분자가이온화를통해조각이온으로분해될수있습니다 이온이질량대전하비율 (m/z) 에따라분리됩니다 이온은하전입자를검출할수있는메커니즘 ( 예 : 전자증폭기 ) 에의해검출됩니다 결과는 m/z 비율과상대적존재비의함수관계를나타내는스펙트럼형태로표시됩니다 측정한질량과이미알려진질량의상관관계나특징적인조각화패턴 (fragmentation pattern) 을통해식별이이루어집니다. 8
작동방식이온화 시료의질량분석을시작하기전에이온소스에서표적물질을이온화해야합니다. 기체상태시료주입 : 전자이온화 (EI) 화학적이온화 (CI) 액체상태시료주입 : 전자분무이온화 (ESI) 대기압화학이온화 (APCI) 대기압광이온화 (APPI) 멀티모드이온화 (MMI) 매트릭스를이용한레이저탈착이온화 (MALDI) 유도결합플라즈마 (ICP) 9
분자량 작동방식이온화 분석물의극성에따라이온화소스를선택합니다. 100,000 ESI ESI APPI 전자분무이온화 대기압광이온화 APPI GCMS APCI APCI 대기압화학이온화 GC/MS 가스크로마토그래피 / 질량분석법 10 비극성 분석물극성 강한극성 10
작동방식이온화 전자충돌 (EI) 전자충돌 (EI) 은가스크로마토그래피 (GC) 분석에가장많이사용되는검증된이온화방법입니다. 가스크로마토그래프에서전달된분자는전자빔 (70eV) 과의충돌을통해하나의전자를상실하여하전이온이생성됩니다. CH 3 OH + 1 전자 CH 3 OH + + 2e - 분자이온 EI는일반적으로 1가하전분자이온과조각이온 ( 원래분자의작은부분 ) 을생성하여구조규명에사용됩니다. CH 3 OH + CH 2 OH + + H 또는 CH 3 OH + CH 3+ + OH 조각이온전자나광전자증배관 (PMT) 을통해분리된이온을검출합니다. 생성된질량스펙트럼은주어진 m/z 비율에서의신호강도를나타냅니다. 11
작동방식이온화 전자충돌 (EI) GC/MS 인터페이스는고온에서작동합니다. EI GC/MS 인터페이스. 출처 : Agilent 7000 시리즈 Triple Quad GC/MS 사용설명서 (46 페이지 ) 12
작동방식이온화 화학적이온화 (CI) EI 는전자의운동에너지를직접분석물분자에넘겨주는직접적인에너지전달방식입니다. 화학적이온화 (CI), 특히양이온의화학적이온화 (PCI) 는화학중간체를사용하는간접적인이온화방식입니다. PCI 에서는이온화를통해시약이온 (reagent ions, 분석물과반응함 ) 을생성할수있는시약기체 (reagent gas) 로이온소스를채웁니다. 가장많이사용되는시약기체 : 메탄, 이소부탄및암모니아. 사용되는시약기체는분석물의이온화와조각화작용을결정합니다. 주요메탄반응 : CH 4 + e - CH 4+, CH 3+, CH 2 + 시약기체는이온화소스에들어가는전자에의해이온화됩니다. CH 4 + CH 4 + CH 5+, CH 3 CH + 2 + CH 4 C 2 H + 4 + H 2 CH + 2 + CH 4 C 2 H + 3 + H 2+ H CH 3 + + CH 4 C 2 H 5 + + H 2 C 2 H 3 + + CH 4 C 3 H 5 + + H 2 자세한사항은슬라이드노트를참조하십시오 13
작동방식이온화 - 시료고려사항 (LC/MS) ESI APCI APPI 휘발성은필요하지않음열에불안정한분석물에적합한방식이온은용액에서형성됨다중하전이온을형성할수있음 약간의휘발성이필요함분석물은열안정성이있어야함이온은기체상에서형성됨 1가하전이온만형성 약간의휘발성이필요함분석물은열안정성이있어야함이온은기체상에서형성됨 1가하전이온만형성 대부분의화합물은이세가지이온소스를통해이온화시킬수있습니다. APCI/APPI 는 ESI 에서생성되는이온보다비극성도가더큰분자를이온화할수있습니다. 14
작동방식이온화 - 시료고려사항 (LC/MS) ESI APCI APPI 용액중의이온예 : 카테콜아민, 황산염결합체, 4차아민헤테로원자를포함한화합물예 : 카르바메이트, 벤조디아제핀 중간 MW 및극성을가진화합물예 : PAHs, PCBs, 지방산, 프탈레이트, 알코올헤테로원자를포함한화합물예 : 카르바메이트, 벤조디아제핀 중간 MW와중간에서낮은극성을가진화합물예 : PAHs, PCBs, 지방산, 프탈레이트, 알코올헤테로원자를포함한화합물예 : 카르바메이트, 벤조디아제핀 용액에서다중전하를띠는 화합물예 : 단백질, 펩타이드, 올리고뉴클레오타이드 ESI 를적용하기에는비극성이 너무강한화합물 ESI 를적용하기에는비극성이 너무강한화합물 15
작동방식이온화 전자분무 (ESI) 전자분무이온화 (ESI) 는연성 (Soft) 이온화기법입니다. LC 용리액은대기압상태에서강한정전기장에서스프레이챔버에분무되고, 건조기체에의해기화가됩니다. 정전기장은분무기 ( 이디자인에서는영전위에놓임 ) 와캐필러리 ( 고압상태에놓임 ) 사이에서발생합니다. 분석에적절한분자 : 작은분자 ( 쿨롱힘, Coulombic) 와큰생체분자 ( 단백질, 올리고뉴클레오타이드 ) 다중전하는 ESI 에서발생하는현상으로보다큰분자의분석을가능하게합니다 (-> Deconvolution) 전자분무이온소스출처 : LC/MS 개념안내서 (22 페이지 ) 16
작동방식이온화 ESI 과정 하전된액상미립자 (charged droplets) 부터건조상태분석물이온까지 Nebulizer 는균일한크기의액상미립자를생성합니다. 하전된액상미립자는질량분석기도입부캐필러리쪽으로끌려가며캐필러리주변의가열된질소가스에의해기화됩니다. 이과정을탈용매 (desolvation) 라부릅니다. 정전기반발력 ( 쿨롱힘, Coulombic) 이액상미립자의결합력을넘어설때까지계속해서액상미립자를수축하여액상미립자폭발을일으킵니다. 이과정은분석물이온이액상미립자표면의강한전기장에의해기체상으로변화 ( 즉, 기화 ) 될때까지반복됩니다. 이과정을이온증발 (ion evaporation) 이라부릅니다. 17
작동방식이온화 대기압화학이온화 (APCI) APCI 는기체상화학이온화과정입니다. 따라서분석물은이온화를위해기체상에존재해야합니다. LC 용리액이 Nebulizing needle 을통과하면미세스프레이가생성됩니다. 액상미립자는가열된세라믹튜브 (~ 400 ~ 500ºC) 에서충분히기화됩니다. 적절한분자 : 분자 1,500u 극성이낮은화합물및비극성화합물 ( 일반적으로순상크로마토그래피로분석 ) 대기압화학이온화소스출처 : LCMS 개념안내서 (27 페이지 ) 18
작동방식이온화 APCI 과정 우측그림은 APCI 의기화및이온화과정을보여줍니다. 분석물은기화와시약기체의이온화를거친후에야이온화된다는점에유의하십시오. 다음시약기체는전하를분석물로전달합니다. 일반적으로 APCI 는단순히 1 가하전이온만생성하지만, 전하부위가떨어진상태로있을때 ( 보통소수성영역에의해 ) 2 가전하이온을얻을수있습니다. 자세한사항은슬라이드노트를참조하십시오 19
작동방식이온화 대기압광이온화 (APPI) APPI 기법을이용할때 LC 용리액은 Nebulizing needle 을통과하여미세스프레이를생성합니다. 생성된액상미립자는가열된세라믹튜브에서충분히기화됩니다. 가스 / 증기혼합물이크립톤램프의자외선을통과하게하여시료분자를이온화시킵니다. 시료분자이온은질량분석기도입부캐필러리로유입됩니다. APPI 는일반적으로 APCI 에의해분석되는대다수의동일한화합물의분석에이용할수있으며비극성방향족화합물의분석에특히유용한것으로입증되었습니다. 대기압광이온화소스출처 : LC/MS 개념안내서 (29 페이지 ) 20
작동방식이온화 APPI 과정 우측그림은광이온화의증발및이온화과정을보여줍니다. APPI 는 APCI 와유사하며 APPI 는이온화에사용되는코로나니들 (Corona needle) 을램프로대체합니다. APPI 는종종추가적인용매나 dopant (D) 라는이동상변형제 (modifier) 를사용하여광이온화과정을지원합니다. Direct APPI: M h M M SH e M H S Dopant APPI: D h D D D M M M e M H D D 자세한사항은슬라이드노트를참조하십시오 21
작동방식이온화 멀티모드이온화 (MMI) 멀티모드소스는서로다른세가지모드로운용될수있는이온소스입니다. APCI ESI 동시 APCI/ESI 동시 APCI/ESI 는전자적으로격리시킨최적화된두개의영역 ( 하나는 ESI 에사용되고다른하나는 APCI 에사용됨 ) 을포함하고있습니다. 동시 APCI/ESI 를실행할경우, 두가지이온화모드에서수집된이온은동시에캐필러리로유입되며또동시에질량분석기에의해분석됩니다. MMI 는미지성분의스크리닝이나여러화합물로조성된혼합물 ( 일부는 ESI 에의해반응하고일부는 APCI 에의해반응함 ) 을포함하는시료의분석에유용하게사용됩니다. 멀티모드이온화소스출처 : LC/MS 개념안내서 (30 페이지 ) 22
작동방식이온화 매트릭스를이용한레이저탈착이온화 (MALDI) 매트릭스를이용한레이저탈착이온화 (MALDI) 는연성이온화기법입니다. 시료와매트릭스를혼합한후금속판에바릅니다. 펄스레이저를시료에조사하여 (irradiates) 용발 (ablation) 및탈착을일으킵니다. 분석물분자는뜨겁게용발된기체상에서이온화됩니다. 이온이질량분석기로가속됩니다. 적절한분자 : 생체분자 (DNA, 단백질, 당류 ) 큰유기분자 ( 중합체 ) 23
작동방식이온화 유도결합플라즈마 (ICP) 유도결합플라즈마 (ICP) 기기는전자기유도 ( 즉시변자기장 ) 에의해생성되는전류를통해에너지를공급하는플라즈마소스를사용합니다. 상당한에너지를보유한플라즈마는분자를이온화된원소로분해시킵니다. ICP 는여러가지기하적구조를가져서다양한기술과연계할수있습니다. ICP-AES 원자방출분광기 ICP-OES 광방출분광기 ICP-MS 질량분석법 ICP-RIE 반응성이온식각 hyphenated ICP-MS 시스템의다양한구성요소간의상관관계를보여주는구조도 출처 : 위키피디아 24
작동방식질량분석관 분석물은이온화및이온전달을거친후질량분석관으로이동합니다. 질량분석관은이온신호를측정하여질량스펙트럼으로표시하며이는화합물의분자량, 구조, 동질성및양에관한중요한정보를제공할수있습니다. 여러가지유형의질량분석관이있습니다. Single Quadrupole(SQ) Triple Quadrupole(QQQ) Time-of-Flight(TOF) Ion Trap(IT) 25
작동방식질량분석관 Single Quadrupole (SQ) 이온소스에서생성된하전이온은질량분석기로이송됩니다. Quadrupole 질량분석관은순차적인스캔방식을사용하여한번에하나의 m/z 값을가진이온을통과시키며다른이온은모두소실됩니다. m/z - 질량대전하비율 : 이온질량 (Daltons 또는 u) 과이온전하수의비 정보수집방식 : MS 개념모델 - Single Quadrupole 개념모델 Single quadrupole 26
작동방식질량분석관 Single Quadrupole (SQ) 단일이온모니터링 (SIM) 스캔모드 질량분석기는단일 m/z 값을가지는이온만검출기로통과할수있도록설정되었습니다 특정 m/z 값을가진표적이온만모니터링됩니다. single quad 의 SIM 은최고감도의정량분석을제공하지만특이성이부족합니다. quadrupole 질량분석관은스캔 MS 모드에서순차적으로스캔하므로한번에하나의 m/z 값을가진이온만검출기로전달될수있습니다. 27
작동방식질량분석관 Triple Quadrupole (QQQ) 이온소스에서생성된하전이온은질량분석관으로이송됩니다. 분석관은세개의 quadrupole(q1-q3) 로이루어지므로여러개의작동모드에서서로다른정보가얻어집니다. 일반적인설정은다음과같습니다. Q1: 특정 m/z 값을가진이온 (precursor ion) 을위한필터로사용 Q2: precursor ion 을조각화하고 product ion 을생성하기위한충돌셀로사용 Q3: 특정 m/z(srm 또는 MRM) 또는스캔모드 (product ion 스캔 ) 로설정 정보수집방식 : MS 또는 MS/MS 개념모델 Triple quadrupole SRM 모드를보여주는구조도 28
작동방식질량분석관 Triple Quadrupole (QQQ) 다중반응모니터링 (MRM: Multiple Reaction Monitoring) 전체스캔 (Full Scan) MS/MS 모드 아르곤기체를사용한충돌셀 단일 m/z 값을가진 Precursor ion 이충돌셀로전달된후질소또는아르곤분자와충돌하여조각이온 (Precursor ion) 을형성합니다. Q3 은단일 m/z 값을가지는특정조각이온만통과하도록설정됩니다. 이는감도가상당히높은분석법으로써정량분석에주로사용됩니다. 전체스캔모드와 SRM/MRM 의차이는스캔기능에있습니다. 전체스캔모드의 Q3 은순차적으로스캔하도록설정되어한번에하나의 m/z 값을가진이온만검출기로전달될수있습니다. product ion 스펙트럼이생성됩니다. 이작동모드는 SRM/MRM 에비해감도가떨어집니다. 29
작동방식질량분석관 Ion Trap (IT) 이온소스에서생성된하전이온은질량분석관으로이송됩니다. 특정질량범위에서의선택된극성의모든이온은함께 Trap 에저장될수있습니다. 이온은 Ion Trap 질량분석기에서다중분리 (multiple isolation), 조각화단계등의작업을거친후검출됩니다. 평행한극자대신에 Ion Trap 은원형의전극와두개의엔드캡으로구성된 "trap" 을형성합니다. 정보수집방식 : MS 또는 MS/MS 개념모델 Ion Trap 30
작동방식질량분석관 Ion Trap (IT) 1 단계 : Precursor Ion 의분리 2 단계 : Precursor ion 의조각화 a a b 이온주입과축적이완료되면이온게이트가닫히고이온은더이상질량분석관으로주입되지않습니다. 파형을가하여질량이해당 precursor ion 보다크거나작은이온을배출, 제거합니다. precursor ion 의공명여기 (Resonance excitation) 는충돌유도분리 (CID) 를일으켜 product ion 을생성합니다 (a). 전체스캔 product ion 이검출기로이동됩니다 (b). 31
작동방식질량분석관 Time-of-Flight(TOF) 이온소스에서생성된하전이온은질량분석관으로이송됩니다. 분석관구성요소 : 질량필터 (Q1), 옵션 충돌셀 (Collision Cell) 비행튜브 (Flight tube) 이온은 Quadrupole 과충돌셀을통과한후이온펄서 (pulser) 에도달합니다. 고압펄스를가해서이온이비행튜브로가속되게합니다. 튜브말단의이온거울 (ion mirror) 이이온을반사하여검출기로내보내도착시간을기록합니다. 정보수집방식 : TOF: MS Q-TOF: MS 및 MS/MS Time-of-Flight(TOF) 질량분석관의구조도출처 : Time-of-Flight(TOF) 질량분석기 Q-TOF 를보여주는그림 32
작동방식질량분석관 Time-of-Flight(TOF) 각질량에대한비행시간 (t) 은고유하며이온이가속되는에너지 (E), 이온이이동하는거리 (d) 및 m/z 에의해결정됩니다. E 1/ 2mv 2 m에대해방정식을풀면 : 2 m 그리고 v에대해방정식을풀면 : 2E / v v ( 2E / m) 방정식 1 b 아르곤기체를사용한충돌셀 이방정식은운동에너지 E 가일정할때질량이작을수록속도가더커짐을보여줍니다. 따라서질량이작은이온이더일찍검출기에도달합니다. 이온이검출기에도달하는시간을측정하여속도 ( 그리고결과적으로질량 ) 를판단합니다. 33
작동방식질량분석관 Time-of-Flight(TOF) 두번째공식은거리 (d) 를시간 (t) 으로나눈속도 (v) 입니다 : v d / t 공식 1 과 2 를합치면 : m 2 2 ( 2E / d ) t 에너지 (E) 와거리가일정할때질량은이온의비행시간의제곱에비례합니다. E 와 d 는일정하게유지되며변수 A 로요약되어단순화된방정식이얻어집니다. m A t 2 결과의정밀도를높이려면고압을가하기위해지연된시간도고려해야합니다. t t m t 0 최종공식은 : m A( t t 0 ) m 2 34
결과예제 1 설파메타진의질량스펙트럼 single quadrupole 질량분석관으로분석 분자식 : C 12 H 14 N 4 O 2 S [M+H] + : 279.33 설파메타진의질량스펙트럼출처 : Agilent 6100 시리즈 Quadrupole LC/MS 시스템 (17 페이지 ) 35
결과예제 2 코카에틸렌의질량스펙트럼 Q-TOF 질량분석관으로분석 분자식 : C 18 H 23 NO 4 [M+H] + : 318.387 코카에틸렌의질량스펙트럼출처 : 독성학에사용되는여러 LC/MS 기법의비교 (A comparison of several LC/MS techniques for use in toxicology)(37 페이지의그림 36) 36
결과 Single Quad 대고분해능 TOF Single(Triple) Quadrupole 를이용한분석은명목질량정보 ( 낮은분해능 ) 를제공하며 Time-of-Flight 기기는정확한질량정보 ( 고분해능 ) 를제공할수있습니다. time-of-flight 분석으로가능한한최적의질량정확도를확보하기위해 TOF 시스템의지속적인검량이필요합니다. 측정치는보통몇 ppm 단위로편차가발생합니다. 충분한질량분해능과질량정확도를가진 TOF 질량분석관은원소조성을정확하게파악할수있습니다. Single quadrupole(a) 와 Time-of-Flight(b) 의분해능비교출처 : 5989-2549EN (14 페이지 ) 37
결과 Single Quad 대 TOF 전형적인 Single Quadrupole 질량스펙트럼 전형적인 TOF 질량스펙트럼 설파메타진의질량스펙트럼출처 : G1960-90083 (17 페이지 ) 부가이온 (adduct ion) 과조각이온 (fragment ion) 을포함한설파메타진의질량스펙트럼출처 : 5989-2549EN (25 페이지 ) 38
결과다중하전이온및 Deconvolution 측정된분자와이온화기법에따라다중하전이온이생성될수있습니다. 작은분자와 APCI 는 1 가하전분자를생성합니다. 측정된 m/z 는전하운반자를빼거나 ( 양이온 ) 더한 ( 음이온 ) 후의분자량에해당합니다. ESI 로이온화된큰분자 ( 펩타이드, 단백질 ) 의경우, 둘이상의가능한전하부위 ( 양성자부가또는양성자제거 ) 가있어서다중하전이온이생성될수있습니다. 이는측정하려는이온을더쉽게측정가능한 m/z 범위로옮겨가기때문에항체 (> 1 Mio Da) 와같은큰분자를질량분석법으로측정할수있게됩니다. 측정된 m/z 를통해실제분자량을계산하려면수학적알고리즘이필요합니다. 이과정을 Deconvolution 이라합니다. 39
결과다중하전이온및 Deconvolution 예제 변형되지않은글루타민합성효소의예상질량 : 51,772.7u 발현된글루타민합성효소의질량스펙트럼 발현된글루타민합성효소의 Deconvoluted 질량스펙트럼 출처 : Accurate-Mass LC/TOF-MS 를통한원형단백질의분자량확인 (Accurate-Mass LC/TOF-MS for Molecular Weight Confirmation of Intact Proteins) (4 페이지의그림 1) 40
약어 약어 정의 약어 정의 APCI 대기압화학이온화 LC/MS 액체크로마토그래피질량분석법 APPI 대기압광이온화 M 분자이온 CI 화학적이온화 MALDI 매트릭스를이용한레이저탈착이온화 CID 충돌유도분리 (Collision Induced Dissociation) MMI 멀티모드이온화 D Dopant(APPI) MS 질량분석법 Da 달톤 (Dalton) m/z 질량대전하비율 EI 전자충돌 QQQ Triple Quadrupole ESI 전자분무이온화 SIM 단일이온모니터링 GC 가스크로마토그래피 SM 용매분자 GC/MS 가스크로마토그래피질량분석법 SQ Single Quadrupole ICP 유도결합플라즈마 MRM 다중반응모니터링 (Multiple Reaction Monitoring) IT Ion Trap (Q) - TOF Time-of-Flight 41
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