EBV Cp 메틸화와악성림프종 175 제 1형은 EBERs와 EBNA-1만발현되는형태로버킷림프종과 EBV 관련위암종이이에해당하고, 제 2형은 EBNA-1과 LMP1은발현되나 EBNA-2 등이발현되지않는형태로서 NKTL과 PTCL은대부분제 2형이라고알려져있다. 7 제3형

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서균 계
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1 대한병리학회지 : 제 37 권제 3 호 2003 The Korean Journal of Pathology. 2003; 37: NK/T 세포림프종과말초 T-세포림프종에잠복감염된 Epstein-Barr Virus의 Major Latent Promoter C의메틸화분석 김지은 김영아 박성신 1 전윤경 1 이승숙 2 김철우 1 서울시립보라매병원병리과 1 서울대학교의과대학병리학교실종양면역연구센터및암연구센터 2 원자력병원병리과 접수 : 2003년 1월 25일게재승인 : 2003년 5월 29일 책임저자 : 김철우우 서울시종로구연건동 28 서울대학교의과대학병리학교실전화 : Fax: cwkim@plaza.snu.ac.kr * 본연구는보건의료기술연구개발사업 (HMP-98-M ) 의지원으로이루어졌음. Methylation Status of Epstein-Barr Virus Major Latent Promoter C in NK/T-cell Lymphoma and Peripheral T-cell Lymphoma Ji Eun Kim, Young-A Kim, SungShin Park 1, YoonKyung Jeon 1, Seung Sook Lee 2 and Chul Woo Kim 1 Department of Pathology, Seoul Municipal Boramae Hospital, Seoul; 1 Tumor Immunity Medical Research Center and Cancer Research Institute, Seoul National University College of Medicine, Seoul; 2 Department of Pathology, Korea Cancer Center Hospital, Seoul, Korea Background : Both the Natural killer/t-cell lymphoma (NKTL) and the peripheral T-cell lymphoma (PTCL) are relatively prevalent in the Asian population, and they are strongly associated with the Epstein-Barr virus (EBV). These two diseases have several common pathologic features, but show somewhat different clinical presentations. The critical point in terms of differentiating of these disease groups might be the impact of EBV in pathogenesis, and the variable gene expression of EBV regulated by a major latent C promoter (Cp). Methods : We investigated 43 cases of NKTL and 30 cases of PTCL to evaluate EBV associated characteristics. EBV in situ hybridization was performed in all of the submitted cases. In the EBV positive cases, the methylation status of Cp which drives the expression of immunodominant viral nuclear protein, was examined by sensitive methylation specific PCR using paraffin embedded tissue. Results : EBV was found in 70% (30/43) of NKTL and 43% (13/30) of PTCL. Nasal and gastrointestinal lymphomas were predominantly NKTL. All of the successfully amplified cases of EBV positive NKTL and PTCL were of methylated Cp status. Conclusion : The detection rate of EBV is high in NKTL, especially in the nasal area. The constantly methylated EBV Cp reflects the major role of Cp in regulating the EBV latency pattern and in helping EBV to avoid host immune system in both NKTL and PTCL. Key Words : Herpesvirus 4, Human-Lymphoma, T-cell-Promoter regions-methylation Epstein-Barr Virus (EBV) 는 gammaherpes virus family 에속하는 DNA virus로구강유모백반증 (oral hairy leukoplakia), 버킷림프종, 호지킨림프종, 코인두암종, 장기이식후면역증식성질환및 T 세포림프종등양성및악성종양을포함한다양한질병의병인과관련이있다. 1 말초 T-세포림프종 (peripheral T-cell lymphoma, PTCL) 과자연살해세포 /T-세포림프종 (natural killer/t-cell lymphoma, NKTL) 은 EBV 관련종양중에서도특히한국을비롯한극동아시아지역에서자주발생하는특징이있어서관심이집중되고있다. 이중비강부위에주로발생하는 NKTL은 1994년 Revised American-European classification of lymphoid neoplasm (REAL) 분류 2 에따르면혈관중심성 T-세포림프종 (angiocentric T-cell lymphoma) 으 로도불리며우리나라비호지킨림프종의 8.7% 를차지하고있고, 3 종양세포가 NK-세포와 T-세포의표지자를공유하고있는경우가많으며거의대부분증례의종양세포핵에서 EBV의게놈이관찰된다. 4 이에비해 REAL 분류및 2001년 WHO 분류 5 에따라 PTCL, unspecified로분류되는일군의질환은성숙 T 세포림프종의대부분을차지하고있으며, EBV와의관련성이 NKTL보다는낮아한국에서는약 58% 의 EBV 검출률을보이고있다. 6 이와같이 EBV와연관되어있는림프종으로면역학적특성을일부공유하고있는 NKTL과 PTCL에서 EBV가종양형성과정에서담당하고있는역할은아직명확하지않다. EBV의잠복감염형은 EBV가종양세포에잠복감염되었을때발현되는단백질의종류에따라세가지형태로분류하고있다. 174

2 EBV Cp 메틸화와악성림프종 175 제 1형은 EBERs와 EBNA-1만발현되는형태로버킷림프종과 EBV 관련위암종이이에해당하고, 제 2형은 EBNA-1과 LMP1은발현되나 EBNA-2 등이발현되지않는형태로서 NKTL과 PTCL은대부분제 2형이라고알려져있다. 7 제3형은 6가지단백이모두발현되는형으로서장기이식후면역증식성질환이이에속한다. 이렇게 EBV가면역우세항원인 EBNA-2를발현하지않고일부단백만을표현하는이유는, 세포독성 T 림프구의공격을피하기위한것으로생각된다. 8 숙주세포에서 EBV 단백질발현을조절하는것은 EBV 유전자중 BamHI-C fragment에위치한 major latency promoter인 C promoter (Cp) 이다. 이 Cp는모든 EBNAs의전사를유도함으로써 EBV 에감염된세포의성장특성과세포독성 T-림프구에대한감수성을결정하는가장중요한인자이다. 9 Cp의활성도조절은일부염기서열의메틸화에의해주로이루어진다. 9 NKTL 과 PTCL은대개제 2형잠복감염형에속한다고알려져있으나, 일부는 EBNA-2 mrna가검출된다는보고가있어 10 이들종양중일부는 Cp가활성화되어있을가능성이있다. 본연구는 Cp 활성도가 NKTL과 PTCL의진단별또는장기별차이를유발하는지알아보고자시행하였다. 재료와방법대상환자 1996년부터 2000년까지서울대학교병원및보라매병원에내원하여조직생검을받은환자중 NKTL 43예, PTCL 30예를대상으로하였다 (Table 1, 2). 환자의임상병력과나이, 성별등은병리검사의뢰서및의무기록지를참조하였다. 43예의 NKTL 환자중남자는 26명, 여자는 17명이었으며 ( 남녀비, 1.53:1), 30 예의 PTCL은남자 18명, 여자 12명이었다 ( 남녀비, 1.5:1). 진단당시환자의연령은 NKTL의경우 29세부터 79세까지 ( 평균 48.8세 ) 분포하였으며 PTCL의경우는 7세부터 71세까지 ( 평균 49.4세 ) 분포하였다. 침범된장기로는 NKTL의경우비강과코인두가가장많았다 (21예, 49%). 비강이외의침범장기로는위장관 (7예) 이가장많았으며, 그외입인두및구강 7예, 침샘 2 예, 고환, 피부, 자궁목, 간, 창자간막등이있었다. PTCL의경우는림프절병변이다수를차지하였으며 (12예, 40%), 위장관 5예, 구강 3예, 비강 2예및기타장기등이있었다. NKTL과 PTCL의진단기준은 2001년출간된 WHO 분류에기초한것이다. 5 비강 NKTL의진단은조직학적으로비정형림프구들의침윤이있고, 면역염색에서종양세포들이 CD56에양성이거나, CD56 음성이라도세포질내 CD3가약하게발현지만세포표면 CD3와 CD45RO는음성일경우에이루어졌다. 비강 NKTL은조직학적으로혈관침윤및응고괴사가관찰되는예들이대다수였다 (Fig. 1). 비강외 NKTL도위에기술한조직학적소견과 Table 1. Clinical profiles and EBV molecular data of 43 cases of NKTL Case Age (years) Sex site EBV ISH Cp 1 42 M nasal cavity negative 2 44 M skin. liver, LN negative 3 41 M oropharynx positive methyl 4 60 M testis positive methyl 5 53 F nasopharynx positive methyl 6 30 M colon positive methyl 7 50 F nasal cavity positive methyl 8 38 F nasal cavity positive methyl 9 59 M nasal cavity, colon negative F oropharynx negative M nasal cavity positive methyl F colon positive methyl M pancreas, liver, BM negative M tonsil positive methyl M nasal cavity positive methyl F nasal cavity negative M nasal cavity positive methyl F nasal cavity positive methyl M nasal cavity positive methyl F nasal cavity positive methyl M duodenum positive methyl F nasal cavity positive methyl M nasal cavity positive methyl F parotid gland, LN negative F parotid gland positive NR M liver, brain, kidney negative M small bowel positive methyl F colon, LN, BM negative F uterine cervix positive NR F nasal cavity positive methyl M cervical lymph node positive methyl F nasal cavity positive methyl F nasal cavity positive NR M nasal cavity positive methyl M hard palate positive methyl M tongue, rectum, LN negative M oral cavity, LN negative M nasal cavity positive NR F esophagus negative M uvula positive methyl M nasal cavity, rectum, lung negative M nasal cavity positive methyl M colon positive methyl NKTL, NK-T cell lymphoma; EBV ISH, EBV in-situ hybridization; Cp, C promoter; LN, lymph node; BM, bone marrow; NR, no reaction; methyl, methylated. 면역염색의기준은동일하였다. 그러나, 위장관종양인경우종양세포의 CD56 양성여부를중요시하였으며융모위축과장병증을동반하는 enteropathy-associated T-cell lymphoma를배제하였다. 비강 NKTL과비강외 NKTL 모두 T-세포수용체감마재배열 (T-cell receptor rearrangement) 은일어나지않는증례들로한정하였다. PTCL의진단은 REAL 기준에기초하여이루어졌으며, 면역염색에서 CD3나 CD45RO 양성이면서

negative 5 68 F oral cavity positive methyl 6 42 F eyelid positive methyl 7 20 M skin negative 8 49 F skin negative 9 42 F colon positive methyl 10 71 M nasal cavity, soft tissue negative 11 36 M

3 176 김지은 김영아 박성신외 3 인 Table 2. Clinical profiles and EBV molecular data of 30 cases of PTCL Case Age (years) Sex site EBV ISH Cp 1 20 M disseminated positive NR 2 39 M colon positive methyl 3 55 M LN positive NR 4 60 M tonsil negative 5 68 F oral cavity positive methyl 6 42 F eyelid positive methyl 7 20 M skin negative 8 49 F skin negative 9 42 F colon positive methyl M nasal cavity, soft tissue negative M colon positive methyl F skin negative M nasal cavity positive methyl M LN negative M LN negative F LN negative M LN negative F skin negative F LN positive NR F nasal cavity negative F colon positive methyl 22 7 M soft tissue negative M stomach negative F LN positive NR M LN negative M LN negative M LN negative M LN positive NR M LN positive NR F hard palate negative PTCL, peripheral T-cell lymphoma; EBV ISH, EBV in-situ hybridization; Cp, C promoter; methyl, methylated; LN, lymph node; NR, no reaction. CD56 음성인예들에한정하였다 (Fig. 2). EBV 제자리부합화 파라핀블록에서 4 m 두께로박절한조직을 silane 도포된슬라이드에얹고탈파라핀과재함수과정을거친뒤 proteinase K로 37 항온조에서 30분간처리한후다시세척하여에탄올로탈수하였다. 다음 fluorescein-conjugated EBV oligonucleotide (cocktails of EBER 1 and 2, Dakopatts, Glostrup, Denmark) 를조직에올려커버슬라이드를덮은채 4 에서 14시간보합결합시킨뒤 TBS 완충액으로세척하였다. 검출은 DAKO ISH detection kit (K046, Dakopatts) 를사용하였는데, 먼저 1:100 으로희석한 rabbit F(ab )2 anti-fitc/ap 150 L로 30분반응시키고 TBS 완충액으로수세하였다. 그리고, 기질완충액에담그고희석한효소기질 (BCIO/NBT) 로 30분처리하여증류수로세척한후봉입하여관찰하였다. Fig. 1. NK-T cell lymphoma shows pleomorphic infiltrates with angioinvasion and zonal necrosis. Fig. 2. Peripheral T-cell lymphoma shows infiltration of atypical small lymphoid cells with vascular proliferation. 메틸화특이 PCR 20 m 두께의파라핀절편 2개를튜브에넣어탈파라핀한후 genomic DNA isolation kit (Boerhinger Mannheim, Indianapolis, USA) 를이용하여 DNA를추출하였다. 다음 bisulfite modification을거쳐중합효소연쇄반응 (PCR) 을시행하였다. 구체적인과정은다음과같다. 2-5 g의 DNA를 0.3 mol/l NaOH 용액에 37 에서 15분간변성시켰다. 매실험마다즉석에서제작한 Bisulfite solution (3.5 M sodium bisulfite 550 L/1 mm hydroquinone, ph 5.0) 을첨가하여무기질유지 (mineral oil) 를떨어뜨린뒤암소에서 55, 16시간동안반응시켰다. 다음 Wizard Clean-Up System (Promega, Madison, USA) 을사용하여염기제거및정제과정을거쳤다. 우선 DNA clean-up Resin을 1 ml 첨가하여혼합한뒤주사기를이용하여 minicolumn에통과시켜 DNA는 column에부착시킨후 80% isopropranolol 2 ml로남은 resin과염기를제거하는과정을 2-3회

EBV Cp 메틸화와악성림프종 177 반복하였다. 이렇게처리된 DNA를튜브에담아 13,000 G에서 2분간원침하여 resin을건조시킨뒤 65-70 의증류수 50 L 로녹였다. 다음 7.

4 EBV Cp 메틸화와악성림프종 177 반복하였다. 이렇게처리된 DNA를튜브에담아 13,000 G에서 2분간원침하여 resin을건조시킨뒤 의증류수 50 L 로녹였다. 다음 7.5M ammonium acetate 35 L와 100% 에탄올 170 L, salmon sperm DNA 1 L 등을첨가하여 -70 에서 15분간침전시킨 DNA를다시 70% 에탄올로수세하여건조시킨후증류수에녹여사용하였다. 이렇게준비된 DNA를이용하여 PCR을시행하였다. PCR 시동체 (primer) 는 bisulfite modification 후메틸화 DNA와비메틸화 DNA에각각선택적으로결합할수있도록제작하였으며, 11 Cp의 EBNA2 반응부위 (response element) 를증폭하도록고안하였다. 시동체의염기서열은다음과같다. 메틸화 Cp: mb3: GTCC*GAAACC*GAAC*GACTC*G (coordinate in B95-8: 10, , 23) mb4: GTAAGGC*GTAATTAATTTC*GTTC* (coordinate in B95-8: 11, , 194) 비메틸화 Cp ub3: CATCCAAAAACCAAACAACTCA (coordinate in B95-8: 10, , 723) ub4: AGTAAGGTGTAATTAATTTTGTTT (coordinate in B95-8: 11, , 194) Thermocycler (Perkin Elmer, Boston, USA) 를사용하여 94 에서 10분간초기변성시킨후, 94 30초 55 (methylated primer 경우는 58 ) 30초 72 30초주기로 35회시행하였으며, 72 에서 10분간최종연장한후결과물을 ethidium bromide 함유된 2% 우무겔에서전기영동하여확인하였다. 메틸화 Cp에대한양성대조표본은 EBV 양성버킷림프종세포주인 Raji를사용하였으며, 비메틸화 Cp에대한양성대조표본은 EBV immortalized B lymphoblastoid cell line인 B95-8을사용하였다. EBV 제자리부합화결과 결과 진단별로구분하여 NKTL은 43예중 30예 (70%) 에서 EBER 제자리부합화결과양성이었다 (Fig. 3). PTCL은 30예중 13예 (43%) 에서양성으로나타나 NKTL의 EBV 양성도가 PTCL 보다현저히높았다 (p<0.05, Table 3). EBV 양성군에서는 EBV 양성 NKTL 남자의평균연령이 51.9세로, EBV 양성 NKTL 여자의평균연령인 42.4세보다많았다 (p<0.05). 발생부위별로비강림프종과비강외림프종으로구분하였을때비강림프종에서 EBV 연관성이뚜렷이높게나타났으며 (p<0.05, Table 4), 비강림프종은대부분이 NKTL이었다. 구강을포함한소화관림프종과비소화관림프종으로구분한군간에는환자의연령, 성별, EBV 양성도등에서유의한차이를발견할수없었다. 그러나비강외림프종중에서소화관림프종과비소화관림프종을분리하였을때소화관림프종은 22예중 14예 (64%) 가 NKTL이었고비소화관림프종은 51예중 29예 (57%) 가 NKTL이었다. 이중비강을제외하면 29예중 8예 (26%) 만이 NKTL이므로소화관은비강다음으로 NKTL이호발하는장기임을알수있었고 (p<0.05), EBV 양성률도비소 Table 3. Analysis of EBV positivity between cases of NKTL and PTCL Group No Mean age (years) Sex (M:F) EBV positivity NKTL :17 30/43 (70%) PTCL :12 13/30 (43%) NS NS p<0.05 No, numbers; NKTL, natural killer/t-cell lymphoma; PTCL, peripheral T- cell lymphoma; NS, not significant. Table 4. Relationship between tumor site, clinical data and EBV positivity Mean age Group No Sex (M:F) EBV positivity (years) A1: nasal NKTL :10 17/21 (81%) A2: non-nasal NKTL :7 13/22 (59%) NS NS p=0.123 B1: nasal, total :11 18/23 (78%) B2: non-nasal, total :18 25/50 (50%) NS NS p<0.05 C1: GI NKTL :4 9/14 (64%) C2: non-gi NKTL :13 21/29 (72%) NS NS NS D1: GI, total :8 14/22 (64%) D2: non-gi, total :21 29/51 (57%) NS NS NS Fig. 3. Positive signals of EBER ISH are found in numerous tumor cell nuclei. No, number; NKTL, natural killer/t-cell lymphoma; NS, not significant; total, NKTL+PTCL; GI, gastrointestinal tract including oral cavity.

5 178 김지은 김영아 박성신외 3 인 L M U 1m 1u 2m 2u 3m 3u Fig. 4. Methylation specific PCR analysis for EBV Cp. Lane L, 100 bp marker; M, positive control of methylated Cp. (Raji) U, positive control of unmethylated Cp, (B95-8); 1m, PCR product of case 4 of NKTL by methylation specific primer; 1u, PCR product of case 4 of NKTL by unmethylation specific primer; 2, case 12 of NKTL; 3 m, case 5 of PTCL. 화관림프종보다높은경향을보였다 (p=0.09). 또한 PTCL에서는소화관을침범한증례 8예중 5예 (63%) 에서 EBV가양성으로나온데비해, 소화관외장기에서발생한증례에서는 22예중 7예에서만 (32%) EBV가연관되어있었다 (p<0.05). Cp 의메틸화양상 Cp의메틸화에관한검색은 EBER 제자리부합화에서양성으로판정된 30예의 NKTL과 13예의 PTCL을포함하여총 43 예에서메틸화특이 PCR 기법으로시행하였다. 성공적인 PCR 산물은 26예의 NKTL (87%) 과 7예의 PTCL (54%) 등 33예 (77%) 에서얻을수있었고, 진단과침범장기등에관계없이모두균일하게메틸화된 Cp만보였으며, 비메틸화산물은전혀검출되지않았다 (Fig. 4). 반복적실험에도불구하고메틸화특이 PCR에서산물이나오지않아결과판정을할수없었던 10 예 (23%) 는 4예의 NKTL과 6예의 PTCL로, PTCL에서메틸화특이 PCR의성공률이더낮았으며이중 4예가림프절이원발병소인 PTCL이었다. 고찰 EBV가 NKTL의병인과밀접한관계가있다는것은이미잘알려져있다. 특히비강주위에생기는 NKTL인경우멕시코인에게서는 90% 이상에서 EBV가검출되었고, 12 한국에서는중국과유사한분포로역시 90% 이상검출되었다. 6 본연구에서도비강 NKTL은 81% 의 EBV 양성률을보인반면, 비강외 NKTL의 EBV 양성률은 59% 로서그간의보고와어느정도일치하였다. 또한구강을포함한소화관에서는 NKTL의발생률이 PTCL보다높고소화관은비강다음으로 NKTL이호발하는장기로서, EBV 의장기또는침범경로에따른선호도가다르다는것을짐작하게하였다. 지금까지 PTCL에서 EBV의명백한침범경로는밝혀져있지않다. 그러나, 비강과소화관은모두점막층을통한 EBV의침입이가능한장기라는공통점이있 고, 구강또는비점막상피세포가 EBV의저장고역할을할가능성을생각할수있다. 특히 EBV 양성 NKTL 환자는남자가여자보다 10년정도평균연령이높았다. 이는 Huh 등 6 의결과와도일치하였는데, 면역력이나내분비계통또는환경의차이에의한것인지규명하기위해다른연구가필요할것이다. Cp 활성도의검사는 bisulfite genomic sequencing 8 또는메틸화특이제한효소를이용한 Southern 13 이주로이용되어왔으나, 이두가지방법모두예민도가떨어지고보존이잘된많은양의 DNA가필요하다는제한때문에파라핀포매조직에서는이용할수없다는단점이있다. 그에비해메틸화특이 PCR 방법을이용하면시료의양이적거나파라핀포매조직같이 DNA 가분절되어있는경우에도이용할수있어서메틸화여부를보기위해서는최적의연구방법이라할수있다. DNA 메틸화를보기위한이방법은 Herman 등 14 이발표하여소개되었다. 그원리는 sodium bisulfite를처리하면시토신이우라실로치환되지만메틸화된시토신은치환되지않는다는이치에착안하여, 메틸화된 DNA와비메틸화된 DNA에각각상보적인시동체를제작하여 PCR을시행하는방법이다. Tao 등 11 은이기법으로여러가지유형의림프증식성질환의신선동결조직에서 EBV Cp 중 EBNA-2 반응부위부근의 EBV Cp의메틸화상태를조사하였으며, 시료의제한점으로인해단지 2예의 NKTL에서 Cp가메틸화되어있음을확인하였다. 따라서본연구가현재까지가장광범위하게 NKTL과 PTCL에서의 EBV Cp의메틸화상태를조사한연구로상기질환들의특성을대표할수있다고생각되며, 파라핀조직에서결과물을얻었다는데더욱큰의의가있다. NKTL과 PTCL에서는대부분 EBNA-1과 LMP1 만발현되고 EBNA-2는발현되지않는다고알려져있다. 그러나, 일부종양세포에서 EBNA2 mrna가전사되는것이확인 되어 10 Cp 의메틸화양상이증례마다다양하게나타날것을기 대하였으나, 결국본연구에포함되었던거의모든 NKTL과 PTCL에서는균일한 Cp 메틸화를확인하였다. 이는 NKTL과 PTCL은 Cp 메틸화를통해항원성이강한 EBNA-2 등을전사하지않음으로써숙주세포로부터면역회피를이끌어내어잠복감염을유지할것이라는가설을뒷받침하는결과이다. 8,13 지금까지 Cp 메틸화에대한결과들을종합해보면다음과같다. EBV-immortalized lymphoblastoid cell line인 B95-8에서는 Cp가비메틸화되어거의모든 EBV 관련단백들이발현되는제3형잠복감염형을유지한다. 그러나장기이식후림프증식성질환과같이숙주면역이저하되어있으나, 아직림프종으로의비가역적변화가일어나지않은단계의질환에서는대부분 Cp 가비메틸화되어있거나일부는메틸화된 Cp와비메틸화된 Cp 가한환자에게서동시에존재하는양상을보였다. 호지킨림프종과버킷림프종에서는 EBV Cp의메틸화가확인된보고들이있다. 8 그외코인두암종등을포함한대부분의 EBV 관련종양에서도 Cp가메틸화되어있어 11 EBV Cp의메틸화가종양생성의핵심적단계라는주장이제기되었다. 그러나정상림프구

6 EBV Cp 메틸화와악성림프종 179 에서도약 48% 에서 Cp의메틸화가밝혀져, 15 Cp의메틸화가직접적으로종양형성에기여한다기보다는 EBV의융해성감염을잠복감염으로전환시키는역할을할가능성이더클것으로보인다. 정상면역을가진환자에서는초감염은 Cp가비메틸화된 EBV에의해발생하더라도곧잠복감염형을유지하기위해 Cp 메틸화가일어나고, 이과정이세포전환능력에는영향을주지않아일정기간후에림프종이발병할수있다는가설을세울수있다. 메틸화는세포성유전자, 특히종양억제유전자에주로발생하여종양내형성과관련이있으며, 16 EBV와같은외부 DNA에메틸화가일어나는일은매우특이하다. PCR 결과물을얻을수없었던 10예 (NKTL 4예, PTCL 6 예 ) 는 Cp의결손 (deletion) 이의심되어야생형 Cp 염기서열중흔히결손이일어나는부위 (Cp EBNA-2 반응부위 ) 전후로올리고핵산염시동체를제작하여 17 PCR을시행하였으나, 결손산물은발견되지않았다. 따라서 Cp 결손은이들종양에서거의발생하지않는것으로추정할수있었다. 메틸화특이 PCR 에서결과를얻을수없었던증례들은종양세포의수가적거나, EBER 제자리부합화에서 EBER 양성세포의수가극히적은것들이대부분이어서 bisulfite modification 도중 EBV를포함한세포의 DNA가소실되었을가능성이있다. 특히 EBV 양성세포의밀도가상대적으로높은 NKTL보다 PTCL에서메틸화특이 PCR의성공률이낮았던점이위의가능성을뒷받침하고있다. 또한 PCR 산물의크기 (512 bp, 516 bp) 가상대적으로커서비교적보존이잘된 DNA가필요한데파라핀블록에서추출한 DNA는질적으로한계가있었던것으로추정된다. 이연구를통해 NKTL과 PTCL은 EBV와밀접한관계가있으며, 그중비강 NKTL과소화관 PTCL에서특히 EBV 감염과깊이연관되어있음을확인하였다. EBV의종양단백발현을조절하는 Cp는이들종양에서거의대부분메틸화되어있음이밝혀졌고, Cp의메틸화가 EBV의잠복감염을유지하는주된기전임을시사하였다. 참고문헌 1. Gaffey MJ, Weiss LM. Association of Epstein-Barr virus with human neoplasia. Pathol Annu 1992; 1: Harris NL, Jaffe ES, Stein H, et al. A revised European-American classfication of lymphoid neoplasms: A proposal from International Lymphoma Study Group. Blood 1994; 84: Ko YH, Kim CW, Park CS, et al. REAL Classification of malignant lymphomas in the Republic of Korea: Incidence of recently recognized entities and changes in clinicopathologic features. Hematolymphoreticular study group of the Korean society of pathologists. Revised Europian-American lymphoma. Cancer 1998; 83: Chan JK. Natural killer cell neoplasm. Anat Pathol 1998; 3: Jaffe ES, Harris NL, Stein H, Vardiman JW. World health organization classification of tumours pathology and genetics of tumours of haematopoietic and lymphoid tissues. Lyon; International agency for research on cancer, 2001; Huh JR, Cho KH, Heo DS, Kim JE, Kim CW. Detection of Epstein- Barr virus in Korean peripheral T-cell lymphoma. Am J Hematol 1999; 60: Chiang AKS, Tao Q, Srivastava G, Ho FCS. Nasal NK-T cell lymphomas share the same type of Epstein-Barr virus latency as nasopharyngeal carcinoma. Int J Cancer 1996; 68: Robertson KD, Manns A, Swinnen LJ, Zong JC, Gulley ML, Ambinder RF. CpG methylation of the major Epstein-barr virus latency promoter in Burkitt s lymphoma and Hodgkin s disease. Blood 1996; 88: Robertson KD, Hayward DJ, Samid D, Ambinder RF. transcriptional activation of the EBV latency C promoter following 5-azacytidine treatment: evidence that demethylation at a single CpG site is crucial. Mol Cell Biol 1995; 15: Harabuchi Y, Yamanaka N, Kataura A, et al. Epstein-Barr virus in pateints with lethal midline granuloma. Lancet 1990; 335: Tao Q, Swinnen LJ, Yang J, Srivastava G, Robertson KD, Ambinder RF. Methylation status of the Epstein-Barr virus major latent promoter C in iatrogenic B cell lymphoproliferative disease. Am J Pathol 1999; 155: Kojo SJ, Johnson E, ZaratOsorno A, et al. Cytotoxic granular protein expression, Epstein-Barr virus strain type, and latent membrane protein-1 oncogene deletions in nasal T-lymphocyte/natural killer cell lymphomas in Mexico. Mod pathol 1998; 11: Minarovits J, Minarovits-Komuta S, Ehlim-Henriksson B, Falk K, Klein G, Emberg I. Host cell phenotype-dependent methylation patterns of Epstein-Barr virus DNA. J Gen Virol 1991; 72: Herman JG, Graff JR, Myohanen S, Nelkin BD, Baylin SB. Methylation specific PCR: A novel PCR assay for methylation status of CpG islands. Proc Natl Acad Sci. 1996; 93: Robertson KD, Ambinder RF. Methylation of Epstein-Barr Virus genome in normal lymphocytes. Blood 1997; 90: Counts JL, Goodman JL. Alterations in DNA methylation may play a variety of roles in carcinogenesis. Cell 1995; 83: Swaminathan S. Characterization of Epstein-Barr Virus recombinants with deletions of the BamHI C Promoter. Virology 1996; 217:

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Jkbcs016(92-97).hwp Expression of bcl-2 and Apoptosis and Its Relationship to Clinicopathological Prognostic Factors in Breast Cancer - A Study with Long Term Follow-up correlated with the survival rate.(journal of Korean