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1 발간등록번호 비임상 / 임상천연물원료민간위탁생산시스템구축 (Candidate compounds for natural drug commercialization infrastructure) ( 유 ) 한풍제약 농림축산식품부

2 제출문 농림축산식품부장관귀하 이보고서를 비임상 / 임상천연물원료민간위탁생산시스템구축 과제의보고서로제 출합니다 년 3 월 22 일 주관연구기관명 : ( 유 ) 한풍제약주관연구책임자 : 전기용연구원 : 김대성연구원 : 전창현연구원 : 유진주위탁연구기관명 : 전북대학교위탁연구책임자 : 김대기위탁연구기관명 : 원광대학교위탁연구책임자 : 김성연위탁연구기관명 : 건양대학교위탁연구책임자 : 조성완

3 요약문 Ⅰ. 제목 비임상 / 임상천연물원료민간위탁생산시스템구축 Ⅱ. 연구성과목표대비실적 Ⅲ. 연구개발의목적및필요성 바이오경제사회의도래와생명공학기술의발전으로산업소재로서의천연물자원의가치와중 요성이부각되고있으며농생명자원의활용가치가급속도로확대되고있음. CMO(Contract Manufacturing Organization) 조직은비임상및임상시험에필요한의약품제조와식약처의임상시험계획승인을위한품질관리문서를제공하고최종제품화까지의약품개발의전반적인업무를지원하는조직임. 의약품후보물질개발에서상용화까지많은시간이소요되며, 성공여부를알수없는상황에서대규모생산시설을구축하는것은현실성이없음. 따라서관련분야의 CMO 조직을활용하는것이일반적임. 천연물의약품의경우특화된 CMO 조직이거의없으며, 천연물의표준화, 규격화에경험과노하우를갖고있는전문조직이필요한실정임.

4 다양한화합물을함유하고있는천연물의약품은화합물의성분이나활성성분을규명하기어렵 고, 활성을반영할수있는지표를찾기힘들다. 또한원료의기원, 지역, 채취시기및기후에 따라차이가심하므로원료의관리가중요하고, 품질의일관성을확보하기에어려움이있음. 따라서의약품의 3 대특성을확보하기위하여원료단계에서시제품단계까지기존에실험실 혹은 pilot scale 에서의관리보다우수한표준화된관리지침 (SOP) 을마련하고이를바탕으로 하는최적화된소규모 GMP 인증시스템구축이필요함. 국내의생물의약품제조 CMO 기업으로는 2002 년셀트리온이인천송도구역에최대의시 설을갖추어설립되었고주로단백질의약품생산을진행하고있음. 그러나천연물특화비 임상및임상시험용의약품을생산해줄시설이미흡한실정임. 따라서, 천연물원료를기반으로하는비임상및임상시험용의약품생산기술을축적하고있는 CMO 조직을육성하여천연물신약개발및기능성소재개발을활성화하고, 이를통해국내약용식물또는기능성식물자원의이용률을높여재배농가의소득증대및국민보건향상에기여하고자함. Ⅳ. 연구개발내용및범위 비임상및임상시험용원료의약품 (API, Active Pharmaceutical Ingredients) 생산최적화시스템구축 제제개발시스템구축 - 임상시험및신제품제제개발에활용할수있는제제개발시스템구축 제조설비적격성평가실시 - 설계적격성평가 (Design Qualification, DQ) - 설치적격성평가 (Installation Qualification, IQ) - 운전적격성평가 (Operational Qualification, OQ) - 성능적격성평가 (Performance Qualification,PQ) 구축된생산시스템의우수의약품제조및품질관리기준 (Korea Good Manufacturing Practice, KGMP) 승인을획득 - KGMP 규격에맞는크린룸설치 - 구축된기기의적격성자료구축 ( 밸리데이션실시 ) 천연물특화비임상및임상시험용의약품제공및기준규격확립 - 인후염개선 (YG-1: 인동등, 우방자, 황금 ) 을위한기능성소재탐색및표준화

5 - 진해 / 거담개선 (HAE-06: 인동등, 황금, 사삼, 옥죽 ) 을위한소재탐색및표준화 - 의뢰받은비임상및임상시험용시료제공 천연물의약품의인습문제해결을위한기술개발 임상시험계획승인 (Investigation New Drug, IND) 승인신청 2건및획득 1건 Ⅴ. 연구개발결과 임상시험용의약품제조시대량생산장비사용으로인한제조단가상승으로천연물신약및기능성소재를개발하는연구자들의부담이있었음. 이러한문제를해결하고자비임상효능시험과임상시험에사용할의약품제조에적당한소규모 API 제조설비및완제의약품제조설비를구축하였으며, 식약처로부터신규제조소에대한 BGMP 및 KGMP 적합판정을받았음. 천연물을활용한의약품및기능성소재발굴, 임상시험및시제품제조샘플제공실적은 3 년간총 80 건의제공실적을달성하였음. 이중대표적인예로오매 30% 에탄올연조엑스 는동화약품소화제인미인활명수액의주성분중하나로사용되어제품화되었음. 한풍제약의시설자금으로액제개발시스템을활용하여신제품을출시하였음. 출시한제품은편감원, 한풍노즈액, 한풍콜드액, 한풍코프액을출시하였음. 또한한방외용제인자운고를국내최초로한약제제밸리데이션을실시하여제품을출시하였음. 본과제를통해총 5 건을사업화하였음. 인후염치료제개발을위하여 YG-1 처방에대한소염및진통효능을평가하였음. Zymosan으로유도한급성염증모델에 YG-1을경구투여한결과 100 mg/kg 투여군에서유의성있는소염효능을보였으며, 과민통인 thermal hyperalgesia 및 mechanical hyperalgesia와이질통인 mechanical allodynia에대한유의성있는진통효능을보였음. 또한 Formalin으로유도한염증성통증에대한농도의존적인진통효능을나타내었음. YG-1은 LPS(Lipopolysaccharide) 로유도된염증성발열모델에서 100 mg/kg, 400 mg/kg 경구투여군에서체온상승을현저히억제하였음. 이러한체온상승억제효능은혈청내발열인자인 IL-1β 및 PGE2 증가를억제하고, 송과선내 inos 및 COX2 발현억제에의한것으로보임. 이러한결과는 in vitro 실험결과에서도유사한경향을보였음. 또한 YG-1은인후염에동반되는기침및가래에대한개선효능을보였으며, acetylcholine 에의해수축된백서의기관지평활근의이완효과를나타내었음. YG-1 추출물의기관지평활근이완효과는농도의존적으로나타났으며, 근형질막에존재하는 Ca 2+ 통로를통하

6 여 Ca 2+ 의유입을감소시킴으로써이완효과가보였음. 또한무스카린성 M 3 수용체를통한 acetylcholine 의수축효과를감소시킴으로써이완을유도하는것으로보임. YG-1 은인동등, 우방자, 황금복합처방이며제조공정, 기준규격및시험방법을확립하고, GLP(Good Laboratory Practice) 기관에서독성시험을통해안전성자료를확보하여 IND 승 인신청을하였으며, 최종승인을획득하였음. 진해 / 거담제개발을위해 6가지처방에대한비임상효능평가를통해진해억제및거담효능이가장좋았던 HAE-06 처방을선정하였으며, 항산화효능, 항염효능이있음을확인하였음. HAE-06의항염효능은 NO 생성과 TNF-α 생성억제, COX2 억제에의한것으로확인됨. HAE-06의기관지이완효능을평가한결과기관지평활근을농도의존적으로이완시켰으며, 이러한효능은 acetylcholine 활성을통해 camp 생성에영향을주고 PKA를통해기관지를이완시킨것으로보임. 또한근형질막에존재하는 K + 과 Ca 2+ 통로를통한 Ca 2+ 의유입을감소시킴으로써이완효과가일어났고, β-아드레날린성수용체와 COX에의해서도이완효과에영향을주는것으로확인하였음. HAE-06 은인동등, 황금, 사삼, 옥죽으로구성된처방이며, 제조공정, 기준규격및시험방법 을확립하고, 독성시험을통해안전성자료를확보하여 IND 승인을신청하였음 ( ). Ⅵ. 연구성과및성과활용계획 특허출원 3 건, 논문게재 2 편, 사업화 5 건, 임상시험계획승인신청 2 건중 1 건승인획득 하였음. 또한임상시험용의약품제조에최적화된소규모제조소에대한 KGMP 허가를받 는성과를달성하였음. 본과제를통해구축된소규모제조소를통해사업화에성공한 5 건의의약품매출액은현 재까지약 4 억 4 천만원이었음. 과제를수행하는동안 80건의비임상및임상시험용시료를제공하였으며, 타기관의신제품개발의뢰를받고있음. 이러한활용을통해신제품을계속적으로개발하여출시하고, 천연물신약개발에성공시개발한소재의원료를재배하는농가의소득증대로이어질수있을것으로기대함.

7 본과제를통해인후염치료제 YG-1 을발굴하여 IND 승인을받았으며, 이러한연구성과 에대해국내제약사로부터기술이전및공동연구추진에대한제의를받고있어후속 연구를통해천연물의약품으로개발할것임

8 SUMMARY Traditional herbs, like as Lonicera japonica, Arctium lappa or Scutellaria baicalensis have been used traditional drug for anti-inflammatory and anti-oxidant, demonstrated their function. The aim of this study was to investigate the anti-inflammatory effect of YG-1, which anti-inflammatory drug consist of golden ratio among Lonicera japonica, Arctium lappa and Scutellaria baicalensis for more effective synergy in a model of lipopolysaccharide (LPS) induced acute inflammatory stage in both macrophage (Raw 264.7) cells and Sprague-Dawley (SD) rats. YG-1 had not revealed specific cellular toxicity in Raw cells until 100 μg/ml. YG-1 reduced various marker related to inflammation such as IL-1β, COX-2 and inos increased by LPS in Raw cells. In consistent with these results, YG-1 exerts significant anti-inflammatory effect in LPS induced acute inflammation followed by fever in rats. LPS injected with intraperitoneal in rats and YG-1 (100, 400 mg/kg) orally administered. According to our expectations, acute fever and high concentration of IL-1β in serum induced by LPS were significantly reduced by YG-1. These results similar to flubiprofen which, commercial anti-inflammatory and anti-febrile drug. Taken together, our results demonstrated that beneficial effect of YG-1 on LPS induced acute inflammation, and suggested possibility of YG-1 served as more effective anti-inflammatory and anti-febrile drug. HAE series (HAE 01 06), are the mixtures of medicinal plants; Lonicerae Folium et Caulis (Lonicera japonica), Scutellariae Radix (Scutellaria baicalensis), Adenophorae Radix (Adenophora triphylla var. Japonica), Polygonati Oddorati Rhizoma (Polygonatum odoratum var. pluriflorum), Platycodi radix (Platycodon grandifiorum), Liriopis seu Ophiopogonis Tuber (Liriope platyphylla). HAE 06 showed the significant antitussive effect in HAE series. HAE 04, 05 and 06 increased the effect o fexpectorant measured by secretion of phenol red in rats. All tested HAE series were observed to have the anti-oxidant activity determined by the scavenging activity. HAE 01, 03 and 06 were significantly reduced the production of nitric oxide (NO) and tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) increased by LPS. HAE 06 was selected based on the results and done further experiments. HAE 06 inhibited the number of coughing induced by citric acid in dose dependent manner. HAE 06 effectively increased the effect of expectorant. HAE 06 exhibited anti-inflammatory effects by inhibiting the production of NO and TNF-α. In addition, HAE 06 significantly suppressed inducible Cyclooxygenase-2 (COX-2). Especially HAE 06 has the highest effect in alleviating the respiratory symptoms. Moreover, the enhacement antioxidant activity and reduction inflammation partly were attributed to it. HAE 06 may become the promising candidate for the treatment of respiratory symptom in the future.

9 CONTENTS ( 영문목차 ) Chapter 1 Overview and Objectives 1 Chapter 2 Overview of current research status of in this field 6 Chapter 3 Contents and results of research and development 9 Chapter 4 Achievement of goals and implications for related 182 Chapter 5 Research and development outcomes and their application plan 186

10 목 차 제 1 장연구개발과제의개요및성과목표 1 제 2 장국내외기술개발현황 6 제 3 장연구개발수행내용및결과 9 제 4 장목표달성도및관련분야에의기여도 182 제 5 장연구개발성과및성과활용계획 186

11 제 1 장 연구개발과제의개요및성과목표 1. 연구개발필요성 전세계적으로환경변화와급속한고령화사회에따른만성질환, 환경성질환, 퇴행성질환등만성 난치성질환이증가하고있으며, 합성의약품은장기간투여시이상반응등으로안전성확보와같은현대의약의치료적한계성갖고있음. 이러한한계를극복하기위한새로운의약품개발의필요성이대두었으며, 예방및장기간투여에따른안정성이확보되는의약품이요구되고있음. 전세계천연물의약품시장규모는중국, 미국, EU 25 개국의전문의약품, 일반의약품을포 함하여 2012 년약 23 조원으로추산되며, 이중중국이 20 조원규모로전체시장의 90% 를 차지하고있음. 신약개발비용이기하급수적으로증가하는가운데천연물은오랜임상경험을바탕으로유효성및안전성이입증되어신약개발에대한실패율을줄일수있으며, 합성의약품에비해비교적적은개발비용과개발기간이짧다는강점이있어합성의약품의대안으로급부상하고있음. 국내천연물의약품개발을촉진하기위해서는국내자생약용식물에대한데이터베이스를구축하고, 전통생약재로사용되는유용식물자원에대해과학적효능규명과천연물의약품의약효에대한신뢰성제고를위한품질표준화연구가지속적으로수행되어야하며, 지표성분또는효능성분에대한데이터베이스구축이필요함. 천연물의장점이자단점은다양한유효성분이존재한다는것이며, 밝혀지지않은미지의화 합물이포함되어있어성분을명확하게규명하기어려우며, 성분들간의상호작용으로인해 약효에영향을미칠수있음. 이러한이유로천연물을활용한의약품및기능성소재개발시유효성, 순도, 안정성, 동등 성등을관리할수있는 know-how 를갖춘전문기관의육성이필요함. 1개의신약제품이개발될경우국제적으로연간 1-2조원의매출과매출의 20-50% 의순이익을창출할수있는고부가가치산업이며, 다양한제형을개발을통해지속적인가치를창출할수있는산업임. 국제보건기구 (WHO) 에따르면천연물의약품시장은 540억달러이상의가치가있으며, 매년 8-10% 의성장률을보이는성장가능성이매우큰시장임. - Bristol-Myers Squib(BMS) 사의경우 Taxus 속식물 ( 주목 ) 로부터개발된항암제인 Taxol" 로 - 1 -

12 연간 12억달러 ( 약 1조 4천억원 ) 이상의매출액실현 - 브라질산뱀독성분인 Teprotide를기초로하여개발된고혈압치료제인 ACE 억제제 (Captropril)" 는연간 20억달러 ( 약 2조 4천억원 ) 이상의매출액실현 - 일본 Sankyo사는미생물로부터혈중콜레스테롤저하제 Compactin (mevastatin)" 을개발하여연간 1,000억엔 ( 약 1조원 ) 이상수출 - 독일의경우은행잎으로부터혈액순환장애치료제를개발하여연간 20억달러 ( 약 2조 4천억원 ) 이상의매출액실현 2014 년국내한약재생산액은 1,860 억원으로전년대비 1.97% 증가하였고, 수출액은 130 억원 으로전년대비 4.24%, 수입액은 1,290 억원으로전년대비 5.07% 증가하였음. CMO는비임상및임상시험에필요한의약품시료제조와임상시험계획승인을위한문서지원과최종승인을마친상업용제품의대량생산까지대행할수있음 - 천연물신약은최종제품개발에성공할확률이낮고의약품후보물질개발에서상용화까지 5년이상의기간이소요되며, 대규모생산시설을구축하는데에많은자본이필요함. - 따라서대규모투자가어려운바이오벤처기업이나제품개발단계에있는대기업의경우, 제품개발과정에서 CMO 업체를활용하는것이일반적임. 활발한신약개발이진행되어신약후보물질의임상시험단계에있음에도불구하고임상시험시료를생산해줄수있는국내인프라가매우미흡하여미국및유럽등지의전문위탁생산기업 (Contract Manufacturing Organization, CMO) 에위탁하여임상시험시료를생산하고있음. 이러한여건은임상시험비용을더욱높이고있으며, 생산된제품에하자를발견하여 - 2 -

13 도국외위탁생산업자를대상으로클레임을걸어해결하는것이언어소통에서나관련기 술수준축적정도로보아국내업체들에게는용이하지않아임상시험진행에어려움을주고 있음. 천연물원료를기반으로하는임상시험용의약품과완제의약품의생산은 KGMP 인증시스템 에서생산되어야하고, 의약품의 3 대특성인유효성 (Efficacy), 안전성 (Safety) 및품질 (Quality) 이확보되어야함. 천연물신약은원료의품질에따라효능과성분의차이가심하기때문에엄격한원료생약의 재배및유통표준화관리가필요함. 그러나현재국내에는이러한관리를위한기술이나 시스템구축이미흡함. 다양한화합물을함유하고있는천연물의약품은화합물의성분이나활성성분을규명하기어렵고, 활성을반영할수있는지표를찾기힘들다. 또한원료의기원, 지역, 채취시기및기후에따라차이가심하므로원료의관리가중요하고, 품질의일관성을확보하기에어려움이있음. 따라서의약품 3 대특성을확보하기위하여원료단계에서시제품단계까지기존에실험실혹은 pilot scale 에서의관리보다우수한표준화된관리지침 (SOP) 을마련하고이를바탕으로하는 최적화된소규모 GMP 인증시스템구축이필요함. 국내의생물의약품제조 CMO 기업으로는 2002 년셀트리온이인천송도구역에최대의시설 을갖추어설립되었고주로단백질의약품생산을진행하고있음. 그러나천연물특화비임 상및임상시험용의약품을생산해줄시설이미흡한실정임. 따라서, 천연물원료를기반으로하는비임상및임상시험용의약품생산기술을축적하고있는 CMO 조직육성은벤처기업및중소기업등소자본의천연물제약및식품업계의천연물신약개발및기능성소재개발을활성화하고, 이를통해국내약용식물또는기능성식물자원의이용률을높여재배농가의소득증대및국민보건향상에기여할수있음

14 2. 연구개발목적 천연물의약품및기능성소재개발시과도한생산설비를자체적으로갖추기보다는전문 위탁생산조직 (CMO, Contract Manufacturing Organization) 을활용함으로써설비투자에대한 손실을방지하고개발제품의특성에맞는전문조직을통해품질을확보할수있음. CMO 조직은단순히천연물제제를제조만하는것이아니라천연물신약후보소재선정단 계에서부터비임상, 임상시험, 식약처인허가등신제품개발전반에걸쳐천연물의품질을 관리하고, 문서를지원하며, 인허가대행및대량생산까지지원할수있는전문조직임. 본연구개발과제의목표는천연물에특화된 CMO 조직을육성하는것이며, 이를위해비임상및임상시험용의약품제조에최적화된소규모 KGMP 생산시스템을구축하여후보소재개발을위한비임상샘플제조및지원과식약처로부터임상시험계획승인 (IND) 을받기위한문서및행정지원, 임상시험실시를위한임상시험용의약품진약및위약제조지원, 제품화를위한식약처품목허가지원등에대한역량을강화하는것임. 1) 최종목표 천연물기반의약품, 비식품기능성소재비임상및임상시험용의약품위탁생산시스템구축 하고및제품화지원 2) 연구개발목표와성격 소규모의비임상시험용시료를생산할수있는시스템을구축하고효능시험진행을위한시 - 4 -

15 료제공및원료생약의표준화를실시한다. 또한보유하고있는장비를활용하여의뢰받은임상시험용의약품을생산 제공한다. 소규모의임상시험용의약품생산시스템을구축하고, 의뢰받은임상시험용의약품의생산 제공한다. 소규모 API 생산시스템구축 소규모제제개발시스템구축 KGMP 규격에맞는설비구축후 KGMP 신청및승인획득 비임상및임상시험용시료제공 - 인후염개선을위한기능성소재탐색 - 진해 / 거담개선을위한소재탐색 - 의뢰받은비임상및임상시험용시료제공 천연물의약품의인습문제해결을위한기술개발 IND 신청및승인획득 - 5 -

16 제 2 장 국내외기술개발현황 1. 천연물의약품국내현황 국내천연물신약개발성공사례에힘입어제약업계는천연물의약품개발을적극적으로추진하고있음. 현재까지개발에성공한신약중천연물신약은 8개로약 24% 를차지하며, 국내시판중인천연물의약품중동아에스티의스틸렌캅셀의경우 2009년 900억원, SK제약의조인스정의경우 200억원매출을기록함. 국내천연물자원으로활용할수있는약용자원이 135 과, 434 속, 712 종 14 품종 98 변종 2 아종으 로총 826 종이자생하고있음. 업체제품명적응증주요성분허가연도비고 동아에스티스티렌캅셀위염애엽 2002 년 위점액분비촉진 SK 케미칼기넥신혈액순환은행잎 1991 년일반의약품 SK 케미칼조인스정골관절염 위령선, 괄루근, 하고초 2001 년 연골파괴억제관절분해효소억제 안국약품푸로스판진해거담아이비엽 2000 년일반의약품 휴온스 살사라진 복부비만 당귀, 작약등 2003년 /2007년 구주제약 아피톡신주 골관절염 봉독 2000년 일반의약품 광동제약편자환간엄사향, 우황등 1983 년일반의약품 녹십자 신바로캡슐 골관절염 구척등 2011년 유유제약 타나민 D 혈액순환 은행잎 1993년 /2008년 안국약품 시네츄라시럽 기관지염 아이비엽, 황련 2011년 동아에스티 모티리톤정 기능성소화불량 견우자, 현호색 2011년 당귀, 목과, 한국피엠지 레일라정 골관절염 방풍, 속단, 2012년 오가피 영진약품 유토마외용액 아토피피부염 돼지폐추출물 일반의약품 - 6 -

17 2. 천연물의약품국외현황 가. 미국 FDA 최근천연물제품 (herbal product) 에대한특허등록건수가기하급수적으로늘어가고있음. 중국항주에있는 Zhejiang Kanglaite Pharmaceutical 회사의 Kanglaite Injection 이라는의이인추출물은중국에서 1995년에승인되었고중국에서항암제로가장유명한제품이되었으며, 2001년 6월 KLT의임상 1상연구가유타 (Utah) 주솔트레이크시 (Salt Lake City) 에있는 Huntsman Cancer Institute에서실시되어 2002년 11월완료되었음. 현재 25만명이상의폐암, 간암, 유방암환자들이치료를받고있음. Vergen(sinecatechinsp; 녹차추출물 ) 은다양한카테킨함량의국소제형으로생식기사마귀치료용도로, 2007년 12월에미국에서최초로판매허가를받은천연물의약품이고, 다른하나인 Fulyzaq(crofelemer; 나무수액에서유래 ) 는 HIV/AIDS약복용환자들의설사증상을치료할수있는천연물의약품으로 2012년 12월 31일에승인되었음. 이약은최초의경구용천연물의약품임 년에는미 FDA 에서처음으로식물약에대한산업가이드라인즉새로운등록허가규 정 (Botanical drugs Guidance) 를제정해새로운약재에신규정을적용하고천연물의약품시 장에서주도권을쥐기위한노력을기울여옴. 나. 유럽 독일은 2012년기준전체유럽천연물의약품시장의 46%(9억 8,400만달러 ) 를차지하여유럽내에서가장큰시장규모를형성. 독일은천연물의약품의개인이소비하는천연물의약품종류가가장다양하지만 2004년이후마이너스성장을기록하고있음. 독일에이어프랑스가 16%(3억 5,200만달러 ), 폴란드가 9%(1억 8,200만달러 ) 로유럽천연물의약품시장점유율을차지. 폴란드는최근성장세를보이고있는데, 주로강력한자국 1 세대천연물의약품기업들이주도한것으로천연물의약품제조에대한오랜역사를지니고있음 대부분의천연물의약품선도기업들은 1개의주력제품이대부분의매출을달성. Ipsen은천연물의약품매출의 95% 가치매치료에사용되는주력제품인 Tanakan. 이와동시에지난 10년동안어떤기업도혁신적인제품을출시하지않음으로써, 이들최다판매제품은천연물의약품선도제조사를위한주성장동력으로지속적인기여를해왔음

18 다. 중국 중국 TCM(Traditional Chinese Medicine) 시장은 년사이연간 34% 의성장률을보여, 같은기간중국전체제약시장의연평균성장률이 26% 인데반해더빠른성장률을기록. 중국천연물의약품시장은 2012년 186억달러의매출규모를기록하였고. 치료용 TCM 시장또한꾸준히성장하여, 2012년 161억 1천3백만달러의매출을달성하였음. 출처 : IMS CHPA, MENET 9 city Data, IMS CG analysis 호흡기계의시장규모가 12 억 9 천 6 백만달러이고, 그뒤를따르는근골격계의시장규모는 12 억 6 천 5 백만달러임. 심혈관계 TCM 처방의약품 (Rx) 시장은 TCM 시장내최대규모로 2012년 71억 3,700만달러매출에 44.3% 의시장점유율을기록하였고, 항암제및면역조절제시장은 20억 8,700만달러의규모로, 두번째로큰시장이며, 18억 1,700만달러규모의비뇨생식기계및성호르몬분야가그뒤를잇고있음

19 제 3 장연구개발수행내용및결과 1. 비임상및임상시험용시료제공및제품화지원 1) 비임상및임상시험용시료제공실적가 ) 1차년도제공실적 1차년도제공된비임상및임상시험용시료는총 14건임 임상시험용 : 1건 비임상시험용 : 8건 시제품제작 ( 허가용 ) : 2건 천연물의약품품질향상기술개발시료 : 3건나 ) 2차년도제공실적 2차년도제공된비임상및임상시험용시료는총 22건임. 임상시험용 : 3건 비임상시험용 : 16건 시제품제작 ( 허가용 ) : 3건다 ) 3차년도제공실적 3차년도제공된비임상및임상시험용시료는총 44건임. 임상시험용 : 1건 비임상시험용 : 31건 시제품제작 ( 허가용 ) : 9건 IND 신청용 : 2건 제품출시 : 1건 연차번호품명용도제공일납품처 1 의이인탕 임상시험 ( 진약 / 위약 ) 상지대부속한방병원 2 육군자탕외 4 종비임상 경희대학교 1차년도 3 단미엑스 28 종비임상 경희대학교 4 육군자탕외 4 종비임상 경희대학교 5 금은화추출물시제품제작 금은화추출물시제품제작 녹십자에이치에스녹십자에이치에스 - 9 -

20 7 육미지황비임상 KGC 인삼공사 8 샘플 A,B,C,D,E,F 비임상 경희대학교 9 YG 1 비임상 전북대, 원광대 10 YG 2 비임상 전북대, 원광대 11 YG 2β 비임상 전북대, 원광대 12 갈근탕외 2종 인습방지기술개발 건양대 13 비트콜외 2종 인습방지기술개발 건양대 14 프론크논캡슐외 1종 인습방지기술개발 건양대 2차년도 진피, 건강, 육계30% 주정허가용시제품 연조엑스진피, 후박, 현호색, 아선약 70% 주정연조엑스의이인탕과립제진약 / 위약 및제품원료허가용시제품및제품원료 동화약품연구소 동화약품연구소 임상용 길한방병원 4 KCHO-1 추출물비임상 / 독성시험 WSY3063 정제진약 / 5 위약 원광대광주한방병원 임상용 부산대학교병원 6 강황 30% 주정 비임상 모과 30% 주정 비임상 원지 30% 주정 비임상 작약 30% 주정 비임상 감초 30% 주정 비임상 창출 30% 주정 비임상 정제부자 30% 주정 비임상 원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원원광대및광주한방병원 13 선학초추출물 비임상 경희대학교 14 선학초 80% 주정추출물 비임상 경희대학교 15 SH003 부탄올, EA, 물 비임상 경희대학교

21 3차년도 ( 분획물 ) 16 KH204 추출물 비임상 한국전통의학연구소 17 오매 30% 주정연조엑스 허가용 동화약품연구소 18 천마 30% 주정 비임상 원광대광주한방병원 19 단삼 30% 주정 비임상 원광대광주한방병원 20 PD10 정제진약 / 위약 임상용 서울아산병원 21 천마, 조구등, 작약, 백이화여대수오, 갈근, 30% 주정비임상 식품영양학과추출물 22 원지, 인삼, 황금, 황백, 이화여대오가피 30% 주정추출비임상 식품영양학과물 1 오매30% 에탄올연조엑스 제품출시 ( 미인활명수 ) 동화약품 2 갈만추출물 화장품제형개발 뷰티화장품 3 갈만추출물 비임상시료 원광대학교 4 여지핵건조엑스 건기식개발 현대약품 5 여지핵정제 건기식개발 현대약품 6 SH003 정 IND 승인신청 경희대한방병원 7 HL301 건조엑스 임상 3상예정 한림제약 8 HL301 건조엑스 공정밸리데이션 - 한림제약 9 HL301 건조엑스 공정밸리데이션 - 한림제약 10 DW2007 신제품개발용 - 동화약품 11 DW2007 신제품개발용 - 동화약품 12 DwacDW2007 신제품개발용 동화약품 13 대황감초탕건조엑스 신제품허가용 종근당 14 H9 건조엑스 IND 신청 한국건설생활환경시험연구원 15 자운고, 자운고위약 임상시험용 경희대학교 16 구절초건조엑스 신제품개발용 녹십자HS 17 식물전초건조엑스 비임상시료 동화약품 18 SH003 분획물 ( 물 ) 비임상시료 경희대학교 19 SH003 분획물 (EA) 비임상시료 경희대학교 20 SH003 분획물 ( 부탄올 ) 비임상시료 경희대학교 21 대황감초탕건조엑스 신제품개발용 종근당 22 H9 건조엑스비임상시료 한경대학교

22 동국대학교 경희대4번 백출, 당귀, 황기, 금은화, 포공영, 하고초 비임상시료 - 경희대학교 =1:1:1:1:1:1 경희대5번 백출, 당귀, 황기, 금은화, 포공영, 하고초 비임상시료 - 경희대학교 =1:1:1:2:2:2 경희대6번 백출, 당귀, 황기, 금은화, 포공영, 하고초 비임상시료 - 경희대학교 =2:2:2:1:1:1 26 당귀건조엑스 비임상시료 경희대학교 27 황기건조엑스 비임상시료 경희대학교 28 백출건조엑스 비임상시료 경희대학교 29 금은화건조엑스 비임상시료 경희대학교 30 포공영건조엑스 비임상시료 경희대학교 31 하고초건조엑스 비임상시료 경희대학교 32 통규탕 1 건조엑스 비임상시료 경희대학교 33 통규탕 2 건조엑스 비임상시료 경희대학교 34 선학초 30% 주정건조엑스 ( 선학초 1) 비임상시료 경희대학교 35 선학초 80% 주정건조엑스 ( 선학초 2) 비임상시료 경희대학교 36 당귀, 황기건조엑스 비임상시료 경희대학교 37 황백건조엑스 비임상시료 경희대학교 38 맥문동건조엑스 비임상시료 경희대학교 39 건지황건조엑스 비임상시료 경희대학교 40 사철쑥수용성추출물 비임상시료 지뉴엔텍 41 의보오적산건조엑스 비임상시료 ( 국산 ), 한국한의학연구 신약개발원 42 당귀수산건조엑스 한약제제효능한국한의학연구 기전연구원 43 HOB-060-RM 한약제제효능기전연구 켐온 44 HOB-060-RM 건기식개발, 독성시험용 켐온

23 2) 제품화지원 (IND filing) 비임상시험을통해후보물질의안전성 ( 독성 ) 과유효성이검증되면사람을대상으로하는연 구를수행하기위해식약처에임상시험계획승인신청 (Investigational New Drug Application; IND) 을함. 가 ) 생약 ( 한약 ) 제제임상시험용의약품품질관리문서 생약 ( 한약 ) 제제의의약품개발을위한임상약리시험 (1 상 ), 치료적탐색임상시험 (2 상 ), 치료적 확증임상시험 (3 상 ) 을식약처로부터승인받기위해서는생약 ( 한약 ) 제제의물리화학적, 제조, 품질관리 (Chemistry, Manufacturing, and Control; CMC) 정보를제출해야하며, 해당자료를 확보하여 IND 신청을지원하였음. 임상약리시험 (1상) 치료적탐색임상시험 (2상) 치료적확증임상시험 (3상) 1. 원료의약품 1.1 일반정보 명칭 구조 구성원생약에대한지표 ( 유효 ) 성분설정, 가능한한범위값설정 일반적특성 물리학적, 화학적중요한특성에대해중요한특성에대해성질에대해간략하게기재, 추가변경사유에기재, 추가변경사유에 기재 대해기재 대해기재 1.2 제조 제조자 학명, 과명, 약용부위, 제조공정및추출용매및추출조건각제조단계별각제조단계별공정관리물리적형태간략하게상세하게기재상세하게기재 기재 1.3 특성 구조및기타특성 순도 일반이물등간략하게기재 제조경험, 안정성, 안전성기준을근거로기준설정, 안전성자료제출 제조경험, 안정성, 안전성기준을근거로기준설정, 안전성자료제출 1.4 원료의약품의관리 기준 확정된규격요구되지규격기재, 확인, 순도, 않음. 함량을포함하여자세한규격설정확인, 함량, 순도필요시추가적인기준 간략하게기재 설정

24 1.4.2 시험방법 특성확인을위한개요제출 시험방법 밸리데이션수행, 밸리데이션자료제출밸리데이션개발사보관 ( 요약된형태가능 ) 뱃치분석 요약표제출 기준설정근거 1.5 표준품또는반드시제출할필요표준물질없음 1.6 용기및포장 1차포장재에대해기술 1차포장재에대해기술 1차포장재에대해기술 1.7 안정성 안정성요약및안정성기준과시험방법결론결과간략하게기재 안정성자료 상세한안정성자료실시한시험의종류및실시한시험의종류및필요없음. 시험결과를요약하여시험결과를요약하여 기재 기재 2. 임상시험용의약품 2.1 임상시험용의약품 의개용와조성간략하게 2.2 개발경위 2.3 제조 제조사 뱃치조성 제조공정및 공정관리간략하게 2.4 첨가제관리 2.5 임상시험용의약품의관리 기준 모든시험항목에대한규격기재, 확인, 순도, 확정된규격을규격기재, 안전성에함량을포함하여요구하지않음. 영향을줄수있는필요시추가적인기준확인, 함량, 순도포함규격상변경은 IND 설정변경승인통해변경 시험방법 시험방법 밸리데이션수행, 밸리데이션자료제출밸리데이션개발사보관 ( 요약된형태가능 ) 뱃치분석 요약표제출 불순물의특성

25 간략하게기재 기준설정근거 2.6 표준품또는원료의약품과동일하면표준물질생략할수있음 2.7 용기및포장 1차포장재에대해 1차포장재에대해 기술 기술 2.8 안정성 임상시험용의약품의 안정성요약및안정성기준과시험방법 안정성시험에만결론결과간략하게기재기재된시험항목과 방법을자세히기재 안정성자료 상세한자료는필요 없음 위약 대조약 별도의정보제출하지별도의정보제출하지않음않음 나 ) IND filing 지원실적 IND filing을총 5건지원했고이중식약처에임상시험계획승인신청을한 4건에대하여모두승인을획득하였음. 1 상심자 IND filing 지원 ( 원광대약대 ) 2 BHH-10 IND filing 및임상시험계획신청후승인획득 ( 경희대한의대 ) 3 한슬림 IND filing 및임상시험계획신청후승인획득 ( 경희대한의대 ) 4 루게릭치료제 ( 메카신 ) IND filing 및임상시험계획신청후승인획득 ( 원광대한의대 ) 5 SH003 IND filing 및임상시험용진약및위약제조 ( 경희대한의대 ) 그림. BHH10, 한슬림, 메카신임상시험계획승인서

26 2. 천연물특화소규모 GMP 구축 1) GMP 승인을위한식약처사전상담실시원료의약품생산시스템구축을위하여전용공간을확보하고크린룸설치를위한도면을완성하였음. 또한공기역학을고려한공압편차및온습도계설치장소를정하고, 식약처사전상담을실시함. 식약처의사전검토를통해공조및도면수정후크린룸설치공사를실시하고 API 생산설비를갖추었음

27 가 ) 원료의약품생산시스템구축 KGMP 기준에적합한크린룸시설을갖추고천연물에특화된원료의약품생산시스템인추출기, 농축기를구축하였음. 구축된시설은임상시험용의약품, 독성시험용샘플및신제품개발을위한공정개발등에활용될것임. 생산시스템시설사진비고 크린룸 2급지 KGMP 제조시설에적합한크린룸조성 원료의약품생산시스템 천연물추출기구축 -200L 급 - 천연물추출물제조 원료의약품생산시스템 농축기구축 - 80~100 L/h - 천연물연조엑스제조

28 나 ) 소규모제제개발시스템구축천연물소재를발굴하기위한연구를지원하기위하여 In vitro와 In vivo 실험용샘플제조에적다한제조시설을자체투자를통해구축하였음. 또한천연물을활용한완제의약품을생산할수있는액제개발시스템, 외용제개발시스템및내용고형제개발시스템 ( 정제 ) 을구축하고 KGMP 승인을받았음. 본시스템은임상시험용의약품및신제품개발등에활용될것임. 생산시스템시설사진비고 비임상시료생산시스템구축 천연물특화비임상시험용샘플제작에활용 - In vitro 효능 - In vivo 효능 - 기시법개발용샘플 액제개발시스템구축 액상형제품개발시스템구축 외용제개발시스템구축 천연물특화외용제개발에활용 - 한방연고제 ( 자운고 ) 건조기 천연물진공건조시스템구축 - 건조온도조절가능 - 진공건조 - 추출물의분말화

29 타정기및탈분기 천연물정제개발시스템구축 - 임상시험용정제 - 제품화를위한정제조성연구 코팅기 정제코팅기 - 임상시험용정제코팅 - 제품의코팅조건연구 다 ) Lab scale 및 pilot scale 생산효율비교 소규모 KGMP 생산시스템 (pilot scale) 과 lab scale 로제조된샘플간의추출수율과지표성분 함량비교를통한생산효율을평가하였음. 1 연조엑스생산수율비교감초연조엑스와진피연조엑스생산수율을 pilot scale과 lab scale가의비교를실시하였음. 각 3회추출을실시하여평균수율을비교한결과감초연조엑스는 lab scale에서 19.3% 의수율이나왔고, pilot scale에서 17.3% 의수율을보였음. 진피연조엑스의경우 lab scale에서 22.0%, pilot scale에서 22.8% 의수율을보였음. 이러한결과는실험실단위생산조건을 pilot 단위생산에적용가능한시스템을갖췄음을보여주는결과임

30 번호원료명제조단위원료량 연조엑스량 수율 수분 환산한건조수율 건조수율평균 1 Lab scale 감초 2 Pilot scale 3 Lab scale 진피 4 Pilot scale 150g 63g 42% 52.3% 20.0% 150g 56g 37.3% 48% 19.4% 150g 54g 36% 48.7% 18.5% 20kg 5.8kg 29% 48.6% 14.9% 20kg 6.3kg 31.5% 48.8% 16.1% 20kg 9.1kg 45.5% 50.6% 22.5% 200g 90g % 18.2% 200g 100g % 22.5% 200g 124g % 25.4% 20kg 9.1kg % 22.2% 20kg 10.1kg % 22.9% 20kg 9.9kg % 23.3% 19.3% 17.8% 22.0% 22.8% 2 연조엑스지표성분함량비교 감초연조엑스와진피연조엑스의지표성분함량을분석하여 lab scale과 pilot scale간의추출물생산효율을검증하였음. 감초연조엑스의지표성분및함량기준은글리시리진산으로서 23.8 mg/g 이상이며, lab scale 단위생산샘플은 26.3 mg/g, pilot scale 단위생산샘플은 39.1 mg/g으로기준규격을모두만족하였음. 진피연조엑스의지표성분및함량기준은헤스페리딘으로서 3.6 mg/g 이상이며, lab scale 단위생산샘플은 3.99 mg/g, pilot scale 단위생산샘플은 4.01 mg/g으로기준규격을모두만족하였음. 번호 제품명제조단위표준품량 (mg/ml) 1 감초연조엑스 ( 글리시리진산 23.8 mg/g 2 이상 ) 3 진피연조엑스 ( 헤스페리딘 3.6 mg/g 4 이상 ) Lab scale Pilot scale Lab scale Pilot scale / /50 A S 검체량 (g) A T 함량 (mg/g) 평균 (mg/g)

31 2) 크린룸환경모니터링실시 GMP 시설내환경관리를위하여작업장, 제조용수, 자재등모든시설에대한미생물시험기준및항목을설정하여제조과정중발생할수있는오염을방지할수있음을실험을통해문서화하였음. 가 ) 미생물시험기준청정도대상지역총세균수노출시간 의약품과직접접촉되는지역 20 개 / 시간 : 9cm 1 시간 2 급지역 갱의실, Air-lock, 세척실, 보관실, 복도등보조지역 20 개 / 시간 : 9cm 1 시간 나 ) 낙하균, 부유균, 표면균측정낙하균은 GMP 시설내지정구역을정하여실시하고, 부유균은 air IDEAL 장비로일정시간공기를포집하여확인함. 표면균은멸균된거즈또는탈지면으로측정부위를문지른뒤시험하여단위면적당생균수를계산함. 시험결과크린룸은청정도 3) 생산시스템적격성평가실시 의약품등의제조에사용되는기계, 설비또는시스템을도입하는경우적격성평가를실시해야 함. 적격성평가에는 4 가지평가항목이있으며, 적격성평가계획서및보고서를문서화함

32 가 ) 설계적격성평가 (Design Qualification, DQ) 새로도입된기계, 설비또는시스템의경우설계적격성평가를실시하여야하며, 의도한목적에적합하게설계되었는지검증하고문서화함. 나 ) 설치적격성평가 (Installation Qualification, IQ) 기계, 설비또는시스템이설정된기준에맞게설치되었는지를현장에서검증하고문서화함. 가기계, 설비또는시스템이당초의도한대로설치되었는지를도면등과비교 확인나기계, 설비또는시스템이그조작, 운전및유지관리등을설명한문서와일치여부다계측기의교정에필요한사항의검토라기계, 설비또는시스템의재질확인다 ) 운전적격성평가 (Operational Qualification, OQ) 기계, 설비또는시스템이예측된운전범위내에서의도한대로가동하는지를검증하고문서화함. 라 ) 성능적격성평가 (Performance Qualification, PQ) 기계, 설비또는시스템이설정된품질기준에맞게제품을제조할수있는지검증하고이를문서화함

33 4) API(Active pharmaceutical ingredients) 생산시스템 CMP 승인가 ) 원료의약품 (API) 제조시설및설비에관한자료제출의약품등품목별사전 GMP 평가를위하여식약처에제출할자료는 약사법시행규칙 에따라준비하였으며, GMP 신청접수, 현장실태조사를받아최종승인을받았음. 1 해당제조소에처음 GMP 평가를신청하는품목의제출자료 제조소평면도 : 각작업소, 시험실, 보관소및기타제조공정에필요한부대시설이표시된제조소평면도 신청품목과관련된작업소시설관련자료 청정등급, 작업실간의차압및인적 물적동선이표시된작업소평면도 제조 시험에사용되는기계 설비내역및기계배치도 공조시설, 압축공기및용수처리계통도 신청품목과관련된시설및환경관리관련자료 제조용수관리현황 자동화장치등관리현황 청정도관리현황 GMP 조직도및품질관리 ( 보증 ) 체계관련자료 문서관리규정및문서목록 신청품목과관련된제품표준서및제조 품질관리기록서 (3 로트 ) 신청품목과관련된밸리데이션자료 나 ) 감초연조엑스품목허가를통한 GMP 승인획득 1 감초연조엑스의기준및시험방법 3 batch 생산으로평균수율실측치를산출하고안정성시험시료로사용함 기준및시험방법설정 감초연조엑스 이약은정량할때감초로서 1g 중글리시리진산 (C 42 H 62 O 16 : ) 4.9 mg 이상을함유한다. 제 법

34 감초 1 kg 위의생약을정선하여약전통칙절도및분말도에따라조절로하고, 물을 10 배량을넣어 100 에서 2 3 시간추출한다음여과한액을 60 이하에서당도 brix로감압농축하여연조엑스약 295g 을얻는다. 성상이약은갈색 흑갈색의연조엑스이다. 확인시험 1) 이약을감초로서약 1 g 해당량을달아생약시험법중감초확인시험법에따라시험한다. 2) 정량법에따라시험할때표준품과같은유지시간에서피크를나타낸다. 건조감량대한민국약전일반시험법건조감량시험법으로시험할때 % 이어야한다 (1 g, 105, 12시간 ). 순도시험 1) 중금속가 ) 총중금속 30 ppm 이하나 ) 납 5 ppm 이하다 ) 비소 3 ppm 이하 질량편차대한민국약전일반시험법제제균일성시험중질량편차시험법에따라시험한다 ( 표시량이상 ). 정량법이약을가지고대한민국약전감초중함량시험법에따라시험한다. 미생물한도대한민국약전일반시험법미생물한도시험법에따라시험한다 ( 총호기성미생물수 개이하, 총진균수 100 개이하, 대장균 살모넬라균 녹농균 황색포도상구균불검출 ). 저장법기밀용기

35 감초연조엑스 HPLC 크로마토그램및분석조건 2 감초연조엑스의안정성시험자료제출 감초연조엑스 3 batch 에대한시험결과를제출함

36 3 우수원료의약품제조및품질관리기준 (BGMP) 획득한약 ( 생약 ) 제제 GMP 실시상황평가에필요한자료를준비하여 GMP 승인신청을하였으며, API 생산시스템에대한 BGMP 획득과감초연조엑스품목허가를획득하였음. 우수원료의약품제조및품질관리기준 (BGMP) 승인획득 - BGMP 신청 : 2013년 10월 18일 - 광주식약청현장실사 : 2013년 12월 9일 ~ 2013년 12월 11일 - BGMP 승인획득 : 2014년 4월 24일

37 그림. BGMP 신청및승인획득 한풍감초연조엑스품목허가획득 - 한풍감초연조엑스품목허가신청 : 2013 년 10 월 18 일 - 한풍감초연조엑스품목허가획득완료 : 2014 년 3 월 21 일 그림. 감초연조엑스품목허가신청접수증및허가증

38 5) 완제의약품생산시스템우수의약품및품질관리기준 (KGMP) 승인가 ) 내용고형제완제의약품 KGMP 승인획득임상시험에주로사용되는정제, 캡슐제, 과립제, 산제등을제조하기위하여제조시설중내용고형제완제의약품에대한 KGMP를획득하였으며, 글리돈정의품목허가를획득하였음. 우수의약품및품질관리기준 (KGMP) 승인획득 - KGMP 신청 : 2015년 3월 15일 - KGMP 승인획득 : 2015년 7월 21일 글리돈정제품목허가신청및획득 - KGMP 신청 : 2015년 3월 15일 - KGMP 승인획득 : 2015년 7월 21일 그림. KGMP 승인및글리돈정제품목허가획득

39 3. 외용제 내용액제 GMP 승인및사업화 1) 한방외용제 ( 자운고 ) 품목변경신고및사업화한방외용제인자운고의품목변경신고를위하여 3 batch 제조를실시하고, 생산된시제품으로부터시험한실측치로기준과시험방법확립하였음. 가 ) 원료의기준및시험방법확립 1 자근의기준확립 성상이약은뿌리로고르지않은긴원기둥모양이고대부분은비틀어져있으며길이 7 20cm, 지름 mm이다. 바깥면은적자색 자갈색이고피부는성글며막대기형조각모양이고보통 10여층이중첩되어있으며쉽게떨어진다. 맨끝에는분지된줄기자국이보일때가있다. 질은성글고연하며가볍다. 횡단면을확대경으로볼때깔끔하지않고목부는비교적작으며황백색 노란색이다. 확인시험설정된시험법에따라시험할때적합하여야한다. 순도 중금속 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 ( 총중금속 30 ppm이하, 비소 3 ppm이하, 납 5 ppm이하, 수은 0.2 ppm 이하, 카드뮴 0.3 ppm이하 ). 잔류농약 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 ( 총BCH 0.2 ppm, 총 DDT 0.1 ppm, Aldrin 0.01 ppm, Endrin 0.01 ppm, Dieldrin 0.01 ppm, Thifluzamid 1.0 ppm, Pencycuron 1.0 ppm, hexaconazole 0.2 ppm 이하 ). 잔류이산화황 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 (30 ppm이하 ). 회분설정된시험법에따라시험할때 11.0% 이하임. 산불용성회분설정된시험법에따라시험할때 3.5% 이하임. 함량시험설정된시험법에따라시험할때이약 1 g에는자근중시코닌 (C 16 H 16 O 5 ) 과아세틸시코닌 (C 18 H 18 O 6 ) 의합으로써 0.1% 이상을함유함. 2 자근의시험방법 성상 : 육안으로확인한다. 확인시험 이약의가루 0.5 g을달아시험관에넣고가열할때붉은색의증기를내며관의위쪽벽에응축되어적갈색의기름방울이된다. 이약의가루또는절편 0.5 g을달아에탄올 1 ml를넣어흔들어섞어얻은붉은색

40 용액에수산화나트륨시액 1 방울을넣을때액은청자색으로변화된다. 이액에묽은염산 1 2 방울을넣으면액은붉은색이된다. 이약의가루 0.5 g을달아에탄올 5 ml를넣고 30분간흔들어섞어여과한다음감압, 40 이하에서농축한다음에탄올 1 ml를넣고검액으로한다. 이액을가지고박층크로마토그래프법에따라시험한다. 검액 5 μl를박층크로마토그래프용실리카겔을써서만든박층판에점적한다. 다음에아세트산에틸 에탄올혼합액 (3 : 1) 을전개용매로하여약 10 cm 전개한다음박층판을바람에말린다. Rf값 0.75 부근에적자색의반점을나타낸다. 순도 중금속 : 대한민국약전일반시험법생약시험법순도시험중중금속시험법으로시험한다. 잔류농약 : 대한민국약전일반시험법생약시험법순도시험중잔류농약시험법으로시험한다. 잔류이산화황 : 대한민국약전일반시험법생약시험법순도시험중잔류이산화황시험법으로시험한다. 회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중회분시험법으로시험한다. 산불용성회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중산불용성회분시험법으로시험한다. 함량시험 자근중총시코닌 ( 시코닌과아세틸시코닌의합 0.1 % 이상 ) 이약을 1.0 g을취하고메탄올 50 ml을넣고 1시간초음파추출후 0.45μm멤브레인필터로여과하여시험용액으로한다. 시코닌표준품약 2.7 mg을정밀히달아 200 ml에녹여표준액으로하고, 아세틸시코닌표준품약 2.3 mg을정밀히달아 20mL에녹여표준액으로한다. 이검액및표준액각각 10μl을취하여아래와같은조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액및표준액의피크면적 A T 및 A S 를구한다. 시코닌의양 (mg) = 표준품의양 (mg) A T 1 A S M T 아세틸시코닌의양 (mg) = 표준품의양 (mg) A T 1 A S M T - 조작조건- 컬럼 : Capcell pak C18, 4.6*150mm, 5μm검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 : 215nm) 유속 : 1.0mL/min

41 이동상 : A 용매 - Acetonitrile B 용매 - 0.1% Acetic acid C 용매 - Methanol 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) C(%) 나 ) 자운고완제품의기준및시험방법확립 1 자운고완제품의기준 성상 : 적자색의연고 확인시험 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다. 제제균일성시험 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 (0.7% 이하 ). 함량시험 : 다음시험법에따라시험할때이약 1 g에는자근중총시코닌 ( 시코닌 (C 16 H 16 O 5 ) 과아세틸시코닌 (C 18 H 18 O 6 ) 합 ) 0.07 mg 이상, 당귀중데쿠르신 3.6mg 이상을함유하여야함. 미생물한도시험 : 다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 ( 세균 개이하, 진균 100개이하, 대장균 살모넬라균 녹농균 황색포도상구균불검출 ). 2 자운고완제품의시험방법 성상 : 육안으로외관을확인한다. 확인시험 자근 : 정량법에따라시험할때표준품과같은유지시간에서피크를나타낸다. 당귀 : 정량법에따라시험할때표준품과같은유지시간에서피크를나타낸다. 제제균일성시험 : 대한민국약전일반시험법제제균일성시험중질량편차시험법에따라시험한다. 정량법 자근중총시코닌 ( 시코닌과아세틸시코닌의합 0.07mg/g이상 ) 이약을총시코닌 ( 시코닌과아세틸시코닌의합 ) 으로서약 2.5mg 에해당하는량을취하고 n-헥산 20 ml에녹인후 90% 메탄올 20 ml을넣어 30분진탕하고분리될때까지방치한다. 하층을취한후 90% 메탄올 20 ml을넣어 3회반복하여하층을모아감압농축한다. 건고물에메탄올 10 ml로녹이고 0.45um 여과후시험용액으로한다. 시코닌표준품

42 약 2.7 mg을정밀히달아 200 ml에녹여표준액으로하고, 아세틸시코닌표준품약 2.3 mg을정밀히달아 20mL에녹여표준액으로한다. 이검액및표준액각각 10μl을취하여아래와같은조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액및표준액의피크면적 A T 및 A S 를구한다. 시코닌의양 (mg) = 표준품의양 (mg) A T 1 A S M T 아세틸시코닌의양 (mg) = 표준품의양 (mg) A T 1 A S M T - 조작조건- 컬럼 : Capcell pak C18, 4.6*150mm, 5μm검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 : 215nm) 유속 : 1.0mL/min 이동상 : A 용매 - Acetonitrile B 용매 - 0.1% Acetic acid C 용매 - Methanol 당귀중데쿠르신 (3.6mg/g 이상 ) 이약을데쿠르신으로서약 9 mg에해당하는량을취하고 n-헥산 20 ml에녹인후 90% 메탄올 20 ml을넣어 30분진탕하고분리될때까지방치한다. 하층을취한후 90% 메탄올 20 ml을넣어 3회반복하여하층을모아감압농축한다. 건고물을메탄올 10 ml로녹이고 0.45um 여과후시험용액으로한다. 데쿠르신표준품약 9.2 mg을정밀히달아 50 ml에녹여표준액으로한다. 이검액및표준액각각 10μl을취하여아래와같은조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액및표준액의피크면적 A T 및 A S 를구한다. 데쿠르신의양 (mg) = 표준품의양 (mg) A T 1 A S M T

43 - 조작조건- 컬럼 : Capcell pak C18, 4.6*150mm, 5μm검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 : 215nm) 이동상 : Acetonitrile : 0.1% Acetic acid (35 : 65) 의혼액유속 : 1.0mL/min 미생물한도 : 대한민국약전일반시험법미생물한도시험법에따라시험한다 ( 총호기성미 생물수 개이하, 총진균수 100 개이하, 대장균 살모넬라균 녹농균 황색포 도상구균불검출 ). 나 ) 원료및자운고완제의 HPLC 분석결과 다 ) GMP 품목허가획득및사업화 1 천연물을활용한외용제품목허가소규모외용제개발시스템구축을완료하고외용제생산을위한 GMP 신청과한풍자운고품목허가변경신청및승인획득 자운고품목허가신청 광주식약청에서품질관리검토및 GMP 현장실사진행 ( ) 최종품목허가획득 : 2014년 9월 11일

44 그림. 한풍자운고품목허가신청및허가획득 2 한풍자운고사업화 효능효과 : 거친피부 ( 추위로살갗이튼데 ), 동상, 땀띠, 항문열상, 옻등으로인한피부염 성분정보 : 자근 72.7 mg/g, 당귀 60.6 mg/g 용법용량 : 1일 1~ 수회환부에적당량을바른다. 그림. 한풍자운고제품

45 2) 내용액제 GMP 품목허가획득및사업화임상시험용액제및제품개발의뢰에대응하기위하여액제개발시스템을자체투자로설비를구축하고품목 GMP를획득하여신제품을출시하였음. 가 ) 내용액제 KGMP 획득액제제품을제조하기위하여내용액제 KGMP를신청하였으며, GMP 실사를통해최종승인을획득하였음. - 내용액제 KGMP 신청 : 2014년 6월 30일 - 내용액제 KGMP 승인 : 2014년 11월 06일 나 ) 편감원액품목허가획득및사업화 1 편감원액원료한약재의품질검사 원료시험을통해적합판정을받은원료를선정하여갈근탕연조엑스를제조함

46 구분작약계지감초갈근마황대추건강 성상적합적합적합적합적합적합적합 확인적합적합적합적합적합적합적합 중금속적합적합적합적합적합적합적합 잔류농약적합적합적합적합적합적합적합 이산화황적합적합적합적합적합적합적합 곰팡이독소 적합 건조감량적합적합적합적합 회분적합적합적합적합적합적합적합 묽은에탄올엑스 적합 산불용성회분 적합 적합 정유함량 적합 정량법 적합 적합 적합 적합 적합 적합 최종판정적합적합적합적합적합적합적합 2 제제용원료의품질관리편감원액의원료의약품인제제용원료에대하여성상, 확인시험, 순도시험 ( 중금속 ), 건조감량, 미생물한도시험, 함량 ( 정량 ) 시험을실시하여적합함을확인하였음

47 3 완제품의품질관리편감원액최종완제품에대한성상, 확인시험, ph, 비중, 순도시험 ( 총중금속, 납, 비소 ), 제제균일성, 미생물한도시험, 함량 ( 정량 ) 시험실시하였으며모두적합판정을받았음. 4 편감원액품목 GMP 승인획득 - 민원명 : 의약품품목신고 -GMP : 편감원액 ( 갈근탕 ) - 접수일자 : 2014 년 7 월 7 일

48 - 편감원액품목 GMP 승인 : 2014 년 10 월 31 일 그림. 편감원액품목 GMP 신청및허가획득 5 편감원액사업화 효능효과 : 감기, 코감기, 두통, 어깨결림, 근육통, 손과어깨통증 성분정보 : 갈근탕연조엑스 2.23g 용법용량 : 성인 1회 1포 (75ml) 를 1일 3회식전또는식간에복용 그림. 편감원액제품

49 나 ) 한풍콜드액, 노즈액및코프액품목허가획득및사업화의약품등표준제조기준에따라갈근탕및소청룡탕에양약을혼합하여만든한 양방복합제한풍콜드액및노즈액의품목허가를획득하였으며, 사업화하였음. 1 한풍콜드액품목허가획득및사업화 품목허가획득 - 민원명 : 의약품품목신고 : 한풍콜드액 - 접수일자 : 2014년 10월 15일 - 편감원액품목 GMP 승인 : 2014년 11월 14일 그림. 한풍콜드액품목 GMP 신청및획득 한풍콜드액사업화 - 효능효과 : 감기의제증상 ( 콧물, 코막힘, 재채기, 인후통, 오한, 발열, 두통, 관절통, 근육통 ) 의완화 - 용법용량 : 성인 1일 3회, 1회 1포 (90ml) 을식후 30분에복용 - 성분정보 : 갈근탕연조엑스 (1,350g), 아세트아미노펜 200mg, 카페인무수물 20mg, 클로르페니라민말레산염 2mg

50 그림. 한풍콜드액제품 2 한풍노즈액품목허가획득및사업화 품목허가획득 - 민원명 : 의약품품목신고 : 한풍노즈액 - 접수일자 : 2014년 10월 15일 - 한풍노즈액품목 GMP 승인 : 2014년 11월 17일 그림. 한풍노즈액품목 GMP 신청및획득 한풍노즈액사업화 - 효능효과 : 감기의제증상 ( 콧물, 코막힘, 재채기, 인후통, 오한, 발열, 두통, 관절통, 근육통 ) 의완화 - 용법용량 : 성인 1일 3회, 1회 1포 (90ml) 을식후 30분에복용 - 성분정보 : 소청룡탕연조엑스 2.980mg, 아세트아미노펜 400mg, 카페인무수물 20mg, 클로르페니라민말레산염 2mg

51 그림. 한풍노즈액제품 3 한풍코프액품목허가획득및사업화 품목허가획득 - 민원명 : 의약품품목신고 : 한풍코프액 - 접수일자 : 2014년 12월 16일 - 한풍코프액품목 GMP 승인 : 2015년 02월 16일 그림. 한풍코프액품목 GMP 신청및획득 한풍코프액사업화 - 효능효과 : 감기의제증상 ( 콧물, 코막힘, 재채기, 인후통, 가래, 오한, 발열, 두통, 관절통, 근육통 ) 의완화 - 용법용량 : 성인 1일 3회, 1회 1포 (90ml) 을식후 30분에복용

52 - 성분정보 : 맥문동탕연조엑스 1,850mg, 아세트아미노펜 400mg, 카페인무수물 20mg, 클 로르페니라민말레산염 2mg, 티페피딘히벤즈산염 12.5mg 그림. 한풍코프액제품 4. 혼합단미연조엑스및혼합단미정제품목 GMP 1) 평위산, 오적산혼합단미연조엑스품목 GMP 획득 한약제제의연조엑스기준규격을새로설정하여신규제형의품목허가를획득하였으며, 한약 제제제품의다양화를추진함. 가 ) 원료한약재품질검사 원료한약재의규격은대한민국약적 (KP) 또는대한약전외한약 ( 생약 ) 규격집 (KHP) 에따라설정 하였고공정서기준에적합한원료만을사용하여단미연조엑스를생산하였음. No. 한약재 검사기준 No. 한약재 검사기준 1 감초 KP 10 생강 KHP 2 길경 KP 11 육계 KP 3 건강 KP 12 작약 KP 4 당귀 KP 13 지각 KHP 5 대추 KP 14 진피 KP 6 마황 KP 15 창출 KP 7 반하 KP 16 천궁 KP 8 백지 KP 17 후박 KP 9 복령 KP 1 단미연조엑스생산 총 17종의한약 ( 생약 ) 은원료량대비 10배수의상수를넣고 98±2 로 3시간추출하고여과 하여 60 이하에서감압농축하였음. 각각의원료별로 3 Lot 생산하여평균수율을산출함

53 2 연조엑스의기준및시험방법설정연조엑스의기준및시험방법의설정은 의약품등의품목허가 규정에맞게설정함. 신고규정 에서정하고 나 ) 원료한약재품질검사결과 원료한약재의시험항목은성상, 확인시험, 순도 ( 중금속, 잔류농약, 잔류이산화황, 곰팡이독소 ), 건조감량, 회분, 산불용성회분, 점유함량, 함량 ( 지표성분 ) 시험을실시함. 1 원료한약재순도시험 원료한약재순도시험 ( 중금속, 잔류농약 ) 사용장비 : GC-MS, AAA, HPLC

54 2 원료한약재품질검사결과 구분 감초 건강 길경 당귀 대추 마황 반하 백지 복령 검사기준성상 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 확인 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 중금속 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 잔류농약 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 이산화황 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 곰팡이독소 적합 적합 건조감량 적합 적합 회분 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 묽은에탄올엑스 적합 적합 산불용성회분 적합 적합 정량법 적합 적합 적합 적합 적합 최종판정 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 구분 생강 육계 작약 지각 진피 창출 천궁 후박 검사기준성상 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 확인 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 중금속 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 잔류농약 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 이산화황 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합

55 건조감량 적합 적합 적합 적합 회분 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 산불용성회분 적합 적합 묽은에탄올엑스 적합 정유함량 적합 적합 정량법 적합 적합 적합 적합 최종판정 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 적합 다 ) 단미연조엑스기준및시험방법 시험항목 성상 감초연조엑스갈색흑갈색의연조엑스 건강연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 길경연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 당귀연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 대추연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 확인감초건강길경당귀대추 건조감량 이하 이하 이하 이하 이하 질량편차 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하 중금속 잔류농약 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 미생물 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 함량 글리시리진산감초 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 시험항목 성상 마황연조엑스갈색흑갈색의연조엑스 반하연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 백지연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 복령연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 생강연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 확인마황반하백지복령생강 건조감량 이하 이하 이하 이하 이하 질량편차 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상

56 총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하 중금속 잔류농약 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 미생물 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 함량 총알칼로이드마황 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 시험항목 성상 육계연조엑스갈색흑갈색의연조엑스 작약연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 진피연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 지각연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 창출연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 확인육계작약진피지각창출 건조감량 이하 이하 이하 이하 이하 질량편차 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 표시량이상 총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하총중금속이하 중금속 잔류농약 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 납 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 비소 이하 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 원료생약실시한경우생략가능 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 총호기성미생물수개이하 미생물 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 총진균수개이하대장균불검출 살모넬라균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 녹농균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 황색포도상구균불검출 함량 신남산육계 패오니플로린작약 헤스페리딘진피 표시량이상 표시량이상

57 시험항목 성상 천궁연조엑스갈색흑갈색의연조엑스 후박연조엑스 갈색흑갈색의연조엑스 확인천궁후박 건조감량 이하 이하 질량편차 표시량이상 표시량이상 중금속 잔류농약 미생물 총중금속이하 총중금속이하 납 이하 납 이하 비소 이하 비소 이하 원료생약실시한경우생략가능총호기성미생물수개이하 원료생약실시한경우생략가능총호기성미생물수개이하 총진균수개이하총진균수개이하 대장균불검출살모넬라균불검출녹농균불검출황색포도상구균불검출 대장균불검출살모넬라균불검출녹농균불검출황색포도상구균불검출 함량표시량이상표시량이상 라 ) 단미연조엑스함량시험결과지표성분설정은 3 Lot에서 Lot 별 3개의시료를채취하여총 9번의함량시험후하한치와상한치를확인하고, 평균값을근거로지표성분함량기준을설정함. 지표성분이공정서에없는경우자체설정한지표성분이원료표시량의 90% 이상을기준으로함

58 감초연조엑스 지표성분 시험방법 대한민국약전감초중함량시험법에의하여시험한다 함량기준감초로서중글리시리진산이상 분석조건 크로마토그램

59 건강연조엑스 지표성분 건강 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 건강표시량의 이상 규격집건강엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

60 길경연조엑스 지표성분 길경 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 길경표시량의 이상 규격집길경엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

61 당귀연조엑스 지표성분 당귀 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 당귀표시량의 이상 규격집당귀엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

62 대추연조엑스 지표성분 대추 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 대추표시량의 이상 규격집대추엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

63 마황연조엑스 지표성분 시험방법 함량기준 총알칼로이드 대한민국약전외한약생약 규격집생약시험법의마황함량시험법에 따라시험한다 마황으로서 중총알칼로이드에페드린 및슈 도에페드린 이상 분석조건 라우릴황산나트륨용액 아세토니트릴 인 산혼합액 크로마토그램

64 반하연조엑스 지표성분 반하 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 반하표시량의 이상 규격집반하엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

65 - 55 -

66 복령연조엑스 지표성분 복령 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 복령표시량의 이상 규격집복령엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

67 생강연조엑스 지표성분 생강 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 생강표시량의 이상 규격집생강엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

68 육계연조엑스 지표성분시험방법대한민국약전육계중함량시험법에따라시험한다함량기준육계로서중신남산이상 분석조건 크로마토그램

69 작약연조엑스 지표성분대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의작약함량시험법에시험방법따라시험한다함량기준작약으로서중패오니플로린이상 분석조건 크로마토그램

70 지각연조엑스 지표성분 지각 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 지각표시량의 이상 규격집지각엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

71 진피연조엑스 지표성분대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의진피함량시험법에시험방법따라시험한다함량기준진피로서중헤스페리딘이상 분석조건 크로마토그램

72 창출연조엑스 지표성분 창출 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 창출표시량의 이상 규격집창출엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

73 천궁연조엑스 지표성분 천궁 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 천궁표시량의 이상 규격집천궁엑스산정량법에따라시험한 분석조건 인산이수소나트륨액 크로마토그램

74 후박연조엑스 지표성분 후박 시험방법 대한민국약전외한약생약다 함량기준 후박표시량의 이상 규격집후박엑스산정량법에따라시험한 분석조건 크로마토그램

75 마. 혼합단미연조엑스제조및시험결과대한민국약전제제총칙중엑스제항에준하여제조한단미연조엑스를원료약품및그분량에따라혼합함. - 대한약전외한약 ( 생약 ) 규격집의 평위산혼합단미산 과 오적산혼합단미엑스산 의처방량에따라연조엑스로환산한분량을설정함. - 설정된주성분분량에따라오적산과평위산혼합하고적당량의감미제를첨가하여균일하게혼합하여포장함. 1 오적산혼합단미연조엑스분량 1회용량 (19.83 g) 중 배합목적 원료명 규격 분량 단위 주성분 창출연조엑스 별규 0.52 그램 주성분 마황연조엑스 별규 0.22 그램 주성분 진피연조엑스 별규 0.28 그램 주성분 후박연조엑스 별규 0.05 그램 주성분 길경연조엑스 별규 0.20 그램 주성분 지각연조엑스 별규 0.20 그램 주성분 당귀연조엑스 별규 0.26 그램 주성분 건강연조엑스 별규 0.14 그램 주성분 작약연조엑스 별규 0.13 그램 주성분 복령연조엑스 별규 0.02 그램 주성분 천궁연조엑스 별규 0.16 그램 주성분 백지연조엑스 별규 0.22 그램 주성분 반하연조엑스 별규 0.09 그램 주성분 육계연조엑스 별규 0.03 그램 주성분 감초연조엑스 별규 0.13 그램 주성분 생강연조엑스 별규 0.01 그램 용제 정제수 KP 적량 그램 감미제 교이 생규 그램 2 평위산혼합단미연조엑스분량 1회용량 (9.81 g) 중 배합목적 원료명 규격 분량 단위 주성분 창출연조엑스 별규 0.52 그램 주성분 진피연조엑스 별규 0.39 그램 주성분 후박연조엑스 별규 0.07 그램 주성분 감초연조엑스 별규 0.13 그램 주성분 생강연조엑스 별규 0.01 그램 주성분 대추연조엑스 별규 0.20 그램

76 용제 정제수 KP 적량 그램 감미제 교이 생규 6.54 그램 3 혼합단미연조엑스제품및성상 평위산혼합단미연조엑스 오적산혼합단미연조엑스 성상불투명플라스틱병에들어있는특이한맛과냄새를지닌갈색의연조엑스 성상불투명플라스틱병에들어있는특이한맛과냄새를지닌갈색의연조엑스 4 오적산혼합단미연조엑스 HPLC 결과 지표성분 시험방법 오적산혼합단미연조엑스총알칼로이드 (Ephedrin, Psuedoepherine), Hesperidin, Paeoniflorin, Cinnamic acid, Glycyrrihizin 마황연조엑스대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의마황함량시험법에따라시험한다진피연조엑스대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의진피함량시험법에따라시험한다작약연조엑스대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의작약함량시험법에따라시험한다육계연조엑스대한민국약전육계중함량시험법에따라시험한다감초연조엑스대한민국약전감초중함량시험법에따라시험한다 함량기준 마황연조엑스중총알칼로이드진피연조엑스중헤스페리딘 이상이상

77 작약연조엑스중패오니플로린육계연조엑스중신남산감초연조엑스중글리시리진산 이상 이상 이상 크로마토그램 크로마토그램

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80 5 오적산혼합단미연조엑스미생물시험결과 배희석 총진균수 배양시간 일배양온도배희석배희석 총호기성미생물수 배양시간대두카제인소화액체배지 일배양온도세트리미디한천배지 녹농균 배양시간 배양온도 배양시간 배양온도 황색포도상구균 대두카제인소화액체배지 만니톨나트륨한천배지

81 배양시간배양온도 배양시간 배양온도 대두카제인소화액체배지 맥콘키액체배지 맥콘키한천배지 대장균 배양시간배양온도 대두카제인소화액체배지 배양시간배양온도라파포트시리아디스살로넬라증균액체배지 배양시간배양온도 엑스엘디한천배지 살모넬라 배양시간배양온도 배양시간배양온도 배양시간배양온도

82 6 오적산혼합단미연조엑스중금속시험결과 이하 결과 이하 7 평위산혼합단미연조엑스 HPLC 결과 지표성분 평위산혼합단미연조엑스 시험방법 진피연조엑스대한민국약전외한약생약규격집생약시험법의진피함량시험법에따라시험한다감초연조엑스대한민국약전감초중함량시험법에따라시험한다 함량기준 진피연조엑스중헤스페리딘 이상회량 감초연조엑스중글리시리진산 이상회량 크로마토그램

83 - 73 -

84 8 평위산혼합단미연조엑스미생물시험결과 배희석 총진균수 배양시간 일배양온도배희석배희석 총호기성미생물수 녹농균 배양시간대두카제인소화액체배지 일배양온도세트리미디한천배지

85 배양시간배양온도 대두카제인소화액체배지 만니톨나트륨한천배지 배양시간배양온도 황색포도상구균 배양시간배양온도 배양시간 배양온도 대두카제인소화액체배지맥콘키액체배지맥콘키한천배지 대장균 배양시간 배양시간 배양시간 살모넬라 배양온도 대두카제인소화액체배지 배양온도라파포트시리아디스살로넬라증균액체배지 배양온도 엑스엘디한천배지

86 배양시간배양온도 배양시간배양온도 배양시간배양온도 9 평위산혼합단미연조엑스중금속시험결과 이하 결과 이하 바 ) 혼합단미연조엑스품목허가신청및획득한약제제의연조엑스제형을개발하여기준규격을설정하고시험방법을확립하였음. 상기기술한품질관리자료를바탕으로평위산, 오적산혼합단미연조엑스품목 GMP를신청하였으며허가를득하였음

87 1 오적산혼합단미연조엑스품목 GMP 획득 16종의단미연조엑스별첨규격을포함하여자료를제출함. 제품명 : 한풍오적산혼합단미연조엑스 신청일 : 2014년 1월 20일 오적산품목 GMP 승인 : 2015년 7월 31일 2 평위산혼합단미연조엑스품목 GMP 획득 6종의단미연조엑스별첨규격을포함하여자료를제출함. 제품명 : 한풍평위산혼합단미연조엑스 신청일 : 2014년 1월 20일 평위산품목 GMP 승인 : 2015년 7월 31일

88 5. 인습성이강한천연물소재의안정성기술개발 1) 연구개발의내용본연구과제개발의내용은크게세가지파트로나누어져있음. 가 ) 부형제선택에의에함습개선기술을개발하는것나 ) 천연물의약품의정제를제조하고팬코팅방법에의해방습코팅을하여인습방지를하는것다 ) 방습물질을사용한유동층코팅기법을이용하여천연물의약품을과립화하는함습개선기술을개발하는것임. 2) 인습방지대상천연물의약품의선정주관기관인한풍제약의자문을얻어천연물중함습을잘하는것으로알려진세가지천연물의약품을대표물질로선정함. 세가지천연물의약품은은교산과갈근탕, 배농산급탕으로각구성물질은아래와같음. 3) 부형제선택에의한함습개선기술개발가 ) 수분흡착능시험 1 실험방법천연물의수분흡착능력은결국습도에민감한천연물의안정성에영향을미치게되므로본연구에서는천연물의수분흡착능력을시험하기위하여먼저다음과같은방법으로부형제선택에따른수분흡착능력을평가함. 100ml의비이커에각원료를넣고교반하면서증류수를 0.1ml씩서서히가하여혼합물이덩어리로되는시점의수분의첨가량을측정하여그결과를도출함

89 2 수분흡착능실험결과 실험결과갈근탕, 은교산, 배농산급탕모두수분흡착능을가지고있었으며 5g을기준으로 갈근탕은 0.5ml, 은교산과배농산급탕은 0.6ml의수분흡착능을각각가지고있는것을알 수있었음. 이러한결과를바탕으로대상천연의약품중가장수분에민감함것으로사료 되는갈근탕엑스를대표물질로선정하여부형제와혼합하여안정성시험을실시하여보 았음. 주약및부형제 흡착능 (5g 기준 ) 1 갈근탕건조엑스 0.5ml 2 은교산건조엑스 0.6ml 3 배농산급탕건조엑스 0.6ml 나 ) 부형제첨가에의한안정성변화시험 1 부형제선정위의수분흡착능실험을근거로선택되어진갈근탕건조엑스 4g을칭량한후각부형제를혼합하고미리 2시간건조시켜수분을제거시킨후온도 40±2도, 습도 75±5% 의조건으로안정성챔버에넣어천연물의약품의수분의함습정도를실험하여보았음. 확인은안정성챔버에넣은후 1시간후에꺼내어함습여부를먼저육안으로판단하고그후인습된정도를저울에달아중량의증가로평가하여보았음. 선정된부형제는정제또는캡슐제에서함습을방지할수있을것으로사료되는 5가지의부형제를선정하였으며각부형제의구성성분은아래표와같음. 2 부형제첨가에따른안정성시험결과실험을위해대표천연물질의약품으로선정한갈근탕엑스와기타부형제를혼합하여미리 2시간건조시켜수분을제거시킨후온도 40±2도, 습도 75±5% 의조건으로가속시험챔버에넣어 1시간후천연물의약품의수분의함습정도를실험하여보았음. 1시간후함습의정도를육안으로확인한다음인습된정도를저울에달아중량의증가를평가하여

90 보았음. 실험결과는다음과같았음. 안정성시험챔버에넣고 1시간후의무게증가정도를평가해본결과 Prosolve EasytabR 이가장인습이덜됨을확인할수있었음. 이러한결과로미루어보아향후인습이잘되는천연물을제형화할때는 Prosolve EasytabR 을사용하는것이상대적으로천연물의인습방지에도움이될수있을것으로사료됨. 갈근탕건조엑스의인습되기전과인습된후의사진은아래와같음. < 인습되기전과인습된후의갈근탕건조엑스사진 ( 좌 : 인습전 / 우 : 인습후 ) > 4) 팬코팅에의한함습개선기술을개발가 ) 원료약품및분량선정된 3개의천연물의약품중에서수분흡착능시험결과가장수분에민감할것으로사료되는갈근탕건조엑스를주성분으로하고부형제와활택제, 붕해제를사용하여정제를제조하였음. 정제제조처방은아래와같음. 첨가제 원료명 함량 (mg) 주성분 갈근탕엑스 964 부형제 미결정셀룰로오스 44.4 부형제 경질무수규산

91 활택제스테아르산마그네슘 3.25 붕해제크로스카멜로오스나트륨 32.5 나 ) 코팅조건및방법제조된정제를실온조건이 20도, 습도가 61% 인곳에서 Warm up 온도를 65도로 7분간유지하면서팬코팅을이용하여코팅하였음. 코팅기제로는 Opadry(OY-C-7000A) 를사용하여코팅하였으며 Inlet 온도는 65-68도를유지하고 Exhaust 온도는 42-44도를유지하면서 Spray rate는 6-9.3g/min을사용하였음. 또한코팅팬의속도는 1분까지는 7rpm을유지하다가그이후에는 15rpm으로하고총코팅부피는정제대비 2% 로맞추어코팅하였음. 다 ) 실험결과코팅후코팅정제를관찰하여본결과코팅이성공적으로이루어졌음을확인할수있었으며안정성 chamber에넣고안정성시험을실시하여본결과코팅을하지않은나정에비하여상대적으로안정성이향상된것을확인할수있었음. 2개월의안정성시험결과코팅을하지않은갈근탕정제의경우는 Glycyrrhizinate의경우함량이 63%, 총 Ephedrine의경우 68%, Puerarin의경우 85% 로감소하는경향을보였으나방습코팅을한정제의경우는 Glycyrrhizinate의경우함량이 75%, 총 Ephedrine의경우 65%, Puerarin의경우 103% 로상대적으로함량감소를보이지않았으며특히갈근탕성분중 Puerarin의경우에는나정의경우 85% 로감소하는반면방습코팅정제의경우 103% 로함량의변화가없는것으로미루어보아방습코팅이성공적으로이루어져천연물의인습방지효과가있음을확인할수있었음. 2 개월의안정성시험결과함량변화 (%) 5) 유동층코팅기법을이용한함습개선기술개발가 ) 은교산건조엑스의함습개선기술개발 1 원료약품및분량은교산건조엑스의함습개선을위하여유동층코팅기를이용하여방습코팅을한후활택제를후혼합하여 1호공캡슐에충진하고항온항습의조건에서함습의정도를확인해봄. 은교산건조엑스의방습코팅물원료약품및분량은다음과같음

92 2 방습코팅조건사용장비로는유동층코팅건조기 (FLP-Mini) 를사용하였으며유동층코팅조건은다음과같았음. Peristaltic Pump 속도로는 RPM 1.0, Fan Speed는 30 Hz, Inlet Air 온도는 45 를사용하였으며 Spraying Pressure는 0.2kgf/cm2 이었음. 3 안정성시험방법가속조건은일반적인안정성시험기준인 40±2 / 상대습도 75±5% 또는온도에따른적절한상대습도를고려하여장기보존시험지정저장온도보다 15 이상높은온도로하고보관하면서흡습의정도를관찰하고기존의흡습제형과흡습성이억제된새로운인습방지제형을상호비교하여소량의흡습성만관찰되면안정한것으로판별하였음. 4 실험결과방습코팅전, 후비교사진은다음과같음. 좌측은코팅후의사진이며우측은코팅전은교산건조엑스의모습임. < 유동층코팅전, 후의은교산건조엑스사진 ( 좌 : 코팅후 / 우 : 코팅전 ) > 실험결과위의사진처럼유동층코팅기에서성공적으로코팅이되었으며코팅된과립을

93 호캡슐에충진하여안정성시험을진행하였음. 방습코팅물을충진한경질캡슐제를실온보관하면서관찰하여본결과코팅된과립물을충진한경질캡슐의경우에는피막만수분에의해경화되었을뿐내용물의경우함습되어액화된부분은없는것으로보아유동층코팅을통해천연물의약품을방습할경우천연물의약품자체에비해안정성을향상시킬수있음을알수있었음. 캡슐의실온보관사진은아래와같음. < 은교산건조엑스를유동층코팅한후경질캡슐에충진한사진 > 나 ) 갈근탕건조엑스의함습개선기술개발 1 원료약품및분량갈근탕건조엑스의함습개선을위하여유동층코팅기를이용하여방습코팅을한후활택제를후혼합하여 1호공캡슐에충진하고항온항습의조건에서함습의정도를확인해봄. 갈근탕건조엑스의방습코팅물원료약품및분량은다음과같음. 2 방습코팅조건사용장비로는유동층코팅건조기 (FLP-Mini) 를사용하였으며유동층코팅조건은다음과같았음. Peristaltic Pump 속도로는 RPM 1.0, Fan Speed는 30 Hz, Inlet Air 온도는 45 를사용하였으며 Spraying Pressure는 0.2kgf/cm2 이었음

94 3 안정성시험판별방법가속조건은일반적인안정성시험기준인 40±2 / 상대습도 75±5% 또는온도에따른적절한상대습도를고려하여장기보존시험지정저장온도보다 15 이상높은온도로하고보관하면서흡습의정도를관찰하고기존의흡습제형과흡습성이억제된새로운인습방지제형을상호비교하여소량의흡습성만관찰되면안정한것으로판별함. 4 실험결과방습코팅전, 후비교사진은다음과같음. 좌측은코팅후의사진이며우측은코팅전갈근탕건조엑스의모습임. < 유동층코팅전, 후의갈근탕건조엑스사진 ( 좌 : 코팅후 / 우 : 코팅전 ) > 실험결과위의사진처럼유동층코팅기에서성공적으로코팅이되었으며방습코팅되지않은갈근탕건조엑스 ( 대조군 ) 는실온에서전체적으로수분에의해함습되어액화되었으나방습코팅처리한건조엑스 ( 실험군 ) 는대조군에비해함습이개선되었음. 방습코팅물을충진한경질캡슐의실온보관시경질캡슐피막이수분에의해경화되었으나내용물의경우함습되어액화된부분은없었으므로유동층코팅방법에의한천연물의약품안정화가천연물의약품자체보다도안정성을향상시킬수있음을알수있었음. 캡슐의실온보관사진은아래와같음. < 갈근탕건조엑스를유동층코팅한후경질캡슐에충진한사진 >

95 6. 인후염개선을위한기능성소재개발 1) 인후염개선소재선정을위한처방별효능비교가 ) YG 처방구성생약 YG-1 : 인동등, 우방자, 황금 (30% EtOH 추출물 ) YG-2 : 인동등, 우방자, 황금, 금은화 (30% EtOH 추출물 ) YG-2β : 인동등, 우방자, 황금, 금은화 (30% EtOH + 산가수분해추출물 ) 나 ) 처방별효능비교 Zymosan 유도형염증성통증모델에서 YG-1, YG-2, YG-2β와대조약물 flubiprofen 및 celecoxib와비교효능을평가하였음. 소염효능평가결과 YG-2β>YG-1=YG-2 순이었으며, 진통효능평가결과열적통각과민 (thermal hyperalgesia) 과기계적통각과민 (mechanical hyperalgesia) 은 3 가지처방이비슷한수준의진통효능을보였고, 기계적이질통 (Mechanical allodynia) 에대한진통효능은 YG-2β>YG-2>YG-1 순으로나타났다. 이상의결과로볼때 YG-1β가가장효능이좋은것으로판단됨. 그러나 YG-1β는추후사업화시제조공정및사용용매의안전성근거확보에어려움이따를것으로판단되어 YG-1과 YG-2 처방으로최종복합소재를선정하였음

96 2) 인후염개선소재 YG-1 및 YG-2의소염및진통효능평가가 ) Zymosan유도급성염증모델에서 YG-1과 YG-2의소염및진통효능평가 1 소염효능평가 Zymosan투여 3시간에발생하는발목부종 (paw edema) 은 YG-1과 YG-2(10, 30, 100 mg/kg) 를경구투여시 100 mg/kg용량에서통계적으로유의한소염효능을나타내었음 (p<0.01). Paw edema Change of paw volume (ml) Vehicle YG1 (10mg/kg) YG1 (30mg/kg) YG1 (100mg/kg) Flurbiprofen (10mg/kg) ** ** 3 Time after zymosan injection (h)

97 2 과민통에대한진통효능평가 Zymosan투여 3시간에발생하는과민통인 thermal hyperalgesia에대해 YG-1과 YG-2(10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg) 을경구투여시용량의존적인소염효능을나타내었음. Thermal hyperalgesia Paw withdrawal latency (s) Vehicle YG1 (10mg/kg) YG1 (30mg/kg) YG1 (100mg/kg) Flurbiprofen (10mg/kg) ** ** ** 0 3 Time after zymosan injection (h)

98 Zymosan투여 3시간에발생하는과민통인 mechanical hyperalgesia에대해 YG-1과 YG-2(10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg) 경구투여시 YG-1은용량의존적인진통효능을나타내었으나 YG-2는 100 mg/kg 투여군에서만유의성있는진통효능을보였음. Mechanical hyperalgesia Paw withdrawal threshold (g) Vehicle YG1 (10mg/kg) YG1 (30mg/kg) YG1 (100mg/kg) Flurbiprofen (10mg/kg) ** ** ** 0 3 Time after zymosan injection (h)

99 3 이질통에대한진통효능평가 Zymosan투여 3시간에발생하는이질통인 mechanical allodynia에대해 YG-1과 YG-2(10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg) 를경구투여시 100 mg/kg용량에서통계적으로유의한진통효능을나타냄 (p<0.01). 이러한진통효능은 flurbiproen (100 mg/kg) 에비해상대적으로미약하였음. Mechanical allodynia Paw withdrawal threshold (g) Vehicle YG1 (10mg/kg) YG1 (30mg/kg) YG1 (100mg/kg) Flurbiprofen (10mg/kg) ** 0 3 Time after zymosan injection (h) ** 나 ) Formalin 유도염증성통증모델에서 YG-1과 YG-2의진통억제효능평가 ICR종마우스의발바닥으로포르말린을피하투여시나타나는후통증반응 (paw licking) 은초기 5분간진행되는 1차기와이후시간지연을두고나타나는 2차기로나누어진다. 1차기는신경성통증이고 2차기는염증성통증기로알려져있다. 1차기의통증은마약성진통제에서만그효과가나타난다고보고되어있음

100 1 YG-1과 YG-2의진통효능비교평가 (early phase & late phase) YG-1과 YG-2를각각 100 mg/kg을포르말린투여 1시간전투여하고 2차기통증에대한진통효능을확인한결과모두유의성있는통증억제효능을보였으며, YG-1이좀더나은진통효능을보였음. 2 YG-1의농도의존적인진통효능평가 YG-1(10 mg/kg, 30 mg/kg 및 100 mg/kg) 을포르말린투여 1시간전에경구투여시 2차기통증에대해서만용량의존적인진통효능을나타냄. 이러한결과로볼때 YG-1은염증성통증에대한진통작용이있음을시사하며신경성통증에대한작용은없는것으로판단됨. 특히, YG1 (100 mg/kg) 에의한진통효능은대조약물과 flurbiprofen (100 mg/kg) 과유사한수준으로나타날정도로우수함

101 3) 인후염개선소재 YG-1의염증성발열모델에서의효능평가가 ) LPS 유도염증성발열억제효능평가 1 해열효능의평가 LPS (2.5 mg/kg) 투여후 6시간에체온이최고점에나타내었으며, 12시간까지발열이유지되었음. YG-1(100 mg/kg 및 400 mg/kg) 를경구투여시 LPS에의한체온상승을현저히억제하였으며, 해열효능의크기는 flurbiprofen (20 mg/kg) 와유사한양상을보였음. 2 혈청내발열인자에대한영향 LPS 투여후 6시간및 12시간후혈청내 IL-1β, TNF-α 및 PGE2의농도가급격히증가되었음. YG-1(100 mg/kg 및 400 mg/kg) 를경구투여시 LPS에의한 IL-1β 및 PGE2 증가를선택적으로억제하였으며 flurbiprofen (20 mg/kg) 와유사한양상을보였음

102 3 송과선내발열인자에대한영향 LPS 투여후 6시간및 12시간후뇌신경인송과선 (pineal gland) 에서 inos 및 COX2의발현량이급격히증가되었음. YG-1(100 mg/kg 및 400 mg/kg) 를경구투여시 LPS에의한 inos 및 COX2의발현을현저히억제하였으며 flurbiprofen (20 mg/kg) 와유사한양상을보였음. 나 ) 장소선호도및자발운동성에미치는영향 YG-1(100 mg/kg 및 400 mg/kg) 를경구로 5회반복투여시투여장소에대한선호도가나타나지않아중독성이없는것으로나타났음. 이때동물의자발성운동에도영향이없어 YG-1이 sedation에영향을미치는않는것으로나타났음

103 4) 인후염개선소재 YG-1의 In vitro 소염및진통기전연구가 ) 세포독성및세포생존율에미치는영향 RAW 264.7세포에서 LPS로유도된세포독성및세포생존률에대한영향을 MTT assay로평가한결과 YG-1은 100 ug/ml까지세포독성을보이지않았으며, 농도의존적으로세포생존율을증가시켰음. 나 ) IL-1β, TNF-α, PGE2 및 NO의농도변화 LPS처리시 RAW 264.7세포에서 IL-1β, TNF-α, PGE2 및 NO의유리를현저히증가시켰음. YG-1의전처치는농도의존적으로 IL-1β, PGE2 및 NO의유리를억제하였으며, flurbiprofen에비해우수한억제효능을보였음

104 다 ) inos 및 COX2의발현변화 LPS처리시 RAW 264.7세포에서 inos 및 COX2의세포내발현량이현저히증가시켰음. YG-1의전처치는농도의존적으로 inos 및 COX2의세포내발현증가를억제하였으며, flurbiprofen과유사한효능을보였음. 5) 인후염개선소재 YG-1의진해억제및거담활성평가가 ) 실험방법 1 진해억제활성평가방법각각의생약추출물로부터진해활성을검색할목적으로수컷 ICR 마우스 (6주령, 오리엔트바이오 ) 에약물을경구투여하고 30분후마우스를플레티시스모그래프챔버 (Buxco, U.S.A.) 에넣은후, 기침유발제 ( 시트르산 ) 를분무하여기침을유발시킴. 양성대조군으로는진해제로사용되고있는테오브로민 (50 mg/kg) 을사용하였으며, 0.4 M의시트르산에마우스를 10분간노출시키고이때발생하는기침수를 5초간격으로 10분간측정함. 2 거담활성평가방법혼합추출물의거담활성을평가하기위하여, 양성대조약물 ( 암브록솔, ambroxol, Sigma), 시험약물을수컷랫트 (6주령, 오리엔트바이오 ) 에경구투여하고 30분후, 페놀레드를복강주사함. 30분후디에틸에테르를이용해마취시키고복부대동맥을절단하여방혈시킨후, 기관 (trachea) 전체를절제함. 분리된기관을 1 ml의생리식염수에넣어 30 분동안

105 세척하였고, 10,000 rpm 으로 5 분간상온에서원심분리하여얻은상등액에 1 N 가성소다 (NaOH) 를첨가 ( 상등액 1 ml 당 1N NaOH 0.1 ml 첨가 ). 이들에대한 546 nm 에서의 흡광도를측정하여배출된페놀레드의농도로서거담활성을평가함 나 ) 실험결과 1 YG-1의진해억제활성 YG series 3종및 G series 3종에대하여진해억제활성을평가하였음. 각각의추출물을 200 mg/kg의용량으로경구투약하고기침유발후기침수를측정한결과, YG-1, G50의경우양성대조군으로사용된기존의진해억제제테오브로민과유사한기침수억제효과를나타내었음. Effect of YG & G series on cough inhibition in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05 significantly different from the normal group. 2 YG-1의거담활성 YG series 3종및 G series 3종에대하여진해억제활성을평가하였음. 각각의혼합추출물을 200 mg/kg의용량으로경구투약하고페놀레드를복강주사한뒤분리한기관의페놀레드농도로서거담활성을평가한결과, 모든시험물질에서거담활성을확인하였으며, 2YG_beta의경우양성대조약물로사용된기존의거담제암브록솔보다우수한거담효과를나타내었음

106 Effect of YG & G series on phenol red secretion in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01 significantly different from the control group. 6) 인후염개선소재 YG-1의생리활성효능평가가 ) 실험방법 1 항산화효과측정혼합추출물의항산화효과를확인하기위하여, 진한보라색을띠는 Diphenylpicrylhydrazyl이항산화제에의해 Diphenylpicrylhydrazine으로환원되어옅은노란색으로변하는것으로, 항산화제의항산화효능이강할수록옅은노란색에가까워지는 DPPH assay를활용함. 0.1 mm DPPH 용액 (Diphenylpicrylhydrazyl) 을 8그룹으로처리함. 1 그룹은음성대조군으로설정하여어떤조작도하지않았으며, 2그룹은양성대조군으로설정하여 ascorbic acid 50 μm을처리함. 실험그룹에는추출물을각각 10 μg/ml, 30μg/mL, 100 μg/ml씩처리함. 520nm의파장에서흡광계를이용하여시료의색변화를정량화함 2 세포독성평가세포는 50,000 cells/well의밀도로 96 well-plate에분주하여, 24시간배양함. 상기 24시간배양한뒤, 아무런처리를하지않은대조군과다양한농도의혼합추출물을 MTT 분석 (MTT assay) 방법으로살아있는세포의수를측정 3 항염효과측정 (NO) 혼합추출물의항염효과를확인하기위하여, 혼합추출물과 LPS를함께첨가한후, Raw cell 24시간배양한뒤, 24시간배양한후의배양액을수집하여, NO 분비량을 Griess reagent system 및 sandwich ELISA을이용한측정법을이용하여측정 나 ) 실험결과 1 YG-1 의항산화효능평가결과 YG series 3 종과 G series 3 종에대하여항산화효능을평가하였음. 양성대조약물로사용된

107 L-ascorbic acid 의항산화능을비교한결과, YG-1 는 10 μg/ml 부터 2YG 및 2YG beta 의경 우는 50 μg/ml 부터 30% 이상의항산화효과를나타내었음. G series 의경우 200 μg/ml 에 서 20% 이상의항산화효과를나타내었으며, YG-1 의항산화활성이가장좋음. Antioxidant acitivity of YG, G_series. The value were presented as means ± S.D. 2 YG-1의면역세포활성능평가 (In vitro) 혼합추출물로부터면역세포보호활성을검색할목적으로, 혼합추출물을처리한후세포생존율을증가시키는추출물을검색함. YG는농도의존적으로세포독성을유발하지만, 2YG, 2YG_beta 그룹에서는세포독성이보완되어짐. G_series 추출물에서는어떠한세포독성도나타나지않음 Effecf of YG and G series on the cells viability. Cells were incubated with various concentration of YG and G (10-500μg/mL). Each bar represented as mean ± S.D. 3 YG-1의항염효능기전확인 (In vitro) YG series 3종과 G series 3종의 NO 생성에미치는영향을확인함. LPS로염증을유발시킨면역세포에서 NO의생성이대조군보다증가하였으나, YG_series 추출물의처리농도가높아질수록 NO의생성량이줄어드는것을확인함. G_series 역시 NO의생성이억제되는것을확인함

108 Effect of YG and G series on the production of NO from macrophage. Cells were incubated with various concentration of YG and G (10-500μg/mL). Each bar represented as mean ± S.D 7) YG-1의호흡기계병원성미생물에대한방어능평가가 ) 실험방법 1 항박테리아활성평가혼합추출물의호흡기계병원성세균에대한항박테리아활성을측정하기위해각조성물을멸균 D.W. 에녹여 Disk agar diffusion assay 법으로측정하였음. 상기도감염을유발하는 Staphylococcus spp. 를도말하고혼합추출물을각각희석하여 6mm 직경가진 paper disk에로딩한후 37 에서 24간배양후생육저지대 (Inhibition zone) 의직경을측정함. 이때 positive control로 penicillin/ streptomycin을사용하고, negative control로는동량의 D.W. 를사용 2 항바이러스활성평가혼합추출물의호흡기계바이러스에대한항바이러스활성을측정하기위해 H5N1 influenza 바이러스를이용하여 TCID 50 방법으로바이러스감염가를측정하여효과를 SRB분석법으로판정함. 각각에 10% trichloroacetic acid (TCA) 를 100μl씩검사한후 1시간동안 4 에방치하고증류수로수회세척함. 실온에서건조시킨후 1% acetic acid에녹인 0.4% SRB (sulforhodamineb) 용액 100μl를첨가해 30분동안염색시킴. 염색제를충분히녹인후 560nm에서흡광도를측정함. 각처리군은바이러스를처리하지않은군 (A), 혼합추출물만처리한군 (B), 바이러스만을처리한군 (C), 바이러스와혼합추출물을같이처리한군 (D) 으로표기하였고각각혼합추출물의세포독성비율과생약추출물의바이러스증식억제비율을계산함

109 나 ) 실험결과 1 항박테리아활성평가 YG series 3종과 G series 3종의항박테리아활성을평가한결과모든시험약물에서상기도감염을유발하는 S. aureus에대한항균활성은나타나지않았음 Antibacterial activity of YG, G_ series 2 항바이러스활성평가 YG series 3종과 G series 3종의항바이러스활성을평가하였음. YG_series추출물은 MDCK 세포에대해높은세포독성을나타내었으며, G_series추출물은 10% 내외의낮은세포독성을나타냄. YG, G_series 추출물에서는 H5N1 influenza virus에대한항바이러스효능은보이지않음 Group 세포독성 (%) 바이러스증식억제능 (%) YG 2YG 2YG_beta G30 G35_beta G50 30 μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L

110 8) YG-1의기관지이완효과평가및기전연구가 ) 실험방법 1 백서기관지분리건강한수컷백서 (Sprague-Dawley, 몸무게약 g) 의두부를탈골시킨후흉곽을절제하고기관지를분리함. 신속하게분리된기관지를 95% O 2 와 5% CO 2 의혼합기체로포화된 ice-cold Krebs 용액 (118 mm NaCl, 4.7 mm KCl, 1.1 mm MgSO 4, 1.2mM KH 2 PO 4, 1.5 mm CaCl 2, 25 mm NaHCO 3, 10 mm glucose, ph 7.4) 에넣고주위지방및결합조직을제거한후약 3-4 mm의길이의절편으로만듬. 이때기관지평활근을손상시키지않도록함 2 백서기관지의장력측정준비되어진백서의기관지절편은 orgam chamber 안 95 % O 2,5 % CO 2 혼합가스로포화시킨 37.4 의 Krebs 용액에서고정시킨후 isometric tension을 force-displacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA) 가장착된생리기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA) 를이용하여측정함. 이때 heat/circulator (Model CW-10GL, JEIO TECH, Korea) 에의해일정한온도를유지함. 고정된기관지는 tension을증가시켜 2 g의 optimum tension에도달하도록하여안정화함. 본실험방법으로는 100 μm 의 acetylcholine으로수축을유도하여평형에도달하는시간인 5분후시험추출물 YG-1 추출물 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1 mg/ml을점차누적적으로투여하였으며, 각농도별로 10분씩관찰하여기관지의긴장도변화를측정하였다. 또한기전을살펴보기위해서여러가지차단제를본실험에들어가기 20분전전처리해준후같은방법으로 100 μm의 acetylcholine으로수축을유도한후 YG-1을농도별로살펴보았음. 유발한수축력을 100% 로가정한후시험물질투여군의이완율 (%) 을산출함. 그림. 기관지확장실험방법모식도 나 ) 실험결과 1 YG-1의기관지이완효과 YG-1 추출물의이완효과를알아보기위하여기관지평활근을 acetylcholine으로수축을유도한후농도의존성효과를평가하였음. Acetylcholine으로수축을유도한후 YG-1 추출물을처리하지않았을때같은시간동안수축이유지되었으며, YG-1 추출물을 0.01 mg/ml, 0.03 mg/ml, 0.1 mg/ml, 0.3 mg/ml 그리고 1 mg/ml을점차누적적으로투여하였으며각농

111 도별로 10 min 씩관찰하였을때이완효과를보이는것을확인하였음. YG-1 추출물은 1 mg/ml 농도에서 ± 2.02% 의이완효과가나타났음. <*p<0.05, ** p<0.01, and ***p<0.001 vs. time-control> -50 Relative Relaxation (%) * * * Time-control ** *** YG-1 (dose-dependent) *** Times 2 YG-1의기관지평활근수축억제효과기관지평활근긴장도증가에있어서대표적인수축제인 acetylcholine은무스카린성 M 3 수용체에작용하여세포내 IP3의증가로인해 Ca 2+ 농도가유입되고그로인하여수축을유도한다. 따라서 YG-1 추출물이 acetylcholine에의한기관지평활근수축에영향을미치는지알아보기위하여 0.3 및 1 mg/ml의농도의 YG-1 추출물을전처리한후 acetylcholine을농도의존적으로투여하였을때수축력을비교해보았다. 그결과 YG-1 추출물에의하여 acetylcholine 수축력은감소하였으며, 0.3 mg/ml 보다 1 mg/ml을전처리했을때그효과가크게나타났다. *p<0.05, ** p<0.01, and ***p<0.001 vs. vehicle

112 Vehicle YG-1 ( 0.3 mg/ml ) YG-1 ( 1 mg/ml ) 120 Contraction (%) * * *** *** ** *** ** *** *** *** *** *** ACh ( M ) 3 Ca 2+ 통로차단시 YG-1 의이완효과 평활근의수축에있어서 Ca²+은중요한역할을한다. 평활근세포내 Ca 2+ 농도가증가하면 calmodulin과결합하여 myosin light chain (MLC) 의인산화를촉진시켜평활근을수축시킨다. 따라서 YG-1 추출물의이완효과가 L형 Ca 2+ 통로와의연관성을알아보기위하여 L 형 Ca 2+ 통로차단제인 verapamil (1 μm), diltiazem (1 μm) 및 nifedipine (1 μm) 을전처리하여진행한결과 YG-1 추출물의이완효과가차단되는것을확인하였다. *p<0.05, ** p<0.01, and ***p<0.001 vs. vehicle 근소포체 (sarcoplasmic Reticulum) 에서저장된 Ca²+의방출은리아노딘수용체 (RyR) 라고하는 Ca²+ 방출통로를거쳐일어난다. 근소포체내 Ca 2+ 을방출시키는데영향을미치는리아노딘수용체 (ryanodine receptor) 선택적차단제인 ryanodine (1 μm) 과근소포체 Ca 2+ -ATPase 선택적차단제인 thapsigargin (1 μm) 을전처리하여 YG-1 추출물의기관지이완효과를살펴보았다. 그결과 YG-1 추출물의이완효과가차단되는않는것을확인할수있었다

113 9) YG-1의 GLP 기관독성시험수행가 ) 단회투여독성시험본시험은시험물질인 YG-1을 Sprague-Dawley 계암수 6주령랫드에단회경구투여시나타나는독성을평가하고, 개략의치사량을구하기위하여실시하였음. 군구성은시험물질 2,500mg/kg의용량및대조군 ( 주사용수 ) 의 2군으로하고, 암수각각 5마리씩단회경구투여하였음. 투여후 14일동안일반증상의관찰및체중측정을실시하였고, 관찰기간종료시에안락사시켜부검하였음. 암수 2,500mg/kg 투여군에서사망례는관찰되지않았음. 암수 2,500mg/kg 투여군에서투여당일및투여후 1일에시험물질색변및점액변이관찰되었으나, 투여후 2일부터일반증상의이상은관찰되지않았음. 체중및부검소견에서시험물질투여에의한영향은인정되지않았음. 본시험의조건하에서 YG-1을랫드에단회경구투여한결과, 개략의치사량은암수모두 2,500mg/kg을상회하는것으로판단됨

114 나 ) 4주반복투여독성시험본시험은 YG-1을 Sprague-Dawley계암수랫드에 4주간반복경구투여시나타나는독성반응과그안전성을평가하고, 2주간의회복군을설정하여독성변화의가역성여부를확인하기위하여실시하였음. 군구성은시험물질 625, 1,250 및 2,500 mg/kg/day의 3개의용량과대조군 ( 주사용수 ) 의 4군으로하고, 군당암수각각 10마리씩 4주간경구투여함. 대조군과 2,500 mg/kg/day 투여군에는군당암수각 5마리씩추가하여 2주회복군을설정함. 관찰기간동안일반증상관찰, 체중측정, 사료섭취량측정, 안과학적검사및뇨검사를실시하였고, 관찰기간종료후혈액및혈액생화학적검사, 장기의중량측정, 부검시육안적검사및조직병리학적검사를수행하였음. 관찰기간동안, 암수 625, 1,250 및 2,500 mg/kg/day 투여군에서사망례는관찰되지않았음. 투여기간동안, 암수 625, 2,250 및 2,500 mg/kg/day 투여군에서시험물질색변이관찰되었고, 암수 2,500 mg/kg/day 투여군에서는연변이관찰되었으며, 암컷 2,500 mg/kg/day 투여군에서는항문주위오염, 점액변및설사가각 1마리에서관찰되었다. 이러한증상은회복 2일부터는관찰되지않았음. 체중, 사료섭취량, 안과학적검사, 뇨검사, 혈액학적검사, 혈액생화학적검사, 장기중량및부검소견에서, 암수 625, 1,250 및 2,500 mg/kg/day 투여군에서시험물질투여에기인한독성학적인변화는관찰되지않았음. 조직병리학적검사결과에서도암수 2,500 mg/kg/day 투여군에서시험물질투여에기인한독성변화는관찰되지않았음. 본시험조건하에서 YG-1을 625, 1,250 및 2,500 mg/kg/day로암수랫드에 4주간반복경구투여한결과, 독성학적으로의미있는변화가관찰되지않았기에무독성량 (NOAEL) 은암수모두 2,500 mg/kg/day를상회하는것으로판단됨. 다 ) YG-1이랫드의중추신경계에미치는여향본시험은 6주령의수컷 Sprague-Dawley 랫드에시험물질인 YG-1을단회경구투여하고, 기능관찰시험을실시하여중추신경계에미치는영향을평가하였음. 군구성은대조군과 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량의시험물질투여군의총 4 군으로설정하여각군당 8 마리씩투여하였고, 대조군은부형제인주사용수를투여하였음. 기능관찰시험의 home cage 내에서의관찰, open field 내에서의관찰, hand held 하에서의관찰, 감각 운동기능검사및체온측정은투여전 (0 시간 ), 투여후 0.5, 1, 3, 6 및 24 시간째에실시하였음. 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량의시험물질투여군은기능관찰시험의모든 parameters에서시험물질의투여에의한변화는관찰되지않았음

115 이상의결과로부터, 본시험조건하에서랫드를이용한단회경구투여에서, 시험물질인 YG-1 은 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량에서중추신경계에미치는영향이없는것으로판단 됨. 라 ) YG-1이랫드의호흡기계에미치는영향평가본시험은 6 주령의수컷 Sprague-Dawley 랫드에시험물질인 YG-1을단회경구투여하고, 무마취 무구속상태하에서호흡기계 parameters ( 분당호흡수 (respiratory rate), 1회호흡량 (tidal volume), 및분당호흡량 (minute volume)) 를측정하여호흡기계에미치는영향을평가하였음. 군구성은대조군과 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량의시험물질투여군의총 4군으로설정하여각군당 6 마리씩투여하였고, 대조군은부형제인주사용수를투여하였음. 호흡기능에관한시험물질의잠재적인영향은 whole body plethysmography를이용하여호흡기계 parameters를투여전 (0 시간 ), 투여후 0.5, 1, 3, 6, 및 24 시간째에측정하여평가하였음. 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량의시험물질투여군의분당호흡수, 1회호흡량및분당호흡량은모든측정시점에서시험물질의투여에의한변화는나타나지않았음. 이상의결과로부터, 본시험조건하에서랫드를이용한단회경구투여에서, 시험물질인 YG-1은 625, 1,250 및 2,500 mg/kg 용량에서호흡기계에영향을미치지않는것으로판단됨. 마 ) YG-1이비글견의심혈관계에미치는영향평가본시험은원격송신기가삽입된무마취 무구속상태의수컷비글견 4 마리에시험물질인 YG-1을경구투여한후, 혈압, 심박수및심전도검사를실시하여심혈관계에미치는영향을평가하였음. 1차투여는대조물질로서부형제인주사용수를, 2, 3 및 4 차투여에서는 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량의시험물질을동일한개체에 1주간격으로각용량당단회경구투여하였음. 심혈관계 parameters ( 혈압, 심박수및심전도 ) 는투여전 0 시간 (pre), 투여후 0.5, 1, 2, 3, 4, 6, 8 및 24 시간째에평가하였다. 혈압 ( 수축기, 이완기및평균혈압 ), 심박수및심전도의 parameters (PR, QRS, QT 및 QTc interval) 에서, 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량의시험물질의투여에의한변화는나타나지않았음. 체온에서, 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량의시험물질의투여에의한변화는나타나지않았음. 일반증상관찰에서, 2,000 mg/kg 용량의시험물질투여시에시험물질의투여에의한영향으로판단되는연변 (Soft stool) 이관찰됨

116 이상의결과로부터, 본시험조건하에서비글견을이용한단회경구투여에서, 시험물질인 YG-1 은 125, 500 및 2,000 mg/kg 용량에서심혈관계에미치는영향이없는것으로판단됨. 바 ) YG-1이 HEK-293 세포에발현된 herg channel currents에대한영향평가본시험은 human Ether-a-go-go Related Gene (herg) 을도입하여 herg 칼륨이온채널을안정하게발현시킨 HEK-293 세포에시험물질인 YG-1을적용하여 herg channel currents에미치는영향을평가한것임. 시험물질군의처리농도는 0.3, 1, 3 및 10 ug/ml로설정하였고, 부형제대조군은 external bath solution을처리하였으며, 각농도당 3개의세포를적용하였음. 양성대조군은 ug/ml의 E-4031을처리하였고, 각실험당일에부형제대조군또는각농도별시험물질군의검사대상물질에대한 herg channel currents의기록이종료된임의의 1개세포에적용하였음. 0.3, 1, 3 및 10 ug/ml 농도의시험물질군의 herg channel currents의억제율 (Compensated Suppression rate(%)) 은각각 6.27, -2.84, 및 2.85% 로나타났고, 부형제대조군과비교하여통계학적으로유의한차이가나타나지않았음. 이와동일한조건하에서양성대조물질로사용한 ug/ml의 E-4031 처리시의 herg channel currents가대부분억제 (Compensated suppression rate: 91.89%) 된점으로볼때, 본시험법은시험물질의 herg channel currents에미치는영향을평가하기에적합한것으로판단됨. 이상의결과로부터, 본시험조건하에서 herg 유전자가도입된 HEK-293 세포를이용한 herg channel currents에미치는영향평가에서, 시험물질인 YG-1은용해도를고려하여적용가능한최고농도인 10 ug/ml까지처리한결과 herg channel currents의최대억제율은 6.27% 로서최대억제율이 50% 를넘지않아 IC 50 값은산출하지않았음. 10) YG-1 의품질관리기준규격설정 가 ) YG-1의지표성분 인동등 구조 일반명 Loganin Loganic acid Sweroside 분자식 C!7H26O10 C16H24O10 C16H22O9 분자량 제조 판매회사명 Sigma Sigma Sigma

117 우방자 : Arctiin 구조 일반명 Arctiin 분자식 C27H34O11 분자량 제조 판매회사명 Sigma 황금 : Baicalin, Baicalein 구조 일반명 Baicalin Baicalein 분자식 C21H18O11 C15H10O5 분자량 제조 판매회사명 Sigma Sigma 지표물질설정근거 바이칼린, 바이칼레인 : 대한민국약전 (KP) 의약품각조 2부황금중정량법을근거로설정하였음. 로가닌 : 대한민국약전 (KP) 의약품각조 2부인동중정량법을근거로설정하였음. 악틴 : SCI 논문을근거로우방자중악틴을설정하였음. < 참조 : Guo M et. al., J Chromatogr A aug 13;1217(33): > 나 ) 원료소재의기준규격확립 YG-1 제조에사용된원료는대한민국약전 (KP) 에준하여기준규격을설정하였으며, 기준에 적합한원료를선별하여사용하였음

118 1 인동등원료시험결과 시험항목시험방법시험기준시험결과 1. 성상대한민국약전육안관찰적합 2. 확인대한민국약전별첨확인 3. 순도시험 1) 이물대한민국약전 2) 중금속대한민국약전 3) 잔류농약대한민국약전 약 5mm이상의줄기가섞여있지않다. Pb : 5 ppm As : 3 ppm Hg : 0.2 ppm Cd : 0.3 ppm 이하 총 BHC : 0.2 ppm 총 DDT : 0.1 ppm Aldrin : 0.01 ppm Dieldrin : 0.01 ppm Endrin : 0.01 ppm Oxolinic acid : 7.00 ppm Endosulfan : 0.01 ppm 섞여있지않다 ppm ppm ppm ppm 불검출 4) 이산화황대한민국약전 30 ppm 이하 0 ppm 4. 건조감량 5. 회분 6. 산불용성회분 대한민국약전일반시험법 대한민국약전일반시험법 대한민국약전일반시험법 7. 묽은에탄올엑스대한민국약전일반시험법 8. 정량법 대한민국약전일반시험법 12.0% 이하 (6 시간 ) 10.7% 9.0% 이하 2.3% 1.0% 이하 0.2% 12.0% 이상 15.3% 로가닌 0.1% 이상 0.5% 2 우방자원료시험결과 시험항목 시험방법 시험기준 시험결과 1. 성상 대한민국약전 육안관찰 적합 2. 확인 대한민국약전 별 첨 확인 3. 순도시험 1) 이물대한민국약전 2) 중금속대한민국약전 약 5mm이상의줄기가섞여있지않다. Pb : 5 ppm As : 3 ppm Hg : 0.2 ppm Cd : 0.3 ppm 이하 섞여있지않다 ppm ppm ppm ppm

119 3) 잔류농약대한민국약전 총 BHC : 0.2 ppm 총 DDT : 0.1 ppm Aldrin : 0.01 ppm Dieldrin : 0.01 ppm Endrin : 0.01 ppm Oxolinic acid : 7.00 ppm Endosulfan : 0.01 ppm 불검출 4) 이산화황대한민국약전 30 ppm 이하 0 ppm 4. 건조감량 5. 회분 6. 산불용성회분 대한민국약전일반시험법 대한민국약전일반시험법 대한민국약전일반시험법 7. 묽은에탄올엑스대한민국약전일반시험법 12.0% 이하 (6 시간 ) 7.3% 7.0% 이하 3.7% 1.0% 이하 0.2% 15.0% 이상 18.1% 3 황금원료시험결과 시험항목 시험방법 시험기준 시험결과 1. 성상 대한민국약전 육안관찰 적합 2. 확인 대한민국약전 별 첨 확인 3. 순도시험 1) 이물대한민국약전 2) 중금속대한민국약전 약 5mm이상의줄기가섞여있지않다. Pb : 5 ppm As : 3 ppm Hg : 0.2 ppm Cd : 0.3 ppm 이하 섞여있지않다 ppm ppm ppm ppm 3) 잔류농약대한민국약전 총 BHC : 0.2 ppm 총 DDT : 0.1 ppm Aldrin : 0.01 ppm Dieldrin : 0.01 ppm Endrin : 0.01 ppm 불검출 4) 이산화황 대한민국약전 30 ppm 이하 0 ppm 4. 건조감량 대한민국약전일반시험법 15.0% 이하 (6시간) 10.3% 5. 회분 대한민국약전일반시험법 6.0% 이하 2.3% 6. 산불용성회분 대한민국약전일반시험법 1.0% 이하 0.2%

120 7. 함량 대한민국약전일반시험법 Baicalin, Baicalein 및 Wogonin의합 10.0% 이상 15.9% 4 YG-1 원료소재시험성적서 YG-1 제조에사용된원료에대한시험성적서를확보함. 인동등시험성적서우방자시험성적서황금시험성적 다 ) YG-1 정제제조공정확립및기준규격및시험방법확립 1 YG-1 제조공정확립 YG-A, YG-B, YG-1 및임상시험용 YG-1 정제제조 YG-1의제조공정을확립하기위해 3 batch 제조를하고실측치를기준으로평균수율을정하고제조공정을확립하였음. YG-1은 YG-A( 인동등, 우방자혼합추출물 ) 과 YG-B( 황금추출물 ) 건조엑스를제조하고두건조엑스를일정비율로혼합하여제조함. YG-1 정제는건조엑스에선정된부형제, 붕해제, 활택제등을혼합하여압출성형방식으로타정을실시하고, 팬코팅을통해안정성을확보하였음

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122 YG-1 정제제조임상시험계획승인신청 (Investigational New Drug Application) 을위해서는임상시험에사용될완제의약품의용량을결정하여제조된임상약의품질관리시험법 ( 기준및시험방법 ) 및제품의사용기간확립을위한안정성자료의제출이필요함. 공정공정번호명칭원료의약품의 1 칭량추출, 농축, 건 2 조및혼합 3 혼합 원료시약용매등주성분우방자 (KP) 주성분황금 (KP) 주성분인동 (KP) 부형제미결정셀룰로오스 (KP) 옥수수전분 (KP) 경질무수규산 (NF) 붕해제카르복시메틸셀룰로오스칼슘 (KP) 활택제스테아린산마그네슘 (KP) 코팅기제히드록시프로필셀룰로오스2910 (KP) 글리세린지방산에스테르 (KP) 차광제산화티탄 (KP) 착색제녹색 3호 (KPTaCS) 적색 40호알루미늄레이크 (KPTaCS) 황색 5호알루미늄레이크 (KPTaCS) YG-A건조엑스 (7.14 1) : 공정 1의주성분인동, 우방자를정선하여적당한크기 ( 파쇄기 30 mm) 로한다음원료약품의분량대로각생약을달아추출기에넣고 20배의 30% 주정 (KP) 를넣어 에서 3시간동안 1회추출한다. 추출액을 5 μm크기의마이크로필터를이용하여여과하고잔사를동일조건으로 2차추출하고여과후 60 이하에서감압농축후건조하여 YG-A 건조엑스를얻는다 ( 수득율 %). YG-B건조엑스 (2.19 1): 공정 1의주성분황금을정선하여적당한크기 ( 파쇄기 30 mm) 로한다음원료약품의분량대로각생약을달아추출기에넣고 20배의 30% 주정 (KP) 를넣어 에서 3시간동안 1회추출한다. 추출액을 5 μm크기의마이크로필터를이용하여여과하고잔사를동일조건으로 2차추출하고여과후 60 이하에서감압농축후건조하여 YG-B 건조엑스를얻는다 ( 수득율 %). 상기 YG-A(7.14 1) 와 YG-B(2.19 1) 를일정비율로혼합하여 YG-1 건조엑스를얻는다. 공정 2의 YG-1 건조엑스공정 1의부형제

123 공정 1의붕해제공정 1의활택제 4 타정공정 3 의혼합물 5 코팅액의조제 6 코팅 공정 1의코팅기제공정 1의차광제공정 1의착색제정제수 (KP) 에탄올 (KP) 공정 4의반제품공정 5의코팅액 7 포장공정 6 의반제품 임상시험용량설정근거전북대학교와원광대학교에서 YG-1의소염및진통효능, 거담활성및해열효능에대한전임상자료및 4주반복투여독성시험자료를바탕으로임상시험용량을결정하였음. 임상시험용량 - 안전성자료로써 4주반복투여독성시험결과 NOAEL(Observed adverse effect level) 은 2,500 mg/kg/day를상회한다는결과를얻음. - Rat로진행된독성시험결과를바탕으로 HED(Human equivalent dose) 를 FDA 가이드라인을참고하여체표면적환산식으로인체투여용량을구하였으며, HED는 24,000 mg/60kg bw/day 임. HED(mg/60kg bw/day) = 2,500 mg/kg/day 6/37 60 kg bw - 유효성자료로써소염및진통효능은 30, 100 mg/kg(rat) 에서유의성있는결과를얻었으며, 거담활성은 200 mg/kg(rat) 였다. 또한해열효능은 100, 400 mg/kg에서유의성있는결과를보였음. 이상의결과를바탕으로안전성과유효성을확보할수있는임상용량을설정하였으며, rat가사람에비해약물대사속도가월등히높고또한순응도에대한종간특이성을고려하여인체적용시험투여용량을 1,000 mg/day, 1,500 mg/day로설정하였음. : 100 mg/kg/day 6/37 60 kg bw = 960 mg/60kg bw/day : 150 mg/kg/day 6/37 60 kg bw = 1,440 mg/60kg bw/day 임상시험용의약품진약 / 위약

124 YG-1 정 ( 진약 ) YG-1 정 ( 위약 )

125 2 YG-1의기준규격확립 YG-A, YG-B, YG-1 및 YG-1 정제의기준규격확립을위하여 3 batch 제조된샘플로시험을실시하여각각의기준규격설정근거자료를확보하여최종기준규격및시험방법을확립하였음. 시험성적서

126 YG-A 건조엑스건조감량기준규격설정근거 건조감량대한민국약전일반시험법생약시험법건조감량항에따라 3 batch 당 3회반복시험하여얻은결과의평균을기준으로설정함. Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 3.3 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 4.0 YG-A 건조엑스건조감량기준규격설정근거 회분대한민국약전일반시험법생약시험법중회분항에따라 3 batch 당 3회반복시험하여얻은결과의평균으로기준을설정함. Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%)

127 Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 8.6 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 10.3 YG-A 건조엑스지표성분의함량기준규격설정근거 YG-A 건조엑스 HPLC 분석결과 ( 크로마토그램 ) 인동등 -Loganin -Loganic acid -Sweroside ( 크로마토그램 ) 우방자 - Arctiin

128 함량별규 YG-A 건조엑스 (7.16 1) 중인동등, 우방자정량법에따라시험하였으며 3 batch 당 3회반복분석하여평균값의 90% 이상으로기준을설정함 - 인동중 Loganic acid (mg/g) 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Loganic acid Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 3.95 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) 인동중 Sweroside (mg/g) 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Sweroside

129 Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 6.10 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) 인동중 Loganin (mg/g) 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Loganin Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g)

130 Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) 우방자중 Arctiin (mg/g) 우방자 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Arctiin Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) YG-B 건조엑스건조감량기준규격설정근거 건조감량 대한민국약전일반시험법생약시험법건조감량항에따라 3 batch 당 3 회반복시험하여

131 얻은결과의평균을기준으로설정함. Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 4.0 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 4.8 YG-B 건조엑스회분기준규격설정근거 회분대한민국약전일반시험법생약시험법중회분항에따라 3 batch 당 3회반복시험하여얻은결과의평균으로기준을설정함. Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%)

132 Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 6.0 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 7.2 YG-B 건조엑스지표성분의함량기준규격설정근거 YG-B 건조엑스 HPLC 분석결과 ( 크로마토그램 ) 황금 - Baicalin - Baicalein 함량대한민국약전중황금정량법에따라시험하였으며, 3 batch 당 3회반복분석하여황금중 baicalin, baicalein의합의평균값의 90% 이상으로기준을설정함 - 황금중 Baicalin (mg/g)

133 황금 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Baicalin Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) 황금중 Baicalein (mg/g) 황금 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Baicalein Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g)

134 Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) 황금중 Baicalin, Baicalein의함량기준 (mg/g) Batch Baicalein Baicalin 합계 (mg/g) YG-B YG-B YG-B 평균값 YG-B YG-B YG-B 평균값 YG-B YG-B YG-B 평균값 batch 평균값 ( / 3) batch 평균값의 90% 이상 (6.0 90%) YG-1 건조엑스건조감량기준규격설정근거 YG-A 와 YG-B 를일정비율로혼합한 YG-1 에대한기준규격을설정하기위하여혼합된 샘플 3 batch 에대한시험을실시하고각항목에대한기준규격을확립하였음. YG-1 건조감량 대한민국약전일반시험법생약시험법건조감량항에따라 3 batch 당 3 회반복시험하여 얻은결과의평균을기준으로설정함

135 Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 건조후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 2.4 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 2.9 YG-1 건조엑스회분기준규격설정근거 YG-1 회분대한민국약전일반시험법생약시험법중회분항에따라 3 batch 당 3회반복시험하여얻은결과의평균으로기준을설정함. Batch 1 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) Batch 2 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%)

136 Batch 3 샘플용량 (g) 용기무게 (g) 회화후무게 (g) % 평균 (%) batch 평균값 ( / 3) 6.5 기준 3 batch 평균값의 120% 이하 ( %) 7.8 YG-1 건조엑스지표성분의함량기준규격설정근거 YG-1 건조엑스 ( 크로마토그램 ) YG-1 건조엑스중인동등의지표성분 ( 크로마토그램 ) YG-1 건조엑스중우방자의지표성분

137 ( 크로마토그램 ) YG-1 건조엑스중황금의지표성분 YG-1 함량별규 YG-1 건조엑스중인동등, 우방자, 황금정량법에따라시험하였으며 3 batch 당 3 회반복분석하여평균값의 90% 이상으로기준을설정하였음 - YG-1의인동등중 Loganic acid 함량기준 YG-1 인동등 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Loganic acid Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 1.71 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %)

138 - YG-1 의인동등중 Sweroside 함량기준 YG-1 인동등 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Sweroside Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 2.67 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) YG-1 의인동등중 Loganin 함량기준 YG-1 인동등 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Loganin

139 Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) YG-1 의우방자중 Arctiin 함량기준 YG-1 우방자 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Arctiin Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g)

140 Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) batch 평균값 ( / 3) 기준 3 batch 평균값의 90% 이상 ( %) YG-1 의황금중 Baicalin+Baicalein 함량기준 YG-1 황금 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Baicalin Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) YG-1 황금 취한량 (mg) 피크면적 A S 표준액용량 순도 (%) Baicalein

141 Batch 1 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 2 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) Batch 3 검체취한량 (g) 피크면적 (A T ) 함량 (mg/g) 평균 (mg/g) YG-1의황금중 Baicalin + Baicalein의함량기준 (mg/g) Batch Baicalin Baicalein 합계 (mg/g) YG-B YG-B YG-B 평균값 YG-B YG-B YG-B 평균값 YG-B YG-B YG-B 평균값 batch 평균값 ( / 3) batch 평균값의 90% 이상 (6.0 90%) ) 임상시험계획서및 CRF 개발과임상시험자자료집 YG-1 의급성상기도감염에의한인후염임상 2 상 IND 심의신청을위하여임상시험전문 CRO 를선정하였으며, 임상시험프로토콜과 CRF 를작성하였음

142 가 ) 임상 CRO 선정 : 주식회사벨몬트리써치나 ) 임상시험제목급성인후염환자를대상으로 YG-1의 1g과 1.5g의유효성과안전성을평가하기위한위약대조, 무작위배정, 이중눈가림 2상임상시험 다 ) 임상시험프로토콜 의뢰자명제목실시기관수실시기관및시험책임자임상시험단계임상시험설계예상대상자수임상시험용 ( 유 ) 한풍제약급성인후염환자를대상으로 YG-1의 1g과 1.5g의유효성과안전성을평가하기위한위약대조, 무작위배정, 이중눈가림 2상임상시험 1개기관분당서울대학교병원호흡기내과김세중제 2 상무작위배정, 이중눈가림, 병행설계총 141명 - 중도탈락률 10% 고려함 시험약 : YG-1 정 (650mg 정중 YG-1 건조엑스 250mg)

143 의약품 임상시험목적 대조약 : 위약정일차목적급성인후염환자에서 YG-1의 1일 1g과 1.5g의군과대비하여평가한다이차목적 YG-1 1g의유효성을위약군과비교평가한다. 안전성과유효성을위약 YG-1 1.5g의유효성을위약군과비교평가한다일차평가변수 YG-1 투여 1회용량을 6회복용이후인후통완화평가척도 (STRRS) 를이용해평가한통증개선여부가중간정도 (3) 이상의호전을보이는비율 이차평가변수 YG-1 1일 1g 투여군, 1일 1.5g 투여군및위약군등세군간아래항목들을비교평가한다. [ 유효성평가변수 ] STRRS를이용해평가한통증개선정도 STPIS 통증평가도구를이용해평가한통증개선정도 VAS를이용해평가한연하곤란정도 (Difficulty Swallowing Scale, 평가변수 DSS) VAS 를이용해평가한목의부어오른정도 (Swollen Throat Scale, SwoTS) 시험자가평가한임상적인전반적인상 (Clinical Global Impression, CGI) 의정도 대상자평가한전반적인인상변화 (Patient Global Impression of Change, PGIC) 의정도 자가평가형보고를이용한시간별통증개선정도 [ 안전성평가변수 ] 임상시험기간동안발생하는이상반응건수 이상약물반응건수 진단의학적검사의분석 임상시험 모집단 활력징후, 신체검사 선정기준 및심전도결과분석

144 1) 만 19 세이상 69 세이하의성인 1. Tonsillo-pharyngitis Assessment-Korean version 상에서 5 점이상인자 2. 급성인후염증상이 3 일이하로지속된자 3. Center score 기준구강체온이 38 미만인자 4. STPIS 기준 66 점이상인자 5. 스크리닝이전급성인후염치료를받지않은자 6. 본연구에동의한자 ( 선정 / 제외 기준 ) 제외기준 1) 상기도및비강에만성적인염증성질환을갖고있어항생제를처방받는자 7. 구강내외상, 구강궤양및염증치료를위한 Benzydamine, Chlorhexidine gluconate 및염화세틸피리디늄성분의가글사용이지속적으로필요한자 8. 약물의흡수, 분포, 대사및배설에영향을미칠수있는외과적또는내과적상태에있는자 A. 위절제, 활동성위염, 위궤양, 위장관내출혈병력이있는자 8.1. 요로계협착또는배설장애가있는자 8.2. 간염, 간질환을앓고있는자 9. 천식및기관지의질환으로스프레이형기관지확장제를사용해야하는자 10. 스크리닝시점에서스테로이드를지속적으로복용해야하는자 11. 만성적인통증의질환이있어진통제를지속적으로복용해야하는자 12. 문맹으로평가지를수행할수없는자 13. 약물이나알코올에의존병력이있는자 14. 다음의실험실적검사결과의이상이있는자 간기능이상 : AST/ALT 가정상범위상한치의 1.5 배 신기능이상 : Serum Creatinine 이정상범위상한치의 1.5 배 혈액검사상의수치에서정상범위상한치의 1.5 배의비정상수치를보이는자 10) 약물의정제복용이어려운자 11) 스크리닝시점에서임산부, 수유부및임신가능성이있으면서물리적인피임방법즉, 자궁내장치, 경구피임제, 피임시술등을적용하지않고있는자. 단임상시험참여기간중명백히임신가능성이없는경우참여

145 임상시험방법 시험기간 통계분석방법 가능함. 12) 인동, 우엉, 황금등에알레르기가있는자 13) 스크리닝기준 4 주이내에다른약물임상시험에참여했었거나현재참여중인자. 본임상시험은급성인후염을앓은지 3일이내의환자이면서임상시험참여에동의하는환자를대상으로 YG-1 1g/day, 1.5g/day, 위약을각각이중눈가림상태로무작위배정하여 1일 3회 5일동안복용하게한다. 대상자들은약물을복용하기전과복용후각각 1일 3회급성인후염의초기증상의정도를평가하는평가설문지를작성하고 3일째방문하여증상의개선정도를평가한다. 대상자들은이후 2일을추가로약물을복용하고마지막 5일째에병원에방문하여안전성을위한검사와통증개선정도를평가한후모든임상시험절차를종료하게된다. 대상자의자가평가형통증일지는 5일동안작성후반납할예정이다. 본임상시험의기간은식품의약품안전처의임상시험승인일로부터마지막대상자의임상시험종료일로한다. 목표대상자수본연구의일차평가변수는시험약복용전대비 6회복용한이후의, 인후통완화평가척도 (STRRS) 를이용한, 통증개선정도이다. 위약군의경우, 위약효과로인해통증개선정도가약 5% 정도될것으로가정하고, YG-1 1g/day를복용하는시험군의경우에는 30% 정도의통증개선효과가나타날것으로기대한다. 양측유의수준 5% 하에서군당 42명의대상자수는이들두군간통증개선효과의유의한차이를발견해낼수있는검정력 90% 를보장해준다. 따라서보수적으로평가해세군에대해서각군당 42명씩총 126명의대상자가최종분석에 사용될것이다. 본연구에서는중도탈락율 10% 를고려해군당 47명씩총 141명의대상자들을등록하는것을목표로한다. 분석대상군유효성평가변수들에대해서는 Full Analysis Set (FAS) 분석대상군과 PP 분석대상군을사용해평가한다. FAS 분석대상군은무작위배정된모든대상자들중무작위배정이후최소한 1회이상시험약을복용한대상자들이고, PP 분석대상군은 modified ITT 분석대상군중계획서에충실하여중대한선정 / 제외기준을위반하지않고, 80% 이상의순응도를보인대상자들이다. 안전성평가변수들에대해서는무작위배정후

146 시험약을최소 1 회이상복용한모든대상자들로정의되는 Safety 분석대상군을사용한다. 통계분석의일반적원칙 유효성평가변수들에대해서는 FAS 분석대상군과 PP 분석대상군을모두사용해평가하되, 최종판정은 FAS 분석대상군의결과에따른다. 만일두군의결과가상이한경우에는그원인을파악한다. 모든유효성평가변수들에대한결측치는보정하지않는다. 모든통계분석은양측유의수준 5% 를사용한다. 교란요인보정을위한다변수분석은다중로지스틱회귀분석 (multiple logistic regression analysis) 및일반화추정방정식 (GEE, generalized estimating equation, 반복측정자료의경우 ) 을실시한다. 기타자세한내용은통계분석계획서 (SAP, statistical analysis plan) 에명시한다. 일차유효성평가변수에대한분석 Pearson s chi-square test를사용해세군간통증개선율을비교한다. 유의수준 5% 하에서세군간에유의한차이가나는경우에한해, 위약군대비 YG-1 1g 군및위약군대비 YG-1 1.5g 군간의통증개선율을각각비교한다. 이는닫혀진검정절차 (closed test procedure) 를사용하는것으로다중검정으로인한추가적인유의수준보정은필요로하지않는다. 12) YG-1 임상시험계획승인신청및획득 (IND 승인획득 ) 인후염치료제로개발한 YG-1은 [ 신조성의약품 ] 에해당하며, 임상시험계획승인신청을위한제출자료를확보하여식약처에제출하고최종승인을획득하였음. 표. 임상시험계획승인을위한제출자료의범위

147 임상시험계획승인신청 : 2014 년 12 월 4 일 임상시험계획승은획득 : 2015 년 3 월 6 일 그림. YG-1 임상시험계획승인통보공문및승인서

148 7. 진해및거담개선을위한기능성소재개발 1) 진해억제및거담소재 HAE-06의진해억제및거담활성평가가 ) 실험방법 1 진해억제활서평가각각의생약추출물로부터진해활성을검색할목적으로수컷 ICR 마우스 (6주령, 오리엔트바이오 ) 에약물을경구투여하고 30분후마우스를플레티시스모그래프챔버 (Buxco, U.S.A.) 에넣은후, 기침유발제 ( 시트르산 ) 를분무하여기침을유발시킴. 양성대조군으로는진해제로사용되고있는테오브로민 (50 mg/kg) 을사용하였으며, 0.4 M의시트르산에마우스를 10분간노출시키고이때발생하는기침수를 5초간격으로 10분간측정함 2 거담활성평가혼합추출물의거담활성을평가하기위하여, 양성대조약물 ( 암브록솔, ambroxol, Sigma), 시험약물을수컷랫트 (6주령, 오리엔트바이오 ) 에경구투여하고 30분후, 페놀레드를복강주사함. 30분후디에틸에테르를이용해마취시키고복부대동맥을절단하여방혈시킨후, 기관 (trachea) 전체를절제함. 분리된기관을 1 ml의생리식염수에넣어 30 분동안세척하였고, 10,000 rpm으로 5분간상온에서원심분리하여얻은상등액에 1 N 가성소다 (NaOH) 를첨가 ( 상등액 1 ml당 1N NaOH 0.1 ml 첨가 ). 이들에대한 546 nm에서의흡광도를측정하여배출된페놀레드의농도로서거담활성을평가함 나 ) 실험결과 1 HAE series 6종의진해억제활성혼합추출물을 200mg/kg의용량으로경구투약하고기침유발후기침수를측정한결과, 혼합추출물 HME 06은진해효과가확인됨. 더욱이, 양성대조군으로사용된기존의진해제테오브로민보다우수한기침수억제효과를나타냄을알수있음 Effect of HAE series on cough inhibition in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01, significantly different from the control group

149 2 HEA06의진해억제활성농도의존성평가 6종류의 HAE 혼합추출물중의진해억제활성검색결과, 가장효과가뛰어난 HAE 06에대한농도별시험을수행함. 혼합추출물 HAE 06의경우농도의존적으로 14.7, 23.5, 26.8% 의기침억제효과를나타내었으며, 기존진해제인테오브로민과유사한진해효능을나타냄 Effect of HAE 06 on cough inhibition in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 significantly different from the control group. 3 HAE series 6종의거담활성혼합추출물 HAE series 와양성대조약물로사용된암브록솔의거담능측정결과, phenol red 분비량은 HAE 04, 05 과 06 투여한 control 대비유의적인거담능의증가가관찰되었으며, 각각 1.7배, 1.3배, 2.0배증가를나타냄 Effect of HAE series on phenol red secretion in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 significantly different from the control group

150 4 HEA06의거담활성농도의존성평가 6종류의 HAE 혼합추출물중의거담활성검색결과, 가장효과가뛰어난 HAE 06에대한농도별시험을수행함. 거담능평가를위해양성대조약물로사용된암브록솔은대조군대비 3.0배 phenol red 분비증가를나타냄. HAE 06의처리시대조군대비각각 1.2, 1.4, 2.3배농도의존적인증가가확인됨 Effect of HAE 06 on phenol red secretion in vivo. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, ***p<0.001 significantly different from the control group. 2) 진해억제및거담소재 HAE-06의생리활성효능평가가 ) 실험방법 1 항산화효과측정 DPPH(Diphenylpicrylhydrazyl) 0.1 mm 용액을 8그룹으로처리함. 1 그룹은음성대조군으로설정하여어떤조작도하지않았으며, 2그룹은양성대조군으로설정하여 ascorbic acid 50 μm을처리함. 실험그룹에는추출물을각각 10 μg/ml, 30μg/mL, 100 μg/ml씩처리함. 520nm의파장에서흡광계를이용하여시료의색변화를정량화함 2 항염효과측정 : NO, TNF-α 함량측정혼합추출물의항염효과를확인하기위하여, 혼합추출물과 LPS를함께첨가한후, Raw cell 24시간배양한뒤, 24시간배양한후의배양액을수집하여, NO, TNF-a 분비량을 Griess reagent system 및 sandwich ELISA을이용한측정법을이용하여측정 3 항염효능및기전연구 Raw 에혼합물을 24 시간동안처리후세포를수집하여 lysis buffer(50 mm Tris Cl

151 , 1 mm EGTA, 1% Triton X-100 and 1 mm phenylmethylsulfonyl fluoride) 로단백질을추출하여정량함. 정량한단백질을 10% SDS-polyacrylamide gel에 20μg을주입하여 2시간동안 100v에서전기영동수행함. 분리된단백질을 80v로 2시간동안방치하여니트로셀룰로오스멤브레인에이동시킨후, 5% non-fat milk로비특이적단백질결합을방지함. 일차항체인 COX-2 polyclonal antibody를 1:5,000으로희석하여 24시간동안반응시킨후, 이차항체인 goat anti-rabbit IgG-horseradish peroxidase conjugate(bio-rad Laboratories, Hercules, CA) 를 1:1,000으로희석하여 2시간동안반응. 세번세척후 enhanced chemiluminescence(amersham Pharmacia Biotech, Inc., Piscataway, NJ) 시약으로필름에감광시켜 COX-2 단백을확인함 4 Carrageenan 유발족부종시험생리식염수에 1% 의농도로 λ-carrageenan을용해하여 0.1 ml를흰쥐의오른쪽뒷발발바닥중심부피하에주사하여부종을유발함. 혼합추출물은 50, 100, 200mg/kg의농도로투약, 양성대조약물인 dexamethasone(sigma) 은 1mg/kg으로경구투약함. 4일째시험물질투약후 60분뒤부종을유발시키고 0, 1, 2, 3 및 4시간에 Caliper를이용하여발의부종정도를측정함 나 ) 실험결과 1 HAE series 6종의항산화활성평가 6종의복합제와양성대조약물로사용된 L-ascorbic acid의항산화능을비교한결과, HAE 03은처리농도 100 μg/ml에서만 69.4% 의항산화능을나타내었으며, 그외그룹에서는 10 μg/ml의농도를제외한 30, 100 μg/ml에서 50% 이상의항산화능을나타냄. HAE 02, 04, 05, 06 고농도에서는실험에사용된 L-ascorbic acid 와유사한항산화효과를보임 Antioxidant acitivity of HAE series. The value were presented as means ± S.D

152 2 HAE series 6 종의면역세포보호활성 HAE series 6 종의면역세포보호활성을평가하였음. 실험결과모든혼합추출물은 HAE series 6 종은 μg / ml에서세포독성을나타내지않았음. Effecf of HAE series on the cells viability. Each bar represented as mean ± S.D. 3 HAE series 6종의항염효능평가 (In vitro) 대식세포가염증반응시생산하는 NO로부터산화된형태인 NO2 농도를측정한결과, LPS를단독으로처리하였을때 NO의농도가 45.3 μm까지증가하였음. 복합제 HAE 01, 02, 03, 04, 06의 100 μg/ml 처리군에서는 LPS에의해증가된 NO의농도를각각 31.1, 35.1, 24.5, 22.5, 41.9% 감소하는것으로나타남. 대식세포가생산하는대표적인염증사이토카인인 TNF-α의농도는 LPS를단독으로처리하였을때의농도는 3.2 ng/ml까지증가하지만, 복합제 HAE 01, 04, 06 함께처리하였을때 TNF-α는고농도처리군에서각각 17.1, 31.2, 30% 감소함. HAE 06는 10 μg/ml 처리시 11.3%, 30 μg/ml 처리시 16.6%, 100 μg/ml 처리시 30% 로농도의존적인감소를보임 Anti-inflammatory effects of HAE series in LPS-stimulated macrophages. Conc (μg/ml) NO (μm) TNF-α (ng/ml) NOR ± ± 0.03 LPS ± ± ± ± 0.13 HAE ± ± 0.15 * ± 1.35 * 2.65 ± 0.14 * ± ± 0.43 HAE ± ± ± 4.35 * 2.91 ± ± ± 0.65 HAE ± 4.30 * 2.74 ±

153 HAE 04 HAE 05 HAE ± 5.13 * 2.84 ± ± 3.46 * 2.88 ± ± 3.35 * 3.12 ± ± 1.35 * 2.20 ± 0.14 * ± ± ± ± ± ± ± ± ± 2.35 * 2.67 ± 0.25 * ± 3.14 * 2.24 ± 0.38 * 4 HAE06의항염효능평가 (In vitro) 10 μg/ml부터세포독성이나타나지않은고농도인 300 μg/ml까지 HAE 06을처리하였을때 LPS로유발된 NO와 TNF-α 생성을농도의존적으로감소시키는것을확인함 Inhibition of (A) NO and (B) TNF-α production by HAE 06 in LPS-stimulated macrophage. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01 significantly different from the LPS group. 5 HAE06의항염기전 (In vitro) 항염기전을확인하기위해 western blot을이용하여 COX-2의발현을측정한결과 LPS에의해증가된 COX-2의단백질발현양이농도의존성있게감소하였으며, β-actin의 band density 비율에따라 COX-2의단백질발현을고농도에서는 44.8% 저해함

154 Inhibition of COX-2 expression by HAE 06 in LPS-stimulated macrophage. The value were presented as means ± S.D. ***p<0.001 significantly different from the LPS group. 6 HAE06 의항염효능평가 Carrageenan 으로족부종유발 4 시간후발의두께가 2.36 배증가됨. HAE mg/kg 투여한그룹에서 1~4 시간까지유의적인소염효능을나타냄. 그룹에서는 2 시간째부터유의적인소염효능을나타내었음 50 mg/kg 을투여한 Anti-inflammatory effects of HAE 06 on Rat's Induced by Carrageenan. The value were presented as means ± S.D. *p<0.05, **p<0.01 significantly different from the LPS group. 7 HAE series 6 종의항히스타민효능평가 비만세포인 RBL-2H3 세포에 HAE series 6 종을 10, 30, 100 μg/ml 처리한후 MTT assay 를 이용하여세포독성을측정함. HAE 01, 02 의 100 μg/ml 처리그룹에서세포독성이나타남

155 Effecf of HAE series on the cells viability. Each bar represented as mean ± S.D. *p<0.05 significantly different from the untreated group. 항원과항체가비만세포에반응하면세포내에서히스타민, 프로스타글란딘등의과립물질이세포외로분비하게되는데, 항알레르기효과를확인하기위해서는세포외로분비된과립의양을측정함으로써확인할수있음. 탈과립의지표로사용되고있는 β-hexosaminidase효소의분비를측정함으로 HAE series의항알레르기효과를측정함. HAE series 알레르기에대한억제효능은나타나지않음 Effect of HAE series on β-hexosaminidase release of anti-dnp IgE-primed RBL-2H3 cells that were stimμlated with DNP-HSA. Each bar represented as mean ± S.D. *p<0.05 significantly different from the untreated group. TNF-α는중요한염증매개인자중하나로서어떤환경에서든생체에매우해로운영향을줌. 비만세포에서TNF-α가분비하게되면혈관내피세포의점착분자의발현을증가시켜호산구및 T 림프구의표적기관으로의유입을촉진시키며, 화학매체들의생산을유도하는역할을하게됨. 그러므로항알레르기효과를갖기위해서는 TNF-α의분비를

156 억제시켜야하는데, HAE series 는 TNF-α 의분비가억제되지않음 Effects of HAE series on TNF-α production from RBL-2H3 cells. Each bar represented as mean ± S.D. *p<0.05 significantly different from the untreated group. 3) HAE-06의호흡기계병원성미생물에대한방어능가 ) 실험방법 1 항박테리아활성평가혼합추출물의호흡기계병원성세균에대한항박테리아활성을측정하기위해각조성물을멸균 D.W. 에녹여 Disk agar diffusion assay 법으로측정하였음. 상기도감염을유발하는 Staphylococcus spp. 를도말하고혼합추출물을각각희석하여 6mm 직경가진 paper disk에로딩한후 37 에서 24간배양후생육저지대 (Inhibition zone) 의직경을측정함. 이때 positive control로 penicillin/ streptomycin을사용하고, negative control로는동량의 D.W. 를사용 2 항바이러스활성평가혼합추출물의호흡기계바이러스에대한항바이러스활성을측정하기위해 H5N1 influenza 바이러스를이용하여 TCID 50 방법으로바이러스감염가를측정하여효과를 SRB분석법으로판정함. 각각에 10% trichloroacetic acid (TCA) 를 100μl씩검사한후 1시간동안 4 에방치하고증류수로수회세척함. 실온에서건조시킨후 1% acetic acid에녹인 0.4% SRB (sulforhodamineb) 용액 100μl를첨가해 30분동안염색시킴. 염색제를충분히녹인후 560nm에서흡광도를측정함. 각처리군은바이러스를처리하지않은군 (A), 혼합추출물만처리한군 (B), 바이러스만을처리한군 (C), 바이러스와혼합추출물을같이처리한군 (D) 으로표기하였고각각혼합추출물의세포독성비율과생약추출물의바이러스

157 증식억제비율을계산함 나 ) 실험결과 1 HAE series 6 종의항박테리아활성평가 모든시험약물에서상기도감염을유발하는 S. aureus 에대한항균활성은나타나지않음 Antibacterial activity of HAE series 2 HAE series 6 종의항바이러스효능평가 HAE 추출물은 MDCK세포에대해높은세포독성을나타내었으며, 모든추출물에서 H5N1 influenza virus에대한항바이러스효능은보이지않음 Group 세포독성 (%) 바이러스증식억제능 (%) HAE 1 HAE 2 HAE 3 HAE 4 HAE 5 30 μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m L μg/ml μg/m

158 HAE 6 L 30 μg/ml μg/m L ) HAE-06의기관지이완효능및기전연구가 ) 실험방법 1 백서기관지의장력측정준비되어진백서의기관지절편은 orgam chamber 안 95 % O 2,5 % CO 2 혼합가스로포화시킨 37.4 의 Krebs 용액에서고정시킨후 isometric tension을 force-displacement transducer (Grass FT 03, GRASS Instrument, MA, USA) 가장착된생리기록계 (Grass Model 7E, Grass Instrument, MA, USA) 를이용하여측정함. 이때 heat/circulator (Model CW-10GL, JEIO TECH, Korea) 에의해일정한온도를유지함. 고정된기관지는 tension을증가시켜 2 g의 optimum tension에도달하도록하여안정화함. 본실험방법으로는 100 μm 의 acetylcholine으로수축을유도하여평형에도달하는시간인 5분후시험추출물 HEA-06 추출물을 0.5, 0.75, 1, 2.5, 5 mg/ml을점차누적적으로투여하였으며각농도별로 10분씩관찰하여기관지의긴장도변화를측정하였다. 또한기전을살펴보기위해서여러가지차단제를본실험에들어가기 20분전전처리해준후같은방법으로 100 μm의 acetylcholine으로수축을유도한후 HEA-06을농도별로살펴보았음. 유발한수축력을 100% 로가정한후시험물질투여군의이완율 (%) 을산출함. 2 camp의측정기관지절편을 95% O 2, 5% CO 2 혼합가스를공급해주면서 Krebs 용액에서 30분간평형을시킨후 100 μm 3-isobutyl-1-methylxanthine (IBMX) 과 100 μm의 acetylcholine을넣어 5 분간더평형을시킨후농도별로 HEA-06 추출물 (1, 2.5, 5 mg/ml) 을처리하여 10분간반응을시켰다. 기관지조직은바로액체질소에넣어반응을정지시킨후 -70 에보관한후 camp 농도측정에이용하였다. 무게 (weight) 를측정한혈관조직을 0.1M HCl 존재하에서균질화시킨후 13,000 g에서 15분간원심분리하여얻은상층액을 Dirict camp ELISA kit (Enzo, ADI ) 를이용하여측정하였다. 나 ) 실험결과 1 HAE-06 추출물의농도의존성기관지확장효과 HEA-06 추출물의이완효과를알아보기위하여기관지평활근을 Acetylcholine으로수축을유도한후농도의존성효과를알아본결과, 5 mg/ml농도에서 69.8 ± 5.96 % 의이완효과가나타났으며, 기전을알아보고자실험을더진행하게되었다

159 Relative Relaxation (%) HAE - 06 (g/ml) 2 Adenyl cyclase/pka(protein kinase A) 효과평활근은아데닐레이트사이클라아제 (adenylate cyclase, AC) 의활성에의하여생성된 camp가 PKA를화성화시킴으로써 Ca 2+ 레벨을감소시킴으로써이완을유도한다고알려져있다. 이러한 AC에직접작용하여활성을유도하는물질인 forskolin (10 μm) 을전처리한후에 HEA-06 추출물의이완효과를알아본결과, 이완효과가 ± 8.96% 로현저히증가하는것을확인할수있었다. 반면에 AC 차단제인 SQ22536 (100 μm) 을전처리한후 HEA-06 추출물의이완효과를알아본결과유의성있는차단효과를보였다. 또한 PKA 억제제로알려진 KT5720을 1 또는 10 μm 전처리하여 HEA-06 추출물의이완효과를알아본결과 10 μm 농도에서이완효과가차단됨을확인할수있었다. 3 K + 통로차단시이완효과세포내 Ca 2+ 증가하면수축이유도되는데이때세포외 K + 농도가증가한다. K + 의세포내유출은세포막의과분극을일으켜 voltage-sensitive Ca 2+ channel의불활성화로이어져평활근세포내 Ca 2+ 의농도감소를초래하게되어이완을유발한다. 이러간기전을바탕으로 K + channel에영향을받아 Ca 2+ 의유입이감소하여이완효과가일어나는지알아기위하여

160 실험을진행하였다. HEA-06 추출물의기관지이완효과가 K + 통로와영향이있는지알아보기위하여비선택적 K + 통로억제제인 TEA (100 μm) 와 4-aminopyridine (100 μm) 전처리하여살펴본결과, HEA-06 추출물의이완효과가유의하게차단되는것으로확인하였다. -40 Relative Relaxation (%) Control TEA ( 10-4 M ) 4-AP ( 10-4 M ) ** * HAE - 06 (g/ml) 4 Ca 2+ 통로차단시이완효과평활근세포내 Ca 2+ 농도가증가하면 calmodulin과결합하여 myosin light chain (MLC) 의인산화를촉진시켜평활근을수축시킨다. 따라서 HEA-06 추출물의이완효과가 L형 Ca 2+ 통로와의연관성을알아보기위하여 L형 Ca 2+ 통로차단제인 verapamil (1 μm) 과 diltiazem (1 μm) 을전처리하여진행한결과 HEA-06 추출물의이완효과가차단되는것을확인하였다. 평활근의수축에있어서 Ca²+은중요한역할을한다. 근소포체 (sarcoplasmic Reticulum) 에서의저장된 Ca²+의방출은리아노딘수용체 (RyR) 라고하는 Ca²+ 방출통로를거쳐일어난다. 근소포체내 Ca 2+ 을방출시키는데영향을미치는리아노딘수용체 (ryanodine receptor) 선택적차단제인 ryanodine (1 μm) 과근소포체 Ca 2+ -ATPase 선택적차단제인 thapsigargin (1 μm) 을전처리하여 HEA-06 추출물의기관지이완효과를살펴보았다. 그결과 HEA-06 추출물의이완효과가차단되는않는것을확인할수있었다

161 5 자율신경계수용체차단시이완효과자율신경계중 β 2 -아드레날린성수용체는기관지를이완시킨다고알려져있다. HEA-06 추출물의기관지확장효과가 β-아드레날린성수용체를통해일어나는지알아보기위하여비선택적 β-아드레날린성길항제인 propranolol (1 μm) 을전처리한후기관지이완효과를살펴본결과유의성있는차단효과를보였다. 그러나항무스카린성약물인 methoctramine (1 μm) 을처리한후기관지이완효과를살펴본결과유의성있는차이를보이지않았다. 6 Cyclooxygenase (COX) 차단시이완효과혈관평활근의긴장도를조절하는또다른내인성인자로 PGI 2 가있다. PGI 2 는 arachidonic acid로부터 COX에의해생성되고, 이때생성된 PGI 2 는이완작용을갖는다. 따 라서 HEA-06 추출물에의한이완효과가 PGI 2 의생성과관련이있는지알아보기위하여 비선택적 COX 억제제인 indomethacin (1 μm) 을전처리한결과차단효과를보임을확인 할수있었다. -40 Relative Relaxation (%) Control Indomethacin (10-6 M) ** HAE - 06 (g/ml)

162 7 Phosphoinositide 3 kinase (PI3K)/protein kinase B (Akt) 경로차단시이완효과 PI3K/Akt 경로는대표적으로알려져있는 NO/cGMP관련평활근이완기전이다. HEA-06 추출물이이러한경로를통한이완효과를나타나는지알아보기위하여 PI3K 저해제로알려져있는 wortmannin (1 μm) 을전처리하여효과를살펴본결과, 차단되지않음을확인하여 HEA-06 추출물의이완작용은 Akt/PI3K 경로와는무관한것으로사료된다. Relative Relaxation (%) Control Wortmannin ( 10-6 M ) HAE - 06 (g/ml) 8 산화질소합성효소및 sgc (soluble guanylate cyclase) 억제시이완효과 HEA-06 추출물에의한기관지평활근이완효과가산화질소계와 cgmp의관련성을알아보기위하여비특이적산화질소억제제인 L-NAME (100 μm) 과세포질 sgc 억제제인 ODQ (10 μm) 를전처리한후 HEA-06 의이완효과를측정하였다. 그결과, 이완효과가차단되지않음을확인할수있었다

163 9 camp 생성효과기관지조직에서 camp의생성에 HEA-06 추출물이영향을미치는지관찰하기위하여농도의존적인 camp 생성량을측정하였다. 그결과 HEA-06 추출물을처리하지않은군에비하여농도의존적으로 camp생성량이 control군에비하여유의성있는차이를보였다. 300 camp - Levels ( % of contol ) ** *** 0 HEA - 06 ( mg/ml )

164 5) 구조결정, 물리화학적및약제학적성질및조성 가 ) 원료의특성 HAE-06 의성상 HAE-06 건조엑스 HAE-06 정제 나 ) 원료의지표물질 1 인동지표물질 구조 일반명 Loganin Loganic acid Sweroside 분자식 C 17 H 26 O 10 C 16 H 24 O 10 C 16 H 22 O 9 분자량 성상 White powder White powder White powder 제조 판매회사명 Sigma Sigma Sigma 2 황금지표물질 구조 일반명 Baicalin Baicalein 분자식 C 21 H 18 O 11 C 15 H 10 O 5 분자량 성상 Yellow powder Yellow-green crystalline power 제조 판매회사명 Sigma Sigma

165 지표물질설정근거 - 바이칼린, 바이칼레인 : 대한민국약전 (KP) 의약품각조 2부황금중정량법을근거로설정하였음. - 로가닌 : 대한민국약전 (KP) 의약품각조 2부인동중정량법을근거로설정하였음. 다 ) 원료의기준및시험방법 1 인동 기준성상이약은잎및덩굴성줄기로잎은원형으로전연이며길이 3~7 cm, 너비 1~3 cm로짧은잎자루가붙어있다. 윗면은녹갈색, 아랫면은연한회록색을띠고확대경으로볼때양면에부드러운털을볼수있다. 줄기는긴원기둥모양이고, 가지가많이갈리며, 보통이리저리얽혀서다발을이루고있으며, 지름 mm이다. 바깥면은적갈색 어두운갈색이고, 회녹색인것도있다. 겉껍질은벗겨져떨어져나가기쉽다. 가지위에는마디가많고, 마디사이는길이 6 9 cm이다. 질은약하여자르기쉽다. 잘린면은황백색이고가운데가비어있다. 이약의횡단면을현미경으로볼때줄기는수선이 1 2 열의세포로되어있다. 도관은지름이약 160 μm에이르고황갈색또는적갈색물질이들어있다. 목부섬유는다각형이고세포벽은아주두껍다. 목부유세포는벽이매우두껍고목화되었으며옥살산칼슘방정이들어있는것도있다. 수부는유세포가불규칙한다각형이고크기가일정하지않으며벽은약간목화되었고벽공이있다. 이약은거의냄새가없고맛은약간떫고후에쓰다. 확인시험이약의가루및인동표준생약 1 g을달아희석시킨메탄올 (1 2) 10 ml를넣어약 10 분간초음파추출한다음여과한여액을검액및인동표준생약표준액으로한다. 이들액을가지고박층크로마토그래프법에따라시험한다. 검액및인동표준생약표준액 10 μl씩을박층크로마토그래프용실리카겔에점적하여아세트산에틸 메탄올 포름산혼합액 (96 : 10 : 0.7) 을전개용매로하여약 10 cm전개한다음박층판을바람에말린다. 여기에묽은황산시액을고르게뿌린다음 105 에서가열할때검액에서얻은여러개의반점은인동표준생약에서얻은반점과색상및 Rf 값이같고, 그중 Rf 값 0.25 부근에서로가닌의반점을각각확인할수있다

166 순도 이물이약은약 5 mm 이상의줄기가섞여있지않다. 중금속 - 납 5 ppm 이하. - 비소3 ppm 이하. - 수은0.2 ppm 이하. - 카드뮴 0.3 ppm 이하. 잔류농약 - 총디디티 (p,p'-ddd, p,p'-dde, o,p'-ddt 및 p,p'-ddt의합 ) 0.1 ppm 이하. - 디엘드린 0.01 ppm 이하. - 총비에이치씨 (á,â,ã 및 ä-bhc의합 ) 0.2 ppm 이하. - 알드린 0.01 ppm 이하. - 엔드린 0.01 ppm 이하. 이산화황 30 ppm 이하. 건조감량 : 12.0 % 이하 (6시간) 회분 : 9.0 % 이하산불용성회분 : 1.0% 이하엑스함량묽은에탄올엑스 : 12.0 % 이상정량 : 이약을건조한것은정량할때로가닌 (C 17 H 26 O 10 : ) 0.1 % 이상을함유한다. 저장법 : 밀폐용기. 시험방법성상 : 육안으로확인한다. 확인시험 : 이약을가루로하고대한민국약전 인동 중확인시험법에따라시험한다. 순도 이물 : 이약은토사등의이물이섞여있어서는안된다. 중금속 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의중금속기준및시험방법에따라시험한다. 잔류농약 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류농약기준및시험방법에따라시험한다. 잔류이산화황 : 식약청고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류이산화황시험방법에따라시험한다. 건조감량 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중건조감량시험법에따라시험한다. 회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중회분항에따라시험한다

167 산불용성회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중산불용성회분시험법에따라시험한다. 엑스함량묽은에탄올엑스 : 대한민국약전일반시험법생약시험법엑스함량중묽은에탄올엑스함량항에따라시험한다. 정량이약의가루약 1.0 g을정밀하게달아희석시킨메탄올 (7 10) 10 ml를넣어 30 분간초음파추출한다음여과하여검액으로한다. 따로로가닌표준품약 10 mg을정밀하게달아메탄올에녹여정확하게 100 ml로하여표준액으로한다. 검액및표준액 10 ìl 씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액및표준액의피크면적 A T 및 A S 를측정한다. 로가닌 (C 17 H 28 O 10 ) 의양 (mg/g) = 로가닌표준품의양 (mg) A T /A S 1/10 [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 254nm) 컬럼 : 안지름 4~6 mm, 길이 15~25 cm 인스테인레스강관에입자크기가 5~10 μm인 액체크로마토그래프용옥타데실실릴화한실리카겔을충전한다. 이동상 : A) 물 메탄올 포름산혼합액 (90 : 10 : 0.1) B) 메탄올 물 포름산혼합액 (90 : 10 : 0.1) 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) 유량 : 1 ml/min 2 황금 기준성상이약은뿌리로원뿔모양이고비틀어져굽어있으며, 길이 8 25 cm, 지름 1 3 cm 이다. 바깥면은황갈색또는진한노란색이고, 혹모양의가는뿌리자국이드문드문있다. 위쪽에는비교적거칠고비틀어져굽어있는세로주름또는불규칙한그물무늬가있다. 질은단단하면서취약하고절단하기쉽다. 자른면은노란색이고, 중심부는적갈색이다. 햇수가오래된것은뿌리의가운데가썩어있거나비어있고, 어두운갈색또는적갈색을

168 나타낸다. 이약은냄새가거의없고맛은약간쓰다. 확인시험 이약의가루 0.5 g을달아에테르 20 ml를넣고환류냉각기를달고 5 분간가열하고식힌다음여과한다. 여액을증발하여얻은잔류물에에탄올 10 ml를넣어녹이고그 3 ml에묽은염화철 (Ⅲ) 시액 1~2 방울을넣으면액은회녹색을띠고나중에자갈색으로변한다. 이약의가루및황금표준생약 1 g을달아각각아세트산에틸 메탄올혼합액 (3 : 1) 30 ml를넣고환류냉각기를달고수욕에서 30 분간가온한다음여과한여액을증발건고한다. 잔류물을메탄올 5 ml에녹여검액및황금표준생약표준액으로한다. 이들액을가지고박층크로마토그래프법에따라시험한다. 검액및황금표준생약표준액 2 μl씩을박층크로마토그래프용실리카겔 ( 형광제첨가 ) 을써서만든박층판에점적한다. 다음에아세트산에틸 메탄올 물혼합액 (100 : 17 : 13) 을전개용매로하여약 10 cm 전개한다음박층판을바람에말린다. 여기에묽은황산시액을고르게뿌린다음 105 에서가열할때검액에서얻은여러개의반점은황금표준생약표준액에서얻은반점과색상및 Rf 값이같다. 순도 중금속 - 납 5 ppm 이하. - 비소3 ppm 이하. - 수은0.2 ppm 이하. - 카드뮴 0.3 ppm 이하. 잔류농약 - 총디디티 (p,p'-ddd, p,p'-dde, o,p'-ddt 및 p,p'-ddt의합 ) 0.1 ppm 이하. - 디엘드린 0.01 ppm 이하. - 총비에이치씨 (á,â,ã 및 ä-bhc의합 ) 0.2 ppm 이하. - 알드린 0.01 ppm 이하. - 엔드린 0.01 ppm 이하. 이산화황 30 ppm 이하. 건조감량 15.0 % 이하. 회분 : 6.0 % 이하. 산불용성회분 : 1.0 % 이하. 정량법 : 이약은정량할때환산한건조물에대하여바이칼린 (C 21 H 18 O 11 : ), 바이칼레인 (C 15 H 10 O 5 : ) 및우고닌 (C 16 H 12 O 5 : ) 의합 10.0 % 이상을함유한다

169 저장법밀폐용기. 시험방법성상 : 육안으로확인한다. 확인시험이약을가루로하고대한민국약전의 황금 중확인시험법에따라시험한다. 순도 - 중금속 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의중금속기준및시험방법에따라시험한다. - 잔류농약 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류농약기준및시험방법에따라시험한다. - 잔류이산화황 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류이산화황시험방법에따라시험한다. 건조감량 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중건조감량시험법에따라시험한다. 회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중회분시험법에따라시험한다. 산불용성회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중산불용성회분시험법에따라시험한다. 정량법이약의가루약 0.5 g을정밀하게달아희석시킨에탄올 (7 10) 40 ml를넣고환류냉각기를달고 1 시간가열한다음여과한다. 잔류물에희석시킨에탄올 (7 10) 40 ml를넣어같은방법으로조작한다. 여액을모두합하여희석시킨에탄올 (7 10) 을넣어정확하게 100 ml로하여검액 1로한다. 이액 2 ml를취하여희석시킨에탄올 (7 10) 을넣어정확하게 20 ml로하여검액2로한다. 따로바이칼린표준품 ( 미리실리카겔데시케이터에서 24 시간이상건조한다 ) 약 10 mg, 바이칼레인표준품 ( 미리실리카겔데시케이터에서 24 시간이상건조한다 ) 약 10 mg 및우고닌표준품 ( 미리실리카겔데시케이터에서 24 시간이상건조한다 ) 약 10 mg을정밀하게달아각각메탄올을넣어정확하게 20 ml로한다. 이들액을각각 2 ml를정확하게취하여희석시킨에탄올 (7 10) 로정확하게 20 ml로하여표준액으로한다. 검액 1, 검액 2 및표준액 10 μl씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액 1중바이칼레인및우고닌의피크면적 A Tb 및 A Tc 과검액 2중바이칼린의피크면적 A Ta 및표준액중바이칼린, 바이칼레인및우고닌의피크면적 A Sa, A Sb 및 A Sc 를측정한다. 바이칼린 (C 21 H 16 O 11 ) 의양 (mg/g) = 바이칼린표준품의양 (mg) A Ta /A Sa 5 바이칼레인 (C 15 H 10 O 5 ) 의양 (mg/g) = 바이칼레인표준품의양 (mg) A Tb /A Sb 1/

170 우고닌 (C 16 H 12 O 5 ) 의양 (mg/g) = 우고닌표준품의양 (mg) A Tc /A Sc 1/2 [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 277 nm) 칼럼 : 안지름약 4~6 mm, 길이 15~25 cm 인스테인레스강관에 5~10 μm의 액체크로마토그래프용옥타데실실릴실리카겔을충전한다. 칼럼온도 : 40 이동상 : A) 희석시킨아세트산 (1 100) B) 아세토니트릴 메탄올혼합액 (7 : 3) 의 1 % 아세트산액 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) 유량 : 1 ml/min 시스템적합성시스템의성능 : 바이칼린표준품, 바이칼레인표준품, 우고닌표준품및파라옥시벤조산메틸 2 mg씩을달아각각메탄올에녹여 100 ml로한다. 이액 10 μl를가지고위의조건으로조작할때파라옥시벤조산메틸, 바이칼린, 바이칼레인, 우고닌의순서로유출하고각각의피크가완전하게분리되도록농도구배조건을조정한다. 시스템의재현성 : 표준액 10 ìl씩을가지고위의조건으로시험을 6 회반복할때바이칼린, 바이칼레인및우고닌피크면적의상대표준편차는 1.5 % 이하이다. 3 사삼 기준성상이약은뿌리로원뿔모양 ~ 원기둥모양이고약간구부러졌으며길이 7 ~ 27 cm, 지름 8 ~ 30 mm이다. 바깥면은황백색또는연한황갈색이고움푹패인곳에는거친껍질이남아있기도하다. 뿌리의머리쪽에는깊게가로로난주름이많고이주름은둥근고리

171 모양을이루고있으나불연속적이다. 아래쪽에는세로무늬와세로홈이있다. 질은가볍고 성글며쉽게꺾인다. 꺾은면은평탄하지않고황백색이며갈라진틈이많다. 이약은냄새가약간있고맛은약간달다. 확인시험 이약의가루0.2 g에아세테이트 2 ml를넣고수욕에서 2분간가온한다음여과한여액 1 ml에황산 0.5 ml를조심스럽게넣을때접계면은적갈색을나타낸다. 이약의가루 2.0 g을달아메탄올 30 ml를넣고환류냉각기를달고 1시간가열한다음여과한다. 여액을감압농축한다음메탄올 1 ml에녹여검액으로한다. 이액을가지고박층크로마토그래프법에따라시험한다. 검액 6 μl를박층크로마토그래프용실리카겔을써서만든박층판에점적한다. 다음에시클로헥산 아세트산에틸혼합액 (3 : 1) 을전개용매로하여약 10 cm전개한다음박층판을바람에말린다. 여기에묽은황산시액을고르게뿌린다음 105 에서10 분간가열할때 Rf 값 0.3 부근에적갈색의반점을볼수있다. 순도시험 중금속 - 납 5 ppm 이하. - 비소3 ppm 이하. - 수은0.2 ppm 이하. - 카드뮴 0.3 ppm 이하. 잔류농약 - 총디디티 (p,p'-ddd, p,p'-dde, o,p'-ddt 및 p,p'-ddt의합 ) 0.1 ppm 이하. - 디엘드린 0.01 ppm 이하. - 총비에이치씨 ( 총 BHC : á,â,ã 및 ä-bhc의합 ) 0.2 ppm 이하. - 알드린 0.01 ppm 이하. - 엔도설판 (Endosulfan : á,â-엔토설판및엔도설판설페이트의합 ) 0.2 ppm 이하. - 엔드린 0.01 ppm 이하. 이산화황 30 ppm 이하. 건조감량 : 14.0 % 이하 (6시간). 회분 : 5.5 % 이하. 산불용성회분 : 1.5 % 이하. 엑스함량묽은에탄올엑스 : 25 % 이상. 저장법 : 밀폐용기

172 시험방법 성상 : 육안으로확인한다. 확인시험 이약을가루로하고대한민국약전외한약 ( 생약 ) 규격집의 사삼 중확인시험법에따라 시험한다. 순도 중금속 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의중금속기준및시험방법에따라시험한다. 잔류농약 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류농약기준및시험방법에따라시험한다. 잔류이산화황 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류이산화황시험방법에따라시험한다. 건조감량 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중건조감량시험법에따라시험한다. 회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중회분시험법에따라시험한다. 산불용성회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중산불용성회분시험법에따라시험한다. 엑스함량묽은에탄올엑스 : 대한민국약전일반시험법, 생약시험법, 엑스함량중묽은에탄올엑스함량항에따라시험한다. 4 옥죽 기준성상이약은뿌리줄기로긴원기둥모양이고대게납작하며때로가지가갈려있고길이 4 18 cm, 지름 3 16 mm이다. 바깥면은황백색또는연한황갈색이고반투명하며세로주름및약간볼록한돌림마디가있다. 또한질은단단하지만부서지기쉽거나약간물렁물렁하고쉽게자를수있다. 자른면은각질모양이거나과립성이다. 이약은특유한냄새가약간있고맛은달고씹으면끈적끈적하다. 순도시험 중금속

173 - 납 5 ppm 이하. - 비소3 ppm 이하. - 수은0.2 ppm 이하. - 카드뮴 0.3 ppm 이하. 잔류농약 - 총디디티 (p,p'-ddd, p,p'-dde, o,p'-ddt 및 p,p'-ddt의합계 ) 0.1 ppm 이하. - 디엘드린 0.01 ppm 이하. - 총비에이치씨 (á,â,ã 및 ä-bhc의합계 ) 0.2 ppm 이하. - 알드린 0.01 ppm 이하. - 엔드린 0.01 ppm 이하. 이산화황 30 ppm 이하. 회분 6.0 % 이하. 산불용성회분 3.0 % 이하. 엑스함량묽은에탄올엑스 12.0 % 이상. 저장법밀폐용기. 시험방법 성상 : 육안으로확인한다. 순도 중금속 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의중금속기준및시험방법에따라시험한다. 잔류농약 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류농약기준및시험방법에따라시험한다. 잔류이산화황 : 식약처고시생약등의잔류 오염물질기준및시험방법중생약등의잔류이산화황시험방법에따라시험한다. 회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중회분시험법에따라시험한다. 산불용성회분 : 대한민국약전일반시험법생약시험법중산불용성회분시험법에따라시험한다. 엑스함량묽은에탄올엑스 : 대한민국약전일반시험법생약시험법엑스함량중묽은에탄올엑스함량항에따라시험한다

174 원료명인동황금사삼옥죽대한민국약전외대한민국약전외규격대한민국약전대한민국약전한약 ( 생약 ) 규격집한약 ( 생약 ) 규격집 1. 성상 적합 적합 적합 적합 2. 확인시험 확인 확인 확인 - 3. 순도시험 1) 이물 섞여있지않음 - - Pb 2.54 ppm Pb 1.54 ppm Pb 1.74 ppm Pb 1.83 ppm 2) 중금속 As 0.13 ppm As 0.64 ppm As 0.07 ppm As 불검출 Hg 0.02 ppm Hg 0.00 ppm Hg 0.00 ppm Hg 0.00 ppm Cd 0.39 ppm Cd 0.19 ppm Cd 0.21 ppm Cd 0.06 ppm 3) 잔류농약 불검출 불검출 불검출 - 4) 이산화황 불검출 불검출 불검출 - 4. 건조감량 10.7 % 10.3 % 5.52 % - 5. 회분 2.3 % 2.3 % 8.14 %( 부적합 ) 2.29 % 6. 산불용성회분 0.2 % 0.2 % 0.11 % 0.17 % 7. 묽은에탄올엑스 15.3 % 15.9 % % % 8. 함량 로가닌 0.5 % Baicalin,Baicalein, Wogonin의합 15.9 % - - 라 ) 원료의약품에관한자료 1 HAE-06 건조엑스 ( 별규 ) 이약은황금 [ 속썩은풀 Scutellaria baicalensis Georgi ( 꿀풀과 Labiatae) 의뿌리 ], 인동 [ 인동덩굴Lonicera japonica Thunberg ( 인동과 Caprifoliaceae) 의잎및덩굴성줄기 ], 사삼 [ 잔대 Adenophora triphylla var. japonica Hara 또는사삼 ( 沙蔘 ) Adenophora stricta Miq. ( 초롱꽃과 Campanulaceae) 의뿌리 ], 옥죽 [ 둥굴레Polygonatum odoratum Druce var. pluriflorum Ohwi 또는기타동속근연식물 ( 백합과 Liliaceae) 의뿌리줄기 ] 를 30% 주정과 3% 빙초산용액으로추출하여얻은건조엑스이다. 이약은정량할때건조엑스 1.0 g에대하여황금중바이칼린 (C 21 H 18 O 11 : ) 및바이칼레인 (C 15 H 10 O 5 : ) 의합 34.5 mg/g 이상, 인동중로가닌 (C 17 H 26 O 10 : ) 14.4 mg/g 이상, 로가닉산 (C 16 H 24 O 10 : ) 4.9 mg/g 이상, 스웨로사이드 (C 16 H 22 O 9 : ) 3.8 mg/g 이상을함유한다

175 제조방법인동 (KP) 황금 (KP) 사삼 (KHP) 옥죽 (KHP) 위생약을정선하여약전통칙절도및분말도에따라조절로한다음원료약품의분량대로각생약을달아추출기에넣고 10배의 30% 에탄올 (KP) 의 3% 빙초산액을넣어 84 ~ 90 É에서 3시간동안 2회추출하여 1 μm크기의마이크로필터를이용하여여과하고, 여액을 60 이하에서감압농축후건조하여건조엑스약 3.7 kg을얻는다 ( 평균수득율 18.5%) 성상 : 특이한향이있는황갈색 ~ 갈색의건조엑스이다. 확인시험 : 다음시험법에따라시험할때이에적합하여야한다. 황금 : 이약의가루및황금표준생약 1 g을달아 대한민국약전 황금의확인시험제2법에따라시험할때확인되어야한다. 인동 : 이약의가루및인동표준생약 1 g을달아 대한민국약전 인동의확인시험법에따라시험할때확인되어야한다. 사삼 : 이약의가루 2.0 g을달아 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 사삼의확인시험제2법에따라시험할때확인되어야한다. 옥죽 : 이약의가루및옥죽 1g을달아메탄올 50 ml를넣고환류냉각기를달고수욕에서 1시간동안가온한다음여과한여액을증발건조한다. 잔류물을메탄올 5 ml에녹여검액및옥죽표준액 10 μl씩을박층크로마토그래프용실리카겔을써서만든박층판 ( 형광제첨가 ) 에점적한다. 다음에아세트산에틸 헥산 (2:1) 혼합액을전개용매로하여약 10 cm 전개한다음박층판을바람에말린다. 여기에 4-메톡시벤즈알데히드 황산시액을고르게뿌린다음 105 É에서가열할때 R f 값 0.8 부근에서청록색의반점을나타낸다. 순도시험 중금속 대한민국약전 일반시험법중생약시험법의중금속시험법에따라시험한다. 잔류농약시험 대한민국약전 일반시험법중생약시험법의잔류농약시험법에따라시험한다. - 총디디티 0.1 ppm이하 - 디엘드린 0.01 ppm이하 - 총비에이치씨 0.2 ppm이하

176 - 알드린 0.01ppm 이하 - 엔드린 0.01ppm이하건조감량 대한민국약전 일반시험법생약시험법건조감량항에따라시험한다 (8.1% 이하 ). 회분 대한민국약전 일반시험법중생약시험법중회분항에따라실험한다 (8.9% 이하 ). 미생물한도 대한민국약전 일반시험법미생물한도시험법에따라시험한다. 정량법 황금중바이칼린, 바이칼레인이약의가루약 0.5 g을정밀하게달아 70% 에탄올 40 ml을넣어환류냉각기를달고 1 시간가열한다음여과한다. 잔류물에 70% 에탄올 40 ml을넣어같은방법으로조작한다. 여액을모두합하여 70% 에탄올을넣어정확하게 100 ml로하여검액1로한다. 이액 2 ml를취하여 70% 에탄올을넣어정확하게 20 ml로하여검액2로한다. 따로바이칼린표준품약 10 mg, 바이칼레인표준품약 10 mg을달아메탄올을넣어정확하게 20 ml로하여이액을 1mL취하여메탄올을넣어정확하게 20mL로한것을표준액으로한다. 검액 1, 검액 2 및표준액 10 μl씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액 1중바이칼레인의피크면적 A Tb, 검액 2 중바이칼린의피크면적 A Ta 및표준액중바이칼린, 바이칼레인피크면적 A Sa, A Sb 를측정한다. 바이칼린의함량 (mg) = 바이칼린표준품의양 (mg) A Ta/ A Sa 2.5 표준품의순도 (%) 바이칼레인의함량 (mg) = 바이칼레인표준품의양 (mg) A Tb /A Sb 0.25 표준품의순도 (%) [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 277 nm) 컬 럼 : 4.6 mm 150 mm, 5 μm또는이와동등한컬럼 컬럼온도 : 40 É 이동상 : A) 1% 아세트산용액 B) 아세토니트릴 메탄올 (70:30) 혼합액의 1% 아세트산액 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%)

177 유 량 : 1.0 ml/min 인동중로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드정량이약의건조엑스 0.5 g을정밀하게달아 100% 메탄올 50 ml을넣어 1 시간환류추출한다음여과하여검액으로한다. 따로로가닌표준품약 8 mg, 로가닉산표준품약 4 mg 및스웨로사이드표준품약 3 mg을달아메탄올에녹여정확하게 50 ml로하여 0.45 μm필터로여과하여표준액으로한다. 검액및표준액 10 μl씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액의로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드피크면적 A TL, A TLa 및 A TS 와표준액의로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드피크면적 A SL, A SLa 및 A SS 를측정한다. 로가닌의함량 (mg) = 로가닌표준품의양 (mg) A TL /A SL 표준품의순도 (%) 로가닉산의함량 (mg) = 로가닉산표준품의양 (mg) A TLa /A SLa 표준품의순도 (%) 스웨로사이드의함량 (mg) = 스웨로사이드표준품의양 (mg) A TS /A SS 표준품의순도 (%) [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 : 254 nm) 컬럼 : C18, 4.6 mm 250 mm, 5 μm또는이와동등한컬럼컬럼온도 : 35 É 이동상 : A) 0.1% 포름산용액 B) 100% 메탄올 (0.1% 포름산 ) 유 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) 량 : 1.0 ml/min

178 저장법 : 실온보관 (1 ~ 30 É), 기밀용기 마 ) 완제의약품에관한자료 1 HAE-06 정 제품명 : HAE-06 정 원료약품분량 : 이약 1정 ( 총내용량 700 mg) 중 HAE-06 건조엑스 320 mg( 별규 ) 제형 ( 성상 ): 이약은적갈색의장방형필름코팅정제 포장용기및재질 : PE+Al-Foil 저장방법 : 기밀용기, 실온 (1-30 ) 보관 사용기간 : 재검사일자, 개시시점초과시의약품등안정성시험기준 ( 식약처고시 ) 등에따라자체재검사 ( 제조일로부터 36개월 ) 제조원 : ( 유 ) 한풍제약, 전라북도완주군봉동읍완주산단6로 원료약품및그분량 1정중 HAE-06 건조엑스 320mg 포함정 함량기준 배합목적 성분명 규격 분량 단위 주성분 HAE-06 건조엑스 별규 320 mg 부형제 미결정셀룰로오스 KP 220 mg 부형제 옥수수전부 KP 92 mg 부형제 경질무수규산 KP 14 mg 1 정 (700 mg) 중 붕해제카르복시메틸셀룰로오스칼슘 KP 20 mg 활택제스테아르산마그네슘 KP 14 mg 코팅제히프로멜로오스 2910 KP 16.5 mg 코팅제 폴리에틸렌글리콜 6000 KP 2.5 mg 착색제 흑색산화철 KP 0.3 mg 착색제 적색산화철 KP 0.7 mg 합계 700 mg

179 제조방법 대한민국약전제제총칙중정제항에준하여제조한다. 공정번호공정명칭원료시약용매등비고 원료의약품의 1 칭량추출, 농축, 2 건조및혼합 3 혼합 4 타정 공정 3의혼합물 공정 1의코팅제 5 코팅액의공정 1의착색제조제정제수 (KP) 에탄올 (KP) 6 코팅 공정 4의반제품공정 5의코팅액 7 포장 공정 6의반제품 주성분인동, 황금, 사삼, 옥죽 (HAE-06) 주성분상기건조엑스 (HAE-06) 부형제미결정셀룰로오스 (KP) 옥수수전분 (KP) 경질무수규산 (KP) 붕해제카르복시메틸셀룰로오스칼슘 (KP) 활택제스테아르산마그네슘 (KP) 코팅제히프로멜로오스 2910 (KP) 폴리에틸렌글리콜 6000 (KP) 착색제흑색산화철 (KP) 적색산화철 (KP) HAE-06 : 공정 1의주성분인동, 황금, 사삼, 옥죽을정선하여약전통칙절도및분말도에따라조절로한다음원료약품의분량대로각생약을달아추출기에넣고 10배의 30% 주정 (KP) 에 3% 빙초산을넣어 84 ~ 90 에서 3시간동안 1회추출한다. 추출액을 1 μm크기의마이크로필터를이용하여여과한후원심분리하고, 잔사를동일조건으로 2차추출하고여과및원심분리후여액을 60 이하에서감압농축후건조 하여건조엑스를얻는다 ( 평균수득율 18.5%). 공정 2의 HAE-06 건조엑스공정 1의부형제공정 1의붕해제공정 1의활택제 PTP PE+Al-Foil

180 3 기준및시험방법 기준성상 : 이약은적갈색의장방형필름코팅정제이다. 확인시험 : 다음시험법에따라시험할때인동, 황금, 사삼, 옥죽은확인되어야한다. 순도시험 : 중금속이약은다음시험법에따라시험할때적합하여야한다. 제제균일성시험 : 이약은다음시험법에따라시험할때적합하여야한다 (5 % 이하 ). 붕해 : 이약은다음시험법에따라시험할때적합하여야한다. 미생물한도 : 이약은다음시험법에따라시험할때적합하여야한다. 함량시험 : 이약은다음시험법에따라시험할때이약 1정당황금중바이칼린 (C 21 H 18 O 11 : ) 및바이칼레인 (C 15 H 10 O 5 : ) 의합 11.0 mg 이상, 인동중로가닌 (C 17 H 26 O 10 : ) 4.61 mg 이상, 로가닉산 (C 16 H 24 O 10 : ) 1.57 mg 이상, 스웨로사이드 (C 16 H 22 O 9 : ) 1.22 mg 이상을함유한다. 시험방법성상 : 이약을가지고육안으로확인한다. 확인시험 황금, 인동이약을가지고 대한민국약전 황금, 인동확인시험법에따라시험한다. 사삼이약을가지고 대한민국약전외한약( 생약 ) 규격집 사삼확인시험법에따라시험한다. 옥죽이약을가지고 ( 별규 )HAE-06 건조엑스 (5.4 1) 옥죽확인시험법에따라시험한다. 순도시험 : 중금속이약을가지고 대한민국약전 일반시험법생약시험법중중금속시험법에따라시험한다. 제제균일성시험 : 이약을가지고 대한민국약전 일반시험법제제균일성시험법중질량편차항에따라시험한다. 붕해 : 이약을가지고 대한민국약전 일반시험법붕해항에따라시험한다. 미생물한도시험 : 이약을가지고 대한민국약전 일반시험법중미생물한도항에따라시험한다. 함량시험 황금중바이칼린, 바이칼레인이약의가루약 1.5 g을정밀하게달아 70% 에탄올 40 ml을넣어환류냉각기를달고 1시간가열한다음여과한다. 잔류물에 70% 에탄올 40 ml을넣어같은방법으로자작한다. 여액을모두합하여 70% 에탄올을넣어정확하게 100 ml로하여검액1로한다. 이

181 액 2 ml를취하여 70% 에탄올을넣어정확하게 20 ml로하여검액2로한다. 따로바이칼린표준품약 10 mg, 바이칼레인표준품약 10 mg을달아메탄올을넣어정확하게 20 ml로하여이액을 1 ml취하여메탄올을넣어정확하게 20 ml로한것을표준액으로한다. 검액1, 검액2 및표준액 10 μl씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액1 중바이칼레인의피크면적 A Tb, 검액2 중바이칼린의피크면적 A Ta 및표준액중바이칼린, 바이칼레인피크면적 A Sa, A Sb 를측정한다. 바이칼린의함량 (mg/ 정 ) = 바이칼린표준품의양 (mg) A Ta /A Sa 2.5 표준품순도 (%) 700 mg/ 정 바이칼레인의함량 (mg/ 정 ) = 바이칼레인표준품의양 (mg) A Tb /A Sb 0.25 표준품순도 (%) 700 mg/ 정 [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 277 nm) 컬럼 : 4.6 mm 150 mm, 5 μm또는이와동등한컬럼컬럼온도 : 40 이동상 : A) 1% 아세트산용액 B) 아세토니트릴 메탄올 (70:30) 혼합액의 1% 아세트산액 유 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) 량 : 1.0 ml/min 인동중로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드이약의건조엑스 1.5 g을정밀하게달아100% 메탄올 50 ml을넣어 1시간환류추출한다음여과하여검액으로한다. 따로로가닌표준품약 8 mg, 로가닉산표준품약 4 mg 및스웨로사이드표준품약 3 mg을달아메탄올에녹여정확하게 50 ml로하여 0.45 μm필터로여과하여표준액으로한다. 검액및표준액 10 μl씩을가지고다음조건으로액체크로마토그래프법에따라시험하여검액의로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드피크면적 A TL, A TLa

182 및 A TS 와표준액의로가닌, 로가닉산, 스웨로사이드피크면적 A SL, A SLa 및 A SS 를측정한다. 로가닌의함량 (mg/ 정 ) = 로가닌표준품의양 (mg) A TL /A SL 표준품순도 (%) 700 mg/ 정로가닉산의함량 (mg/ 정 ) = 로가닉산표준품의양 (mg) A TLa /A SLa 표준품순도 (%) 700 mg/ 정스웨로사이드의함량 (mg/ 정 ) = 스웨로사이드표준품의양 (mg) A TS /A SS 표준품순도 (%) 700 mg/ 정 [ 조작조건 ] 검출기 : 자외부흡광광도계 ( 측정파장 : 254 nm) 컬럼 : C18, 4.6 mm 250 mm, 5 μm또는이와동등한컬럼컬럼온도 : 35 É 이동상 : A) 0.1% 포름산용액 B) 100% 메탄올 (0.1% 포름산 ) 유 시간 ( 분 ) 용매 A (%) B (%) 량 : 1.0 ml/min 6) HAE-06의독성시험자료가 ) 단회투여독성시험본시험은시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 Sprague-Dawley 랫드에단회경구투여하였을때나타나는독성을알아보기위하여수행하였음. 시험물질인 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 1500, 3000 및 5000 mg/kg의용량으로투여하는시험물질투여군, 멸균주사용수만을투여하는부형제대조군을설정하였고, 군당 10 마리 ( 암수각 5 마리 ) 에단회경구투여하였음. 2 주간사망률, 일반증상관찰, 체중변화및육안적부검소견을관찰하여부형제대조군과비교하였음. 본시험에서는사망동물은관찰되지않았고, 체중변화및육안적부검소견에서도시험물질과관련된변화는관찰되지않았음 mg/kg 이상투여군암수에서관찰된연변및설사는공복상태에서물질적용에따른변화로판단하고, 하복부오염은그에따른이차적인변화로판단되었음 mg/kg 투여군수컷에서관찰된물섭취량증가및다뇨또한용량

183 반응상관성있게관찰되어시험물질에의한변화로판단되었음. 이상의결과로보아, 시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 Sprague-Dawley 랫드에단회경구투여하였을때, 사망동물은관찰되지않았기에본시험조건하에서개략의치사량 (Approximate Lethal Dose, ALD) 은암수모두 5000 mg/kg을상회하는것으로판단됨. 나 ) 4주 DRF 반복투여독성시험본시험은 HAE-06( 생약복합추출물 ) 를 Sprague-Dawley 랫드에 4 주간반복경구투여하였을때나타나는독성을확인하여추후실시할 13 주반복경구투여독성시험에서의용량설정근거로활용하기위하여수행하였음. 시험물질을 500, 1000, 2000, 3000 mg/kg/day로투여하는시험물질투여군및멸균주사용수만을투여하는부형제대조군을설정하여군당 10 마리 ( 암수각 5 마리 ) 에 4 주간반복경구투여하였음. 일반증상관찰, 체중측정, 사료및물섭취량산출, 안과학적검사, 요검사, 혈액학적및혈액생화학적검사, 장기중량측정, 부검소견관찰을실시하였음. HAE-06( 생약복합추출물 ) 를 Sprague-Dawley 랫드에 500, 1000, 2000, 3000 mg/kg/day로 4 주간반복경구투여하였을때, 2000 mg/kg/day 이상투여군수컷에서증체량감소및체중증가억제경향, A/G ratio 증가, 암컷에서간장의상대중량증가, 암수에서 RBC 수, HGB 수치, HCT 백분비감소및감소경향, RDW 증가및증가경향, 2000 mg/kg/day 이상투여군수컷및 3000 mg/kg/day 투여군암컷에서 TBIL 농도증가, 3000 mg/kg/day 투여군수컷및 1000 mg/kg/day을제외한모든시험물질투여군암컷에서비장의절대또는상대중량증가, 모든시험물질투여군암수에서물섭취량증가및증가경향이관찰됨. 상기시험결과를토대로, 추후실시할 13 주반복투여독성시험에서는독성이관찰될것으로예측되는용량인 2000 mg/kg/day를고용량군으로두고그아래로공차 500으로두개군을설정하여 13주반복투여시험을할것을추천함. 다 ) 13주반복투여및 4주회복독성시험결과본시험은 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 Sprague-Dawley 랫드에 13 주간반복경구투여하였을때나타나는영향과 4 주간의회복기간에나타나는변화를확인하여, 무독성량및표적장기를평가하고자수행하였음. 시험물질을 1000, 1500, 2000 mg/kg/day로투여하는시험물질투여군과멸균주사용수만을투여하는부형제대조군을설정하여군당암수각 10 마리와부형제대조군및 2000 mg/kg/day 시험물질투여군에군당암수각 5 마리의동물을두고 4 주간의회복기간을두었음. 일반증상관찰, 체중측정, 사료및물섭취량산출, 안과학적검사, 요검사, 혈액학적및혈액생화학적검사, 장기중량측정, 부검소견관찰및조직병리학적검사를실시하였음

184 본시험에서일반증상, 체중변화, 사료및물섭취량산출, 안과학적검사, 요검사에서시험물질에의한변화는관찰되지않았음. 혈액학적검사결과, 1500 mg/kg/day 이상투여군수컷에서 RBC 수감소, MCV, MCH 수치증가가관찰되었고, 1000 mg/kg/day 투여군에서도부형제대조군대비증가한경향이관찰되었음. RBC수는암컷에서도감소경향이관찰되었음. 상기변화중수컷에서관찰된 MCV, MCH, RET를제외하고는용량-반응상관성이뚜렷하지않으나, 시험물질에포함된인동및황금에서추출한물질인쌍화련 (shuanghuanglian) 을 Dog에정맥내투여시적혈구막장애및용혈에영향을준다는보고와시험물질에포함된사삼의성분중의하나인사포닌이용혈작용을일으킨다는점을볼때, 상기의변화는시험물질에의한변화로판단됨. 또한, 모든시험물질투여군에서 RET의증가및증가경향이관찰되었고, 이는 RBC 수감소에따른보상성반응으로시험물질에의한변화로판단되었음. 다만, 상기의변화들은차이가미미하고, 회복성이인정되므로독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단됨. 혈액생화학적검사결과, 모든시험물질투여군암컷에서관찰된 TBIL 및 K+ 증가는용량-반응상관성이뚜렷하지않지만, 적혈구손상에기인한변화로시험물질에의한변화로판단됨. 하지만, 회복기간동안회복되어독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단됨 mg/kg/day 투여군암컷에서관찰된혈청의 IP 수치의증가는수컷에서도증가경향이관찰되었고, 용량-반응상관성있는변화로시험물질에의한변화로판단함. 혈청내무기인 (Inorganic phosphorus) 의증가는사구체여과율 (GFR) 의감소와연관된것으로알려져있음. BUN 및 CRE의수치가증가시사구체여과율이감소하는데, 본시험에서는 BUN 및 CRE 이오히려감소하였고, 조직병리학적검사에서도신장의변화를동반하지않아독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단되었음 mg/kg/day 이상투여군수컷에서관찰된 CRE 감소는독성과무관한변화임. 장기중량측정결과, 2000 mg/kg/day 투여군암컷에서관찰된폐및간장의상대중량증가는절식체중의감소에도불구하고절대중량의증가경향이관찰되었고, 또한, 용량-반응상관성있는변화로시험물질에의한변화로판단되었음. 간장의변화는적혈구손상에따른대식세포 (macrophage) 들의식균작용 (phagocytosis) 에따른변화로추정됨. 상기변화들은조직병리학적검사에서연관된변화가관찰되지않아독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단됨. 조직병리학적검사결과, 비장에서관찰된골수외조혈발생례증가는적혈구수감소에따른보상성반응으로시험물질에의한변화로판단하나, 회복성이인정되므로독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단됨. 장간막림프절에서관찰된출혈, 적혈구포식, 조직구증및색소침착은서로연관된변화로서출혈이주요한변화였음. 적혈구포식, 조직구증및색소침착은출혈에따른이차적인변화로판단됨. 상기변화들은비장에서관찰된골수외조혈, 혈액학적검사결과의적혈구관련지표의변화및혈액생화학적검사결과 TBIL( 암컷 ), K+ 의변화와연관된변화이고, 시험물질투여군에서만관찰된변화로시험물질에의한변

185 화로판단됨. 다만, 장간막림프절에서만국한된변화이고, 병변과연관될수있는요검사의 BIL 및 BLO, 혈액생화학적검사에서의 AST 의변화가관찰되지않았고, 회복성이인정되므 로독성학적으로유해한변화는아닌것으로판단됨. 라 ) 안전성약리작용에관한자료 1 중추신경계영향평가본시험은시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 를 ICR 마우스에단회경구투여한후동물의체온및전신행동에대한반응을관찰함으로써시험물질이중추신경계에미치는영향을평가하기위하여수행하였음. 시험군은 HAE-06( 생약복합추출물 ) 를 750, 1500 및 3000 mg/kg 로투여하는시험물질투여군및멸균주사용수만을투여하는부형제대조군으로구성하였으며, 군당수컷 8 마리에단회경구투여하였음. 시험물질투여군에서투여전과투여후 30, 60, 120, 240 및 360 분에동물의체온을측정하고전신행동을관찰하여부형제대조군과비교하였음. 시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 를 3000 mg/kg 이하의용량으로 ICR 마우스에단회경구투 여하였을때체온및전신행동의변화가관찰되지않았기때문에, 본시험조건하에서시 험물질이중추신경계에미치는영향은없는것으로판단됨. 2 호흡기계영향평가본시험은시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 Sprague-Dawley 랫드에단회경구투여후동물의호흡수및호흡량을측정함으로써시험물질이호흡기계에미치는영향을평가하기위하여수행하였음. HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 750, 1500 및 3000 mg/kg으로투여하는시험물질투여군및부형제인멸균주사용수만을투여하는부형제대조군으로구성하였으며, 군당수컷 8 마리에단회경구투여하였음. 시험물질투여군에서투여전과투여후 30, 60, 120, 240 및 360 분에일반증상관찰, 호흡수 (respiration rate), 일회호흡량 (tidal volume), 분당호흡량 (minute volume) 을 10 분간측정하여부형제대조군과비교하였음. 시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 의단회경구투여는호흡수및호흡량에변화를나타내지 않았으므로, 본시험물질은 3000 mg/kg 이하의용량에서호흡기계에영향을미치지않는것 으로판단됨. 3 심혈관계영향평가 본시험은시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 Beagle Dog 에단회경구투여후 Telemetry system 을이용하여혈압, 심박수, 심전도및체온에미치는영향을관찰함으로써시험물질

186 이심혈관계에미치는영향을평가하기위하여수행하였음. 시험군은시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 325, 500 및 750 mg/kg으로투여하는시험물질투여군및부형제인경구투여용젤라틴캡슐만을투여하는부형제대조군으로구성하였으며, 군당수컷 4마리단회경구투여하였음. 시험물질투여군에서는투여전과투여후 1, 2, 4, 6 및 24시간에일반증상, 혈압, 심박수, 심전도및체온을측정하여부형제대조군과비교하였으며, 그결과는다음과같음. 일반증상관찰결과, 시험물질과연관된이상변화는관찰되지않았음. 혈압측정결과, 수축기, 이완기및평균혈압에서시험물질과연관된이상변화는관찰되지않았음. 심박수측정결과, 시험물질과연관된이상변화는관찰되지않았음심전도측정결과, 시험물질과연관된이상변화는관찰되지않았음. 체온측정결과, 시험물질과연관된이상변화는관찰되지않았음. 이상의결과로보아, 시험물질 HAE-06( 생약복합추출물 ) 을 750 mg/kg 이하의용량으로 Beagle Dog 에단회경구투여하였을때, 시험물질이심혈관계에미치는영향은없는것으로 판단됨. 4 herg potassium channel에미치는영향평가이시험은 CHO herg cells에서 HAE-06에의해 herg Potassium Channel에미치는영향을평가하기위함임. herg Potassium Channel을안정화시킨후, Normal Tyrode 용액 ( 부형제대조군 ) 및 HAE-06을약 5분이상흘려주면서 run-down rate를기록하였음. 부형제대조군을관류시켰을때약 0.4% 정도 herg Potassium Channel을억제하였고 HAE-06을 0.1 yg/ml 및 0.5 ug/ml, 1 ug/ml의농도로관류시켰을때약 2.8%, 1.0%, 0.2% 억제하였음. 부형제대조군과시험물질투여군의억제율을비교하였을때모든농도에서통계적인유의성을나타내지않았음. 이와동일한조건하에서양성대조물질인 E nm을관류시켰을때 herg potassium Channel이 91.5% 억제됨을확인할수있었음. 이상의결과로볼때, HAE-06 은 1 ug/ml 까지 herg Potassium channel 에미치는영향이없 는것으로사료됨

187 7) HAE-06 임상시험프로토콜 임상시험제목임상시험단계실시기관수시험책임자 급성기관지염및만성기관지염급성증상악화환자를대상으로 HAE-06 의유효성과안전성을평가하기위한위약대조, 무작위배정, 이중눈가림전기 2상임상시험제 2a상국내단일기관한전병원흉부외과손상태과장 임상시험용 의약품 시험약 : HAE-06 정 대조약 : HAE-06 정 320mg 320mg 동일한모양의위약 임상시험디자 인 무작위배정, 이중눈가림, 위약대조, 제 2a 상임상시험 대상자수 78 명 ( 군당 39 명 ) ( 최소시험대상자수, 70 명, 중도탈락률 10% 고려 ) 일차목적 급성기관지염및만성기관지염의급성증상악화환자에서 HAE-06 의 효성을탐색한다. 유 목적 이차목적 급성기관지염및만성기관지염의급성증상악화환자에서 HAE-06 의 전성을확인한다. 안 1. 유효성일차평가변수 HAE-06정투여전기준투여 7일후 Bronchitis 변화량 Severity Score (BSS) 의 평가항목 이차평가변수 Day 7일에시행한 BSS 의 5개평가항목의변화량 Day 7일에시행한 Integrative Medicine Outcome Scale (IMOS) 로평가한치료개선정도 Day 7일에시행한 Integrative Medicine Patients Satisfaction Scale (IMPSS) 로평가한치료개선정도 Day 7일에시행한 Breathless, cough, and sputum scale (BCSS) 변화량

188 2. 안전성 이상반응및중대한이상반응 활력징후및신체검사 진단의학적검사결과선정기준대상자들은다음의모든조건에적합하여야한다. 1) 만 19세이상 80세이하의성인 2) 스크리닝시측정한급성기관지염또는만성기관지염의증상악화를보이는환자로 BSS 5점이상인인자 3) 스크리닝기준급성기관지염의경우는 5일이내, 만성기관지염의급성증상악화인경우에는 10일이내의증상을보인자 4) 본임상시험참여에자발적으로서면동의한자 선정 / 제외기준 제외기준다음조건중하나라도해당되는환자는본임상시험에참여할수없다. 1) 스크리닝기준심한호흡기질환으로항생제치료가필요한자 2) 알러지성천식, 폐결핵또는만성폐쇄성폐질환을앓고있는자 3) 출혈성경향의질환을앓고있는자 4) 다음의진단의학적검사결과의이상이있는자 간기능이상 : AST/ALT 가정상범위상한치의 1.5배 신기능이상 : Serum Creatinine 이정상범위상한치의 1.5배 혈액검사상의수치에서정상범위상한치의 1.5배의비정상수치를보이는자 객담검사 ( 그램염색 ) 결과항생제치료가필요하다고판단되는자 5) 스크리닝시점에서임산부, 수유부및임신가능성이있으면서물리적인피임방법즉, 자궁내장치, 경구피임제, 피임시술등을적용하지않고있는자. 단임상시험참여기간중명백히임신가능성이없는경우참여가능함. 6) 스크리닝기준소화와관련된질환으로약물치료가필요한자예를들어, 만성위염, 위궤양, 과민성대장증상등 7) 스크리닝시활력징후가시험자판단으로안정되어있지않은자예를들어, 고혈압약물을복용하였음에도혈압이 SBP 170mmHg 이상이

189 임상시험용의약품투여용량및투여방법 거나고열, 빈맥, 과호흡등의증상을보이는자 8) 스크리닝시뉴욕심장학회 (NYHA) 심부전분류 Class III 또는 Class IV 에해당하는중증의심부전환자. [ 뉴욕심장학회심부전분류 ] Class I: patients with no limitation of activities; they suffer no symptoms from ordinary activities. Class II: patients with slight, mild limitation of activity; they are comfortable with rest or with mild exertion. Class III: patients with marked limitation of activity; they are comfortable only at rest. Class IV: patients who should be at complete rest, confined to bed or chair; any physical activity brings on. 9) 스크리닝시 6개월이내에악성종양을진단받았거나항암치료를받고있는자. 10) 본임상시험참여전 4주이내에인동그리고 / 또는황금 ( 黃芩 ) 을포함한한약, 또는인동과황금의지표성분인로가닌 (Loganin) 과바이칼린 (Baicalin) 을포함한기타약물을투여받았거나건강기능식품을섭취한자 11) 과거 3개월이내에다른약물임상시험에참여했던자단, 관찰연구로약물복용이없었던경우에는본임상시험참여가가능함 12) 이외의이유로시험자가임상시험참여에적절하지않다고판단하는자본임상시험에참여한모든대상자는 1:1 비율로 HAE mg/day 또는대조군 (HAE-06 위약 ) 에무작위배정되어 HAE-06정또는위약을 1회 2 정, 1일 3회투여한다. 대상자들은임상시험참여전평가한 BSS에서 5점이상으로확인이되어야하며, 다른호흡기질환으로항생제에의한약물 치료와천식및만성폐쇄성폐질환에대한치료가진행되지않는대상자이어야한다. 시험자는대상자의선정제외기준을확인후임상시험에참여가능할경우대상자를두군으로무작위배정하여당일부터복용하도록설명하여야한다. 대상자들은약물을 6일간복용한후 7일째병원에방문한다. 방문시 BSS, IMOS, IMPSS, 및 BCSS 등을시행하며대상자의임상상태를확인한다. 대상자들은모든약물복용을종료하고, 마지막평가이후임상시험절

190 차를종료하게된다. 치료군별배정된시험약의구성은다음과같다. 치료군아침점심저녁시험군 mg/day 대조군 위약군 HAE-06정 960 mg HAE-06정위약 시험기간 식품의약품안전처및임상시험심사위원회승인일로부터약 12 개월 연구대상자수산출 : HAE mg/day 투여군의 baseline 대비투여 7일째 BSS 평균 ( 표준편차 ) 감소량을 7.2(3.1) 로, 위약군의 BSS 감소량을 4.9(2.7) 로가정하고, 양측유의수준 5% 및검정력 90% 하에서군간평균 BSS 감소량을비교하기위해군당 35명씩총 70명을분석한다. 중도탈락률 10% 를감안해총 78명 ( 군당 39 명 ) 의연구대상자들을등록한다. 일반적원칙 : 모든유효성및안전성평가변수들에대한통계분석은양측유의수준 5% 통계분석 하에서실시된다. 결측자료에대한처리는없이오직관찰된자료만을사용한다. 연구대상자들의눈가림코드가해제되기전에종합적인통계분석계획서 (SAP) 를작성한다. 유효성평가대상은전체분석대상군 (Full Analysis Set, FAS) 및계획서순응분석대상군 (Per-Protocol Set, PPS) 이다. FAS 대상군은본임상시험참여에서면동의하고, 시험군에대한무작위배정을받은뒤, 최소한번이상임상시험약물을투여받은모든연구대상자로정의한다. PPS 분석대상군은 FAS 분석대상군중임상시험계획서에충실하여중대한선정 / 제외기준을위반하지않고, 제 7일째평가되는복약순응도가 80% 이상인모든연구대상자들이다. 안전성평가대상은본임상시험참여에서면동의하고최소한번이상임상약을투여받은모든연구대상자들로정의되는안전성분석대상군 (Safety Set) 이다. 유효성평가 : 일차유효성평가변수인 BSS의평균변화량에대한 HAE-06 투여군과위약군간의비교는 Student s t-test를사용해분석한다. 이차유효성평가변수들인 BSS 5개평가항목들, IMOS, IMPSS 및 BCSS에대해서는해석상의

191 용이성을위해응답내용을범주형으로간주한 chi-square test ( 혹은 Fisher s exact test) 과연속형으로간주한 Student s t-test ( 혹은 Mann-Whitney U-test) 를실시한다. 두분석결과가상이하면그원인을파악한다. 안전성평가 : 군간이상반응의발현율, 중도탈락의원인이된이상반응의발현율, 중대한이상반응의발현율등의차이를 chi-square test를사용해비교평가한다. 활력징후및신체검진검사결과들에대한요약통계량을제시하고, 정상 / 비정상여부에대해서는시점간변화표를제시한다. 8) HAE-06 IND 승인신청접수완료 IND 승인신청을위해필요한안전성, 유효성및임상시험용의약품에관한자료를확보하여임상시험계획승인신청을완료하였음. - IND 승인신청접수 : 2015년 12월 15일

192 제 4 장 목표달성도및관련분야에의기여도 1. 연구개발의목표및연구개발수행내용 실험동물을이용한진해거담, 등호흡기질환예방및치료효력시험 호흡기계병원성미생물에대한방어능측정

193

194 β α β α 실험동물을이용한진해거담등호흡기질환예방및치료효력시험 호흡기계병원성미생물에대한방어능측정

195 호흡기질환예방및치료

196 제 5 장 연구개발성과및성과활용계획 1. 연구개발결과의성과및활용목표대비실적 1) 연구성과목표 2. 논문게재성과 게재연도 논문명급성염증성발열모델에서의항염증성약재혼합추출물 (YG-1) 의효과 Relief effect of medicinal herb mixture HAE series on respiratory symptoms 저자 주저자교신저자공동저자 송인봉 BoYoon Chang 권중기 SungYeon Kim 나지영, 송기쁨, 김석호, 이진현, 권영배, 김대기, 김대성, 조형권 DaEun Kim JiHye Han JooSeok Lee DaeSung Kim HyoungKwon Cho 학술지명한국식품영양과학회지 Kor. J. Phar maco gn. 국내 Vol. 외 (No.) 구분 44(4) 국내 46(4) 국내

197 3. 특허출원성과 출원연도특허명출원인출원국출원번호 인동등, 우방자및황금추출물을유효성분으로하는염증, 통증및가래의예방, 개선또는치료를위한조성물인동등, 황금, 및맥문동혼합추출물을유효성분으로함유하는진해또는거담용조성물인동등, 황금, 사삼, 옥죽혼합추출물을유효성분으로함유하는진해또는거담용조성물 유한회사한풍제약대한민국 유한회사한풍제약대한민국 유한회사한풍제약대한민국 기술료징수현황 기징수액향후징수액합계 21,000,000 21,000, 사업화현황 구분제품명제품사진제품출시일 매출액 ( 백만원 ) 1 편감원액 한풍자운고

198 3 한풍노즈액 한풍콜드액 한풍코프액

199 6. 홍보실적 구분매체명홍보내용 <CMO KGMP 적합통보 > 1 뉴스타운 <YG-1 임상시험계획승인 (IND) 획득 > 2 뉴스타운

200 < 편감원액등감기약 3 종 > 3 뉴스타운

201 <CMO KGMP 적합통보 > 4 메디파나

202 <YG-1 임상시험계획승인 (IND) 획득 > 5 메디파나

203 < 편감원액등감기약 3 종 > 6 메디파나

204 <CMO 사업영역확대 > 7 약업신문

205 < 자운고밸리데이션 > 8 약업신문

206 <YG-1 임상시험계획승인 (IND) 획득 > 9 약업신문

207 < 편감원액등감기약 3 종 > 10 약업신문

208 <CMO 육성과제선정 > 11 쿠키뉴스

209 특허, 논문및시장분석 1. 본연구와관련된기술의국내외수준비교 기술명 관련기술최고보유국 현재기술수준 우리나라관련기술수준 연구사업단보유기술수준 기술개발목표수준 비고 추출독일 제형화기술일본 품질관리 (QC) 일본 / 미국 특허조사 분석 가. 특허조사 분석범위 대상국가국내, 국외 ( 미국, 일본, 유럽 ) 특허 DB 검색기간 검색범위 특허정보원 ( ~ 제목및초록 나. 특허조사 분석에따른본연구과제와의관련성 기술명 Keyword 검색건수유효특허건수 천연물특화민간생산위탁시스템실용화기반, CMO(Contract manufacturing organization), 위탁생산시설설계, 바이오의약품위탁생산, 천연물위탁생산시설, CMO 설계실용화기반 (1,133), CMO(12), 위탁생산시설설계 (101), 바이오의약품위탁생산 (23), 천연물위탁생산시설 (0), CMO 설계 (6) 실용화기반 (0), CMO(0), 위탁생산시설설계 (0), 바이오의약품위탁생산 (0), 천연물위탁생산시설 (0), CMO 설계 (0) < 천연물특화생산시스템에대한기술은없음 >

210 3. 논문분석 가. 논문분석범위 대상국가논문 DB 검색기간검색범위 미국, 일본, 유럽국회도서관 ( Pubmed( 등논문DB ~ 제목, 초록및키워드 나. 논문분석에따른본연구과제와의관련성 기술명 Keyword 검색건수유효논문건수 천연물특화민간생산위탁시스템 CMO(Contract manufacturing organization), Manufacturing industry, Manufacturing industry, Manufacturing systems, Contract manufacturing, Contract manufacturing, drug outsourcing CMO(Contract manufacturing organization(18), Manufacturing industry, Manufacturing industry, Manufacturing systems, Contract manufacturing, Contract manufacturing, drug outsourcing 논문검색 DB를이용하여본과제와관련이있는 keyword로검색한결과검색건수는있었으나관련이있다고보기어려웠음. 4. 제품및시장분석 가. 생산및시장현황 1) 국내제품생산및시장현황 1 국내제약시장동향 2013년제약산업의총생산액은 16조1,918억원으로전년대비 4.1% 증가하였음. 2008년까지전년대비 10% 대의높은성장을보였던생산액이 2009년이후성장속도가둔화되기시작하였으며 2011년생산액이처음으로감소한후 2012년부터소포증가하였음. 2009년부터 2013년까지의약품생산은연간 2.3% 증가로, 동기간국내 GDP 성장률 (5.5%) 및제조업 GDP 성장률 (7.8%) 보다낮은증가율을기록하였음

211 표 1. 국내제약시장동향 ( 단위 : 억달러, %) 구분 CAGR (2010~14) 세계시장규모 (A) 8,333 8,772 9,033 9,476 10, 국내시장규모 (B) 국내생산 (C) 국내제조업 GDP (D) 3,042 3,425 3,443 3,686 3, 비중 세계시장대비 (B/A) 제조업 GDP 대비 (C/D) 자료 : 한국보건산업진흥원, 보건산업브리프 (2014년글로벌제약시장주요동향 ) Vol. 191 그러나제약산업의부가가치율은 2013년 35.65% 로제조업평균 (21.25%) 보다 14.4%, 전산업평균 (26.01%) 보다 9.64% 높아타산업에비해고부가가치산업임. 또한기업에투자된총자본이 1년동안어느정도의부가가치를산출하였는지를나타내는비율인총자본투자효율역시제약산업이 19.7% 로제조업 (19.53%) 과전산업 (16.89%) 에비하여높았음. 표 2. 제약산업생산성관련지표 (2013) ( 단위 : %) 구분 부가가치율 총자본투자효율 설비투자효율 기계투자효율 의약품 제조업 전산업 자료 : 2014년제약산업분석보고서 ( 한국보건산업진흥원 ) 2014년국내제약산업시장규모는 19조 2,539억원으로저년대비 1.2% 증가하였으며 2010~14년동안연평균 0.5% 로시장규모가확대되고있음. 2014년의약품생산액은 16조 4,194억원으로전년대비 1.4% 증가하였으며, 2010년부터 2014년동안연평균 1.3% 성장했음. 또한수입은 2014년 5조 3,659억원으로 2013년 5조1,558억원대비 4.1% 증가했음. 제약산업은수출보다수입이많아무역수지는 2조8,345억원의적자를보였으며, 무역수지적자폭이전년과비슷한수준으로나타났음

212 표 3. 우리나라의약품시장규모및동향 ( 단위 : 백만원, %) 구분 2010년 2011년 2012년 2013년 2014년 CRGA 전년대비 (`10-`1 성장률 4) 생산 15,569,588 15,440,251 15,560,663 16,191,845 16,419, 수출 1,770,059 1,943,493 2,309,534 2,318,522 2,531, 수입 5,108,911 5,447,053 5,728,874 5,155,829 5,365, 무역수지 -3,338,851-3,503,560-3,419,340-2,837,308-2,834, 시장규모 18,908,439 18,943,812 18,890,003 19,029,152 19,253, 자료 : 한국제약협히 (2015), 한국의약품수출입협회 (2015) 2 국내의약품제조업동향 최근 GMP 규정이강화되고 2014년 7월의약품실사상호협력기구 (PIC/S) 에가입됨에따라한약 / 생약제제도밸리데이션실시의무화되었음. 따라서의약품의제조및품질관리역량을국제수준으로끌어올려국제적신뢰도제고를통해해외수출과더불어국내제약산업발전에기여할것으로보임. 최근 GMP 규정강화에따라교차오염을방지하고자별도의제형별전용라인을구축하는과제에서많은투자비용이발생됨에따라위탁생산을하려는업체가증가하고있음. 천연물의경우이런위탁생산을할수있는곳이제한적임. 2) 국외제품생산및시장현황 1 세계의약품시장 2013년세계의약품시장규모는 9,893억달러로전년대비 3.2% 의성장을기록했음. 최근전세계적경기침체에도불구하고의약품시장이성장한것은상당부분아시아, 중남미등 pharmerging 지역의시장확대에기인함. 그림 276. 세계의약품시장규모추이 (2004~2013)

213 자료 : IMS Health, IMS Market Prognosis, September 2014 미국, EU 5개국, 일본, 캐나다, 한국등선진국의제약시장규모는 6,236억달러로전체시장의 63% 를차지하고, 중국, 브라질, 러시아등파머징국가의시장은 2,429억달러로 24.6% 의비중을보였음. 과거 5년간미국, 일본등주요선진국의성장률은전체성장률을하회하며저상장기조를유지하거나마이너스성장을기록한반면, 중국 (19.0%), 브라질 (15.2%), 인도 (14.9%) 등파머징국가는최근 5년간 10% 이상높은성장을이어나가고있음. 향후 5년간세계제약시장의성장률은 4~7% 가될것으로예상되며, 1018년에이르러서는현재보다 2,900~3,200억달러증가한 1조 2,800~1조 3,100만달러에달할것으로전망됨. 표 4. 지역별세계의약품시장규모 (2013) ( 단위 : 십억달러, %) 자료 : IMS Health, IMS Market Prognosis, September 약효군별세계시장현황 상위 20개약효군별세계시장규모는 6,296억달러로전체의약품시장의 72% 를차지했다. 항암제가 671억달러로 2012년에이어가장많이판매된것으로나타났으며, 진통제, 당뇨병치료제가 573억달러, 544억달러순으로시장규모가큰것으로나타났음