대한임상뱅리사회지 : 제 17 권제 1 호 1985 염색체의분석방볍과세포유천학척안검토 제일병원염색체검사살 최수경 서울보건천문대학임상병리파 검태천 Analytic Methods and Cytogenetic Discussion of Chromosome = Abstract

Size: px

Start display at page:

Download "대한임상뱅리사회지 : 제 17 권제 1 호 1985 염색체의분석방볍과세포유천학척안검토 제일병원염색체검사살 최수경 서울보건천문대학임상병리파 검태천 Analytic Methods and Cytogenetic Discussion of Chromosome = Abstract"

단율 십
4 years ago
Views:

1 대한임상뱅리사회지 : 제 17 권제 1 호 1985 염색체의분석방볍과세포유천학척안검토 제일병원염색체검사살 최수경 서울보건천문대학임상병리파 검태천 Analytic Methods and Cytogenetic Discussion of Chromosome = Abstract = 800 Kyung Choi Laboratory 01 cytoge η etics, Cheil hospital. Tai Jeon Kim Dept. 01 Medical Tech:η ology, College 01 Seoul Health Presented in this paper is the cytogenetic study in patients for suspected chromosomal abnormalities. karyotypes were obtained using short-term peripheral blood culture and conventional staining and G-banding methods for correct analysis of structural abnormalities. As a res ults, we confirmed structural abnomalities of chromsome by the G-banding study. it was not possible by the conventional staining. Therefore the obtained successful results by trypsin-giemsa banding were preferable to the other methods. 서론 염색체의이상에관한살험은최근에이르기까지주 로 Giemsa 또는 aceto-orcein 에의한일반염색법으로 만염색체이상을판찰하였었다. 그러나 1970 년도에 이르러 Caspersson et ap) 이염색체의분염볍 (differential staining method) 을개발하면서부터동일그룹에 속하는비상동염색체 (nonhomologous chromosome) 는 물론, 염색체의쿠조이상을정확히분석할수있었다. 염색체이상의유형을보면세포핵속에있는염색체 수는정상세포에서는 2 배수 (diploid) 즉 46 개로되어있 는데이보다수가많거나척을해를수적이상 (numerical abnormalities) 이라하고염섹체의파열 (breaks) 로 유래된것을쿠조이상 (structural abnormalities) 이라고 한다. 쿠조이상으로는역위형 (paracentric inversion and pericentric inversion), 천좌헝 (robertsonian translocation and reciprocal translocation) 또는윤상염색 체 (ring chromosome), 결살염색체 (deleted chromosome) 및중복 (duplication) 기원 (origin) 을알수없는대 상쿠조 (band) 의부가 (addition), 표식염색체 (marker chromosome) 등이있다. 이에본저자들은염색체이상이의섬되어온환자 틀중일반염색볍으로분석이어려운경우블 trypsin

2 을이용한 G- 분염법을시행하여염색체의쿠조이상을반복한다. ) 확언푼석한결파블보고하고자한다. 5. 고정이끝난후원심분리하여상층액을제거시킨 대상및방법 본살험의대상은염색체이상이의심뇌어제일랭원염 색체검사살로의뢰된환자의말초혈액임파쿠를사용 하였다. 분석방법으후는말초혈액배양법 2)(Moorhead -et a ) 에의해허 1 파란이첨가된렬액병에피검 자의혈액 10ml 를넣어 4 0 C 냉장고에 3,,-, 5 시간방치한 후에렉혈쿠층을분리하여준 l.l 1 된배양액에주입하였 오머혈액채취가곤란한신생아일경우지두 (finger tip) 나말뒷꿈치 (heel prick) 또는렛볼 (ear lobe) 천자를 하여오세판 (cap i1l ary tube) 오후채취한다읍헤파린 이첨가된배양병에주업시키는미량전혈배양법 (micromethod: Arakaki and Sparkes, 1963) 으로살시하였 다.3) 배양액 (culture medium) 으로는최소배지 (Eagle s minimal essential media with Hank s salt: Difco) 에 아마노산 (100 x, MEM amino acid, O. 018m1/5ml of media; GIBCO) 과벼타만 (50 x, MEM vitamine, O. 0 1m1/5ml of media; GIBCO) 을첨가한보완배지 (enriched medium) 을사용하였 며 GIBCO 사의 TC 199, RPMI 1640, HAM S F-10 등도아울러사용하였다. 모든배지에는 20% fetal bovine serum 을첨가하 였 며미량의 penicillin G (10, 000μIml: GIBCO) 와 streptomycin 10, 000μ Im1 과 T- 엄파주의분열을자극 시키기위해 phytohemagglutinin(pha; 1. 5ml/100ml,of media) 을첨가하였다. 마음얄맞은세포부유액을만든다. 6. 깨끗이처리된 6,,-, 8 장의슬라이드상에세포부유 액을척하시킨다. 7. 공기건조법으로건조시칸마음건조된슬라이드 2 장을 buffer(ph 6. 8) 용액으로희석된 4% Gurr s Giemsa R66 용액에서 10 분동안염색한다. 8. 염섹이끝난후 Leitz-Dialux 현마경하에서분열중 기세포의검경 (X 1, 000) 달하여염색체블분석한다. 9. 나머지 slide 3,,-, 4 장갚 3,,-,5 일정도성숙 (ageing) 시킨후 H202 (hydrogen pεroxide) 로처리둡 10 분깐하 여 0.9% isotonic saline 으로수세한다 % trypsin 용액에서수초내지수분간처 리한마음 ( 시간결정은슬라이드성숙시간파배양상태 에짜라차이가난다 ) O. 9% isotonic saline 용액으로 3 회수세하고 4% Gurr s Giemsa R66 용액에서염색시 킨다음검경한다. 중기세포 30,,-, 50 개를검경하고최종적으로의의가 있다고생각되는 λ11- 포들을 technical pan film(kodak) 또는 microfilm (fuji) 을사용하여현미경사진촬영을 한다읍 kodabromide F-5 지에인화하며 idiogram 작 성후정확한염색체분석같실시하였다. 염색체의표기법은 Paris cðnference (1971)'), Paris conference supplement 5 ) (1975) 와 ISCN (An internat ional system for human cytogenetic nomenclature, 1978)6) 의명명규약에준하였다. 결과 배양병에주입된임파구는수증기로포화된 5% CO2 배양기에서 37 0 C 를유지하여 72 시간배양하였다. 배양 종료 1,,-, 3 시간천에 colcemid(gibco) 를 0.1,,-, 0.2μgl :m 1( 최종농도 ) 첨가하여셰프 E 의유사분열중기상에서 정지시킨다음, 중기상을포획 (arrest of metaphase) - 하였으며, 염색채표본을만들어서검경하는순서는 다음파같다. 1. colcemid 로처리된엄파주는 1, OOOrpm 에서 8 분 - 동안원심분리한다. 2. 상층액을제거시키고저장액으로 (0. 075M KCl) 처 리블하여 37 0 C 에서 10 분간방치한다. 3. 원심분리 (1, OOOrpm 8 분 ) 하여장층액을제거시키 고미리준 13 1 된 Carnoy 고정액 (glacial acetic acid (1) : absolute methanol (3)) 으로셰프 E 를고정하였다 (* 고 청액은항상차고신선한것을사용해야한다 ) 4. 냉장고에 20 분정도방치한다 ( 고정파정을 3,,-, 5 회 검사대상자모두일반염색볍파 G- 분염볍을병행하 여살시한결파일반염색에서확안할수없었던염색 체의이상을 G- 분염법을질시하여정확한염색체의 고유번호와쿠조적이상을분석확안할수있었다. 다음도표들은일반염색과 G- 분염법을통해비교분 석하여염색체의군조이상을관찰한결과이다. 증례 1. 46, XY, -9, + HSR(9) 이환자는출생 2 일된아기로서심한쿠개열이있어 의뢰된경우이다. Fig. 1 에서제시한바외 - 같이일만염색상에서는염 색체의이상을확인할 수없었으나 G- 분염볍을잘시 하여쿠조이상을확안할수있었다 (Fig. 1-1 참조 ). 염색체지도를통해서자세허그기천을섣명한것 은 Fig. 1-2 이다. 증례 2. 47, XY, inv(9),

훌률웰?혔했A, 홉쫓 ι輸g 鍵짧 F ~ 藝 풀쫓 { 옳를* 1 옳옳 11 c 훌짧 옳훌 훌솔 13 14 15 E 앓훌 17 '8 F 2c G 훌.A 훌옳 Fig. 1-2.

3 훌률웰?혔했A, 홉쫓 ι輸g 鍵짧 F ~ 藝 풀쫓 { 옳를* 1 옳옳 11 c 훌짧 옳훌 훌솔 E 앓훌 17 '8 F 2c G 훌.A 훌옳 Fig G-banded partial karyotype showing compare chromosome 9 with homogeneously staining region due to gene amplification of chromosome 9. Fig. 1. Conventional karyotype with the chromosome constitution, 46, XY,? 이환자는 5 세된남아로서아주섬한지능장애 (mental retardation) 가있었고안면파두부의소견은요두 Down Syndrome 의특징적임상소견을나타내었우며 양손에 simian crease( 鐘線 ) 가있었으며선천성심장 기형이합병되어있었다. c 술훌쫓훌藏繼앓E 생 ~ ~.:.~. 옳 1$ 17 훌 F 樓數響 I 풍 g 짧옮 Fig Trypsin Giemsa banded karyotype with the chromosome constitution, 46, XY, HSR(9). ε 혔썩썼*없혔 * J * 혔* 홉驚 *f1 ** 쨌짧앙* 었 옳 f Fig. II. Conventional karyotype with the chromosome constitution, 47, XY, 十 2 1.?

< 염색체분석결파 21 번염색체가하나더있는것으로만일반염색상으로나타났으냐 (Fig. 11) G-분염볍결파 9 벤염색체의중심절 (centromere) 을기준으로역위 (inversion) 떤상이있었다 (Fig. n -1). Fig. n-2는염색체지도를통하여염색체의파열 (breaks) 부위플표시하여설명한것이다. 중례 3.

4 < 염색체분석결파 21 번염색체가하나더있는것으로만일반염색상으로나타났으냐 (Fig. 11) G-분염볍결파 9 벤염색체의중심절 (centromere) 을기준으로역위 (inversion) 떤상이있었다 (Fig. n -1). Fig. n-2는염색체지도를통하여염색체의파열 (breaks) 부위플표시하여설명한것이다. 중례 3. 45, X/146, X, i(xq) 이환자는 23 세의여성으로서원발성우월경 (primary amenorrhea) 을주소로내원하였다. 유방은발달하지않았으며액모 (ax i1l ary hair) 외- 치모 (pubic hair) 도없었다. 임상검사에서 LH (lutenizing hormone) 는 mlμ Iml, FSH(foUicle stimulating hormone) 는 mlμ Iml, prolactin ng/dl, TSH(tyroid stimulating hormone) 도 4. 1μμ Iml로모두정상상한치블보였 으며흰-자의염색체분석결파는얻반염색에선불가능하여 (Fig. III, fig. III-2 참조 ). G-분염법을살시한결괴 (Fig. III-1, III-3 참조 ) X 염색체하나가모자라는 세포와 X 염색체의단완 (short arm) 부분이소실되고 강완 (l ong arm) 부분이복제 (replication) 되어장완 (l ong arm) 과만완 (short arm) 의모양괴- 걷이가같은등완염 Table 1. An abnormal female karyotype in a subject (case-3) with Turner syndrome at 23 years old 1 44 I 45 I 효 { 꾀폐 Total N 잉 b 많 rc 앓 S J 2 I 58 I Karyotype : 45, X/46, X,i(Xq) Fig. n -1. Trypsin-Giemsa banded karyotype with the chromosome constitution, 47, XY, inv (9) (pllq21), 十 2 1. A 10 '1 2 D 옳옳했썼짧짧 ls E : F 1 앓 l{~ G #. 옳 ~" x Fig. n -2. Partial karyotype showing compare normal chromosome 9 with the pericentric Fig. m. Conventiona l. karyotype with the chromosoinversion chromosome 9(pll ; q21). me constitution, 45, X?

$r쨌옳ι : μ 썼&앓@옳8%** %A 찮활 2 '<< 흉했 ~ c 홍 *, 정짧 * 흉鍵警 ---- "'~._- 4 -_ 싸앓영양 e 훌 '1111... --- $? 9 10' 11 12 g 훌짧쭉짧 13 14 í5 * 명 ~ 캅훌쓸 "'!\ 영.. * i ξ 짧옮 '1< ι 16 17 18 S 싫 * γ $ 3* % 씩k F. ~ t 었용 짧.$

5 r쨌옳ι : μ 썼&앓@옳8%** %A 찮활 2 '<< 흉했 ~ c 홍 *, 정짧 * 흉鍵警 ---- "'~._- 4 -_ 싸앓영양 e 훌 ' $? 9 10' g 훌짧쭉짧 í5 * 명 ~ 캅훌쓸 "'!\ 영.. * i ξ 짧옮 '1< ι S 싫 * γ $ 3* % 씩k F. ~ t 었용 짧... 썼 -~---" ~~ ji 19 2' "''le. 영, 'l!"> G.ø x 4f*v!f, 환lDlOGRAM ~X \'1 ~,",..,. g 녕,~. "ìf 홍 & ι " ~... ~ & 영 ~, & K '<\0 ι.. ~...,.~ k << ~;_, '.. 톨훌뺑흉繼훌짧짱*쩡ι$ 앓썼훌&%* 혔쨌 vf 훌쓸쓸總 $ 해쫓 )( í\)(q) γgg 용Fig. III -1. Trypsin-Giemsa banded karyotype with the chro mosome constitution, 45, X. Fig. III -3. Trypsin-Giemsa banded karyotype with the chromosome constitution, 46, X,i(Xq) arrows indicate an isochromosome X. 훌 * 훌 x 홉 * 쫓 io(q) Fig. III -2. Conventional karyotype with the chromosome constitution? 색체 (i sochromosome) 으로분석되었다. Fig. m-4 는염 색체지도상무휴섣명한것이다 ( 염색체검사소견은 Table-1 참조 ). 고 ~~ E크 냥옳 *br%k % nt 講 r 빠 li t. 뿔 ft;: p~t~~ 상 OrL 혔 뺑 r - ð". _-'._", _:Iml'I:. _ -.'_- ';;1.. ~ - x i {)(, 쩍, Fig. III -4. Partial karyotype showing compare normal X chromosome with an isochromosome of chromosome X. Below part is diagrammatic representation of the origin of an isochromosome. 주장한이온처리법 (ionic treatment )í) 파 Yoshida 등이주장한 Urea 볍 8) 및 Shiraishi 와 Wang 파 Federoff 등의 trypsin 과 EDTA 흔합액에서의 G 분염법 9) 파 ph G- 분염법에대한보고는 1971 년어 1 Evans et al 이에의한 Giemsa-9 banding(patil, Merrick and Lubs)lO )o

6 파 Giems1-11 banding(gagne and Laberge)ll) 이있 며 1973, 건 Seabright에의한 trypsin banding 방법 12) 과 ficin, bromelin, papain등의다른단백질효소를 사용한방엽 13) 빛 1974 년에 Sun, et al 의 Giemsa, trypsin혼합액 망업 14) 파가장최근어1 Trusler가주장깐.c ollagenase를사용한망뱀 15) 등이보고되였었다. 본저자들은 Y oshida et a1의 Urea블사용하는양법 8) 을시행해보았으나않은 band를보기에걱합하지않았으며 Giemsa-9 분염엽은재생력이뒤델어지며샅험해마다어려운점이있었고 Giemsa-11 분염법은결과를얻지뭇하였다. Wang et a1 아주장한 trypsin, EDT A9) 혼합용액에서의살험은재생력도좋고효소처리가천천히진행되묘로얀정성있게살험할수있었으냐시간소모가 염색체의이상을 Turner syndrome이라고한다. 이러한성염색체의 mosaicism은수정란의제 1 난분할 l 후의어느분할기에변칙적유사분열즉, 정염색체의부분리 (sex chromosome nondisjunction) 에거안된것우로해석된다. 지금까지의실험에서는염색체의쿠조이상에대해서는 G-분염법이잘행해졌느냐의유무에따라다소차이가있을것으로사료되며금후염색체기술이더욱개말되어여러분염법에돼해염색체이상, 특히마세한염색체의쿠조이상을찾아낸다면많은염색체의떤형이발견된것오로추리되며븐보고에서는많은염색체의쿠조이상에대해논할수없으묘로그중 3예만보고하였마. 많은것이단점이었다. 가장좋은성적을거둘수있는살험방엽은 Seabright 어1 의한 trypsin을사용하는 켜 c 론 방엽이었으며 12) 이방법은신속한시간과간련한살험 방볍으로재생펙도 100% 에 파를얻었마. 가까울만큼만족스러운결 Seabright 등이보고한다른단백칠효소 (ficin, bromelin, papain) 를이용한 G- 분염볍 13) 은아직살험을 해보지않았으묘로추후에보고하기로한다. 특히 G- 분염법을시행하기전유의해야할것은세포 의배양상태가양호해야하며배양상태가양호하려면 우선배지의영양상태가좋아야하고정확한 ph 와배 지성분등의알맞은조성이 이루어져야하며 incubator 의경확한온도유지와세균이나 virus 의오염이있어 서는안된다. 중기세표를포휘하는데에있어서도고청 액의상태나저장액의농도등도고려해야하며특히세 포블골고루화합시키기 져야한다. 위한 pipetting 도철저히행해 한펀증례 1, 2, 3 을살펴보면증례 1 의 46, XY, -9, +HSR(9) 의핵형을가진환자는염색체 분석후수개 월살지뭇하고사망하였다. HSR 은동질염색부위 (ho ID:)geneously staining region) 로서 Ratt :'1 er 14 ) 등에의 해암서 1 포에서만발견된다는보고가있다. 증려 1 2 의 47, XY, inv(9), +21 의핵헝윷가진환자 는 21 먼염색체가하나더있는 tris:)my 21 과 9 벤의 염색채중하나에중심철 (cen tromere) 을기준무로역위 (inversion) 현상이있었다. chromos:)me 이하고딴다. 이란염색체릅 inversion 증례 3 헤서의 45, X;45, X, i (Xq) 의헥형을가진환 자는성염색체의조합에이상이있어 2 종의세포릎가 지고있었다. 2 종의세포즉, 45, X 와 46, X, i(xq) 가 4: 1 로흔재하는 m:)s1icism 을나타내였으며이와같은 염색체이상이의심되어의뢰된환자들중잎만염색볍오로정확한분석이어려웠던경우블 Trypsin을이용한 G-분염법을실시하였던바증례 1의 (46, XY, -9, +HSR(9)) 에서는 9 먼염색체중하나에유전자중독 (gene amp1ification) 현상이있었마. 증례 2의 (47, XY, inv(9), +21) 은 21 먼염색체가하나더있는 Down Syndrome 이었 A며동시에 9 벤염색체중하나가중성설 (centromere) 을기준으로역위 (i nversion) 되었다. 증례 3에서는 45, X;46, X, i (Xq) 에서는염색체가 하나없는제포와 X 염섹체중하나가단완 (short 부분이소살되고장완 (long arm) arm) 쑤분이복제 (replication) 된 iso chromosome X 로분석되었다. 따라서염색체의쿠조이상 (structural abnormalities) 을확인하는데는 trypsin을이용한 G-분염법에마른방법에비해좋은결파릎얻을수있었다. 참고문헌 1) Caspersson, T. and Zech, L., Chromosome identification techniques and applications in biology and medicine. Nobel symposium 23., NewYork, Academic press, ) Moûrhead,P.S., P.C. Nowell, W.]. Me l1man, D.M. Battips and D.A. Hungerfordl Chromosome preparations of leukocytes cultured from human peripheral blood. Exp. cel1. Res 20, 613, ) Arakaki, D.T. and R.S. sparkes, Micro-technique for cultured leukocytes from whole blood

7 Cytogenetics 2, 139rv152, ) Paris Conference Supplement, Standardization in human Cytogenetics, Cytogenet. Cell Genet. 18 : 201rv238, ) Paris Conference, Standardization in human Cytogenetics 11 ; 313/"'V362, ) ISCN: An international system for human Cyto genetic nomenclature. Cytogenet. Cell Genet, 21, 3Q9rv409, ) Evans, H.]., Buckton, K.E., and Sumner, A.T., Cytological mapping of human chromosomes. results obtained with quinacine fluorescence and the Acetic-Saline-Giemsa technique, chromosoma, 35, 31Qrv325, ) Arunkumar Sharma, Archana Sharma., chromosome technique, Theory and Practice, 3rd., Butterworths Co., pp. 422rv424, ) Wang, H.C. and Federoff, P.S., Banding in human chromosomes treated with trypsin. Nature Ne\V Biol 235, 52rv54. 10) Patil, S., Merrick, S., and Lubs, H.A., Identification of each human chromosome with a mod ified Giemsa stain, science 173, 821rv833, ) Gagr:e, R. and Laberge, C., Specific cytological recognition of the heterochromatic segment of number 9 chromcsorr.e in man, Exp. cell. Res., 73, 239/"'V242, ) Seabright, M., Improvement of trypsin method fer banding chromcscrr.es. Lancet i, 1249, ) Seabright, M., A rapid banding technique for human chromosomes. Lancet ii, 97lrv972, ) Rattner, ].B., and C.C. Lin, Ultrastructural organization of double minute chromosomes and HSR regions in human colon carcinoma cells. Cytcgenet. Cell Genet, 38, 176rv181,

Can032.hwp

Can032.hwp Chromosomal Alterations in Hepatocellular Carcinoma Cell Lines Detected by Comparative Genomic Hybridization Sang Jin Park 1, Mahn Joon Ha, Ph.D. 1, Hugh Chul Kim, M.D. 2 and Hyon Ju Kim, M.D. 1 1 Laboratory