30-4.hwp

Size: px

Start display at page:

Download "30-4.hwp"

덕환 전
4 years ago
Views:

1 Kor J Oral Maxillofac Pathol 2006 ; 30(4) : 흰쥐에서사람치아회분말과연석고매식후치유과정에서아미노산수송계 L의역할 안영재, 김수관, 윤정훈, 안상건, 김학균, 문성용, 김도경 * 조선대학교치과대학구강생물학연구소 ABSTRACT Role of Amino Acid Transport System L in the Healing Process after the Implantation of Human Particulate Dentin and Plaster of Paris YoungChae Ahn, SuGwan Kim, JungHoon Yoon, SangGun Ahn, HakKyun Kim, SeongYong Moon, Do Kyung Kim* Oral Biology Research Institute, Chosun University College of Dentistry, Gwangju , Korea System L amino acid transporter is a major route for providing living cells with neutral amino acids including several essential amino acids. To elucidate the expression pattern of Ltype amino acid transporter 1 (LAT1) in the bone formation process, the expressions of LAT1 and its subunit 4F2 heavy chain (4F2hc) were investigated in the healing process after the implantation of bone graft materials in the calvarial osseous defected rats. Circular calvarial defects (1 cm in diameter) were made midparietally. The rats were divided into 4 groups of 1 control group and 3 experimental groups. In the control group, the defect was only covered with soft tissue flap. In the experimental groups, they were filled with human particulate dentin (particulate dentin group), with plaster of Paris (plaster of Paris group) and with the mixture of human particulate dentin and plaster of Paris with ratio of 2 : 1 by weight (mixture group). The rats were sacrificed at the 1, 2, 4 and 8 weeks after operation and the RTPCR analysis and immunohistochemical analysis were performed. In the RTPCR analysis, the mrnas of LAT1 and 4F2hc were strongly detected in all 4 groups. In the immunohistochemical analysis, at 1 week after operation, the LAT1 protein and its subunit 4F2hc protein were mainly expressed in the osteoblasts, osteocytes and interstitial tissues of the around the defect and inner part of newly forming bone in all 4 groups. The expressions of LAT1 and 4F2hc proteins were decreased at 2 and 4 weeks after operation. The LAT1 and 4F2hc proteins were scarcely expressed at 8 weeks after operation in all 4 groups. These results suggest that the LAT1 and its subunit 4F2hc highly expressed at the early stage of new bone formation and may have an important role in providing cells with neutral amino acids including several essential amino acids at that stage. Key words:amino acid transport system L, Bone regeneration, Particulate dentin, Plaster of Paris I. 서론 *Correspondence:Do Kyung Kim, Department of Oral Physiology, Chosun University College of Dentistry, #375 Seosukdong, Donggu, Gwangju , Korea, Tel: kdk@chosun.ac.kr 본연구는보건복지부보건의료기술진흥사업 ( 과제고유번호 : A050142) 의지원에의하여이루어진것임. 구강악안면영역에서발생한낭, 골절, 종양등의재건과악교정외과술및임프란트매식시골결손부에대한골이식의필요성은증가하고있으며, 특히최근들어임프란트가치과외래진료의중요한부분으로자리잡게되면서이러한

2 골결손부의치료에대한관심이더욱증가하였다. 골이식재의종류로는자가골, 동종골, 이종골, 골대체물로분류할수있으며, 이러한골이식재료들은즉시사용이가능하고, 면역반응을일으키지말아야하고빠른골생성및재혈관화를촉진하여야하며, 또한골지지와연속성을유지하는등의기본적인조건을만족시킬수있어야한다 1,2). 골이식재종류중, 자가골이이식후예후가가장좋다고알려졌으나, 자가골은얻을수있는골량의한계, 부가적인수술을요한다는점, 수술후예상하지못한만기흡수등의여러단점들이있다 3,4). 이러한단점들을보완하기위하여금속, 합성수지, 도재 (ceramic) 등과같은다양한재료들이개발되어임상에서사용되고있으며, 현재여러연구자들에의해계속적인신소재개발이진행되고있다 5). 현재시판되어치과임상에서주로사용되고있는골이식재로서는생체적합성과골전도성을갖는 deproteinized natural bovine cancellous bone mineral로구성된이종골이있으며, 치과임상에치아회분말과치과용연석고의적용을위해많은연구들이진행되고있다 6,7). 치아회분말 (particulate dentin) 의주구성성분은수산화인회석이며, 수산화인회석은생체적합성이높고높은압축강도를갖고있어경조직재건술, 심미성형술및인공치아매식술에도도입되어활발하게사용되었으나, 이식시재료가굳을때까지그과립을유지하는것이힘들며고가등의단점이있다 8). 연석고 (plaster of Paris) 는쉽게사용이가능하고무균처리가가능하며흡수가빠른생체적합재료로알려져있다 9). 또한연석고는치아회분말을고정시키는기질로서작용하며효과적인 delivery system 을제공한다고도알려져있다 9). Kim 등 6) 은수산화인회석과치과용연석고의혼합비율에대한실험적연구에서치아회분말단독이식군, 치아회분말과치과용연석고를무게비 2:1, 3:1 및 4:1로혼합한실험군에서는조직병리학적으로상호간에골전도의차이가없었으나, 치과용연석고단독이식군에비해서는현저하게양호한골전도현상을관찰할수있었으며, 치과용연석고가치아회분말의유동성을감소시킬수있었다고보고하였다. 그러나이러한골이식재들에의한골전도및골형성의골치유에대한분자적인기전은밝혀지지않았다. 골이식재들의골전도및골형성에는고밀도의신생골형성이필수적이며, 고밀도의신생골형성을위해많은단백합성과정과단백합성을위한기질인아미노산의세포내유입이증가하여야할것이다. 세포내로아미노산수송의증가는아미노산을수송할수있는아미노산수송체의과발현에의해유도될것으로생각되나이와같은실험적증거및 특히 bone healing에관한분자적인기전은전혀밝혀지지않았다. 아미노산은단백합성의기질이되는기능이외에도, 포도당, 퓨린, 피리미딘등많은생체분자들의합성을위한전구물질이되므로생체내필수영양물질중의하나이다 10). 생체분자의생합성반응은주로세포내에서이루어지고아미노산은세포막을투과하기어려운친수성물질이므로, 세포는아미노산을세포의밖에서세포의안으로수송하기위한수송단백 ( 아미노산수송체 ) 을세포막에필수적으로보유해야한다. 세포내대사가특이적으로항진되거나계속적인증식과성장이필수적인세포들에는아미노산수송체의기능이상승되어단백합성을위한아미노산의공급이활발하게되며, 이는이들세포내아미노산의공급을위한아미노산수송체들의발현이특이적으로과발현됨에의해서이루어진다고알려져있다 10). 아미노산수송계 L은 Na비의존적으로중성아미노산을주로수송하는세포막단백으로서종양세포를포함한대부분의세포에서중성아미노산의주경로가되는아미노산수송체로알려져있다 10,11). Kanai 등 12) 에의해아미노산수송계 L의첫번째아형인아미노산수송체 Ltype amino acid transporter 1(LAT1) 이 C6 rat glioma cell에서동정되었다. LAT1은 12회세포막을관통하는막단백으로서 Na비의존적으로 leucine, isoleucine, valine, phenylalanine, tyrosine, tryptophan, methionine 과 histidine 같은구조가큰중성아미노산을수송하는특징을가지고있다 12,13). LAT1 은 4F2 heavy chain(4f2hc) 이라는 1회세포막을관통하는막단백과 disulfide 결합을가진 heterodimer 형막단백이며, LAT1 이기능을나타내기위해서는보조인자 4F2hc의존재가필수적이다 1215). 중성아미노산수송체 LAT1은종양세포와같이세포내대사가특이적으로항진되거나계속적인증식과성장이필수적인세포에서과발현되어세포의계속되는성장에중요한역할을한다고알려져있다 12,13). 아미노산중필수아미노산은세포자신이합성하지못하므로세포외로부터세포내로수송되어야한다. 생체내아미노산수송체들의역할은모두중요하지만, 그중에서특히아미노산수송계 L은그수송기질이필수아미노산을포함한대부분의중성아미노산이므로매우중요하게인식되고있다 10,12). 골이식재들의골전도및골형성과정시필수적인고밀도의신생골형성과정에서도 LAT1을포함한아미노산수송체들의과발현현상이나타나리라사료되지만이와같은 194

3 아미노산수송체들의발현에관한실험적증거및분자적인기전을밝히는연구는거의없었다. 따라서본연구에서는치아회분말, 연석고및혼합재들의매식후치유과정에서 LAT1 및그보조인자 4F2hc의발현을관찰하여신생골형성과정에서중성아미노산수송체 LAT1의발현양상및역할을밝히고자하였다. II. 재료및방법 1. 실험동물및실험재료 1) 실험동물동일조건하에서일정기간사육한체중 200gm 이상의 SpragueDawley 백서를암수구별없이사용하였으며, 먹이와물은제한하지않았다. 2) 매식재료 (1) 사람치아회분말사람에서발거된상태가양호한치아들을생리식염수로세척한후, 950 훠니스에서회화하여약제분말기에서 100mesh(0.149mm) 의미세한입자크기로분쇄하여매식재로이용하였다. (2) 치과용연석고치과에서주로사용하는연석고 (plaster of Paris, Calcium sulfate hemihydrate, Gypsum Co., USA) 를구입하여매식재로사용하였다. (3) 매식재의혼합치아회분말과치과용연석고를무게비 2:1로혼합하여종이에포장한후, ethyleneoxide gas 로멸균처리하여매식재로이용하였다. 3) 실험재료 Affinitypurified antilat1 및 4F2hc 항체는 Kumamoto Immunochemical Laboratory, Transgenic Inc.(Kumamoto, Japan) 으로부터제공받아사용하였으며, 실험에사용한기타시약들은 analytical grade를구입하여사용하였다. 2. 실험방법 1) 매식재의매식염산 ketamine(90mg/kg, 유한양행 ) 과 xylazine(10mg/kg, 바이엘코리아주식회사 ) 를흰쥐의대퇴부에근육주사하여마취시키고감염방지목적으로 gentamicin(5mg/kg, 삼우제약 ) 을근육주사한후, 수술부를제모하고소독하였다. 2% lidocaine HCl(1:100,000 epinephrine 함유 ) 을지혈목적으로주사한후, 두개골정중부를절개하여골막을노출시켰다. 노출된두개골의정중앙부에 #1/4 round bur 을이용하여직경 1cm 크기의원형으로전층골결손을야기시킨후, 실험1군은대조군으로아무런이식을시행하지않았고실험 2군은사람치아회분말을, 실험3군은치과용연석고를이식하였으며, 실험4군은사람치아회분말과치과용연석고를무게비 2:1로혼합하여멸균한이식재를이식하였다. 수술후철저하게창상세척및소독을하였으며, 골막을포함하여층별로견고하게봉합하였다. 2) 실험동물의희생실험 1, 2, 4 및 8주가경과한후, ether 를과도흡입시켜희생시키고실험부의시편을채취한후, 일부는중성 formalin 용액에고정하여보관하고, 일부는질소탱크에보관하여 RNA 정제시사용하였다. 실험1군 ( 대조군 ), 실험2군, 실험3군및실험4 군의 1, 2, 4, 및 8주군에백서를각각 4마리씩배정하여, 총 64마리의백서를사용하였다. 3) 병리조직학적관찰매식된경계부를포함하여조직편을채취한후, 일정기간고정하고탈회및포매과정을거쳐 HematoxylinEosin 으로이중염색하여광학현미경으로흡수정도, 신생골의형성및염증반응유무등의치유과정을분석하였다. 4) 아미노산수송체 LAT1 과그보조인자 4F2hc 의발현 (1) RTPCR analysis 질소탱크에보관한각실험군들의시료로부터 TRI REAGENT kit(molecular Research Center, Inc., Ohio, USA) 를이용하여 total RNA 를추출한후, 자외선분광기 (UV spectrophotometer) 를이용하여 260nm에서흡광도를측정하였다. cdna 합성을위하여 5μg 의 total RNA 를 reverse transcriptase(invitrogen Life Technologies, Carlsbad, California, USA) 와 oligo(dt) primer를이용하여 42 에서 1시간동안역전사반응을시행하였다. 합성된 195

4 Table 1. Primer sequences for PCR of LAT1 and 4F2hc Prime Name Sequence (5' 3') PCR product (bp) LAT1 (sense) LAT1 (antisense) 4F2hc (sense) 4F2hc (antisense) CAATGGTGTGGCCATCATAG GATGCATCCCCTTGTCCTAT TCACAGGCTTATCCAAGGAG TACAATGTCAGCCTGAGGAG cdna 를이용하여 LAT1 및 4F2hc의각 primer(table 1) 로 PCR을시행하였다. PCR 반응은초기변성반응을 94 에서 12분, 변성반응을 94 에서 30초, 결합반응을 60 에서 30 초, 중합반응은 72 에서 45초간 30주기를반복하고마지막중합반응은 72 에서 30분간연장하여반응시켰다. RTPCR 반응산물은 1.2% agarose gel 에서전기영동하여확인하였다. (2) 면역조직화학염색각실험군의표본을 xylene 용액에서 30분간침수시켜파라핀을제거하고 95%, 90%, 70% 에틸알콜과증류수에순차적으로함수하였다. 3% H2O2 로 20분간 endogenous peroxidase 를제거한후 goat serum 에 30분간반응시켰다. LAT1 및 4F2hc의일차항체를 3% bovine serum albumin(bsa) 이포함된 PBS 용액에희석하여반응시킨후, Trisbuffered saline(tbs) 를이용하여 10회세척하고, 이차항체에 30분간반응시킨다음다시 TBS에서 10회세척하였다. 염색한시료를 3,3diaminobenzidine tetrachloride 와 hydrogen peroxide 를이용하여발색시킨다음 Meyer 씨 hematoxylin 으로대조염색하여광학현미경으로관찰하였다. III. 결과 1. 병리조직학적관찰 1) 대조군 ( 골결손 ) 1주에육아조직의형성이특징이었고, 골결손부에인접한골편에서는골모세포의활성이미약하였다. 2, 4주를거치며염증과부종상이감소하고골결손부에인접한골편에서는신생골소주의형성이활발하고골소주주위로는골모세포의활성도가증가하였다. 8주에는 4주군에비해신생골의양이더욱증가하고역전선이뚜렷하였다. 2) 사람치아회분말매식군 1주에는대조군과유사하고결손변연부에서는소수의신생골소주가증식하였고골소주주위로는왕성하게골모세포가증식하였으며, 이는일부매식체와연결되고있었다. 2 주에골결손부에서증식하는신생골소주의증식이활발하였으며그변연부에는골모세포의활성이증가하였고, 일부는골양조직이매식체와유합하여매식체의일부를피복하는소견이관찰되었다. 4주에는골결손부에서매식체주위에결합조직의개재가없이완전히신생된골소주로피복되어기존골과융합되는소견을보였다. 8주에골결손부에서는매식체주위에신생된골소주로완전히피복되어기존골과융합되어있어구분이어려웠고역전선이나신생골내부에있는매식체의존재로만구분이가능하였다. LAT1 4F2hc A B C D E F G H 500 bp 500 bp Fig. 1. Detection of mrnas of LAT1 and 4F2hc by RTPCR. The LAT1specific PCR product (527 bp) and 4F2hcspecific PCR product (499 bp) were obtained from all experimental groups. A (LAT1; control group), B (LAT1; particulate dentin grafting group), C (LAT1; plaster of Paris grafting group), D (LAT1; particulate dentinplaster of Paris mixture grafting group), E (4F2hc; control group), F (4F2hc; particulate dentin grafting group), G (4F2hc; plaster of Paris grafting group), H (4F2hc; particulate dentinplaster of Paris mixture grafting group). 196

5 Table 2. Expression of LAT1 protein in bone regeneration after the implantation of particulate dentin and plaster of Paris Control 1 week Particulate dentin 1 week Plaster of Paris 1 week Mixture group 1 week Extracellula matrix / / / / Osteoid Osteoblast Osteocyte / / / / / / / / / / Table 3. Expression of 4F2hc protein in bone regeneration after the implantation of particulate dentin and plaster of Paris Control 1 week Particulate dentin 1 week Plaster of Paris 1 week Mixture group 1 week Extracellula matrix / / / / / Osteoid Osteoblast Osteocyte / / / / / / / / / / / / / / / / 3) 치과용연석고매식군 1주에기존골의결손변연부에서는소수의신생골소주가증식하였지만연석고괴와는분리되어있었다. 2주에는기존골의결손변연부에서는신생골소주의증식이 1주군에비해다소증가하였지만연석고과립과는분리되어있었다. 4 주에는기존골의결손변연부에서는신생골소주의증식이 2주군에비해증가하였지만연석고과립과는유합되지않았다. 8주에는기존골의결손변연부에서는신생골소주의증식이 4주군에비해증가하였지만연석고과립과는유합되지않았다. 197

6 4) 사람치아회분말과연석고 (2:1) 혼합매식군 1주에는기존골의결손변연부에서는소수의신생골소주가증식하였지만매식체와는분리되어있었다. 2주에는골결손부에서증식하는신생골소주의증식이활발하며그변연부에는골모세포의활성이증가하고, 일부는골양조직이매식체와유합하여매식체의일부를피복하는소견이관찰되었다. 4주에는골결손부에서는매식체주위에결합조직의개재가없이완전히신생된골소주로피복되어기존골과융합되는소견을보였다. 신생된골내부에는역전선이뚜렷하고그변연부에는골모세포의증식이활발하였다. 8주에는골결손부에서는매식체주위에신생된골소주로완전히피복되어기존골과융합되어있어구분이어려웠고역전선이나신생골내부에있는매식체의존재로만구분이가능하였다. 2. 아미노산수송체 LAT1과그보조인자 4F2hc의발현 1) LAT1과 4F2hc의 mrna 발현각실험군들에서아미노산수송체 LAT1 및그보조인자 4F2hc mrna 의발현을확인하기위하여, 각시료의 total RNA 와각각의 primer(table 1) 을이용하여 RTPCR analysis 를시행하였다. 대조군, 치아회분말매식군, 치과용연석고매식군및치아회분말과연석고혼합매식군의모든실험군에서 LAT1 및그보조인자 4F2hc mrna 의발현을관찰할수있었으나, 매식 1주군에서 LAT1 및 4F2hc mrna 의발현이두드러졌다 (Fig. 1). 2) LAT1과 4F2hc의단백발현조직에분포하는다양한유형의세포를, 면역조직화학적으로 LAT1과 4F2hc 단백의발현정도에따라강한발현은, 중등도, 미약한발현은 로등급하였고, 국소적이거나의심이될만한발현을보이는경우는 /로나타내었다. LAT1 과 4F2hc 단백의면역조직화학적연구결과를요약하면각각 Table 2 및 3과같다. (1) 대조군 ( 골결손 ) LAT1 단백은 1주군에서는주로골결손부에서새로형성되는신생골주위와내부의골모세포, 골세포및간질조직에서중등도로발현되었다 (Fig. 2A). 2주, 4주및 8주로시간이경과함에따라 LAT1 단백의발현이감소되어 8주에서는거의발현되지않았다. 4F2hc 단백은 1주군에서는신생골주위와내부의골모세포, 골세포및간질세포에서미약하게발현되었다 (Fig. 2B). 2 주, 4주, 8주군에서는 4F2hc 의단백이거의발현되지않았다. (2) 사람치아회분말매식군 LAT1 단백은 1주군에서는주로골결손부에서새로형성되는신생골주위와내부의골모세포와골세포에서강하게발현되었으며매식체주위의간질세포에서도강한발현을보였으나매식체자체에서는발현되지않았다 (Fig. 3A). 2 주, 4주, 8주로시간이경과함에따라 LAT1 단백의발현이점차감소하는경향을보였다. 4F2hc 단백은 1주군에서는신생골주위와내부의골모세포와골세포그리고매식체주위의간질세포에서강하게발현되었다 (Fig. 3B). 2주, 4주, 8주로시간이경과함에따라 4F2hc 단백의발현은점차감소하였다. (3) 치과용연석고매식군 LAT1 단백은 1주군에서는주로골결손부에서새로형성되는신생골주위와내부의골모세포및골세포에서강하게발현되었고매식체주위의간질세포에서도중등도의발현을보였다 (Fig. 4A). LAT1 단백의발현은 1주에비해 2주군에서급격히감소하였으며, 4주및 8주에서도 2주군과유사한발현양상을보였다. 4F2hc 단백은골모세포및간질세포에서미약하게발현하였으며, 이는모든실험기간에서동일한양상을보였다 (Fig. 4B). (4) 사람치아회분말과연석고 (2:1) 혼합매식군 LAT1 단백은 1주군에서는주로골결손부에서새로형성되는신생골주위와내부의골모세포및골세포에서강하게발현되었고매식체주위의간질세포에서도중등도의발현을보였으며매식체자체에서는발현되지않았다 (Fig. 5A). 2 주, 4주및 8주로시간이경과함에따라 LAT1 단백의발현이감소하는경향을보였다. 4F2hc 단백은 1주군에서는신생골주위와내부의골모세포및골세포에서중등도로발현되었다 (Fig. 5B). 매식체주위의간질세포에서도중등도의발현을보였다 (Fig. 9). LAT1과유사하게 4F2hc 단백의발현도 2주, 4주및 8주로시간이경과함에따라그발현이감소하였다. 198

Fig. 2 A. Fig. 2 B. Fig. 3 A. Fig. 3 B. Fig. 4 A. Fig. 4 B. Fig. 5 A. Fig. 5 B. Fig. 2. A. Expression of LAT1 protein in the control group (1 week).

Expression of 4F2hc protein in the control group (1 week). 4F2hc was minimal expression in the osteoblasts, mesenchymal cells (x 200). Fig. 3. A.

LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). B.

4F2hc was highly expressed in the osteoblasts and surrounding mesenchymalcells around graft materials (x 200). Fig. 4. A.

LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials.

Minimal 4F2hc expression was found in the osteoblasts and surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). Fig. 5. A.

LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). B.

4F2hc was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials.

7 Fig. 2 A. Fig. 2 B. Fig. 3 A. Fig. 3 B. Fig. 4 A. Fig. 4 B. Fig. 5 A. Fig. 5 B. Fig. 2. A. Expression of LAT1 protein in the control group (1 week). LAT1 was moderately expressed in the osteoblasts and surrounding mesenchymal cells (x 200). B. Expression of 4F2hc protein in the control group (1 week). 4F2hc was minimal expression in the osteoblasts, mesenchymal cells (x 200). Fig. 3. A. Expression of LAT1 protein in the particulate dentin grafting group (1 week). LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). B. Expression of 4F2hc protein in the particulate dentin grafting group (1 week). 4F2hc was highly expressed in the osteoblasts and surrounding mesenchymalcells around graft materials (x 200). Fig. 4. A. Expression of LAT1 protein in the plaster of Paris grafting group (1 week). LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials. There was nonspecific expression in the graft matrials (x 200). B. Expression of 4F2hc protein in the plaster of Paris grafting group (1 week). Minimal 4F2hc expression was found in the osteoblasts and surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). Fig. 5. A. Expression of LAT1 protein in the particulate dentinplaster of Paris mixture grafting group (1 week). LAT1 was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials (x 200). B. Expression of 4F2hc protein in the particulate dentinplaster of Paris mixture grafting group (1 week). 4F2hc was highly expressed in the osteoblasts and moderate expression of surrounding mesenchymal cells around graft materials. There was nonspecific expression in the graft matrials (x 200). 식군, 치과용 연석고 매식군 및 치아 회분말과 연석고 혼합 매식군의 모든 실험군에서 LAT1 및 그 보조인자 4F2hc mrna의 발현을 관찰할 수 있었다(Fig. 1). 아미노산 수송 계 L의 첫 번째 아형인 LAT1은 정상 조직에서는 뇌, 태반, 12,13) 정소 등 그 발현하는 부위가 매우 제한되어 있다. 또 LAT1은 종양세포에서 과발현되며, 세포의 계속되는 성장에 12,13) 중요한 역할을 한다고 알려져 있다. 아미노산 수송계 L 의 두 번째 아형인 Ltype amino acid transporter 2(LAT2)는 대부분의 사람 장기에서 발현하고 있으며, 특히 IV. 고찰 본 연구에서는 골 이식재들의 골전도 및 골형성 과정시 필수적인 고밀도의 신생골 형성과정에서 아미노산 수송체 LAT1의 발현양상 및 역할을 밝히기 위해, 치아회분말, 연석 고 및 혼합재들의 매식 후 치유과정에서 LAT1 및 그 보조인 자 4F2hc의 발현을 관찰하였다. 아미노산 수송체 LAT1 및 그 보조인자 4F2hc mrna 발 현을 조사하는 RTPCR 기법을 통해 대조군, 치아회분말 매 199

8 심장, 뇌, 태반, 신장, 비장, 전립선, 정소, 난소, 림프절및태아의간등에서많은발현을하고있다 16,17). 사람의신장암세포인 T24 human bladder carcinoma 세포 18) 와사람의구강암세포인 KB human oral epidermoid carcinoma 세포 19) 에서도 LAT1의발현을확인할수있었으나 LAT2의발현은관찰할수없었다. 따라서아미노산수송체를연구하는많은연구자들은여러문헌을통하여 LAT1은암세포형중성아미노산수송체이며 LAT2는정상세포형중성아미노산수송체라간주하고있다 12,13,18,19). 본연구에서대조군, 치아회분말매식군, 치과용연석고매식군및치아회분말과연석고혼합매식군의모든실험군에서 LAT1의발현을관찰할수있었다 (Fig. 1). 본실험결과는 LAT1이세포의계속되는성장에중요한역할을한다는것을밝힌여러문헌들의결과 12,13) 와일치하는것으로서, 골이식재들의골전도및골형성과정시필수적인고밀도의신생골형성과정에서단백들의생합성을위한중성아미노산의수송에 LAT1이중요한역할을한다는것을시사하고있다. 그러나본 RTPCR 실험기법은유전자의발현을밝히는실험방법이지만그발현정도의측정에는한계가있다. 따라서 RTPCR 기법을통한 LAT1 및 4F2hc mrna 발현의확인을토대로각시료의절편에서 LAT1 및 4F2hc 단백의발현을관찰하는면역조직화학염색을시행하였다. 본연구에서 LAT1 단백의발현양상은대조군, 치아회분말매식군, 치과용연석고매식군및치아회분말과연석고혼합매식군의모든실험군에서비슷하게나타났다. 실험 1 주군에서는주로골결손부에서새로형성되는신생골주위와내부의골모세포와골세포에서강하게발현되었으며매식체주위의간질세포에서도강한발현을보였으나 (Fig. 2A, Fig. 3A, Fig. 4A, Fig. 5A), 실험 2주, 4주, 8주로시간이경과함에따라 LAT1 단백의발현이점차감소하였다. LAT1의기능을위한필수적인보조인자 4F2hc 단백의발현양상도대조군, 치아회분말매식군, 치과용연석고매식군및치아회분말과연석고혼합매식군의모든실험군에서비슷하게나타났다. 실험 1주군에서는신생골주위와내부의골모세포와골세포그리고매식체주위의간질세포에서강하게발현되었으나 (Fig. 2B, Fig. 3B, Fig. 4B, Fig. 5B), 2 주, 4주, 8주로시간이경과함에따라 4F2hc 단백의발현은점차감소하였다. Kim 등20) 은사람의구강암발생단계에서 LAT1 및 4F2hc 단백의발현이구강암발생의초기단계에매우증가함을밝혀, LAT1 이구강암발생초기단계에매우중요한역할을하고있음을밝힌바있다. 따라서 LAT1 과 4F2hc가새로형성되는신생골주위와내부의골모세포 와골세포에서강하게발현되며실험 1주군에서강하게발현하고시간이경과함에따라그발현이점차약해진다는본연구의실험결과와 LAT1이구강암발생초기단계에매우중요한역할을하고있음을밝힌이전결과20) 를같이고찰하여볼때, LAT1 은골형성과정시중요한역할을하는신생골주위의골모세포와골세포의단백생합성을위한중성아미노산의수송에 LAT1이중요한역할을한다는것을시사하고있으며, 또골이식재들의골전도및골형성과정시필수적인고밀도의신생골형성과정에서아미노산수송체 LAT1 이초기단계에중요한역할을한다는것을시사하고있다. 그러나본연구에서 LAT1과 4F2hc 단백발현양상이대조군, 치아회분말매식군, 치과용연석고매식군및치아회분말과연석고혼합매식군의모든실험군에서대체적으로비슷한경향을보였다. 이는단백발현을더욱정밀하게검토할수있는실험방법을통하여추구하여야할과제라사료되며, 아울러이식재로서현재시판되어치과임상에서주로사용되고있는이종골이식후중성아미노산수송체 LAT1의발현과중성아미노산이외에산성및염기성아미노산수송체에관한연구및각이식재매식후초기단계에서의세밀한연구등이추구하여야할과제라사료된다. 결론적으로, 본연구의결과로서다수의필수아미노산을포함하는중성아미노산수송체 LAT1이골형성과정시중요한역할을하는신생골주위의골모세포와골세포에서골이식재들의이식후초기단계에서높은발현율을보이는것을알수있었으며, 이러한결과는골이식재들의골전도및골형성과정시필수적인고밀도의신생골형성과정에서아미노산수송체 LAT1이초기단계의단백생합성을위한중성아미노산의수송에중요한역할을한다는것을시사한다. V. 참고문헌 1. Jarcho M. Biomaterial aspects of calciumphosphate. Dent Clin North Am 1986; 30: Schaberg SJ, Petri WH, Gregory EW, Auclair PL, Jacob E. A comparision of freeze dried allogenic and fresh autogenous vascularized rib graft in dog radial discontinuity defects. J Oral Maxillofac Surg 1985; 43: Alberius P, Dahlin C, Linde A. A role of osteopromotion in experimental bone grafting to the skull ; A study in adults rats using a membrane technique. J Oral Maxillofac Surg 1992; 50:

9 4. Linde A, Alberius P, Dahlin C, Bjurstam K, Sundin Y. Osteopromotion ; A soft tissue exclusion principle using membrane for bone healing and bone neogenesis. J Periodontol 1993; 64: Cutright DE, Hunsuck EE. The repair of fracture of the orbital floor using biodegradable polylactic acid. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1972; 33: Kim SG, Yeo HH, Kim YK. Grafting of large defects of the jaws with a particulate dentinplaster of Paris Combination. Oral Surg Oral Med Oral Pathol 1999; 88: Kim SG, Kim HK, Lim SC. Combined implantation of particulate dentine, plaster of Paris, and a bone xenograft (BioOss r ) for bone regeneration in rats. J CranioMaxillofac Surg 2001; 29: Johnson RB, Gilbert JA, Cooper RC, Dai X, Newton BI, Tracy RR, West WF, DeMoss TL, Myers PJ, Streckfus CF. Alveolar bone loss one year following ovariectomy in sheep. J Periodontol 1997; 68: Beeson WH. Plaster of Paris as an alloplastic implant in the frontal sinus. Arch Otolaryngol 1981; 107: Christensen HN. Role of amino acid transport and countertransport in nutrition and metabolism. Physiol Rev 1990; 70: Silbernagl S. Renal transport of amino acids. Klin Wochenschr. 1979; 57: Kanai Y, Segawa H, Miyamoto K, Uchino H, Takeda E, Endou H. Expression cloning and characterization of a transporter for large neutral amino acids activated by the heavy chain of 4F2 antigen (CD98). J Biol Chem 1998; 273: Uchino H, Kanai Y, Kim do K, Wempe MF, Chairoungdua A, Morimoto E, Anders MW, Endou H. Transport of amino acidrelated compounds mediated by Ltype amino acid transporter 1 (LAT1): insights into the mechanisms of substrate recognition. Mol Pharmacol 2002; 61: Mastroberardino L, Spindler B, Pfeiffer R, Skelly PJ, Loffing J, Shoemaker CB, Verrey F. Aminoacid transport by heterodimers of 4F2hc/ CD98 and members of a permease family. Nature 1998; 395: Pfeiffer R, Spindler B, Loffing J, Skelly PJ, Shoemaker CB, Verrey F. Functional heterodimeric amino acid transporters lacking cysteine residues involved in disulfide bond. FEBS Lett 1998; 439: Pineda M, Fernandez E, Torrents D, Estevez R, Lopez C, Camps M, Lloberas J, Zorzano A, Palacin M. Identification of a membrane protein, LAT2, that coexpressed with 4F2 heavy chain, an Ltype amino acid transport activity with broad specificity for small large zwitterionic amino acids. J Biol Chem 1999; 274: Segawa H, Fukasawa Y, Miyamoto K, Takeda E, Endou H, Kanai Y. Identification and functional characterization of a Naindependent neutral amino acid transporter with broad substrate selectivity. J Biol Chem 1999; 274: Kim DK, Kanai Y, Choi HW, Tangtrongsup S, Chairoungdua A, Babu E, Tachampa K. Anzai N, Iribe Y, Endou H. Characterization of the system L amino acid transporter in T24 human bladder carcinoma cells. Biochim Biophys Acta 2002: 1565: Yoon JH, Kim IJ, Kim H, Kim HJ, Jeong MJ, Ahn SG, Kim SA, Lee CH, Choi BK, Kim JK, Jung KY, Lee SU, Kanai Y, Endou H, Kim DK. Amino acid transport system L is differently expressed in human normal oral keratinocytes and humal oral cancer cells. Cancer Lett 2004; 222: Kim DK, Ahn SG, Park JC, Kanai Y, Endou H, Yoon JH. Expression of Ltype amino acid transporter 1 (LAT1) and 4F2 heavy chain (4F2hc) in oral squamous cell carcinoma and its precusor lesions. Anticancer Res 2004; 24:

<312E20BEC6B9CCB3EBBBEA20BCF6BCDBC3BC2DBCB1BBFDB4D4B1B3C1A42E687770>

<312E20BEC6B9CCB3EBBBEA20BCF6BCDBC3BC2DBCB1BBFDB4D4B1B3C1A42E687770> Kor J Oral Maxillofac Pathol 2006 ; 30(1) : 1-8 아미노산수송체 LAT1 RNA interference에의한사람구강편평세포암종 KB 세포의성장억제 김창현, 홍주영, 양준기, 조현우, 김지혜, 홍민기, 신용우, 김도경 * 조선대학교치과대학구강생물학연구소, NURI project ABSTRACT The Effect of RNA