Flow Cytometry의 원리와 진단 혈액 분야에서의 다양한 이용 방법 및 사례

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1 Flow Cytometry의 원리와 진단 혈액 분야에서의 다양한 이 용방법소개 한경자

2 Flow Cytometry란 무엇인가? A technology that simultaneously measures multiple characteristics of single cells at a rapid rate 즉 유액( 流 液 )상태의 입자(Particle) 나 세포(Cell) 가 일정 감지지역 (sensing area)를 통과할 때 각각의 입자나 세포가 갖는 여러 특징을 동시에 측정하는 방법 relative Size : FSC relative Granularity or Internal Complexity : SSC relative Fluorescence Intensity : FL1, FL2, FL3...

3 Flow cytometry (FC) is an emerging technique which holds great promise for the separation, classification and quantitation of cells.

4 Flow Cytometry 발전 역사 1930년대 스웨덴 Karolinska Institute의 Caspersson이 세포내 핵산과 단백질 양을 측정하기위해 microspectrophotometer를 개발한 것이 시초. 1947년 Northwestern대학(미국)의 Gucker등에 의해 공기를 빠 른 속도로 주입하면서 검체를 실려보내고 입자가 통과하면 빛이 산란되어 photodetector에서 전기 신호로 검출해낼 수 있는 최 초의 Flow Cytometer가 개발. 1950년대 형광 항체 개발, hematology counter 도입 1960년대-형광 측정이 cytometry에 도입, DNA content 분석 시도 1970년대에는 Herzenberg 들에 의해 fluorescence flow cytometry 와 cell sorting법이 개발되어 살아있는 세포를 분리 하여 연구에 사용할 수 있게 됨.

5 Flow Cytometry 발전 역사(계속) 현재는 초당 10만개의 세포를 분석할수있으며, 100만개 중에 하 나 섞여있는 드문 세포를 찾아낼 수있고, 1%이내의 정밀도로 형 광을 측정하고, 세포 표면에 붙어있는 수백개 분자의 형광 항체 를 검출해 낼 수 있다. Slow flow system에서는 관찰 시간을 microsecond에서 millisecond로 늘리므로서 한 분자의 형광 분자의 검출이 가능 해짐으로서 세균, 바이러스, macromolecule등의 연구에 이용될 수 있다. 또한 이들에 microfluidic technology가 도입됨으로써 flow를 정지시키거나 뒤로 돌릴 수도 있게 되었다.

6 Fluorescence Dye Chart Absorption Emission Compound Application FITC Covalent PE Labelling PerCP Reagents Hoechst3334 DAPI PI DNA content

7 Flow Cytometer의 구성 1. Fluidic System 2. Laser 3. Optic System 4. Electronic System 5. Computer

8 Fluidic System Air Filter Air Pump Sheath Regulator Sample Regulator Flow Cell Sample Sheath Tank Sheath Filter Waste Tank

9 Fluidic System 세포나 입자를 일정 감지지역(sensing area) 까지 정확하고 안전하게 운반하는 역할을 한다. Hydrodynamic Focusing : 내부 물줄기에 포함 된 측정하고자 하는 세포 하나하나가 물줄기 가운데 위치 Laminar Flow: 외부 및 내부의 물줄기가 각각 의물줄기형태를유지

10 Injector tip Sheath fluid Focused laser beam Fluidics Sample fluid - Cells flowing inside Fluorescence signal Side Scatter (SS) Forward Scatter (FS) Flow Cell Hydrodynamic Focusing Laminar Flow Cross Section sheath sample laser Flow cell Orifice

11 Optics system

12 Application Clinaical Laboratories * HIV immunophenotyping * CD4 absolute counts * Leukemia and lymphoma immunophenotyping * Cell cycle and ploidy anaylsis of tumors * Reticulocyte enumeration * Flow crossmatching (organ transplantation) * Stem cell enumeration * Residual WBC detection (QC platelet, red blood cell packs) Research Laboratories * Immune function studies * Apoptosis * Hematopoietic stem cells * Kinetics studies (cell function) * Micronucleus test * Environmental sample analysis * Flow and FISH * Multi-drug resistance studies (cancer)

13 Sample Preparation Sample that can be analysed by Flow Cell Culture Whole Blood Purified WBC Tumor Cell Suspensions Add Antibody labeled with a Fluorochrome to the Cells Flow Cytometry single cell suspension in a test tube

14 Immuno Phenotyping T-Cell subset : AIDS 환자 Monitoring Leukemia & Lymphoma PNH (혈액학적이상여부초기발견가능) Platelet Function Test

15 Immuno Phenotyping Surface Antigen Detection CD4 Mouse-anti anti-cd4 CD3 CD8 CD3 Human Lymphocytes CD8 Mouse-anti anti-cd3 CD3 Mouse-anti anti-cd8 CD4 CD3

16 0.5 Tdt Tdt CD14 CD24 CD7 CD15 CD1a CD64 Scoring system for markers proposed by the European group for the Immunologic Classification of Leukemia(EGIL) Score B-lymphoid T-lymphoid Myeloid 2 cytcd79a CD3(m/cyt) MPO cyt IgM anti-tcr 1 CD19 CD2 CD117 CD20 CD5 CD13 CD10 CD8 CD33 CD10 CD65

17 DNA Content Analysis with PI G0-G1 Punch holes in cell and nuclear membranes PROPIDIUM IODIDE This nucleus is twice as bright as this nucleus

18 DNA Content Analysis with PI DNA Content # of Events G 0 -G 1S G 2 -M # of Events PI intensity G 0 -G 1S G 2 -M PI intensity

19 CBA (Cytometric bead assay) Various analytes Antibody coupled beads, emitting at distinct FL3 intensities Antibody coupled PE label, emitting at FL2 intensity proportional to analyte conc.

20 CBA (Cytometric bead assay) Capture Ab Target protein Detection Ab IL-2 IL-4 IL-5 IL-10 TNFα IFNγ MFI Concentration (pg/ml)

21 Reticulocyte Counting 525nm DNA DNA Excited with 488 nm LASER Acridine orange in the Retic-STAT solution RNA 675nm RNA

22 Flow Cytoenzymology (1) Flow cytometry로세포내혹은세포위의효소기능 을 있는 그대로 측정하는 방법 2개의 leaving group이 dye molecule에 붙어있는 기질을 이용 - quenches the dye's fluorescence leaving group과 dye 사이의 연결이 효소에의해 끊 어지면형광발생 세포내 효소 활성도에따라 세포내 형광물질 축적 mean fluorescence측정

23 Flow Cytoenzymology (2) 현재 coulter시판 시약으로 측정가능한 효소 -Aminopeptidase M, Leukocyte and pancreatic elastases, Chloroacetate esterase, Aminopeptidase A, Acetate esterase, Kallikrein, Aminopeptidases, αand βgalactosidase, Collagenase, Subtilisin, Cathepsin D, B- glucosidase, B-glucuronidase, Dipeptidyl peptidase IV, Dipeptidyl peptidase II, Prolyl aminopeptidase, B1 and B2 esterase, Acid phosphatase, Cathepsin C,G,B. Oxidative burst.

24 Flow Cytometry의 기타 이용 경험

25 Basophil의 New Ag 발견 We suggest flow cytometric basophil counting method using a specific marker CD22+ / CD19- as a reliable method of basophil count. Furthermore, it gives B cell count simultaneously.

26

27 Normal Control CML

28 골수내 비정상 표현형 세포의 분포에 관한 연구 Hematogone populations always exhibit a continuous and complete maturation spectrum of antigen expression typical of the normal evolution of B- lineage precursors they lack aberrant or asynchronous antigen expression.

29 Asynchronous expression of the earliest and latest antigens, e.g. concurrent CD34 and CD20, and aberrant over- or under-expression of antigens are not observed in hematogone populations

30 CD20+/CD34+(R1 gate) % max mean min normal B-ALL(1) B-ALL(2) T-ALL AML Distribution of CD20+/CD34+ cells in the large lymphocytes gate(r1) in the bone marrow of patients with each diagnosis. B-ALL(1): group with CD20(+) and CD34(+) in the initial BM. B-ALL(2): group with CD20(-) and CD34(-) in initial BM. Bar : standard deviation.

31 B-ALL 완전관해 골수의 R1 gate CD20+/CD34+ : 최대 4.2% CD13,33+/CD19+ : 최대 2.69 % CD11b+/CD19+ : 최대4.03% -> 초기 재발이나 미세 잔존 백혈병 진단 기준 : 5%

32 MAHA Fragmented RBC 검출 PE-conjugated anti-hb in 0.6% NaCl

33

34 Analysis of Bone Marrow Aspirates using Flow cytometry Flow cytometric differential count of BM cells using CD45 and propidium iodide (PI)

35 PI R1 R3 R4 R2 R1: CD45 negative R2: CD45 weakly positive & low PI R3: CD45 weakly positive & high PI Debris R4: CD45 strongly positive CD45

36 R1 gate R8 PI R1 R3 R4 R2 CD45 R5 R5 : Normo R8 : IG

37 Normo IG G Flow cytometry Flow cytometry Flow cytometry Microscopy Microscopy Microscopy Lympho Mono Eos Flow cytometry Flow cytometry Flow cytometry Microscopy Microscopy Microscopy *IG : Sum of blasts, promyelocytes and myelocytes ** G : Sum of metamyelocytes and neutrophils

38 EDTA-Blood 를 이용한 혈소판 분석 EDTA-anticoagulated platelets 은 특정 clone의 CD41a 항체로는 염색이 안됨 항응고제를 바꾸거나 EDTA를 중화시키면 정상적으로 결합

39 Scattergram and histogram of same platelets after staining with CD41a-plus Substance show high fluorescence. It means the inhibitory effect of EDTA is completely neutralized.

40 세포내외의 항원양을 정량적으로 검출 Intracellular IL-4, IL-10, IFN-γ levels of leukemic cells and bone marrow T cells in acute leukemia

41 QuantiBRITE PE and CellQuest program(bd) Geometric mean value converted to bound PE molecules/cell

42

43 Geo Mean value를 MESF단위로 convert

44 주의 1.정량 분석시 SSC, FSC 등 비형광 parameter의 Amplification, Compensation을 바꾸면 형광값에도 변 동이 생김 2. 항상 control sample을 동시 분석 권장 예) Eosinophilgating을위해SSC Amp를낮춘경우

45 XyDPA 염색을 이용한 백혈구분석 Zn(II)-DPA(dipicolylamine) complex Flavin Adenine Dinucleotide(FAD)와 결합 FAD로 하여금 형광을 내게함

46 No DAPI DAPI The eosinophil granules reveal faint fluorescence before staining with XyDPA, but show increased red color fluorescence after staining with XyDPA(0.79 mm)

47 Monocyte가Eosinophil만큼강한형광을냄-다량 의FAD 함유 Monocyte counting에 이용 가능

48 결론 Flow Cytomery는 세포를 이용한 연구에서는 아 주흔히이용될수있는기본술기이다. 세포를 이용한 작업을 할때는 한번쯤 Flow Cytometry를 이용해서 할수 있는 방법은 없나를 생각한다. 다수의 세포를 분석하고 객관적이면서 정량적인 정보도 얻을 수 있다. 기본 setting을 자유롭게 변화시키면서 분석을 시도해 볼수 있다.

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