124 Ⅰ. 서론 생체에서적정량의활성산소는체내에침입해 온이물질을제거하는중요한역할을담당하나과 량의활성산소는인체의세포를공격하여여러가 지질병을유발시킨다. 1) 피부는활성산소를제거 하는 SOD,CAT,glutathioneperoxidase(GPx), glutathionered

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세원 원
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1 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 123 Hairless 마우스에서치자열수추출물의피부주름형성억제효과 형순희 민경진 김영철 계명대학교대학원공중보건학과 Ⅰ. 서론 Ⅱ. 재료및방법 1. 시약및기기 2. 시료조제 3. 실험동물및처치 4. 피부주름유발및시료도포 5. 피부표면의형태학적관찰 < 목차 > 6. 피부의조직학적관찰 7. 피부조직의유해산소대사효소활성측정 8. 피부조직의 MMP-3 유전자발현량측정 Ⅲ. 연구결과및고찰 Ⅳ. 결론참고문헌 초록 치자추출물의피부주름형성억제효과를확인하고자 6-7 주령의 SKH-1hairless 마우스에 UVB 조사와 Sq-OOH 를도포하여피부주름형성을유발시키고, 이와병행하여치자추출물을도포하여 retinoic acid 를도포한양성대조군과비교검증하였다. 실험동물은정상군 ( 생리식염수도포 ), 대조군 (UVB 조사 + Sq-OOH 도포 + 생리식염수도포 ), 용매대조군 (UVB 조사 + Sq-OOH 도포 + 용매도포 ), 양성대조군 (UVB 조사 + Sq-OOH 를도포 + retinoicacid 도포 ), 실험군 (UVB 조사 + Sq-OOH 를도포 + 치자추출물도포 ) 총 5 개군으로나누었다. 대조군은정상군에비해주름능선의두께가굵고골이깊게형성된반면, 실험군과양성대조군은대조군에비해상대적으로주름능선의두께가얇고골이얕게나타났다. 조직학적관찰에서대조군은진피층내교원섬유가파괴되어밀도가엉성하고양도많이줄어있었고변성되어엉킨탄력섬유가군데군데형성되어있는반면, 실험군과양성대조군은대조군에비해교원섬유의밀도가조밀하고양이많았으며변성된탄력섬유가적게관찰되었다. 대조군은정상군에비해유해산소를생성하는효소인 XO 의활성이유의하게증가하였고유해산소를제거하는효소인 SOD 와 CAT 의활성은현저하게감소한반면, 실험군과양성대조군은대조군에비해 XO 의활성은유의하게감소하였고 SOD 와 CAT 의활성은현저히증가하였다. 피부조직의 MMP-3mRNA 발현에서, 정상군에비해대조군은유의하게높았고, 실험군과양성대조군은대조군에비해유의하게낮았으며정상군과비슷한수치를나타냈다. 이상의실험결과, 치자열수추출물은 UVB 조사와 Sq-OOH 도포시유해산소의생성을줄여피부조직의산화스트레스를경감시킴으로써이로인해피부조직의손상을적게야기하고피부주름형성을억제시키는효과가있음을확인하였다. 주제어 : 치자열수추출물, 헤어리스마우스, 피부주름, 교원섬유, 탄력섬유 교신담당저자 : 김영철 yckim@kmu.ac.kr Tel: 접수일자 :2009 년 4 월 12 일 수정일자 :2009 년 5 월 11 일 게재확정일자 :2009 년 5 월 13 일

2 124 Ⅰ. 서론 생체에서적정량의활성산소는체내에침입해 온이물질을제거하는중요한역할을담당하나과 량의활성산소는인체의세포를공격하여여러가 지질병을유발시킨다. 1) 피부는활성산소를제거 하는 SOD,CAT,glutathioneperoxidase(GPx), glutathionereductase(gr) 등의여러효소를갖 고있어직 간접적으로활성산소를제거하는항 산화방어체계를구축하고있다. 그러나자외선이 피부에과량으로노출되면활성산소가많이발생 하여, 피부의항산화방어체계가손상받게됨으 로써주름형성, 피부의탄력성저하등피부노화 가가속화된다. 2) 피부의주름형성을억제하거나 개선하기위해서는노화된피부에결핍된교원섬 유의양을증가시키는것이한가지방법일수있 다. 3) 피부에서교원섬유양을증가시키기위해서 는섬유아세포의교원섬유합성능을증가시키거 나기질금속단백분해효소인 matrix metaloproteinases(mmps) 발현을억제시키는방법이 있다. 4) 피부의주요한구성성분인교원섬유는섬 1)Haliday GM, Inflammation, gene mutation and photoimmuno-suppressioninresponsetouvr-induced oxidative damage contributes to photocarcinogenesis, MutationResearch, 571(1-2):p ,2005 2)Bernstein EF,Chen YQ,TamaiK,ShepleyKJ,Resnik KS,ZhangH,TuanR,MauvielA,UitoJ,Enhanced elastin and fibrilin gene expression in chronicaly photodamaged skin, Journal of Investigative Dermatology,103(2):p ,1994 3) 박성규, 이종찬, 안수미, 이진영, 김연준, 황재성, 이병곤, 장이섭, 적송엽이피부의노화에미치는영향, 대한본초학회지,20(4):p.1-10,2005 4)OhJH,ChungAS,SteinbrennerH,SiesH,BrenneiseP, Thioredoxin secreted upon ultraviolet A iradiation modulates activities ofmatrix metaloproteinase-2 and tissueinhibitorofmetaloproteinase-2inhumandermal fibroblasts,archives ofbiochemistry and Biophysics, 423(1):p ,2004 유아세포및혈관내피세포에서생성되는단백질 이며사람의피부에서는제 Ⅰ 형교원섬유가가장 많이존재한다. 5) 교원섬유는진피건조중량의 70-80% 를차지하며성숙된비수용성교원섬유인 TypeⅠ 이총교원섬유의 80%, 수용성교원섬유 인 TypeⅢ 가 15% 를차지하고있으나, 광노화시 자외선에의해유발된염증세포로부터분비된효 소에의해가수분해되어교원섬유 TypeⅠ 이감소 하는반면 TypeⅢ 는증가한다. 6) 정상피부에서 는 TypeⅠ 교원섬유의합성과 MMP-1 이균형을 이루고있으나광노화된피부에서는 TypeⅠ,Ⅲ 교원섬유의합성이저하되고 MMP-1 의활성이 증가되어있다. 7) MMP-3 은제 Ⅳ 형교원섬유, proteoglycan,fibronectin,laminin 과같이여러종 류의기질단백질을분해하며 stromelysin1 이라 고불리며,proMMP-1 을활성화시키는효소로서 주름생성에중요한역할을담당한다. 8) Hairless 마우스는자외선조사시표피비후, 진피내교원섬유감소,colagenase 와변형된 glucosaminoglucans(gags) 의증가, 탄력섬유의 변형이두드러지는등자외선에대한피부반응이 5)UitoJ,OlsenDR,FazioMJ,Extraceluarmatrixofthe skin;50 years ofprogress,journalofinvestigative Dermatology,92(4):p.61-77,1989 6)Plastow SR, Lovel CR, Young AR, UVB-induced colagen changes in the skin ofthe hairless albino mouse, Journal of Investigative Dermatology, 88, p ,1987 7)Talwar HS, Grifith CEM, Fisher GJ, Hamilton TA, VoorheesJJ,ReducedtypeI,type Iprocolagensin photodamaged adult human skin, Journal of InvestigativeDermatology,105(2):p ,1995 8)MacNaul KL, Chartrain N, Lark M, Tocci MJ, HutchinsonNI,Discoordinateexpressionofstromelysin, colagenase, and tissue inhibitor of metaloproteinases-1 in rheumatoid human synovial fibroblast Synergistic efects of interleukin-1 and tumor necrosis factor-alpha on stromelysin expression, Journal of Biological Chemistry,265(28):p ,1990

3 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 125 인체에서나타나는반응과유사하다. 9) 한편, squalene monomonohydroperoxide(sq-ooh) 를 sub-erythema 양으로반복적으로처치하는방법 은피부거침, 주름형성과심각한염증반응없이 in vivo 에서산화적스트레스와관련된피부노화를 연구하기위한효율적이고유용한방법으로사용 되고있다. 10) 다양한공해물질의지속적인접촉으로인해체 내에축적되는활성산소는세포유전자변형, 세 포성장억제, 세포노화, 세포자멸사등을촉진시 키기때문에활성산소를효율적으로제거하는것 이피부노화및각종만성피부질환을예방하는 데핵심적인기전으로알려져있다. 화장품원료 로집중연구되고있는유효성분으로는비타민 A, C,E 등의비타민류와각종식물추출류가있다. 비타민 A 류는레티노이드 (retinoid) 라지칭하며 레티놀 (retinol), 레티노익산 (retinoicacid) 등이포 함된다.Retinoicacid 는 procolagen 유전자의생 성을유도하여교원섬유를생성시키고, 피부세포 의증식과분화에영향을주어손상된교원섬유와 탄력섬유의회복을촉진시켜주름을호전시킨다. 그러나과량피부유입시강한피부자극을유발 하고분자자체가매우불안정한단점을지니고 있어효능및안전성, 안정성의측면에서개선되 어야할사항이아직많은것으로알려져있다. 11) 9)BissetDL,Hannon DP,OrTV,An animalmodelof solar-aged skin: histological, physical, and visible changesinuv-iradiatedhairlessmouseskin,journal of Photochemistry and Photobiology A Chemistry, 46(3):p , )Chiba K, Sone T, KawakamiK, Onoue M, Skin roughness and wrinkle formation induced by repeated application ofsqualene monohydro- peroxide to the hairless mouse, Experimental Dermatology, 8(6):p , )WyssR,Chromatographicand electrophoretic analysis of biomedicaly important retinoids, Journal of Chromatography B: Biomedical Sciences and 이에따라최근에는천연항산화물질에대한 연구가활발히진행중이며, 12) 부작용이적은천 연물질에대해관심이집중되고있다. 천연식물의 추출물은약리적효능과더불어항산화작용을하 는생리활성물질을갖고있어유용한연구재료가 되고있다. 치자는주성분으로 carotenoid 계성분 인 crocin,croccetin 과 flavonoid 계성분인 gardanin,iridoid 배당체인 genipin,geniposide 와 gardenoside 등을함유하고있으며, 13) 치자에대한 in vitro 생리활성연구로는항산화효과, 항염효과, 항암효과, 피부미백효과, 항균효과가보고되어져 있다. 14) 이에본연구는 hairless 마우스에반복적인 UVB 조사와 Sq-OOH 를도포하여피부주름형성 을유발시키고이와병행하여우수한항산화효과 로인해피부주름형성억제에효과가기대되는 치자열수추출물을도포하여피부의육안적, 조직 학적관찰을통하여피부노화억제효과를알아보 고아울러피부조직내유해산소대사효소들의활 성을알아보았다. Ⅱ. 재료및방법 1. 시약및기기 Hydrogen peroxide 는 Junsei 사 (Japan) 의제품 을,hematoxylin,bovineserum albumin,retinoic Applications,671(1-2):p , )DarD,FridovichI,Freeradicalsincutaneousbiology, JournalofInvestigative Dermatology,102,p , )Jeong HS,ParkKH,Characteristicsofthe conversion pigmentfrom Gardenia jasminoides yelow pigment, JournalofFoodScience& Technology,30,p , )Han YN,Oh HK,Hwang KH,Lee MS,Antioxidant components of Gardenia fruit, Korean Journal of Pharmacognosy,25,p ,1994

4 126 acid,polyethyleneglycol 은 Sigma 사 (USA) 의제품을,squalene 은 Acros 사 (USA) 의제품을사용하였으며그외일반시약들은특급품을,jojobaoil 은 DesertWhale 사 (USA) 의제품을사용하였다. 실험기기중자외선조사장치는 UVB sunlamp(uvm-225d,minerallampuvp,usa) 를, 자외선측정장치는 UV-radiometer(HD9021, DeltaOHM,Italy) 를사용하였다. 시료추출은초고속감압저온추출기 (COSMOS-660, 경서기계산업, 한국 ) 를사용하였다. 피부조직의관찰은 inverted microscope(axiovert200,carlzeiss, Germany),fluorescencemicroscope(Axioimager, CarlZeiss,Germany) 를사용하였다. 2. 시료조제국내에서유기농재배한치자 600g 을구입하여물 6l 를가하여초고속감압저온추출한후농축하여추출물 2l 를얻었다. 추출물을파우치진공포장후냉장보관하여실험에사용하였다. 동결건조로측정한치자열수추출물의수율 (yield) 은 36.33% 였다. 치자추출물 10 ml에용매 (jojoba oil1 ml,100% 에탄올 2.5 ml, 물 6.5 ml ) 비율로혼합하여치자열수추출물시료로사용하였다. 3. 실험동물및처치실험동물은 6-7 주령의 SKH-1hairless 마우스 (Charles-River,Japan) 를분양받아 1주일간사육실에서적응시킨후실험전기간동안사료와물은자유롭게공급하였다. 사육실은온도 22±1, 상대습도 50±5%, 조명주기 12 시간씩밤낮을유지하였다. 실험군은 5군으로나누었으며각군당 5 마리씩총 25 마리를사용하였다. 실험동물은실험 4주째되는날 4시간동안절식시킨다음에테르로마취한후개복하여피부는적출한후일부는 10% 중성포르말린용액에고정하여조직학적검사에사용하였고나머지는냉동보관후 MMP-3 발현량측정, 효소활성도측정에사용하였다. < 실험군의분류 > -정상군 (normalgroup,n): 생리식염수도포군 -대조군 (controlgroup,c): 자외선조사 + Sq-OOH 도포 + 생리식염수도포군 -용매대조군 (vehiclecontrolgroup,vc): 자외선조사 +Sq-OOH 도포 + 용매도포군 -양성대조군 (positivecontrolgroup,pc): 자외선조사 +Sq-OOH 도포 +0.01% Retinoicacid 도포군 -실험군 (experimentalgroup,e): 자외선조사 +Sq-OOH 도포 + 치자열수추출물도포군 4. 피부주름유발및시료도포자외선조사장치의광원은 302nm 의 UVB 를방출하는 sunlamp 를사용하였다. 자외선조사량은 UV-radiometer 로측정하였으며, 마우스를자외선조사용 cage 에가둔후등부위에균등하게 120 mj/cm 2 의광량으로격일간격으로 1주일에 3회,4 주동안조사하였다. 피부거침과주름형성을촉진하기위하여 Sq-OOH 를 1일 2회, 주 6일,4 주동안매회 100 μl씩도포하였다. 치자열수추출물 (0.87g/kgBW/day), 용매,saline 은 1일 2회, 주 6 일,4 주동안매회 200 μl씩도포하였다.retinoic acid 는 polyethyleneglycol 에 0.01% 로희석하여 1 일 2회, 주 6일,4 주동안매회 200 μl씩도포하였다.

5 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 피부표면의형태학적관찰 피부의육안적관찰은 4 주째에에테르로가볍 게마취를하고디지털카메라로사진촬영을한 후 replica 를떠서도립현미경으로주름의형태를 관찰하였다. 6. 피부의조직학적관찰 1) Van Gieson s 염색 절취한피부조직을실온에서 10% 중성포르말 린용액에 24 시간고정한후통상적인방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을거친다음 parafin 으로포매하고 4 μm두께로절편을만들어 Van Gieson 용액으로감별염색, 탈수, 투명, 봉입후 진피층내교원섬유의양과형태를형광현미경으 로관찰하였다. 2) Verhoeff's 염색 절취한피부조직을실온에서 10% 중성포르말 린용액에 24 시간고정한후통상적인방법으로 수세, 탈수, 투명, 침투과정을거친다음 parafin 으로포매하고 4 μm두께로절편을만들어 Verhoef 용액에염색후수세,fericchloride2% 로감 별수세후 sodium thiosulfate 에처리하여피부 진피층내탄력섬유의변화, 소실및퇴행성변화 등을형광현미경으로관찰하였다. 7. 피부조직의유해산소대사효소활성측정 1) 피부조직의단백질함량측정 피부조직중단백질함량은 Lowry 등 15) 의방 15)Lowry OH, Rosebrough NJ, Far AL, RandalRJ, Protein measurementwith the folin phenolreagent, JournalofBiologicalChemistry,193(1):p ,1951 법에따라 bovineserum albumin 을표준품으로 사용하여측정하였다. 2) Xanthine oxidase(xo) 피부조직중 XO 의활성도는 xanthine 을기질로 사용하여 30 에서 20 분간반응시켜생성된요산 을 292 nm에서흡광도를측정하는 Stripe 와 Dela 16) 의방법에준하여측정하였다. 활성도단위는효 소액중에함유된단백질 1 mg이 1 분간반응하여 기질인 xanthine 으로부터생성된 uricacid 의양을 nmole 로표시하였다. 3) Superoxide dismutase(sod) 피부조직중 SOD 의활성도는 hematoxylin 자 동산화의억제정도를관찰하는 Martin 등 17) 의방 법에따라 0.1mM EDTA 가함유된 50mM 인산 완충액 (ph7.5) 에 10μM hematoxylin 및효소액을 가해 25 에서반응시켜생성된 hematein 을 560 nm에서측정하여효소의활성도를산정하였다. 활 성도단위는효소액을넣지않은반응액중의 hematoxylin 자동산화를 50% 억제하는정도를 1 unit 로단백질 1 mg이 1 분동안반응한 unit 로표시 하였다. 4) Catalase(CAT) 피부조직중 CAT 활성도는 hydrogenperoxide 를기질로하여환원되는정도를파장 240 nm에서 그흡광도를읽고분자흡광계수 (E=0.04mM -1 cm -1 ) 를이용하여활성을산출하는 Aebi 18) 의방법에 16)StripeF,DelaCE,Theregulationofratliverxanthine oxidase.conversion in vitro ofthe enzyme activity from dehydrogenase(typed)oxidase(typeo),journal ofbiologicalchemistry,244(14):p , )Martin JP, Dailey M, Sugarman E, Negative and positive assays ofsuperoxide dismutase based on hematoxylinautoxidation,archivesofbiochemistryand Biophysics,225(2):p , )AebiH,Catalase,In Methods ofenzymatic Analysis, Edited by H. U. Bergmeyer.New York:Academic Press,p ,1974

6 128 준하였다. 활성도단위는피부조직중에함유된단백질 1mg이 1분동안반응하여감소되는 hydrogenperoxide 양을 nmole 로표시하였다 8. 피부조직의 Matrix metalloproteinase-3 (MMP-3) 유전자발현량측정 1) RNA 추출 Deepfreezer 에냉동보관하였던피부조직을액화질소에담아이송한후얼음으로저온을유지시키며조직 50 mg당 1ml의 Trizol(Invitrogen,New Zealand) 을첨가하여조직을마쇄하고실온에서 5 분간 incubation 시킨후 chloroform 200 μl를첨가하여실온에서 3분간방치후 15000rpm,4,10 분간원심분리하였다. 상층액을취한후 isopropylalcohol 을 500 μl첨가한다음 15000rpm, 4,15 분간원심분리후상층액은제거하고 70% ethanol1 ml을첨가하여 RNA pelet 을 washing 하고 15000rpm,4,2 분간원심분리하여나온상층액은제거하고남은 RNA pelet 을실온에서건조후 diethylpyrocarbonate(depc) 로희석하여 260 nm에서 OD 값을측정하여 RNA 를정량하였다.280 nm에서 OD 값을측정하고 absorbance ratio (A260/A280) 가 1.8~2.0 사이인지확인하였다. 2) cdna 합성 BioNEER 사의 CycleScriptRT PreMix(dT20) kit 에서제공하는 protocol 에따라 totalrna 양이 0.1~1 μg / μl가되도록 RNA sample 을넣고 DEPC 를 20 μl까지채운후 30 에서 1분간,50 에서 4 분간 12cycle 반응시키고 95 에서 5분간가열하여반응을종결시켰다. 3) PCR과전기영동 BioNEER 사의 AccuPowerTM PCRPreMixkit 를구입하여사용하였다.Template2 μl,forward primer 와 reverseprimer(10pmole/l,bioneer, Korea) 를각각 1.4 μl, 멸균된증류수 15.2 μl를섞고 PCR 반응 (Bio-RAD,MycyclerTM thermal cycler,usa) 을실시하였다.Primer 는대조군으로 GAPDH(57,35cycle), 실험군으로 MMP-3(6 0,35cycle) 를사용하였으며사용된 primer 의염기서열은 GAPDH(sense: CCCACT- AACATCAAATGGGG, antisense: ACACAT- TGGGGGTAGGAACA),MMP-3(sense:TAG- CAGGTTATCCTAAAAGCA,antisense:CCA- GCTATTGCTCTTCAAT) 와같다.Tris-acetate ethylenediaminetetraaceticacid(tae)bufer 를이용하여 1.5% agarose gel 에전기영동시켜 ethidium bromide 에염색한후수세하고 UV 를조사하여 DNA band 를확인하였고 GelLogic100 ImagingSystem(Kodak,USA) 을이용하여발현량을수치화하여통계처리하였다. 9. 자료분석통계적분석은 SPSS 12.0forwindows(SPSS Inc.,USA) 를이용하여일원배치분산분석 (onewayanova) 을이용하였고각그룹간의차이를검증하기위하여 Duncan's 다중비교분석을이용하여사후분석을실시하였다. 통계적유의수준은 p<0.05 로실시하였다 Ⅲ. 연구결과및고찰 1. 피부표면의형태학적관찰

대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 129 Figure 1. Comparison of replica images of SKH-1 hairless mice after 4-week experiment to evaluate the inhibitory effect of Gardeniae fructus water extract on skin aging.

7 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 129 Figure 1. Comparison of replica images of SKH-1 hairless mice after 4-week experiment to evaluate the inhibitory effect of Gardeniae fructus water extract on skin aging. Groups are the same as described in Table 1. 피부주름의형태를관찰한결과는 Figure1 과 같다.UVB 조사와 Sq-OOH 를도포한대조군은 깊이가깊고선이굵은주름이형성되어있었다. 반면에 retinoicacid 를도포한양성대조군과치자 열수추출물을도포한실험군은대조군에비해주 름의선이가늘고깊이가얕게나타나치자열수 추출물도포군이주름형성억제 / 개선에효과가있 음을확인하였다.Sq-OOH 를 hairless 마우스에 반복도포하여형성시킨주름과 UVB 반복조사 로형성시킨주름의형태를비교한선행연구 19) 19)Chiba K, Kawakami K, Sone T, Onoue M, Characteristics ofskin wrinkling and dermalchanges 에서 UVB 반복조사로형성시킨주름은척추에 수직으로평행한모양의일정한방향성을나타냈 으며,Sq-OOH 도포로형성시킨주름은방향성이 없는깊고선명한양상을나타냈다. 본연구에서 는일정한방향성이없는선명한주름이형성되었 는데이는 UVB 조사와 Sq-OOH 도포를병행하 였기때문인것으로생각된다. induced by repeated application of squalene monohydroperoxide to hairless mouse skin, Skin Pharmacology and Applied Skin Physiology, 16(4):p ,2003

130 Figure 2. Histological observation on SKH-1 hairless mice skin after 4-week experiment to evaluate the inhibitory effect of Gardeniae fructus water extract on skin aging. Van Gieson's stain, 100.

8 130 Figure 2. Histological observation on SKH-1 hairless mice skin after 4-week experiment to evaluate the inhibitory effect of Gardeniae fructus water extract on skin aging. Van Gieson's stain, 100. Groups are the same as described in Table 피부의조직학적관찰 1) Van Gieson s 염색 진피층내교원섬유의양과형태를관찰한결과 는 Figure2 와같다. 변형된탄력섬유가다소증 가하는탄력섬유증 (elastosis) 과함께교원섬유의 감소는광노화된피부의주요한소견으로알려져 있다. 20) 대조군은교원섬유가파괴되어밀도가엉 성하고배열이불규칙적이고양도많이줄어있었 20)KligmanLH,Thehairlessmousemodelforphotoaging, ClinicsinDermatology,14(2):p ,1996 다. 양성대조군과치자열수추출물도포군은대조군에비해교원섬유의밀도가조밀하고배열이규칙적으로나타났다. 2) Verhoeff's 염색탄력섬유는무정형의탄력소 (elastin) 와미세섬유로구성되어있고광노화된피부에서는진피상부에탄력섬유증물질의축적과함께표피직하부에수직으로구성된미세한탄력섬유 (oxytalane fiber) 가차츰분해되고없어지면서수평으로배열된미세한탄력섬유 (elaunine fiber) 가증가되는형태적인변형이일어나게된다.

대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 131 Figure3.HistologicalobservationonSKH-1hairlessmiceskinafter44-weekexperimenttoevaluatetheinhibitoryefectof Gardeniaefructuswaterextracton skin aging.verhof'sstain, 200& 400.

9 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 131 Figure3.HistologicalobservationonSKH-1hairlessmiceskinafter44-weekexperimenttoevaluatetheinhibitoryefectof Gardeniaefructuswaterextracton skin aging.verhof'sstain, 200& 400.Groupsare thesameasdescribed in Table1. 이러한탄력섬유의형태적인변화가피부의탄력성감소에중요한영향을미치는것으로생각되며내인성노화에비하여광노화된피부에서탄력섬유의변성이심하고그수와두께가더욱감소되는것으로보고된바있다. 21) 진피층내탄력섬유의소실및양과형태를관찰한결과는 Figure 3과같다. 대조군은진피층내탄력섬유가끊어지고엉킨변성된탄력섬유가불규칙적으로배열된 탄력섬유증이관찰되었으며, 치자열수추출물도포군은대조군에비해변성된탄력섬유가적고배열이규칙적이었다. 이와같은조직학적관찰을통해치자열수추출물은피부조직에서 UVB 와 Sq-OOH 로유발되는진피조직의손상을경감시키는효과가있음을확인하였다. 21)Chung JH,The mechanism ofskin aging,medical Postgraduates,32(1):p.23-28,2004

10 피부조직의유해산소대사효소활성비교 Table 1. Comparison in xanthine oxidase, superoxide dismutase and catalase activities of SKH-1 hairless mice skin after 4-week experiment to evaluate the inhibitory effect of Gardeniae fructus water extract on skin aging Items Normal Control Experimental N C VC PC E XO 1) 1.93±0.34 a 3.01±0.47 b 2.11±0.36 a 2.36±0.22 a 2.07±0.59 a SOD 2) 11.60±3.32 a 7.79±2.23 a 8.26±1.75 a 8.84±3.68 a 8.49±2.28 a CAT 3) 5.88±3.25 a 2.99±0.59 a 3.36±1.15 a 3.43±1.59 a 5.23±2.76 a Valuesarethemeans±SD of5mice. 1)Unit:nmoleuricacidformed/ mg protein/min 2)Unit:U(50% inhibitionofautoxidationofhematoxylin)/ mg protein/min 3)Unit:nmoleH2O2reduced/ mg protein/min N:Salineapplicationgroup C:UVBiradiation+Squalene-OOH +Salineapplicationgroup VC:UVBiradiation+Squalene-OOH +Jojobaoil+100% ethanol+waterapplicationgroup PC:UVBiradiation+Squalene-OOH +Retinoicacidapplicationgroup E:UVBiradiation+Squalene-OOH +Gardeniaefructuswaterextractapplicationgroup Valueswith diferentsuperscriptsin the same row are significantlydiferent(p<0.05)byanova and Duncan'smultiple rangetest. 자외선이피부에과량으로노출되면활성산소 가많이발생하여, 피부의항산화방어체계가손 상받게됨으로써주름형성, 피부의탄력성저하 등피부노화가가속화된다. 22) 적출한피부조직에 서유해산소대사효소활성변동을측정한결과는 Table1 과같다. 유해산소를생성하는효소인 XO 활성은정상군에비해대조군은약 56.0% 유의하 게높았으나, 치자열수추출물도포군은정상군과 유의한차이가없었다. 대조군에비해서용매대조 군은약 29.9%, 양성대조군은약 21.6%, 치자열 수추출물도포군은약 31.2% 유의하게낮았다. 유 해산소를제거하는효소인 SOD 와 CAT 활성은 모든군에서정상군에비해감소하였다. 치자열 수추출물도포군은대조군에비해 SOD 활성은 22)Gilchrest BA, Skin aging and photoaging An overview, Journal of the American Academy of Dermatology,21,p ,1989 약 9.0% 높았고 CAT 활성은약 74.9% 높아정상 군과비슷한수치를나타내었다. 주목할점은 CAT 활성의경우대조군, 용매대조군, 양성대조 군이정상군에비해현격한감소를나타낸반면, 치자열수추출물도포군은정상군과비슷한수치 를나타낸점이다.Rhie 등 23) 은노인의진피에서 SOD,GPx,GR 과같은항산화효소의활성도는 젊은피부와비교해서변화가없었으나 catalase 활성은현저하게감소함을보고하였다. 23)Rhie G,Shin MH,Seo JY,ChoiWW,Cho KH,Kim KH, Park KC, Eun HC, Chung JH, Aging and photoaging dependent changes of enzymic and nonenzymicantioxidantsintheepidermisanddermisof human skin in vivo, Journal of Investigative Dermatology,117(5):p ,2001

11 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 b b MMP-3/GAPDH(%) a a a N C V C P C E G r o u p s Figure4.ComparisonofMMP-3mRNAexpressioninhairlessmiceskinafter4-weekexperimenttoevaluatetheinhibitory efectofgardeniae fructus waterextracton skin aging.valuesare the means±sd of5 mice.values with diferent superscriptsaresignificantlydiferent(p<0.05)byanova and Duncan'smultiplerange test.groupsarethesameas describedintable1. 또한이연구에서노화된피부에서는젊은피부 에비해서 H2O2 가증가되어있음을관찰하였는 데, 이는 catalase 활성이감소되어 H2O2 를제대 로물로해독하지못하기때문인것으로해석하였 다. 이와같이 catalase 는피부노화과정에서가장 중요한역할을하는항산화효소로인식되고있 다. 24) 실험결과를통해대조군은정상군에비해 XO 활성의유의한증가와함께 SOD 와 CAT 활 성은감소하여 UVB 조사와 Sq-OOH 도포로인 해유해산소의생성을높게하고생성된유해산소 를제거하기위해해독계효소가많이사용됨으로 써항산화방어기구의불균형을가져와산화스트 레스가심함을알수있었다. 본실험의유해산소 대사효소활성결과는조직학적관찰에서치자열 수추출물도포군이대조군에비해피부손상을적 게초래한일련의결과를뒷받침해준다 24)Chung JH,The mechanism ofskin aging,medical Postgraduates,32(1):p.23-28, Matrix metalloproteinase-3(mmp-3) mrna 발현량비교마우스에서피부진피조직에서기질단백질분해에중요한역할을담당하는 MMP-3 효소유전자의 mrna 발현량을피부조직에서측정한결과는 Fig.4 와같다. 대조군과용매대조군은정상군에비해유의하게높게나타난반면, 치자열수추출물도포군과양성대조군은대조군, 용매대조군에비해유의하게낮게나타남으로써치자열수추출물이세포외기질단백질의분해를억제시키는효과가있음을확인하였다. 이는치자열수추출물이자외선에의해발생하는활성산소의양을줄임으로써피부의각질형성세포와섬유아세포에서 MMP-3 유전자의발현을억제시킨것으로해석된다. 이와같은결과는주름양상과조직학적관찰에서치자열수추출물이주름형성을억제시키고피부손상을경감시킨일련의결과와부합한다.

12 134 Ⅳ. 결론 참고문헌 피부주름양상의관찰에서 UVB 조사와 Sq-OOH 를도포한대조군은생리식염수를도포한정상군과비교할때주름능선의두께가두껍고골이깊게형성된반면,retinoicacid 를도포한양성대조군과치자열수추출물도포군은상대적으로주름능선의두께가얇고골이얕게나타나치자열수추출물도포군이피부노화의대표적인징후인주름개선에효과적임을확인하였다. 피부조직의관찰에서대조군은진피층내교원섬유가파괴되어밀도가엉성하고양이많이줄어있었고. 변성된탄력섬유가엉킨탄력섬유증이군데군데관찰된반면, 양성대조군과치자열수추출물도포군은교원섬유의밀도가조밀하고. 변성된탄력섬유가적었으며배열이보다규칙적이었다. 유해산소대사효소활성에서대조군은 XO 활성의유의한증가와 SOD,CAT 활성의현저한저하를보임으로써산화스트레스가심하게나타난반면, 양성대조군과치자열수추출물도포군은대조군에비해 XO 활성은유의하게낮았고 SOD 와 CAT 활성은현저하게높게나타났다. 피부조직의 MMP-3mRNA 발현에서정상군에비해대조군은유의하게높았고, 양성대조군과치자열수추출물도포군은대조군에비해유의하게낮게나타났다. 이상의실험결과를종합해볼때,UVB 조사와 Sq-OOH 를도포한마우스피부에서치자열수추출물도포는유해산소의발생을감소시켜이로인해피부세포에서 MMP-3mRNA 발현을억제시키고피부조직의손상을적게시킴으로써피부주름형성을억제시키는효과가있음을확인하였다. 박성규, 이종찬, 안수미, 이진영, 김연준, 황재성, 이병곤, 장이섭, 적송엽이피부의노화에미치는영향, 대한본초학회지,20(4):p.1-10,2005 Aebi H, Catalase, In Methods of Enzymatic Analysis,EditedbyH.U.Bergmeyer.New York: AcademicPress,p ,1974 Bernstein EF,Chen YQ,TamaiK,Shepley KJ, ResnikKS,ZhangH,TuanR,MauvielA,Uito J,Enhancedelastinandfibrilingeneexpression in chronicaly photodamaged skin,journalof InvestigativeDermatology,103(2):p ,1994 BissetDL,HannonDP,OrTV,Ananimalmodelofsolar-aged skin:histological,physical,and visiblechangesinuv-iradiatedhairlessmouse skin,journalofphotochemistryandphotobiology A Chemistry,46(3):p ,1987 Chiba K, Kawakami K, Sone T, Onoue M, Characteristics of skin wrinkling and dermal changesinducedbyrepeatedapplicationofsqua lenemonohydroperoxidetohairlessmouseskin, SkinPharmacologyandAppliedSkinPhysiology, 16(4):p ,2003 ChibaK,SoneT,KawakamiK,OnoueM,Skin roughnessandwrinkleformationinducedbyre peated application of squalene monohydroperoxide to the hairless mouse, Experimental Dermatology,8(6):p ,1999 ChungJH,Themechanism ofskinaging,medical Postgraduates,32(1):p.23-28,2004 DarD,FridovichI,Freeradicalsincutaneousbi ology,journalofinvestigativedermatology,102, p ,1994

13 대한피부미용학회지제 7 권제 2 호 135 GilchrestBA,SkinagingandphotoagingAnover view,journal of the American Academy of Dermatology,21,p ,1989 Haliday GM,Inflammation,gene mutation and photoimmuno-suppression in response to UVR-induced oxidative damage contributes to photocarcinogenesis, Mutation Research, 571(1-2):p ,2005 HanYN,OhHK,HwangKH,LeeMS,Antioxidant componentsofgardeniafruit,koreanjournalof Pharmacognosy,25,p ,1994 Jeong HS,Park KH,Characteristics ofthe con version pigmentfrom Gardeniajasminoidesyel low pigment, Journal of Food Science & Technology,30,p ,1998 KligmanLH,Thehairlessmousemodelforphoto aging,clinicsindermatology,14(2):p ,1996 LowryOH,RosebroughNJ,FarrAL,RandalRJ, Protein measurementwith the folin phenolre agent, Journal of Biological Chemistry, 193(1):p ,1951 MacNaulKL,Chartrain N,Lark M,TocciMJ, HutchinsonNI,Discoordinateexpressionofstro melysin,colagenase,andtissueinhibitorofmet aloproteinases-1inrheumatoidhuman synovial fibroblastsynergisticefectsofinterleukin-1and tumornecrosis factor-alpha on stromelysin ex pression, Journal of Biological Chemistry, 265(28):p ,1990 MartinJP,DaileyM,SugarmanE,Negativeandpositiveassaysofsuperoxidedismutasebasedonhematoxylinautoxidation,Archivesof Biochemis tryandbiophysics,225(2):p ,1987 Oh JH,Chung AS, Steinbrenner H, Sies H, Brenneise P,Thioredoxin secreted upon ultra violeta iradiationmodulatesactivitiesofmatrix metaloproteinase-2andtissueinhibitorofmetal loproteinase-2 in human dermal fibroblasts, Archives of Biochemistry and Biophysics, 423(1):p ,2004 Plastow SR,LovelCR,YoungAR,UVB-induced colagenchangesintheskinofthehairlessalbi nomouse,journalofinvestigativedermatology, 88,p ,1987 RhieG,Shin MH,SeoJY,ChoiWW,ChoKH, Kim KH,ParkKC,EunHC, ChungJH,Aging and photoaging dependentchanges ofenzymic and nonenzymic antioxidants in the epidermis and dermisofhuman skin in vivo,journalof Investigative Dermatology, 117(5):p , 2001 StripeF,DelaCE,Theregulationofratliverxanthineoxidase.Conversioninvitrooftheenzyme activity from dehydrogenase(type D) oxidase (type O), Journal of Biological Chemistry, 244(14):p ,1969 TalwarHS,Grifith CEM,FisherGJ,Hamilton TA,VoorheesJJ,ReducedtypeI,type Iprocolagens in photodamaged adulthuman skin, Journal of Investigative Dermatology, 105 (2):p ,1995 UitoJ,OlsenDR,FazioMJ,Extraceluarmatrix ofthe skin;50 years ofprogress,journalof InvestigativeDermatology,92(4):p.61-77,1989 Wyss R, Chromatographic and electrophoretic analysis of biomedicaly important retinoids, JournalofChromatographyB:BiomedicalSciences andapplications,671(1-2):p ,1995

14 136 Inhibitory efectsofgardeniaefructuswaterextracton skinwrinkleformationinhairlessmice Abstract Hyung,Soon-Hee Min,Kyung-Jin Kim,Young-Chul Dept.ofPublicHealth,KeimyungUniversity Toinvestigatetheinhibitory efectsofgardeniaefructuswaterextracton theskin wrinkleformation,both theirradiation ofuvb and theapplication ofsqualene monohydroperoxide(sq-ooh) wereappliedtothebacksofexperimentalanimalsfor4weeksand atthesametime,experimental materialswereappliedtopicaly.six toseven weeksfemaleskh-1hairlessmiceweredividedinto fivegroupsincluding normal(n;saline),control(c;uvb +Sq-OOH +saline),vehiclecontrol(vc; UVB + Sq-OOH + vehicle),positivecontrol(pc;uvb + Sq-OOH % retinoicacid)and experimental(e;uvb +Sq-OOH +Gardeniae fructuswaterextract)groups,fiveanimalseachgroup. Wrinkles forthe C group were formed as a patern ofdeep furrows and thick crests.whereas wrinklesforthepc and E groupswere formed as a patern ofshalow furrowsand thin crests which weresimilartothatofthen group.colagen fibersin thedermisofc groupwerebroken severely and the density was sparse.whereas colagen fibers in the dermisofpc and E groups werealmostintactwith aregulararrangement.elastosiswasfound in thedermisofc groupwith theinfiltration ofdegeneratedandclotedelastin.whereaselasticfibersin thedermisofpc ande groupswereconsiderably intactwith aregulararrangement.theactivity ofxanthineoxidasewas significantly higherin C group compared to N group,buttherewasno significantdiferencebetweene groupandn group.mmp-3mrna expressioninc groupwassignificantlyhigherthann group,andthatofpc ande groupsshowedsignificantlylowerthanc group.takentheresultstogether,gardeniaefructuswaterextractcouldhaveaconsiderableinhibitoryeficacyonskinwrinkle formationinhairlessmice,probably duetoreducing oxidativestresscausedby UVB iradiationand Sq-OOH application. Keywords:Gardeniaefructus,wrinkles,colagenfiber,antioxidantenzymes,MMP-3

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Journal of Life Science 2011 Vol. 21. No. 8. 1120~1126 ISSN : 1225-9918 DOI : http://dx.doi.org/10.5352/jls.2011.21.8.1120 μ μ μ α β Journal of Life Science 2011, Vol. 21. No. 8 1121 μ μ 1122 생명과학회지 2011,