치의학석사학위논문 발치후삼차신경절신경세포의변화 Changes of Trigeminal Ganglion Neurons after Tooth Extraction 2013 년 2 월 서울대학교치의학대학원 치의학과신경생물학전공 장은수

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경진 한
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1 저작자표시 - 비영리 - 변경금지 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 변경금지. 귀하는이저작물을개작, 변형또는가공할수없습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 치의학석사학위논문 발치후삼차신경절신경세포의변화 Changes of Trigeminal Ganglion Neurons after Tooth Extraction 2013 년 2 월 서울대학교치의학대학원 치의학과신경생물학전공 장은수

3 발치후삼차신경절신경세포의변화 지도교수오석배 이논문을치의학석사학위논문으로제출함 2012 년 10 월 서울대학교치의학대학원 치의학과 장은수 장은수의석사학위논문을인준함 2012 년 11 월 위원장최세영 ( 인 ) 부위원장오석배 ( 인 ) 위원정지훈 ( 인 )

4 초록 발치후삼차신경절신경세포의변화 장은수 서울대학교치의학대학원 치의학과 발치에의한말초신경의손상은삼차신경절신경세포의활성을일으킨다. 이러한변화는신경병증적인악안면통증의발생에중요한역할을하는것으로생각된다. 치성구심성신경섬유는, 그대부분을차지하는것으로알려진유해수용성의작고수초화되지않은 C섬유신경세포와더불어일부존재하는낮은역치의기계수용성의큰수초화된 Aβ 섬유신경세포로구성된다. 발치후 ATF3 발현을통해삼차신경절의치성구심성신경세포에손상이나타나는것이알려져있지만, 현재까지발치후시간경과에따른 ATF3의발현양상및신경세포의종류에따른 ATF3 발현양상의차이는명확하게알려져있지않기에이를규명하고자본연구를수행하였다. 수컷 Sprague-Dawley 쥐의하악구치를발치한후 2시간, 4시간, 8시간, 1일, 7일, 14일, 21일, 30일이경과한쥐의삼차신경절을적출하여슬라이드를제작하였다. 면역형광염색법을이용해손상된신경세포의표지자인 ATF3와각각 C섬유및 Aβ섬유신경세포의표지자인

5 peripherin과 neurofilament 200의항체에면역반응성을나타내는세포의수를측정하여, 발치후시간에따른 ATF3의발현양상및신경세포의종류에따른 ATF3의발현양상의차이를조사하였다. 발치후삼차신경절의신경세포에서 ATF3의발현이관찰되었으며발치후 1일에절편당 6.1개로최대값을보였다. C섬유및 Aβ섬유신경세포모두에서발치후시간의경과에따라서 ATF3 면역반응성을보인세포의비율이증가하여 1일째에각각 6.5%, 7.4% 의세포에서 ATF3 면역반응성을보이며최대값을나타내었고그이후로는감소하였다. 발치후두신경세포간에 ATF3의발현비율은동일한각시점에서통계적으로유의미한차이를보이지않았다. 그리고손상받은신경세포전체중두종류의신경세포가차지하는비율또한각시점에서의비교시에유의미한차이를나타내지않았다. 이상의결과를통해, 발치후삼차신경절신경세포의손상을 ATF3 의발현으로확인할수있었다. 그리고치성구심성신경의발치에의한손상이 C섬유및 Aβ섬유신경세포에서세포의종류와무관하게동일한양상으로나타남을확인하였다. 주요어 : 삼차신경절, 면역형광염색, 신경세포, ATF3 학번 :

6 목 차 I. 서론 1 II. 실험재료및방법 3 III. 실험결과 6 IV. 고찰 12 V. 참고문헌 15

7 I. 서론 발치후환자들은신경병증적인통증, 혹은그와유사한증상을호소하는경우가있다 (Berge TI, 2002; Tay and Zuniga, 2007). 그원인으로감염원의신경계침입이나하치조신경의손상에따른삼차신경계의병적변화등을들수있지만 (Berge TI, 2002; Fried et al., 2001; Kohjitani et al., 2002), 아직그기전은명확하게알려져있지않다. 치아및안면부의유해자극은삼차신경계의유해자극감각계에의해삼차신경절과삼차신경핵복합체를거쳐중추신경계로전달된다 (Matthews B, 1985). 삼차감각신경의손상은삼차신경계전반에걸쳐신경세포및교세포등여러종류의세포활성을유발한다 (Chudler et al., 1997; Kim et al., 2008; Piao et al., 2006). 이와같은삼차신경계의세포활성은궁극적으로신경병증적통증을유발할수있는중추신경계의소성변화를일으킬수있는것으로알려져있다 (Terayama et al., 2008). 삼차신경절은삼차신경의세개의종지인안신경, 상악신경및하악신경이합쳐지는신경절로 (Henderson, 1965), 말단의구심성감각신경의손상에의해삼차신경절에존재하는신경세포및교세포에서여러가지세포활성이일어나는것이알려져있다. 여기에는직접손상된신경세포에서의 activation transcription factor 3(ATF3) 의발현및주위신경세포의 transient receptor potential vallinoid 1(TRPV1) 발현, satellite glial cell의 glial fibrillary acidic protein(gfap) 발현등의세포활성이포함된다 (Chudler et al., 1997; Gunjikake et al., 2009; Kim et al., 2008; Vang et al., 2012). 이러한세포의활성화는삼차신경계손상후의신경병증적악안면통증과연관된변화를일으키는것 1

8 으로생각된다 (Chudler et al., 1997; Gunjikake et al., 2009; Kim et al., 2008; Vit et al., 2006). 치성구심성신경은치아내부에직접축삭말단이분포하는말초감각신경으로치아에가해지는유해자극및비유해자극을감지하는역할을한다. 그대부분을차지하는것으로알려진유해수용성의작고수초화되지않은 C섬유신경세포와더불어, 일부존재하는낮은역치의기계수용성의큰수초화된 Aβ섬유신경세포로구성된다 (Narhi et al., 1992; Kim et al., 2011; Park et al., 2006; Vang et al., 2012). 기존의연구에따르면쥐에서상악구치를발치한경우에치성구심성신경의손 상에의해삼차신경절에서부분적으로 ATF3 의 발현양상이나타났다 (Gunjikake et al., 2009). 그러나하치조신경및이신경손상의경우 (Kim et al., 2008) 와는달리, 발치후시간에따른 ATF3 발현의변화는아직명확하게알려져있지않다. 또한, 치성구심성신경에서신경섬유의수초화여부, 혹은신경세포의종류에따른 ATF3 발현양상의차이도명확하게알려져있지않다. 따라서본실험에서는발치후시간에따른삼차신경절에서의 ATF3의발현을관찰하고정량화하고자하였으며, C섬유신경세포와 A β섬유신경세포의표지자인 peripherin과 neurofilament 200(NF200) 에대한면역염색법을이용하여 (Lysakowski et al., 1999; Staikopoulos et al., 2007) 신경세포의종류에따른 ATF3의발현양상을비교함으로써, 치성구심성신경의세포종류와발치시의신경세포의손상양상사이의연관성을규명하고자하였다. 2

9 II. 실험재료및방법 실험동물 본연구는서울대학교동물실험윤리위원회의검토와승인하에이루어졌으며, 의식이있는동물의실험에관한통증연구학회의윤리적규정을준수하였다. 실험동물로는수컷 Sprague-Dawley 쥐 ( 수술시점에서약 g 내외 ) 를사용하였다. 실험동물에게실험 1주일전부터 23±2 온도와 12시간명-암주기의하우징에서물과음식을자유롭게공급하였다. 그리고동물이받는고통을최소화하였다. 수술과정 총 54마리의쥐가실험군 (n=48) 및수술대조군 (sham surgery group) (n=6) 으로사용되었고 6마리의쥐가비수술대조군 (naive group) 으로포함되었다. 우레탄 (1.2g/kg) 의복강내주사로마취후실험군의쥐에서우측하악제 1, 2 구치를발치하였다. 모든쥐에서반대측은그대로두었다. 수술대조군에서는발치전까지의모든과정을실험군과동일하게수행한후, 발치를시행하지않고수술과정을종료하였다. 시간경과에따른실험을위하여, 발치후 2시간, 4시간, 8시간, 1 일, 7일, 14일, 21일, 30일의시점을설정하고, 각시점당 6마리의쥐를사용하여면역조직화학적분석을시행하였다. 3

10 면역형광염색 발치후각각의경과시점에서쥐를생리식염수와 4% paraformaldehyde가포함된 0.1mol/L phosphate buffer (ph 7.4) 로관류시켰다. 쥐에서동측의삼차신경절을적출하여후고정액에담근채로 4 에서 overnight한후 10% 에서 30% 의 sucrose를포함한 PBS에 48시간동안처리하였다. 그후동결된횡단절편 (14μm두께 ) 을슬라이드에마운팅하였다. 모든면역조직화학적과정은특별한언급이없는한상온에서진행되었다. 슬라이드를 PBS로세척한후 5% normal goat serum(ngs), 2% BSA, 2% FBS, 0.1% Triton X-100을포함한 PBS blocking solution에서 1시간동안처리하였다. 슬라이드는두가지방법으로이중염색되었다. 각시점별로 n=3 씩두군으로나누어서첫번째군은 peripherin과 ATF3, 두번째군은 NF200과 ATF3에대한이중염색을수행하였다. 첫번째군은 goat anit-peripherin antibody(1:50; Santa Cruz biotechnology, Inc.) 와 rabbit anti-atf3 antibody(1:500; Santa Cruz biotechnology, Inc.) 을사용하였고, 두번째군은 mouse anti-neurofilament 200 antibody (1:1000; Sigma-Aldrich, MO 63101, USA) 와 rabbit anti-atf3 antibody(1:500; Santa Cruz biotechnology, Inc.) 을사용하였다. 두군은모두 4 에서하루동안배양되었다. 다음과정으로슬라이드를다시세척한후, 첫번째군에서 FITC-conjugated donkey anti-goat IgG (H+L) antibody (1:200; Jackson ImmunoResearch) 와 Cy3-conjugated donkey anit-rabbit IgG (H+L) antibody(1:200; Jackson ImmunoResearch), 두번째군에서 FITC-conjugated donkey anti-mouse IgG (H+L) antibody (1:200; Jackson 4

11 ImmunoResearch) 와 Cy3-conjugated donkey anit-rabbit IgG (H+L) antibody(1:200; Jackson ImmunoResearch) 를사용하여 1시간동안배양하였다. 모든절편은 VectashieldR (Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, USA) 로마운팅하였고, 적절한필터를사용한공초점으로시각화하였다 (FV-300; Olympus, Tokyo, Japan). 분석및통계 ImageJ(National Institutes of Health, USA) 의 auto-threshold 와 particle analysing tool을사용하여각절편에서 peripherin 또는 NF200에면역반응성을가진세포의수를측정하고 cell counter tool 을사용하여 ATF3에면역반응성을가진세포의수를측정하였다. 모든데이터는평균값 (means)± 표준오차 (S.E.M.) 으로표시하였다. 통계적유의성의검토를위하여 Prism 6(GraphPad Software, Inc., San Diego, CA) 을사용하였으며, 시간에따른변화는 one way analysis of variance(anova) 로평가하고신경세포의종류에따른 ATF3 발현비율차이의유의성은 Bonferroni s multiple comparison test로평가하였다. 5

12 III. 실험결과 발치후 ATF3 의발현 비수술대조군과수술대조군에서는 ATF3의발현이관찰되지않았다.(Fig 1A; panel a). 그러나우측하악제1, 2 구치를발치한쥐의삼차신경절의하악연관부위에서는현저히증가된 ATF3의발현이관찰되었다 (Fig 1A; panel c). 발치후경과된시간에따라분석해보면, ATF3가발현된핵의개수는발치후시간에따라증가하여, 발치후 4시간에서발치후 7일까지의시점에서대조군과비교시에통계적으로유의미한 ATF3 발현양의증가를나타내었다. 발치후 1일에서 ATF3-면역반응성 (immunoreactive; IR) 핵의개수가최대값을보였고 ( 절편당 6.1±1.1 개의 ATF3 면역반응성핵, n=6, P<0.0001)(Fig 1A; panel c-d, Fig 1B) 이후로는점차감소하였다 (Fig 1B). 6

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14 신경세포의종류에따른 ATF3 의발현 모든절편에서각각 C섬유신경세포의표지자인 peripherin의발현과 (Fig 2A; panel a) Aβ섬유신경세포의 NF200의발현을확인하였다 (Fig 2A; panel d). 각각의표지자에의해확인된두종류의신경세포의전체수를측정하고, 그중 ATF3 면역반응성핵을동시에가진신경세포의수의비율을측정하였다. 발치후경과된시간에따라 C섬유신경세포에서 ATF3 면역반응성핵의발현비율이증가하여발치후 1일에최대값을보이고 (6.5±1.2%, n=3, P<0.05)(Fig 2A; panel b-c, Fig 2B) 이후점차감소하였다 (Fig 2B). Aβ섬유신경세포에서도 ATF3 면역반응성핵의발현비율이발치후점차증가하여발치후 1일에최대값을보이고 (7.4±1.5%, n=3, P<0.01)(Fig 2A; panel e-f, Fig 2B) 이후점차감소하였다 (Fig 2B). C섬유신경세포와 Aβ섬유신경세포간에발치후동일한시점에서의핵에서의 ATF3 발현비율을비교하였을때, 두신경세포사이에 ATF3 면역반응성핵을가진세포의비율이통계적으로유의미한차이를보이지않았다 (Fig 2B). 8

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16 ATF3 가발현된신경세포중각신경세포가차지하는비율 앞선결과에서발치후시간에따른 ATF3 발현양이통계적으로유의미한증가를보였던발치후 4시간, 8시간, 1일, 7일의네개군에서 ATF3가발현된신경세포전체중 ATF3와 peripherin 혹은 ATF3와 NF200이같이발현된세포의비율을각각계산하였다. 각각의시점에서두종류의세포간의차이를비교하였을때네시점모두에서 peripherin이같이발현된세포와 NF200이같이발현된세포의비율이통계적으로유의미한차이를보이지않았다 (Fig 3B). 10

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18 IV. 고찰 이번연구의목적은 ATF3의발현을통해발치에의한삼차신경절신경세포의손상을확인하고, 치성구심성신경의종류에따라손상양상에차이가존재하는지면역조직화학적방법을사용하여확인하는것이다. 그러므로본연구는발치후종종발생하는악안면영역의신경병적인통증의발생기전을밝히는연구의기초적인자료로서그의미를가진다. 본연구에서는 ATF3를손상받은신경세포의표지자로이용하였고 (Gunjikake et al., 2009), peripherin과 NF200을각각 C섬유및 Aβ 섬유신경세포의표지자로이용하였다 (Lysakowski et al., 1999; Staikopoulos et al., 2007). 이연구를통해얻은결과를정리하면, 1) 발치에의해삼차신경절신경세포가손상되었음을 ATF3의발현을통해확인하였고, 2) ATF3의시간경과에따른발현양상은 C섬유신경세포와 Aβ섬유신경세포에서유의미한차이를보이지않았으며, 3) 손상받은전체신경세포에서 C섬유및 Aβ섬유신경세포가차지하는비율은발치후시간경과에따라유의미한변화를보이지않았음을알수있었다. 발치후나타난삼차신경절신경세포의 ATF3 발현은치성구심성신경의직접적인손상을의미한다 (Kim et al., 2008; Gunjikake et al., 2009). 본연구에서는이 ATF3의발현양상을발치후경과한시간에따라정량적으로측정하였다. 이에따르면, ATF3의발현정도가발치후 1일에최대값을가진후감소하였는데, 이는하치조신경및이신경절단후 14일까지 ATF3의발현정도가동일한수준으로유지되었던기존연구의양상 (Kim et al., 2008) 에비하여상대적으로이른시점에 ATF3 발현정도의감소를볼수있었다. 하치조신경및이신경의절단 12

19 시에신경세포의축삭돌기가거의완전히손상되는데비하여각치아에는치성구심성신경을구성하는각신경세포의축삭돌기중일부만이분지하여치아내로분포하므로 (Johansson et al., 1992), 하악구치의발치시에이축삭의분지만절단되어신경세포가부분적인손상만을받을것으로유추할수있다. 이러한신경손상정도의차이가발치시와신경의절단시에 ATF3 발현의감소가나타나는시점의차이가나타난원인으로작용할것으로추정되나, 이를확인하기위해서는추후연구를통해통제된실험조건에서의비교분석이필요할것이다. 발치후항-peripherin 항체로표지된 C섬유신경세포와항 -NF200 항체로표지된 Aβ섬유신경세포둘모두에서일부세포의핵에 ATF3의발현이관찰되었다. 이결과는 C섬유및 Aβ섬유신경세포가모두발치에의해직접적으로손상되었음을의미한다. 이결과는상기의두신경세포가모두치성구심성신경을구성함을밝힌기존연구와일치한다 (Kim et al., 2011; Narhi et al., 1992; Park et al., 2006; Vang et al., 2012). 두신경세포모두 ATF3의발현이발치후 1일에최대로증가된후그이후로는감소하는양상을보였으며이는발치후삼차신경절전체에나타난 ATF3의발현양상과도일치하였다. 발치후각각의동일한시점에서 C섬유신경세포와 Aβ섬유신경세포에서의 ATF3의발현비율을비교하였을때통계적으로유의미한차이를보이는시점은발견되지않았다. 마지막으로 ATF3가발현된세포를손상된신경세포로가정하고전체손상된세포에서 C섬유, Aβ섬유각신경세포가차지하는비율을살펴보면, Fig 1에서 ATF3의증가가유의미한결과를보였던발치후 4 시간, 8시간, 1일및 7일군모두에서 C섬유및 Aβ섬유신경세포가전체손상된신경세포중차지하는비율은두세포사이에유의미한차이 13

20 를보이지않았다. 이결과는 C섬유신경세포와 Aβ섬유신경세포에서 ATF3의발현시점이나발현의지속시간에차이가존재하지않음을시사한다. 그러나본실험의조건에서는각절편에대해두신경세포중한종류씩만각각표지하였기때문에직접적으로두신경세포의비율의차이를비교하는것이불가능하므로비교에있어서한계를가진다. 그러므로더정확한비교분석을위해서는각절편에서두종류세포를동시에표지하는실험조건을사용해야할것이다. 이러한결과를종합해보면, 치성구심성신경은발치에의해손상을받아세포의활성이나타나며이때 ATF3의발현은 C섬유및 Aβ 섬유신경세포에서유사한양상을보였다. 이는발치에의한 ATF3의발현이신경세포의종류와는무관하게공통된기전으로나타남을의미한다. 이결과는발치에의한삼차감각신경계의손상이신경병적통증의발생을유발하는기전과관련하여삼차신경절수준에서의연구를위한기초자료로서그의미가있다. 또한발치에의한세포의활성에대하여시간에따른정량적인해석을시도하여이후치성구심성신경의손상과관련된세포수준에서의연구에기여할것으로사료된다. 14

21 V. 참고문헌 Berge TI (2002). Incidence of chronic neuropathic pain subsequent to surgical removal of impacted third molars. Acta Odontol Scand. 60(2): Chudler EH, Anderson LC, Byers MR (1997). Trigeminal ganglion neuronal activity and glial fibrillary acidic protein immunoreactivity after inferior alveolar nerve crush in the adult rat. Pain 73:141-9 Fried K, Bongenhielm U, Boissonade FM, Robinson PP (2001). Nerve injury-induced pain in the trigeminal system. Neuroscientist. 7(2): Gunjikake KK, Goto T, Nakao K, Kobayashi S, Yamaguchi K (2009). Activation of satellite glial cells in rat trigeminal ganglion after upper molar extraction. Acta Histochem Cytochem. 42(5):143-9 Henderson WR (1965). The anatomy of the gasserian ganglion and the distribution of pain in relation to injections and operations for trigeminal neuralgia. Ann R Coll Surg Engl. 37(6): Johansson CS, Hildebrand C, Povlsen B (1992). Anatomy and developmental chronology of the rat inferior alveolar nerve. Anat Rec. 234(1): Kim HY, Park C, Cho I, Jung SJ, Kim JS, Oh SB (2008). Differential changes in TRPV1 expression after trigeminal sensory nerve injury. J Pain 9(3):280-8 Kim HY, Chung G, Jo HJ, Kim YS, Bae YC, Jung SJ, Kim JS, Oh SB (2011). Characterization of dental nociceptive neurons. J Dent Res. 90(6):

22 Kohjitani A, Miyawaki T, Kasuya K, Shimada M (2002). Sympathetic activity-mediated neuropathic facial pain following simple tooth extraction: a case report. Cranio. 20(2):135-8 Lysakowski A, Alonto A, Jacobson L (1999). Peripherin immunoreactivity labels small diameter vestibular 'bouton' afferents in rodents. Hear Res. 133(1-2): Matthews B (1985). Peripheral and central aspects of trigeminal nociceptive systems. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 19;308(1136): Narhi M, Jyvasjarvi E, Virtanen A, Huopaniemi T, Ngassapa D, Hirvonen T (1992). Role of intradental A- and C-type nerve fibres in dental pain mechanisms. Proc Finn Dent Soc. 88 Suppl 1: Park CK, Kim MS, Fang Z, Li HY, Jung SJ, Choi SY, Lee SJ, Park K, Kim JS, Oh SB (2006). Functional expression of thermo-transient receptor potential channels in dental primary afferent neurons: implication for tooth pain. J Biol Chem. 23;281(25): Piao ZG, Cho IH, Park CK, Hong JP, Choi SY, Lee SJ, Lee S, Park K, Kim JS, Oh SB (2006). Activation of glia and microglial p38 MAPK in medullary dorsal horn contributes to tactile hypersensitivity following trigeminal sensory nerve injury. Pain. 121(3): Staikopoulos V, Sessle BJ, Furness JB, Jennings EA (2007). Localization of P2X2 and P2X3 receptors in rat trigeminal ganglion neurons. Neuroscience. 5;144(1): Tay AB, Zuniga JR (2007). Clinical charateristics of trigeminal nerve injury 16

23 referrals to a university centre. Int J Oral Maxillofac Surg. 36(10):922-7 Terayama R, Omura S, Fujisawa N, Yamaai T, Ichikawa H, Sugimoto T (2008). Activation of microglia and p38 mitogen-activated protein kinase in the dorsal column nucleus contributes to tactile allodynia following peripheral nerve injury. Neuroscience 153(4): Vang H, Chung G, Jung SJ, Kim JS, Oh SB (2012). Neurochemical properties of dental primary afferent neurons. Exp Neurobiol. 21(2):68-74 Vit J, Jasmin L, Bhargava A, Ohara PT (2006). Satellite glial cells in the trigeminal ganglion as a determinant of orofacial neuropathic pain. Neuron Glia Biol. 2(4):

24 Abstract Peripheral nerve damage following tooth extraction causes cellular injury response in trigeminal ganglion (TG) neurons, which may contribute to development of neuropathic pain in orofacial area. Using a neuronal injury marker, ATF3, we therefore examined temporal changes of ATF3 expression from 2 hours to 30 days after mandibular molar extraction and also whether there exists difference in ATF3 expression between nociceptive C-fiber and mechanosensitive Aβ-fiber neurons. Nociceptive neurons and mechanosensitive neurons were identified with immunohistochemical detection of peripherin and neurofilament 200, respectively. ATF3 expression peaked at 1 day after tooth extraction and gradually returned to baseline level. ATF3 expression at 1 days was 6.5% and 7.4% in C-fiber neurons and Aβ-fiber neurons, respectively, with no significant difference between two types of neurons at each time point analyzed. Also, when analyzed at time points with significant increase of ATF3 expression (at 4hr, 8hr, POD1, POD7), proportion of C-fiber and Aβ-fiber neurons was comparable among entire injured TG neurons. Our results demonstrate that tooth extraction causes neuronal injury in trigeminal ganglion neurons and C-fiber and Aβ-fibers could be similarly damaged by tooth extraction.

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