(72) 발명자 한재건 강원춘천시퇴계동퇴계주공 3 차 306 동 1003 호 하지혜 강원도춘천시퇴계동퇴계주공아파트 402 동 1505 호 오성호 강원도춘천시효자 3 동 김영 강원도춘천시효자 2 동강원대학교 권민철 강원도춘천시석사동 곽형

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만석 영
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1 (51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) A61K 36/232 ( ) A61P 37/02 ( ) (21) 출원번호 (22) 출원일자 2008 년 11 월 10 일 심사청구일자 전체청구항수 : 총 2 항 2008 년 11 월 10 일 (54) 고전압펄스전기장을이용한당귀추출방법 (11) 공개번호 (43) 공개일자 2010년05월19일 (71) 출원인 강원대학교산학협력단 강원춘천시효자동 강원대학로 42 (72) 발명자 이현용 강원도춘천시동면만천 2 리 406 번지 정향숙 강원도춘천시후평 3 동석사 2 지구아파트 207 동 304 호 ( 뒷면에계속 ) (74) 대리인 이정익 (57) 요약 본발명은고전압펄스전기장기술을이용한당귀의효율적인추출방법으로, 기존일반추출방법으로는유효성분을쉽게얻지못한다는점과, 고온추출시활성물질을파괴할수있다는점을고려하여선택한당귀의효율적인추출방법에관한것이다. 본발명의고전압펄스전기장추출방법은 65~80 에서 25 kv / cm의전기장을 5~20 분간 2~3 회정도주어천연물인당귀로부터유효성분을뽑아내는기술이다. 전기에너지의단기간투여시활성물질의파괴없이세포벽만선택적인파괴가가능해목적하는활성물질의생산성증대및기타유용활성의증진이가능하다. 본발명은종래초고압추출에비하여고가의장비를사용하지않아도된다는점과, 시간을절약할수있다는점에서특징을가진다. 또한수율과생리활성물질을많이내는것으로알려진 40~60kHz 의저에너지초음파추출과비교했을때역시비용과시간면에서경제적이다. 본발명의고전압펄스전기장추출방법을통하여얻어진당귀등의천연물은종래통상적인추출기술에비해천연물의생리활성물질에대한높은수율을가진다. 대표도 - 도 3-1 -

2 (72) 발명자 한재건 강원춘천시퇴계동퇴계주공 3 차 306 동 1003 호 하지혜 강원도춘천시퇴계동퇴계주공아파트 402 동 1505 호 오성호 강원도춘천시효자 3 동 김영 강원도춘천시효자 2 동강원대학교 권민철 강원도춘천시석사동 곽형근 강원도강릉시교 1 동 황보영 강원도원주시일산동우보삼성아파트 나천수 경기도수원시팔달구화서동 703 대우아파트 124 동 801 호 - 2 -

3 특허청구의범위청구항 1 당귀의열수추출물에 25-50kV / cm의전기장을발생시키는것을특징으로하는고전압펄스전기장을이용한당귀추출방법. 청구항 2 제 1 항에있어서, 상기전기장발생은 에서 5-20 분간 2-3 회발생시키는것을특징으로하는고전압펄스 전기장을이용한당귀추출방법. 명세서 발명의상세한설명 [0001] 기술분야본발명은고전압펄스전기장기술을이용한천연물당귀의효율적인추출방법에관한것이다. 더상세하게본발명은기존의추출수율향상을위해 500~1000psi 이상에서이루어지는초고압추출방법및 40~60kHz에서이루어지는초음파추출방법에서발생했던고비용과많은에너지소비에따른단점을개선하고자고안한것으로, 당귀의열수추출물에 25-50kV / cm의전기장을가하여수율증진효과와면역생리활성증진효과를갖는추출물을얻는추출방법에관한것이다. 본발명은당귀의면역기능증진과생육촉진인자의생산을위해추출물의전처리단계에서고전압펄스전기장을도입하여, 천연물자체의온도상승을수반하지않고신속히유용물질의생성을유도하고, 전압의연속처리가가능하므로물리적, 화학적및영양학적특성을펄스처리후에도유지할수있는장점을가진다. [0002] [0003] [0004] [0005] [0006] [0007] 배경기술참당귀 (Angelica gigas) 는미나리과에속하는다년생초본으로예부터진정, 진통, 빈혈및월경통, 냉대하증등의부인과질환에보혈, 청혈약으로널리임상에사용되어왔다. 대한약전에나오는당귀의약성은 ' 특이한냄새가나고맛은약간쓰면서달다 ' 고되어있으나, 이는중국당귀와왜당귀에서만느낄수있다. 참당귀는단맛은나지않고약간쓴맛만난다. 성분으로는 coumarin 유도체인 decusin, decursinol과 umbelliferon 등이보고되어있으며, 최근항돌연변이활성, 암세포생육억제활성, 간해독활성등이보고되어있다. 이러한당귀는최근기능성식품소재의원료로서타블렛, 파우치등으로개발되고있으며, 당귀의새로운이용에대하여많은연구가이루어지고있다. 하지만기존의추출방법인합성, 기타천연물의추출방법으로얻은당귀의면역조절물질에대해서추출물의활성에비해생산의효율성이낮은것이문제가되었다. 둘째, 기존에추출수율향상을위해탄성체를이루고있는질점들이압축되었다가팽창하면서전파되는파동의주파수를높여극세진동작용을통해침투력및진동효과증진을이용하는기술인초음파를이용한추출방법역시천연물의높은생리활성, 면역활성에비해시간과비용이커서효율적이지못했다. 마지막으로통상 100,000psi 이상의압력을가하여세포벽및조직을깨뜨려성분의용출을가속화하고단시간에높은용출량을얻음으로써효율을높이는방법인초고압을이용한추출방법은높은압력공정으로인하여위험이따르고에너지를발생시키기위해초고압을도입하려다보니그에따른장비의고비용이문제가되었다. 따라서본발명은천연한약재당귀의효율적인추출및저비용장비로의개선효과등을고려해고전압펄스전기장추출을고안했다. 짧은시간에 65~80 에서 25-50kV / cm의전기장을 2회정도주어천연물로부터유효성분을뽑아내는기술인전기펄스법은전기에너지를단기간투여시활성물질의파괴없이세포벽만선택적파괴가가능해져목적하는활성물질의생산성증대및기타유용활성의증진이가능해질뿐만아니라고온이아니기때문에, 당귀의유효성분의파괴위험또한없으므로안정적으로추출물을얻을수있다. 전압펄스 - 3 -

4 에의한당귀의수율은현탁액속에인가된펄스의수와펄스길이와전계강도에의하여결정된다. 또한전기 장의세기와처리시간이외에펄스의형태에의해서도영향을받는다. 발명의내용 [0008] [0009] [0010] [0011] [0012] 해결하고자하는과제본발명의고전압펄스전기장을이용한추출방법은통상적으로천연물의전처리단계에서행해지고있는초고압추출공정및초음파추출공정에비해낮은온도, 낮은압력에서추출함으로써추출성분의안정성을높이고, 다양한용매의사용이가능하면서도, 높은수율을가지는것을특징으로한다. 따라서많은에너지가소비되는초고압조건의형성을대신해고전압펄스를줌으로써, 비용이절감되는효율적인추출을행할수있게된다. 즉, 전기펄스추출법을통해초고압기기의경제적인어려움을극복할수있고, 지금까지의단순한추출방법으로얻을수없는새로운생리활성물질을생산할수있게한다. 본발명에의한고전압펄스전기장을이용한추출방법은종래초고압추출조건에비해용이한조건에서고효율의추출이가능하게함으로써, 종래 100,000psi 이상에서행해지는초고압추출이고압및고압에의한온도상승으로추출성분이불안정할수있으며고압조건형성을위해많은에너지및고비용이소요되는단점을가지고있는것을개선한다. 또한종래초음파추출이장비의고비용및추출시간을효율적으로조절할수없는단점을가지고있는것을개선한다. 본발명은짧은시간에 65~80 에서 25-50kV / cm의전기장을 2~3회주어천연물로부터유효성분을뽑아내는고전압펄스전기장추출방법을도입함으로써매우짧은시간에추출을완료할수있고, 전기에너지를단기간투여시활성물질의파괴없이세포벽만선택적파괴가가능해져목적하는활성물질의생산성증대및기타유용활성의증진이가능해질뿐만아니라저온에서추출이이루어지기때문에, 뿌리식물체인당귀의유효성분의파괴위험또한없으므로안정적으로추출물을얻을수있다. 따라서, 본발명의목적은기존일반추출법및이의개선을위해도입된초고압추출방법및초음파추출방법의조건형성이용이하지못하고고비용의설비및고에너지의소비가수반되는것을고려해서보다용이한방법으로높은수율을가지며경제적으로효율적인추출밥법을제공하는데있다. 본발명은고전압펄스전기장추출을통한당귀의수율및생리활성을측정하고, 종래의일반추출, 초음파추출및초고압추출공정과비교하여그차이를알아보았다. [0013] [0014] [0015] [0016] 과제해결수단상기목적을달성하기위하여, 본발명의고전압펄스전기장을이용한당귀추출방법은당귀의열수추출물에 25-50kV / cm의전기장을발생시키는것을특징으로한다. 또한, 상기전기장발생은 에서 5-20분간 2-3회발생시키는것을특징으로한다. 본발명은열수추출된뿌리식물체당귀시료를고전압펄스전기장발생장치에서입력전원교류전압을 high voltage transformer를사용하여전압을올린후정류하였으며완충효과를위해 oil 속에장치하였다. 본발명은특히, 처리과정에서열이많이발생하지않기때문에천연물의처리과정에서온도상승이없으므로열에의하여야기될수있는물질의특성변화, 발생물의추가등에대한문제가없다. 그리고고전압펄스전기장기술은전기세포조작이라고하여이미세포내로의물질도입법으로이용되고있기때문에본발명은유용한추출방법으로사용될수있으며높은생리활성물질을얻을수있다. [0017] 효과본발명의고전압펄스전기장을이용한당귀추출방법에서는전기를사용한고전압을이용하므로종래일반추출, 초고압추출, 초음파추출법에비하여낮은압력및온도에서행해짐에따라, 저에너지를소비함으로써공정비용이적게든다는이점이있다. 본발명에서는뿌리를이용하는천연물인국내산참당귀에고전압펄스전기 - 4 -

5 장을가함으로써수율을증진시킬수있고, 면역생리활성의증진효과를가진다. [0018] 발명의실시를위한구체적인내용 이하, 본발명의고전압펄스전기장을이용한뿌리식물당귀의추출방법에대해상세히설명한다. [0019] [0020] [ 제 1 공정 : 열수추출공정 ] 추출하고자하는생또는건조국내산참당귀 (Angelica gigas) 를적당한크기로분쇄하고, 일정비 ( 통상 10 배 ) 의 용매에서 로 시간 2 회연속열수추출한다. [0021] [0022] [ 제 2 공정 : 전기펄스공정 ] 제1공정에서열수추출된시료를고전압펄스전기장발생기의회분식으로제작된처리용기에담는다. 본발명에서는고전압펄스전기장이걸리는부위의전극간격, 처리시료의부피, 펄스의넓이, 펄스수 (n) 을달리하여뿌리식물당귀의생리활성물질증가도를향상시켰다. 고전압펄스전기장발생기의온도는 65~80 로 25-50kV / cm의전기장을 5~20분간 2~3회주어당귀의세포벽이깨어져생리활성물질이나오도록유도했다. [0023] [0024] [ 제 3 공정 : 추출물수득공정 ] 추출이완료되면고전압펄스전기장추출물을분리하고, 본발명의생리활성실험을위해여과및감압농축등 으로추출물을분말상태로수득한다. 밸런스를사용하여분말상의전기펄스추출물의수율을얻는다. [0025] 이하, 실시예및실험예를통하여본발명을더욱상세히설명한다. [0026] [0027] [0028] [0029] 실시예 1. 본실험의실시예를위하여일반적으로추출하여식용약용으로널리이용되는국내산참당귀를가지고시행하였다. 본발명에서는분쇄시켜얻은생또는건조참당귀 ( 건조중량 50g) 에 10배 (w/v) 의 1차증류수를가하여 60 에서 12시간씩 2회연속열수추출하였다. 열수추출물을고전압펄스전기장발생기에서회분식으로제작된처리용기에담는다. 고전압펄스전기장발생기에서천연물의생리활성물질을유도하기위한최적온도인 65 의온도가유지되게설정한다. 전기장의설정은 25kV / cm, 전극간격은 4mm, 저항은 400Ω, 펄스의수는 30회, 펄스의넓이는 100us, 펄스의형태는지수감쇄 (expotential decay) 파형으로설정하여 5분동안동일한조건으로 2회연속반복한다. 이후전기펄스전처리를마친시료를농축하였고, 동결건조하여분말화하였으며수율을확인하였다. [0030] [0031] [0032] 실시예 2. 본실험의방법을통한추출수율의효율을확인하기위하여국내산참당귀를대상으로에탄올을용매로한 60 열수추출, 100,000psi 초고압공정추출, 60kHz의초음파공정추출의세가지방법으로추가실험을실행하였고추출효율을비교하였다. 고전압펄스전기장전처리를실행한추출물은상기실시예1의방법으로수득한추출물을이용하였으며, 수율은각추출물을감압농축, 동결건조하여처음시료에대한건조중량 (%) 을구하여비교하였다. 표 1. 추출공정에따른추출수율비교 [0033] 시료수율 ( 중량 %) Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ - 5 -

6 참당귀 17.94± ± ± ±0.25 [0034] Ⅰ : 60 열수추출, Ⅱ : 100,000psi 초고압추출, Ⅲ : 60kHz 의초음파추출, Ⅳ : 고전압펄스전기장추출 [0035] 상기표 1에서보는바와같이각추출공정에따른수율은참당귀가 60 열수추출일때 17.94%, 초고압추출일때 24.26%, 초음파추출일때 19.32% 를보이며, 본발명에의한고전압펄스전기장추출수율은열수추출에비해 2% 이상의수율증진을보였으며, 초고압및초음파추출에비해서는수율은비슷하지만수율대비시간과비용면에서는주목할수있을정도로효율적이었다. [0036] [0037] [0038] [0039] [0040] 실험예 1. 본발명자는본발명으로인한추출물의수율증진을통한생리활성증진효과를알아보기위하여실시예 1 및 실시예 2 를통해얻어진참당귀추출물 ( 증류수를용매로한 60 열수추출물, 100,000psi 초고압추출물, 60kHz 초음파추출물, 려진면역활성실험을실시하였다. 25 kv / cm고전압펄스전기장처리하여수득한추출물 ) 을이용하여참당귀의생리활성으로알 본실험에서는 0.5 mg / ml의시료의첨가를통한인간면역세포인 B 세포와 T 세포의생육도를측정하고무처리한 대조군과비교함으로써시료의면역활성을측정하였다. 표 2. 시료첨가 (0.5 mg / ml ) 를통한참당귀추출물의생육조건활성측정 시료 6일째면역세포의생육도 ( 10 4 cell/ ml ) ( 참당귀추출물 ) B세포 T세포 60 열수추출물 10.92± ± ,000psi 초고압추출물 14.56± ± kHz의초음파추출물 11.54± ±0.46 고전압펄스전기장추출물 14.61± ±0.45 [0041] [0042] [0043] 면역세포인 B세포, T세포생육도의경우시료투여후최고수치를기록한 6일째의생육정도를표2에나타내었다. 그중 6일째가장높은활성을나타낸추출물인고전압펄스전기장의경우 B세포와 T세포가각각 cells/ ml, cells/ ml로가장높은생육활성도를나타났다. 상기표 2의실험결과를통하여 60 열수추출물과 60kHz의초음파추출물및 100,000psi의초고압추출물의면역활성은큰차이를보이지않는데반해, 60 열수추출물과비교했을때고전압펄스전기장추출공정을도입해얻은당귀추출물의경우면역활성이탁월한수치를보임에따라생리활성에있어서고전압펄스전기장추출공정이면역활성증진효과가있음을확인할수있었다. 본발명을위한실시예및실험예를통해수율과면역세포생육도사이에추가비교를할수있다. 100,000psi 초고압추출물과고전압펄스전기장추출물의수율이각각 24.26±0.34( 중량 %), 20.20±0.25( 중량 %) 인데 6 일째면역세포의생육도측정에서고전압펄스전기장추출물이 B 세포와 T 세포각각 cells/ ml, cells/ ml로초고압추출물의 B 세포와 T 세포각각 cells/ ml, cells/ ml보다 높은활성을나타내기때문에면역세포에효과적으로작용하는추출물이나왔음을확인할수있었다. [0044] [0045] 실험예 2. 실시예2에서의 60 열수추출법, 60kHz 초음파추출법및실시예1에서의 25kV / cm고전압펄스전기장추출법을통해추출한당귀를 HPLC를이용해, decursin 함량을측정하였고, decursin 함량정도를나타낸피크를도1,2,3 에나타내었다. Decursin은체내에서혈액순환과대사를활성화시켜항산화작용을하는생리활성물질이다. 동일한 8min 시간대에서 60 열수추출물이 0.003~0.0035AU의 decursin 함량을보인데반해, 60kHz 초음파추출 - 6 -

7 물은약 0.004AU 의함량을, 400Ω 고전압펄스전기장추출물은 30% 이상향상된약 0.007AU 의 decursin 함량을 보였다. [0046] [0047] [0048] 도면의간단한설명도1은열수추출법에따른 Decursin 함량을나타낸그래프이다. 도2는초음파추출법에따른 Decursin 함량을나타낸그래프이다. 도3은고전압펄스전기장추출에따른 Decursin 함량을나타낸그래프이다. 도면 도면 1 도면 2 도면 3-7 -

(72) 발명자안주희강원도춘천시효자2동양우아파트 104동 303호박성진강원도춘천시사농동현대아파트 103동 1004호김승섭강원도원주시명륜2동명륜2차아파트 103동 403호 하지혜 강원도춘천시석사동퇴계주공 4 단지아파트 402 동 1505 호 이준희 강원도춘천시효자 2 동

(72) 발명자안주희강원도춘천시효자2동양우아파트 104동 303호박성진강원도춘천시사농동현대아파트 103동 1004호김승섭강원도원주시명륜2동명륜2차아파트 103동 403호 하지혜 강원도춘천시석사동퇴계주공 4 단지아파트 402 동 1505 호 이준희 강원도춘천시효자 2 동 (19) 대한민국특허청 (KR) (12) 공개특허공보 (A) (11) 공개번호 10-2011-0099970 (43) 공개일자 2011년09월09일 (51) Int. Cl. A61K 36/20 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) B01D 11/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2010-0019009 (22) 출원일자 2010 년