Gallate 로표면코팅된이중인산칼슘골이식재가 골형성에미치는영향 연세대학교대학원 치의학과 박노제

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1 Gallate 로표면코팅된이중인산칼슘골이식재가 골형성에미치는영향 연세대학교대학원 치의학과 박노제

2 Gallate 로표면코팅된이중인산칼슘골이식재가 골형성에미치는영향 지도정문규교수 이논문을박사학위논문으로제출함 2011 년 12 월일 연세대학교대학원 치의학과 박노제

3 박노제의박사학위논문을인준함 심사위원심사위원심사위원심사위원심사위원 인인인인인 연세대학교대학원 2011 년 12 월일

4 감사의글 본논문이완성되기까지많은격려와지도편달해주신정문규교수님께진심으로감사드립니다. 논문의작성및심사에아낌없는조언과도움을주신이근우교수님, 문홍석교수님, 정한성교수님그리고권긍록교수님께도감사드립니다. 실험의전과정과논문작성까지일일이살펴주신김성태교수님, 기초실험을맡아주신오승한교수님, 문석준교수님께감사의인사를드리며동물실험에많은도움을주신자미안선생님, 데이터정리를도와주신박상현선생님과이채은선생님께도감사드립니다. 항상부족한저를끊임없이응원해주시는부모님과주말마다제가공부할수있도록손자손녀돌보기를마다하지않으신장모님께다시한번감사와사랑의마음을전합니다. 끝으로사랑하고존경하는나의아내김소연과언제나내삶의기쁨이되어주는딸서영과아들준서에게도큰감사와기쁨의마음을전합니다.

5 차 례 그림차례 ⅱ 표차례 ⅳ 국문요약 ⅴ Ⅰ. 서론 1 Ⅱ. 연구재료및방법 5 Ⅲ. 연구결과 15 Ⅳ. 고찰 32 Ⅴ. 결론 41 참고문헌 42 영문요약 49 - i -

6 그림차례 Figure 1. Schematic diagram of HA surface coating procedure 6 Figure 2. Surgical procedure 11 Figure 3. Radiographic analysis : micro CT 12 Figure 4. HE stained slide 13 Figure 5. Masson's trichrome stained slide 13 Figure 6. Image-Pro-plus program (The Proven Solution,USA) for histometrical analysis 14 Figure 7. Broad XPS scan of peptide grafted HA 15 Figure 8. FDA result 17 Figure 9. MTT assay result 18 Figure 10. Bone nodule formation test result : gallate 19 Figure 11. Histologic findings - 8 week 25 Figure 12. Histologic findings - high magnification 25 - ii -

7 Figure 13. Histologic findings of 4 week ErhBMP-2 group 26 Figure 14. Histologic findings of 8 week Oligopeptide group 27 Figure 15. Histologic findings of 8 week Oligopeptide group :Cuboidal osteoblast 28 Figure 16. Histologic findings of 8 week ErhBMP-2 group 29 Figure 17. Histologic findings of 8 week Oligopeptide group :osteoblast 30 Figure 18. Histologic findings of 8 week Oligopeptide group :osteoclast 31 - iii -

8 표차례 Table 1. Design of experiment 5 Table 2. BEs(eV) assigned to specific nitrogen-carbon and silicium containing functional groups in agreement with literature data 16 Table 3. Micro CT result : 4 week 19 Table 4. Micro CT result : 8 week 20 Table 5. Histometrical result : 4 week 21 Table 6. Histometrical result : 8 week 21 Table 7. Histometrical result : 4 week vs 8 week (NB%) 22 Table 8. Histometrical result : 4 week vs 8 week (RG%) 22 - iv -

9 국문요약 Gallate로표면코팅된이중인산칼슘골이식재가골형성에미치는영향 최근각광받는합성골이식재중에서많이사용되는재료로는하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite,ha) 와베타-트리칼슘포스페이트 (β-tricalcium phos phate,β-tcp) 를성분으로하는이중인산칼슘 (biphasic calcium phosphate,bcp) 골이식재가있다. 이중인산칼슘골이식재는다른물질들로표면을코팅처리함으로서골형성능력을향상시키는등보다우수한성질을가지게할수있을것으로보인다. 본연구의목적은이중인산칼슘골이식재표면을 gallate로코팅처리하였을때기존의문헌에보고된다른표면처리방법인 oligopeptide, ErhBMP-2를이용한경우와비교하여골형성능의향상에미치는영향을비교분석하는것이다. 총 36마리의토끼 (male New Zealand white rabbit) 에서 72개의상악동을대상으로실험을진행하였다. 토끼상악동의양측외벽에외경 6mm의윈도우를형성하고각토끼의우측상악동을대조군으로좌측상악동을실험군으로설정하였다. 대조군에는이중인산칼슘골이식재 (OSTEON,Dentium,Seoul,Korea) 만을넣었고, 실험1군에는 oligopeptide 5mg/ml로표면처리한 OSTEON 을, 실험2군에는녹차추출물인 gallate 5mg/ml로표면처리한 OSTEON 을, 그리고실험3군에는 ErhBMP mg/ml로표면처리한 OSTEON 을각각적용하였다. 대조군과각실험군의토끼중일부는 4주간의치유후희생시켰고, 일부는 8 주간의치유후희생시켰다. 희생시킨토끼의두개골을 micro CT(SkyScan 107 6,SkyScan,Aartselaar,Belgium) 로스캔하여, 증강된골부피 (CT volume) 및최대로증강된골높이 (MAH,maximum augmented height) 와결손부최고깊이 (DDD, deepest depth of the defect) 를측정하였다. Image-Pro-plus(The Proven So lution,usa) 프로그램으로토끼상악동내에골이식재를넣어증강된부위에대한조직계측학적분석을시행하였다. 통계프로그램 (SAS) 을이용하여, 4주와 8주희생군에서대조군과각실험군간의비교는 Kruskal-Wallis Test 를, 각군에서 4주, 8주치유기간에따른비교는 Mann whitney U test 를수행하였다.(p<0.05) - v -

10 이중인산칼슘골이식재의표면을 oligopeptide, gallate, ErhBMP-2로코팅하여골이식재의골형성능향상정도를비교한결과다음의결과를얻었다. 1. 4주희생군에서조직계측학적분석으로얻은신생골면적비 (NB%) 를보면대조군인이중인산칼슘골이식재 (OTSEON TM ) 만을적용한군에비해 ErhBMP -2로표면처리한이중인산칼슘골이식재를적용한군에서유의성있게신생골의형성이증가하였다. 2. 8주희생군에서조직계측학적분석으로얻은신생골면적비 (NB%) 를보면대조군인이중인산칼슘골이식재 (OTSEON TM ) 만을적용한군에비해 oligop eptide, gallate 로표면처리한이중인산칼슘골이식재를적용한군에서유의성있게신생골의형성이증가하였다 주희생군과 8주희생군간의비교시 gallate 로표면처리한군에서신생골면적비 (NB%) 가유의성있게증가하였다. 이상의결과로보아이중인산칼슘골이식재에대한 gallate 코팅처리가골이식재의골형성능력을향상시킨것으로생각되며, 4주이후 8주까지신생골의형성이현저히증가하였다. 핵심어 : 이중인산칼슘골이식재, gallate, oligopeptide, ErhBMP-2, 골이식재, 표면코팅 - vi -

11 Gallate로표면코팅된이중인산칼슘골이식재가골형성에미치는영향 연세대학교대학원치의학과 ( 지도정문규교수 ) 박노제 Ⅰ. 서론 치조골내, 골외결손부위의골재생을위해다양한골이식재들이연구되고사용되어왔다. 이러한골이식재는성분에따라자가골, 동종골, 이종골, 합성골등으로분류되어지며, 그작용기전은골형성, 골전도, 골유도의 3가지양상으로구분되어진다. 자가골은최고의골이식재로평가되어왔는데, 골형성, 골전도및골유도성이있는유일한재료이다.¹ 하지만, 공여부에대한부가적인수술이필요한불편함이있고, 자가골을채취할수있는공여부에한계가있으므로사용가능한양에도제한이있다.² 동종골은사람의시신에서채취한뼈를탈회, 살균, 소독시켜사용하는것으로골유도및골전도성을가지는골이식재이다. 동종골은다른사람의시신에서유래하기때문에면역반응이생길수있는가능성의문제, 시신에감염되었을지모르는 B형간염,C형간염및 AIDS등감염성질환의전염위험성등으로그사용에우려가제기되는재료이기도하다.¹ 이종골은동물의뼈특히, 소의뼈를가공하여만든골이식재로골전도성을가진다. 이종골은인간광우병 (Creutzfeldt-Jakob disease, CJD) 발병위험에대한논란과골이식재자체의흡수성여부에대한논란이있기도한재료이다.² 최근에는세라믹이나폴리머등으로만든합성골이각광받고있다. 합성골은골전도성골이식재로서생체불활성혹은생체활성을가지는재료이다.¹ 이중최근많이사용되는재료로는하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite,ha) 와베타-트리칼슘포스페이트 (β-tricalcium phosphate,β-tcp) 를성분으로하는이중인산칼슘 (biphasic calcium phosphate,bcp) 골이식재가있다

12 이중인산칼슘골이식재는다양한형태로제조되고있으나가장대표적인것은베타-트리칼슘포스페이트 (β-tricalcium phosphate,β-tcp) 로코팅된하이드록시아파타이트를주성분으로하는것이다. 이중인산칼슘골이식재는생체활성, 생분해성및골전도성을가지고있고조골세포의부착을촉진하는기능과이식재가생분해되면서신생골의침착을일으키는특성을가진다. 3 베타-트리칼슘포스페이트는생체활성이뛰어난재료로서하이드록시아파타이트에비해많은양의신생골을형성하지만흡수속도가너무빠른단점을가지고있다. 반면, 하이드록시아파타이트는비교적안정적인재료로서베타-트리칼슘포스페이트보다는적은양의골을형성하지만흡수속도가느려서베타 -트리칼슘포스페이트와서로보완되는성질을가진다. 너무빨리골이식재가흡수되면신생골이형성될때까지적절한공간을유지시켜주지못하므로바람직하지않고, 너무늦게골이식재가흡수되는것도역시신생골형성에도움이되지않으므로적절한흡수속도의조절이필요하다. 두성분의구성비를조절하여흡수속도를조절하려는연구가많이진행되었는데, 이전의연구에따르면하이드록시아파타이트의성분비가높은경우 (HA:β-TCP =75:25) 흡수속도가느려지게되고베타-트리칼슘포스페이트의성분비가높은경우 (HA:β -TCP=25:75) 흡수속도가빨라지게됨을확인할수있었다. 4,5 동물실험에서하이드록시아파타이트와베타-트리칼슘포스페이트의성분비가 20:80인경우에서높은흡수율을보이고, 골형성량도자가골과유사한수준을나타낸것으로보고되기도하였다. 5 이와같이하이드록시아파타이트와베타-트리칼슘포스페이트의성분비를조절하여흡수속도를변화시킬수있으므로최상의조합비율을찾고자하는노력이이어져왔다. 세포실험에서이중인산칼슘골이식재의흡수양상은자연상에존재하는석회화된유기질조직이흡수되는양상과매우유사하여흡수강이관찰되었다. 이중인산칼슘골이식재는많은증례를통해임상적으로만족스러운결과를보였고자가골을대체할만한골이식재로평가되고있다. 6 이러한많은장점에도불구하고이중인산칼슘골이식재는골형성능 (osteogenetic potential) 이결여된치명적인단점을가지는데이를개선하기위해다양한표면처리방법이연구되어왔다. 이중인산칼슘골이식재의골형성능을향상시키기위해여러단백질을첨가하는실험들도이루어져왔는데, 여러단백질중 TGF-β에높은친화성을보이고있는것으로밝혀져, 이를결합시켜서골형성능을향상시키 - 2 -

13 려는연구가시도되었다. 7 또한, 골형성단백질 (BMP-2) 와의결합 8, osteocalc in과의결합 9, alkaline phosphatase 같은효소와의결합 10, 법랑기질단백질과의결합 11 등이중인산칼슘골이식재의다양한표면처리방법이연구되었다. 이처럼이중인산칼슘골이식재를다른물질들로표면처리함으로서골형성능력을향상시키는등보다우수한성질을가지게할수있을것으로보인다. 본실험에서는녹차추출물인 gallate, oligopeptide, ErhBMP-2 를이용하여이중인산칼슘골이식재의표면을코팅처리한후골형성효과를비교하여보았다. 녹차는널리음용되는음료로서건강에유익하다는것이과학적사실로판명되었다. 암발생예방, 심혈관질환예방및골다공증예방등많이알려진녹차의효능은녹차에많이함유된 epigallocatechin-3-gallate(egcg) 라는 polyp henol에주로기인한다. EGCG의작용은골형성과도관련이있는데, EGCG 는 c ollagenase 혹은 gelatinase의활성과발현을억제하며, 파골세포 (osteoclas t) 의 apoptotic cell death를유도하여파골세포 (osteoclast) 형성을억제하는것으로알려져있다. 12,13 또한, EGCG는 alkalinephosphatase(alp) 의활성을증가시켜서 multipotent mesenchymal stem cell 이조골세포로분화되는과정을촉진하고결국광화된골결절의형성에영향을주는것으로보인다 개의아미노산으로된 BMP-2 유사배열을가진 oligopeptide가골재생을향상시킨예가보고되었고, 14 콜라겐 (collagen) 의세포부착도메인에상응하는펩타이드배열이조섬유세포 (fibroblast), 조골세포 (osteoblast) 등의세포부착에관여하는것으로보고되는등 15 적은양의합성oligopeptide를골이식재와혼합하여사용하면골이식재의골형성능향상에큰영향을줄것으로생각된다. 골형성단백질 (bone morphogenetic protein,bmp) 은성장인자의하나로서골유도성을가지는데, 골이식재의골유도성을높이기위해서골형성단백질로골이식재표면을처리하기도한다. 이렇게골이식재표면을처리하여사용하면다양한골이식재가생체적합성과골전도성을가지고있음에도불구하고골유도성이결핍되어생기는골이식재로서의한계를극복할수있다. 16 본연구에서는녹차추출물인 gallate, oligopeptide, ErhBMP-2 등으로이중인산칼슘골이식재의표면을코팅처리한후골형성정도를비교하였는데, olig opeptide와 ErhBMP-2 에대한이전의연구가많은데비하여상대적으로 galla te 를이용한연구는찾아보기어려웠다. 많은연구에서녹차추출물중 EGCG - 3 -

14 가골형성에미치는영향에관하여보고하였으나 gallate 에대한연구실적은거의전무하였다. 반면, 본실험의기초실험으로진행한 gallate 와 EGCG 를이용한골결절형성실험결과에서는 gallate 를이용했을때더많은골결절이형성된결과를얻을수있었고, 이에따라 gallate 코팅처리가이중인산칼슘골이식재의골형성능향상에어떤영향을주는지를 oligopeptide, ErhBMP-2와비교하게되었다. 본연구의목적은이중인산칼슘골이식재표면을 gallate로코팅처리하였을때기존의문헌에보고된다른표면처리방법인 oligopeptide, ErhBMP-2 를이용한경우와비교하여골형성능의향상에미치는영향을비교분석하는것이다

15 Ⅱ. 연구재료및방법 1. 실험동물 실험동물은 male New Zealand white rabbit을선택하여총 36마리의토끼에서 72개의상악동을대상으로실험을진행하였다. 토끼상악동에윈도우를형성하는위치는두개골의 nasofrontal suture line 전방으로 20mm 그리고정중선에서 10mm 측방을기준으로하였다. 17 실험동물의선택, 관리, 수술과정등은 Institutional Animal Care and Use Committe of Yonsei Medical Center 의표준을따랐다. 2. 대조군과실험군설정 본실험에서는토끼의양측상악동외벽에각각외경 6mm의윈도우를형성한후우측상악동은대조군으로좌측상악동은실험군으로설정하였다. 대조군에는이중인산칼슘골이식재 (OSTEON,Dentium,Seoul,Korea) 0.1 cc 를적용하였다. 실험1군에는 oligopeptide 5mg/ml로표면코팅한 OSTEON (0.1cc) 을, 실험2군에는 gallate 5mg/ml로표면코팅한 OSTEON (0.1cc) 을, 실험3군에는 ErhBMP mg/ml로표면코팅한 OSTEON (0.1cc) 을각각적용하였다. 대조군과각실험군의토끼중일부는 4 주간의치유후희생하고, 일부는 8주간의치유후희생하였다. Table 1. Design of experiment group 실험재료 대조군 희생시기 group당개체수 실험1군 Oligopeptide OSTEON TM 4주,8주 4주 (6마리)8주(6마리) 실험2군 Gallate OSTEON TM 4주,8주 4주 (6마리)8주(6마리) 실험3군 ErhBMP-2 OSTEON TM 4주,8주 4주 (6마리)8주(6마리) - 5 -

16 3. 골이식재표면코팅 본실험에사용한재료중이중인산칼슘골이식재인 OSTEON (Dentium,Seo ul,korea) 은 100% 합성골이식재로서사람의해면골과유사한공극구조를가지며하이드록시아파타이트와베타-트리칼슘포스페이트가 7대3의성분비율 (HA: β-tcp = 70:30) 로함유되어있다. 이중인산칼슘골이식재의표면처리에사용한재료중에서 oligopeptide(5mg/ml,sigma,mo,usa) 는 GTPGPQGIAGQRGVV(P-15) 의펩타이드배열을가지는데, 이는사람의 type I collagen 의세포부착도메인에해당한다. 18,19 P-15 펩타이드로코팅된무기질골입자가골기질성분과유사하게작용하여골재생을촉진하는것으로보고된바있다. 20 gallate(si gma,purity %,MO,USA) 는 5mg/ml의농도로사용하여이중인산칼슘골이식재표면을코팅하였다. ErhBMP-2 (Cowellmedi R,Busan,Korea) 는 0.05mg /ml의농도로골이식재표면코팅에사용하였다. 실험재료를이중인산칼슘골이식재표면에코팅한방법은다음과같다. 1) 이중인산칼슘골이식재의표면코팅과정 HA OH OH OH OH (I) APTES HA O Silane NH 2 (II) O Silane NH 2 O Silane NH 2 SMP O Silane NH 2 O Silane SMP O Silane SMP HA O Silane SMP O Silane SMP (III) Peptide HA O Silane SMP O Silane SMP O Silane SMP O Silane SMP Fig. 1 Schematic diagram of HA surface coating procedure: (I) APTES treatment; (II) Bi-functional cross-linker (SMP) connection; (III) thiolized peptide grafting

17 이중인산칼슘골이식재인 OSTEON (Dentium,Seoul,Korea) 의성분중하이드록시아파타이트에실험재료인 oligopeptide, gallate, Erh BMP-2 를결합시키는방법으로골이식재의표면코팅을시행하였다. 하이드록시아파타이트의수산화기 (OH-) 에 silane coupling agent인 3-aminopropyltriethoxysilane(A PTES)(Sigma,MO,USA) 를먼저결합시키고, 여기에다시중간결합제 (bifunction al cross-linker) 인 N-succinimidyl-3-maleimidopropionate(SMP)(Sigma,MO,U SA) 를결합시킨후실험재료인 oligopeptide, gallate, ErhBMP-2를이 SMP 와다시결합하도록하였다. 이러한표면코팅과정은골이식재표면에아민기 (NH -) 를형성시키는과정인 silanization과중간결합제 (bifunctional cross-link er) 인 SMP를아민기에결합시키는과정, oligopeptide, gallate, ErhBMP-2를 SMP와결합시키는과정의 3단계로구분할수있다. 21,24 Fig.1은이중인산칼슘골이식재의표면코팅과정의모식도이다. 각단계를자세히기술하면다음과같다. 우선, 골이식재표면에있는 carbon, oxygen 등의오염물질을제거하기위하여골이식재를속슬렛장치에넣고에탄올을용매로하여 100 에서 24시간순환시켰다. 이과정이완료된후 100 의진공상태 (10 ⁵torr) 에서 20시간동안 outgassing을시행하였다. 이후에 3단계로이루어진코팅과정을진행하였다. 첫번째단계는 silanization과정으로서골이식재표면에아민 (NH-) 기를형성시키는과정을수행하였다. 3-aminopropyltriethoxysilane(APTES) 를헥산 (H exane,sigma,mo.usa) 에녹이고, 그용액내에골이식재를넣었다.( 농도 : M =10mM) 실험은아르곤 (Ar) 가스환경에서진행하고, 2시간동안 stirring 하여반응시켰다. 21 반응이완료되고난후, 깨끗한헥산으로 3회세척하였다. 아르곤 (Ar) 가스환경에서수행하였고, 세척방법은 30분동안 stirring을 3회반복수행하였다. ( 각각 30분이아니라 3번세척이 30분안에이루어져야한다.)silanization이완료된후 70 의진공에서 4시간보관하여 outgassing 시켰다. 두번째단계는중간결합제 (bifunctional cross-linker) 를아민 (NH-) 기에결합시키는과정으로서 silane처리된골이식재를 SMP와결합시키는데, SMP를 M 농도인 dimethylformamide(dmf,sigma,mo,usa) 에녹인후, 2시간동안아르곤 (Ar) 가스환경에서 stirring하여반응시켰다

18 반응이완료되고난후깨끗한헥산으로 3회세척하였다. 아르곤 (Ar) 가스환경에서수행하였고, 세척방법은 30분동안 stirring이나 sonication을 3회반복수행하였다. 결합이완료되고난후 70 의진공에서 4시간보관하여 out gassing 시켰다. 세번째단계는 oligopeptide, gallate, Erh BMP-2 를 SMP와결합시키는과정으로서 Erh BMP-2를 DMF에녹이고그용액안에 SMP 처리된골이식재를넣은후 1시간동안반응시켰다. gallate와 oligopeptide에는 SH-기가없으므로, th iolation 과정을거쳐서표면의반응기를 SH-기로치환시킨후, 이과정을수행하였다.(thiolation 과정은아래에따로기술한바에따랐다.) gallate와 o ligopeptide가결합된시편은 DMF를이용하여 2회세척시행하였다. 아르곤가스환경에서수행하였고, 세척방법은 30분동안 stirring이나 sonication을 2 회반복수행하였다. 세척이완료된시편은 PBS를넣어냉동실 (-4 ) 에보관하였는데, 저장기간은 1주일을넘기면안된다. 1주일이상보관이필요한경우, 동결건조 (lyophilize) 시켜야한다. 위에언급한 gallate와 oligopeptide의 thiolation 과정은다음과같으며, 이과정도오염물질 (carbon,oxygen등) 을배제하기위해아르곤가스환경에서시행하였다. 22 유리아민 (NH-) 기가없는 ph 8 의 buffer를준비한후 buffer 용액에 degassing 과정을시행하였다. 새로운 thiol의산화를방지하기위하여 1mM EDTA를첨가하고 10 mg의 peptide를용해시켰다. 1 mg의 2-iminothiol ane를첨가하고반응이이루어지도록 분간실온에서보관하였다. 반응하지않은 2-iminothiolane은 Sephadex G-10(Equilibrated in degassed PBS with 1 mm EDTA) 으로 desalting 하여제거하였다. 이렇게 thiolated 된펩타이드는즉시사용하도록하거나, 아니면동결건조 (lyophilize) 시킨다. 2) Oligopeptide-HA 분석및세포실험 골이식재의표면처리과정이성공적인지를알기위해 silane 처리후와 olig opeptide를결합시킨후에각각 X-선광전자분광분석기 (XPS,K-Alpha ESKA SYS TEM,Thermofisher Scientific Inc.,MA,USA) 로분석하였다 23. oligopeptide가결합된골이식재에대해서는 fluorescein diacetate(fda) 염색과 MTT assay를시행하여세포에대한초기부착정도를관찰하기위한세포실험을시행하였다

19 FDA는살아있는세포에만착색되며녹색의형광으로발현된다. 따라서, 살아서골이식재표면에부착한세포들만관찰가능한방법이다. 48well plate에이중인산칼슘골이식재인 OSTEON TM 150mg을넣고, human mesenchymal stem ce ll(lonza AG,Switzerland) 를이용하여 cell/well로분주한다음각각 2시간, 24시간동안배양한뒤 1 PBS로세척하였다. FDA stock solution(sig ma,usa,5mg/ml acetone) 을 1 PBS로 working solution(20μg /ml) 을만들어 30 초동안반응시킨후시편에부착된살아있는세포의수를형광현미경 (JuLI TM, Smartfluorescentcellanalyzer,USA) 을이용하여시편당 5군데를촬영하여촬영된면에부착된세포를계산하였다. MTT assay는세포의증식을측정하기위한표준비색분석법이다. 세포의증식을정확하고신속하게판단하기위해 hemocytometer를이용하여생존세포수를세거나광학밀도 (optical density) 를측정하는방법이사용되지만많은수의세포를측정해야하는경우많은시간과노력이요구되고부정확한결과를가져올수있다. 반면, MTT assay는살아있는세포의미토콘드리아탈수소효소작용 (dehydrogenases) 에의하여노란색의수용성기질인 3-(4,5-dimethyl-t hiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide(mtt) 를자주색을띄는비수용성의 MTT-formazan 결정으로환원시키는미토콘드리아의능력을이용하는검사법으로서신속하고정확하게많은양의세포증식을측정할수있는방법이다. 자주색결정은 DMSO에용해되고흡광도 (Optical Density) 는 540nm의파장에서최대가되며, 이파장에서측정된흡광도는살아있는세포의수와직선적인상관관계를나타내게된다. 24 3) Gallate 에대한기초실험 골이식재표면의코팅처리에사용한재료중 gallate(sigma,purity %,MO,USA) 에대하여골결절형성에관한기초실험을진행하였다. NIH3T3 c ell을사용해서골결절의형성정도를관찰하였다. NIH3T3 cell line은스위스마우스태자 ( 胎仔,fetus) 세포를지름 50mm 샬레에 개씩이식한후 3일마다계대배양을반복하여제작한세포주 (3T3: 3day/Transfer/ 개 ) 로서여기에 vitamin C 를추가하여골형성을일으키게된다. 추가로 1μM,5μM,25 μm,50μm 의 gallate 를더넣어골결절이형성되는정도를계측하였다

20 4. 수술과정및시편처리 실험에사용된모든토끼에는 Zoletil(Virbac,Virbac Korea,Seoul,Korea)(1 5mg/kg) 과 xylazine(rumpun,bayer Korea,Seoul,Korea)(5mg/kg) 를혼합한후근육주사하여전신마취를시행하였다. 상악동부위의털을깎은후표면소독을시행하였고, 수술부위에는 2% lidocaine(epinephrine 1:100000,lidocaine HCl,Huons,Seoul,Korea) 를이용하여침윤마취를추가로시행하였다. nasal bo ne의 sagittal midline을따라절개한후피부와골막을포함하는전층판막 (f ull thickness flap) 을거상하였다. 충분한식염수관주하에외경 6mm 의 trephine bur (3i Implant Innovatio n,palm Beach Gardens,FL,USA) 를사용하여상악동에윈도우를형성하였다. 토끼두개골의 saggital midline 과좌우윈도우를연결한가상의선이만나는위치에핀을식립하여추후에 micro CT 촬영및조직표본채취시에기준점이될수있게하였다. 골편을제거한후조심스럽게상악동막을거상하고막하방에대조군및실험군에해당하는골이식재료를넣었다. 모든토끼에서우측상악동은대조군, 좌측상악동은실험군으로설정하였다. 좌우방향은토끼를기준으로정하는데토끼두개골의전면부를앞으로향하게했을때술자가위에서바라보는방향대로좌우측을구분하였다. 실험재료를넣은후차단막을사용하지않은채로골막을제위치시키고봉합하였다. 4-0 Monosyn(Glyconate absorbable monofilament, B-Braun,Aescul ap,pa,usa) 을사용하여봉합하고봉합사는일주일후제거하였다. 수술후 1 주일간항생제 Enrofloxacin(5mg/kg) 을근육주사하였다. 이미실험군설정에서계획된대로수술후 4주희생군과 8주희생군에각각마취제를과량주입하여해당하는시기에희생시켰다

21 (a) (b) Fig.2 Surgical procedure : (a) bilaterally prepared windows (b) insertion of grafting material (metal pin was inserted at the midline as a reference point for microct scanning and section.) 5. 방사선분석 - micro CT 상악동과주위의골을포함하는두개골블록을 10% 포르말린으로 10일간고정한후 micro CT(SkyScan 1076,SkyScan,Aartselaar,Belgium) 로스캔하였다. 스캔한데이터는 CT analyser프로그램 (SkyScan,Aartselaar,Belgium) 을이용하여 3차원적으로분석하였다. 3차원적분석을통해증강된골부피 (CT volume) 를측정하였다.Dataviewer 프로그램 (SkyScan,Aartselaar,Belgium) 으로최대로증강된골높이 (MAH,maximum augmented height) 와결손부최고깊이 (DDD,deepes t depth of the defect) 를측정하였다. MAH는단면영상에서직선적으로측정하고 (Fig.3(a)),DDD 는원래골위치에해당하는가상의선에서결손부최하방까지직선으로측정하였다 (Fig.3( b)). MAH 와 DDD 를계측하기위해 dataviewer 프로그램에서이미지파일을 3 차원적으로재구성하였고, 3차원적좌표값중에서 X(sagittal 좌표 ) 와 Z(front al 좌표 ) 좌표를이동하면서가장높이증강된부위에서 MAH를측정하고, 결손부가가장깊은부위에서 DDD 를측정하였다. CTvolume은 micro CT 영상에서

22 신생골이나잔존골이식재의입자로보이는것들이분포하는전영역을지정하여계측하였다. (a) (b) Fig.3 Radiographic analysis : micro CT (a)mah - maximum augmented height (b)ddd - deepest depth of the defect 6. 조직학적관찰 micro CT 를촬영한후상악동절편을채득하여 5% formic acid 로 2주간탈회시키고, 파라핀으로포매하였다. 골이식에의해증강된상악동중심부를따라 5μm두께로절편을만들어관상면으로절단하고, HE 염색 (Fig.4) 과 Mass on's trichrome 염색 (Fig.5) 을시행후조직슬라이드를광학현미경 (BX50,Ol ympus,tokyo,japan) 으로관찰하였다

23 Fig.4 HE stained slide Fig.5 Masson's trichrome stained slide 7. 조직계측학적관찰 광학현미경으로조직표본을관찰한후 Image-Pro-plus 프로그램 (The Proven Solution,USA) 으로조직계측학적분석을수행하였다. Fig.6은조직계측학적인측정을수행하는과정을보여주는사진이다. 토끼상악동내에골이식이시행된부위의총면적 (total augmented area) 과신생골의면적 (newly formed bo ne area) 및잔존골이식재의면적 (remaining grafts area) 을계측하였다. Image- Pro-plus프로그램 (The Proven Solution,USA) 상에서토끼상악동내의신생골과잔존하는골이식재를모두포함하는영역 (Fig.6에서녹색선으로표시된영역 ) 을지정하면상악동내골이식이시행된부위의총면적 (total aug mented area) 이계산되어표시된다. 또, 사진에서붉은색으로표시되는신생골의영역을지정하면신생골의면적 (newly formed bone area) 을구할수있다. 화면에서흰색의거친입자로보이는잔존골이식재의면적 (remaining gr afts area) 도같은방법으로구하였다. 표본간의비교를위하여계측한총면적과신생골면적간의백분율값인신생골면적비 (NB%), 총면적과잔존골이식재의면적간의백분율값인잔존골이식재면적비 (RG%) 를계산하였다

24 신생골면적비 (NB%) = 신생골면적 / 총면적 100 잔존골이식재면적비 (RG%)= 잔존골이식재면적 / 총면적 100 (NB%: newly formed bone area %, RG%: remaining grafts area %) Fig.6 Image- Pro-plus program(the Proven Solution, USA) for histometr ical analysis 8. 통계 micro CT 분석및조직계측학적분석에서얻어진데이터에대한통계처리는통계프로그램 (SAS) 을이용하여수행하였다. 4주,8주희생군에서대조군과실험군간비교를위해 Kruskal-Wallis Test를시행하였다. 각군에서 4주,8주치유기간에따른비교를위해서는 Wilcoxon Two-Sample Test 를시행하였다. (p<0.05)

25 Ⅲ. 연구결과 1. Oligopeptide-HA 분석및세포실험결과 XPS 분석골이식재표면의코팅처리를위해실험재료들 (oligopeptide,gallate,erhbmp- 2) 을골이식재성분중하이드록시아파타이트 (HA) 표면에결합시켜코팅하였다. 이과정이성공적인지확인하기위해 X-선광전자분광분석기 (XPS,K-Alpha ESKA SYSTEM,Thermofisher Scientific Inc.,MA,USA) 로분석하였다. 23 Fig.7의그래프는그결과를보여주는데, Si2p 밴드가 100eV 부근에보이는것으로보아 silane 처리가잘되었음을알수있었다. 또한, N1s, C1s 등이보이므로펩타이드결합이이루어진것도확인할수있었다. Fig. 7 Broad XPS scan of peptide grafted HA

26 Table 2. 에서보면 SiO 3 C에서 Si2p 밴드가 102.7eV에서나타나는데이는 Si lane 처리가되면나오는피크이다. C-NH 2,C-O와 N-C=O 에서 C1s 와 N1s등이보이는것은펩타이드가붙어있다는증거이다. Maleimide에서 C1s,N1s등이보이는것은중간결합제 (bifunctional cross-linker,smp) 가사용된증거이다. 이러한결과로보아 HA 표면과실험재료간의결합이잘되어있다는것을알수있었다. Table 2. BEs(eV) assigned to specific nitrogen-carbon and silicium cont aining functional groups in agreement with literature data C1s Si2p N1s SiO₃C [27] CH x 284.8[28] C-CO 285.3[29,28] C-NH₂,C-O [28] 398.9[30] N-C=O 286.4[28] [29] Maleimide [28] [9,31] COOH 288.5[28] FDA 염색 Oligopeptide로표면처리된골이식재 (oligopeptide-ha) 에대해서 FDA(fluor escein diacetate) 염색을시행한결과 Fig.8에서보듯이분주2시간후, 분주2 4시간후모두 oligopeptide로코팅된하이드록시아파타이트 (HA) 에서더많은녹색의형광발현을볼수있었는데, 이는세포의초기부착이증진된것을눈으로확인할수있는결과이다

27 (a) (b) (c) (d) Fig.8 FDA result : (a) after 2 hrs. HA (b) after 2 hrs. Oligopeptide-H A (c) after 24 hrs. HA (d) after 24 hrs Oligopeptide-HA MTT assay Fig.9는 MTT assay 시행결과를보여준다. Fig.9 그래프에서대조군 (contro l) 은 pure HA,SM6은 oligopeptide로코팅처리된골이식재 (peptide grafted HA), S7은 silane 처리된골이식재 (silane treated HA) 를나타내는데, 24시간분석과 48시간분석에서모두 oligopeptide나 silane 으로표면처리된골이식재가세포부착이더우수한것을알수있었다. 특히, oligopeptide로표면처리한골이식재 (SM6) 는 24시간분석에서더높은세포부착수치를나타내었는데, 이는 oligopeptide가세포의초기부착향상에도움을준결과로보인다

28 Fig.9 MTT assay result : control-pure HA, SM6-peptide grafted HA, S7-si lane treated HA 2. Gallate 기초실험결과 NIH3T3 cell line 에 gallate를추가하여골결절이형성되는정도를관찰한결과 (Fig.10) gallate의농도가 25μM 일때형성되는골결절의수가가장많았다. 원래 vitamine C 등을추가해서골형성을시키는데본실험에서는 gall ate를추가로넣어주면더많은골형성이일어나는것을확인할수있었다. gallate 농도 50μM에서는오히려골결절형성이줄어드는데, 이농도에서 ga llate의세포독성이있는지확인해볼필요가있을것으로보인다

29 Fig.10 Bone nodule formation test result : gallate 3. 방사선분석결과 : micro-ct Table 3. Micro CT result : 4 week MAH(mm) DDD(mm) CTvolume(mm 3 ) OSTEON 5.02± ± ± 4.06 Oligopeptide 4.48± ± ± 6.69 Gallate 4.93± ± ± 3.57 ErhBMP ± ± ± 1.67 * Data are mean± standard deviation. * MAH : maximum augmented height, DDD : deepest depth of the defect CTvolume : total volume of augmented area

30 Table 4. Micro CT result : 8 week MAH(mm) DDD(mm) CTvolume(mm 3 ) OSTEON 5.24± ± ± 5.85 Oligopeptide 4.15± ± ± 1.55 Gallate 4.70± ± ± 4.86 ErhBMP ± ± ± 2.91 * Data are mean± standard deviation. 위의 Table 3 에정리한바와같이 4주희생군에서 MAH 는 ErhBMP-2군 (5.03 ± 1.00) 이가장크고, OSTEON 군 (5.02± 0.87),gallate군 (4.93± 0.85),oligo peptide군 (4.48± 0.81) 의순으로나타났다. 4주희생군에서 DDD 는 oligopept ide 군 (0.80± 0.55) 이가장작고, ErhBMP-2군 (1.00± 0.60),OSTEON 군 (1.05± 0.60),gallate군 (1.40± 0.56) 의순으로나타났다. 4주군에서 CTvolume 은 gal late군 (27.73± 3.57) 이가장크고,oligopeptide군 (27.44± 6.69),OSTEON 군 (24.81± 4.06), ErhBMP-2군 (23.36± 1.67) 순서로나타났다. Table 4 는 8주희생군에서의 microct 계측결과를정리한것이다. 8주희생군에서 MAH 는 ErhBMP-2군 (5.37± 0.94) 이가장크고,OSTEON 군(5.24± 0.97), gallate군 (4.70± 0.83),oligopeptide군 (4.15± 0.52) 의순으로나타났다. DDD 는 oligopeptide군 (0.64± 0.44) 이가장작고 ErhBMP-2군 (0.93± 0.66),OSTEON 군 (1.00± 0.50),gallate군 (1.06± 0.66) 의순서로커진다. CTvolume은 galla te군 (26.71± 4.86) 에서가장크고 oligopeptide군 (24.53± 1.55),ErhBMP-2군 (24.37± 2.91),OSTEON 군 (22.94± 5.85) 순서로작아진다

31 4. 조직계측학적관찰 Table 5. Histometrical result : 4 week NB% (HE) RG%(HE) OSTEON 18.80± ± 4.72 Oligopeptide 26.30± ± Gallate 23.34± ± 9.00 ErhBMP ± ± 4.71 * Data are mean± standard deviation. * NB% : newly formed bone area %, RG% : remaining grafts area % * HE : hematoxylin-eosin stain * : significantly different(p<0.05) Table 6. Histometrical result : 8 week NB% (HE) RG%(HE) OSTEON 21.26± ± 5.49 Oligopeptide 30.53± ± 6.17 Gallate 31.60± ± 2.63 ErhBMP ± ± 4.67 * Data are mean± standard deviation. * : significantly different(p<0.05)

32 Table 7. Histometrical result : 4 week vs 8 week (NB%) 4week NB%(HE) 8week NB%(HE) OSTEON 18.80± ± 6.91 Oligopeptide 26.30± ± 5.36 Gallate 23.34± ± 4.94 ErhBMP ± ± 3.38 * Data are mean± standard deviation. * :significantly different(p<0.05) Table 8. Histometrical result : 4 week vs 8 week (RG%) 4week RG%(HE) 8week RG%(HE) OSTEON 31.50± ± 5.49 Oligopeptide 30.64± ± 6.17 Gallate 32.50± ± 2.63 ErhBMP ± ± 4.67 * Data are mean± standard deviation. * :significantly different(p<0.05) 4주희생군에서 HE 염색으로관찰한결과신생골면적비 (NB%) 는 oligopepti de군 (26.30± 7.02) 이가장크고, ErhBMP-2군 (26.08± 5.84),gallate군 (23.34± 4.81), OSTEON 군 (18.80± 5.73) 의순으로작아진다. 대조군인 OSTEON 군 (1 8.80± 5.73) 과 ErhBMP-2군 (26.08± 5.84) 간에는통계적으로유의한차이가있었다. 4주희생군에서 HE 염색으로관찰한잔존골이식재면적비 (RG%) 는 gall ate군 (32.50± 9.00) 이가장크고, OSTEON 군 (31.50± 4.72), oligopeptide군 (30.64± 11.25), ErhBMP-2군 (30.07± 4.71) 순으로작아진다. 통계학적유의성은없었다

33 8주희생군에서 HE 염색으로관찰한결과 NB% 는 gallate군 (31.60± 4.94) 이가장크고, oligopeptide군 (30.53± 5.36), ErhBMP-2군 (28.46± 3.38), OSTEON (21.26± 6.91) 순이며, 이중대조군인 OSTEON 군 (21.26± 6.91) 과 gallate군 (31.60± 4.94) 및 oligopeptide군 (30.53± 5.36) 간에통계학적유의성이있었다. 8주희생군 HE 염색에서 RG% 는 gallate군 (29.59± 2.63), OSTEON 군 (27.2 3± 5.49), ErhBMP-2군 (27.02± 4.67), oligopeptide군 (26.51± 6.17) 순이다. 각군에서 4주와 8주희생시기에따른 NB% 와 RG % 값을비교했을때 gallate 군에서 4주 NB%(23.34± 4.81) 와 8주 NB%(31.60± 4.94) 사이에통계학적으로유의성있게그값이증가하였고, OSTEON 군에서 4주와 8주 RG% 간에통계학적유의성있게 RG% 값이감소하였다

34 5. 조직학적관찰 전반적으로 Schneiderian membrane 하방으로신생골과 cortical layer 가형성된것을볼수있고, augmented 된골은 pseudostratified ciliated colu mnar epithelium 으로덮여있었다 (Fig.11). 골이식재주변으로신생골이보이고신생혈관, 조골세포, 신생골내 lacuna 속골세포 (osteocyte) 를관찰할수있다 (Fig.12). 비교적이른시기인 4주에주변결손부마진에서자라나온골이아니라골이식재주변에서신생된골이형성되는것을볼수있었다 (Fig.13). 신생골은주변의원래있던골에서기원된것으로보이고, trabecular patt ern 은상악동내잔존골에서부터발생한듯한양상을가지기도하며, 골이식재변연부가부드럽게변하여이식재 particle이흡수가진행되고있는양상을볼수있었다 (Fig.14). 대부분의신생골은결손부가치유되면서결손부주변에서발견되고있다. 결손부변연에서생겨나고있는신생골을확인하기위해고배율로보았을때골이식재가신생골에둘러싸여있는모습을볼수있었는데, 이러한골이식재와신생골이 incorporation되어있는양상을통해장차골이식재흡수가진행되면서해당부위는완전히신생골로바뀔것을기대할수있다. Fig.15에서는 Cuboidal osteoblst를볼수있는데, 이는 mesenchymal stem cell이 osteoblast로 differentiation 되는과정에서나타난다고보고된다. 3 가지실험군에서대부분비슷한소견을발견할수있었다. osteoblast들이생겨서신생골이생성되는것이 8주에서도계속진행되고있다는것을보여주고있다. 골이식재주변으로성숙된 lamellar bone의소견인 Haversian system, Harversian Canal, interstitial lamella가나타났으며 (Fig.16), 이는신생골이형성된후성숙된양상을보이는것으로파악된다. 다수의 osteoblast가신생골주변으로배치되어있는것을볼수있었고 (Fig.17), Fig.18은 8주 ol igopeptide 군으로 osteoclast가관찰되고있다. 다른개체에서는이러한흡수양상을거의찾아볼수없었는데, 이는이중인산칼슘골이식재가흡수되면서나오는 Ca 2+ 이온이 osteoclast를억제하기때문으로보인다

35 (a) (b) Fig.11 Histologic findings - 8 week : (a) Erh BMP-2 group 8 week. (b) O STEON group 8 week. Fig.12 Histologic findings - high magnification : Newly formed bone and blood vessel,osteoblast,osteocyte in lacuna were observed around graft material(osteon )

36 Fig.13 Histologic findings of 4 week ErhBMP-2 group: Callus was found near graft material(osteon ). It seemed to be originated from graft ma terial, not the margin of window site

37 (a) (b) Fig.14 Histologic findings of 8 week Oligopeptide group : (a) low magni fication finding (b) Shape of graft material was smoothened due to reso rption of graft material particles

38 (a) (b) Fig.15 Histologic findings of 8 week Oligopeptide group : (a) low magni fication (b) Cuboidal osteoblast (yellow arrowhead) was found, which oc curred when osteoblast was differentiated from mesenchymal stem cell

39 (a) (b) Fig.16 Histologic findings of 8 week ErhBMP-2 group : (a) low magnifica tion (b) Haversian system(yellow arrowhead,1),harversian Canal(red arro whead,2),interstitial lamella(blue arrowhead,3) were found

40 (a) (b) Fig.17 Histologic findings of 8 week Oligopeptide group : (a) low magni fication (b) Many osteoblast were found near newly formed bone.(yellow arrowheads)

41 (a) (b) Fig.18 Histologic findings of 8 week Oligopeptide group : (a) low magni fication (b) Many osteoclast were found

42 Ⅳ. 고찰 이중인산칼슘골이식재는베타-트리칼슘포스페이트 (β-tricalcium phosphat e,β-tcp) 와하이드록시아파타이트 (hydroxyapatite,ha) 성분이혼합된골이식재로서세포실험과동물실험및임상적용에서좋은결과를보이는대표적인합성골이식재이다. 25 이중인산칼슘골이식재는생체활성, 생분해성및골전도성을가지고있으며조골세포 (osteoblast) 의부착을지지하는기능과골이식재가생분해되면서새로운골의침착을일으키는기능을가지고있다.³ 베타-트리칼슘포스페이트 (β-tcp) 는생체활성이뛰어난성분으로서하이드록시아파타이트 (HA) 보다더많은골을형성하도록작용하지만너무빠르게흡수되는단점을가지고있다. 반면에하이드록시아파타이트 (HA) 는비교적안정적인재료로알려져있는데, 베타-트리칼슘포스페이트 (β-tcp) 보다는더적은양의골을형성하도록작용하지만흡수속도가느려서골이식재가흡수되는시기를연장할수있는성분이다. 너무이른시기에골이식재가흡수되면신생골이형성될때까지적절한공간을유지하지못하므로신생골형성에불리하고, 너무늦게골이식재가흡수되는것또한신생골이자리잡을공간을잔존골이식재가차지하게되어신생골형성에도움이되지않는다. 이중인산칼슘골이식재에서는베타-트리칼슘포스페이트 (β-tcp) 와하이드록시아파타이트 (H A) 의성분비를조절함으로서흡수속도와미세구조나입자사이공간의크기를변화시키고⁵, 이로인해골형성능의차이를보이게할수있다. 현재까지여러연구를통해이상적인혼합비율을찾게되었는데, 이전의연구에서하이드록시아파타이트 (HA) 가많으면 (HA:β-TCP = 75:25) 흡수율이낮아지게되고하이드록시아파타이트 (HA) 가적고베타-트리칼슘포스페이트가많으면 (HA:β-TC P = 25:75) 흡수율이높아지게됨을확인하였다. 4,5 세포실험에서이중인산칼슘골이식재가흡수되는양상은자연상에존재하는석회화된유기질조직이흡수되는양상과아주비슷하여흡수강이관찰되는것으로보고되었다. minipig를대상으로한동물실험에서는하이드록시아파타이트 (HA) 와베타-트리칼슘포스페이트 (β-tcp) 의혼합비율이 (HA/β:TCP) 20대 80 인경우에서높은흡수율을보였고자가골과대등할정도의골형성량을보였다고보고되었으며⁵, 총 52주간의치유기간을거치더라도 20% 이상의하이

43 드록시아파타이트 (HA) 가포함된골이식재는흡수가되지않고잔존하는것으로나타났다. 이중인산칼슘골이식재는많은장점에도불구하고골형성능 (ost eogenetic potential) 이결여된치명적인단점을가지는데최근에는이러한이중인산칼슘골이식재의골형성능을개선시키기위해여러단백질을첨가하는실험들이이루어져왔다. 그중에서 TGF-β에높은친화성을보이고있는것으로밝혀져골이식재와 TGF-β를결합시켜골형성능을향상하려는연구가진행되기도하였다. 7,42 또한골형성단백질-2 (BMP-2)⁸,Osteocalcin⁹,alkaline phosphatase 같은효소 10, 법랑기질단백질과의결합 11 등다양한방법으로이중인산칼슘골이식재의표면을처리하여골형성능을개선하려는시도가진행되었다. 녹차는널리음용되는음료로서건강에유익하다는것이과학적사실로판명되었다. 다수의역학조사등에서녹차를마시는것이암의발생과심혈관질환을예방한다는것이입증되었는데, 이런효능은녹차에많이함유된 epigallo catechin-3-gallate(egcg) 라는 polyphenol 에주로기인한다. EGCG가풍부한녹차를마시는것은골밀도의증가와도관련이있는것으로여겨지는데, 역학조사에의하면녹차음용과골다공증의위험도감소간에연관성이있다고보고되었다. 녹차잎의 polyphenol 중 30~40% 는 catechin( 혹은 flavonol) 에해당하고, 녹차에함유된 catechin의주성분은 EGCG,ECG 와 epicatechin이다. 12 EGCG의작용은골형성과도관련이있다. EGCG 는 collagenase 혹은 gelatin ase(mmp-2 와 MMP-9) 의활성과발현을억제하며, 파골세포 (osteoclast) 의 ap optotic cell death를유도하여파골세포 (osteoclast) 형성을억제한다. 12,13 또한, EGCG는쥐의파골세포 (osteoclast) 에서 apoptotic cell death를유도하 고 28 쥐의 bone marrow 에서의파골세포 (osteoclast) 형성과두개골의초기 조골세포 (primary osteoblast) 의형성을억제하는것으로알려졌다. 13 골을형성하는조골세포 (osteoblast) 와흡수하는파골세포 (osteoclast) 의활성이조화를이루어야완전한골이유지된다. 성숙한조골세포는세포외기질 (extra celluar matrix) 의분자를합성하고분비하는특성을가지며, alkaline phosp hatase(alp) 를생산하여세포외기질의광화를조절한다. ALP 는 phosphate e sters 를가수분해하여국소적인 phosphate 농도를증가시키고세포외기질의광화를촉진한다. ALP 를합성하는능력도성숙한조골세포의특징중하나로서 ALP의합성은조골세포의분화의초기지표로간주된다

44 multipotent mesenchymal stem cell이조골세포로분화되는과정은 Runt-rel ated transcription factor-2(runx2) 로알려진 runt-domain gene family에의해조절된다. Runx2 는 type I 과 type II의두가지형태가있는데, 이둘은 N -terminal 만다르고, SaOS-2 세포를포함한다수의 osteoblast-like cell line 에서나타난다. 기존의문헌에서 EGCG의조골세포에대한직접적인효과를연구하기위해 SaOS-2 cell 을이용하였는데, 이는사람의조골세포 (human osteo blast,hob) 는배양하는데긴시간이소요되고비용이많이드는반면 SaOS-2같은 osteosarcoma cell line은변형이많기는하지만 cell culture 상에서안정적인 osteoblast-like phenotype을가지므로조골세포의특징과기능을연구하는데좋은모델이되기때문이다. 그결과 EGCG가광화된골결절 (mineralized bone nodule) 의형성을강하게촉진하는효과를나타냄을증명하였다. 12 EGCG는 ALP의활성을증가시켜서 multipotent mesenchymal stem cell 이조골세포로분화되는과정을촉진하고결국광화된골결절의형성에영향을주는것으로보인다. Runx2가결핍되면 multipotent mesenchymal stem cell이조골세포로분화하는능력이결여된다. 반면, transgenic mice에서보여진것처럼조골세포의 Runx2가과도하게발현되는경우, 조골세포의숫자는많아지지만골기질형성이나광화같은기능은떨어진다. 즉, Runx2는조골세포분화의초기단계에서는조골세포의분화를촉진하여숫자를늘리지만, 후기단계에서는조골세포의성숙을억제하여골을약하게한다. EGCG는 Runx2단백질을억제하여광화된골결절의생성을증가시킨다. 즉, EGCG는 Runx2 단백질의합성을막아서조골세포의성숙을촉진하여 bone matrix의광화를증가시키고더많은골결절을만들게된다. 12 이와같이녹차추출물중 EGCG에관하여는많은연구가진행되어왔다. 반면, 녹차추출물의성분중 gallate(gallic acid) 에대하여는거의연구된바가없었다. 본연구의초기에녹차성분중에골형성에더효과적인성분을찾아보기위해골결절형성실험을진행하면서 galla te와 EGCG의골결절형성능을비교하는실험을진행하였데그때특정농도에서 gallate 가현저히많은골형성을일으키는것을확인하게되었고본실험에서도 EGCG 대신 gallate를이용하여연구를진행하게되었다. 앞으로 gallate의작용기전에대하여는많은연구가진행되어야하리라생각된다. 세포막에있는골형성단백질 receptor 와의결합에관여하는골형성단백질의특정펩타이드배열 (peptide sequence) 을이용하는것도골이식재의골형성

45 능향상을위한훌륭한대안이된다.15개의아미노산으로된 BMP-2 mimicking 배열을가진 oligopeptide가골재생을향상시킨예가보고되었다. Saito A등에의하면 펩타이드를주입한 α-tri scaffolds가토끼의요골 (radial bone) 에생긴 20mm 크기의결손부를 12주만에거의재생시켰다. 14 작은아미노산배열이큰단백질의 counterpart 만큼이나세포의결합, 세포증식그리고골재생에효과적으로알려져있는데, 특히, 콜라겐 (collagen) 의세포부착도메인에상응하는펩타이드배열은조섬유세포 (fibroblast), 조골세포 (oste oblast) 등의세포부착에관여하는것으로보고되었다. 15 Bhatnagar 등은 α 1(I) 사슬내에서사람의 type-i collagen 세포부착도메인 (P-15) 으로코팅된무기질의골입자를관찰하였는데, 18,19 이들이골기질과유사하게기능하여골형성을촉진하는것으로보고하였다. 20 또한, 골형성단백질-2(BMP-2) 에서기원한 oligopeptide와알지네이트를결합시켰을때정상적인장소를벗어난부위에서골형성이일어나는것이보고된바있다. 26 이전의실험에서 BMP receptor I과 BMP receptor II와결합하는도메인에해당하는 15개의아미노산을이종골에코팅을한후토끼두개골결손부에이식하였을때대조군과비교하여 2주, 4주째에서골형성이증가된다는것이보고되었다. 27 이로인해골형성단백질 (BMP) 과결합하는도메인에해당하는 olig opeptide가초기골형성에영향을준다는사실이확인되었다. 또한개의 3벽성결손부에대하여시행된실험을통해서도이 oligopeptide가골형성에미치는영향이규명되었다. 27 따라서, 적은양의합성oligopeptide를골이식재와혼합하여사용하면골이식재의골형성능향상에큰영향을줄것으로생각된다. 본실험에서는사람의 type I collagen 의세포부착도메인에해당하는 GTPGPQGIAGQRGVV(P-15) 의서열을가지는 oligopeptide로이중인산칼슘골이식재의표면을코팅하여실험재료로사용하였다. 16, 년 Urist 가골형성단백질의골유도성과골형성능력을보고한이래로유전자재조합기술에의해골형성단백질을생산해왔는데, 대부분은 chinese h amster ovary cell(bmp-2), mouse myeloma cell(bmp-4), human embryonic ki dney cell(bmp-4) 또는기타영장류 cell (BMP-7) 로부터생산하였다. 그러나, 이런방식으로생산하는경우생산량의한계및고비용의문제가있어최근에는주로 Escherichia coli bacteria에서생산된 Erh-BMP가임상적으로많이사용된다. 16 다른성장인자들의경우와마찬가지로 Erh-BMP 역시운반시스템

46 이필요한데, 하이드록시아파타이트나베타-트리칼슘포스페이트등이최적의후보물질이다. 이들하이드록시아파타이트나베타-트리칼슘포스페이트같은운반시스템재료들은세포성장, 혈관생성, 세포부착을위한최적의상황을제공하며공간확보의기능도한다. 29 골형성단백질이유용하기는하지만분자량이크고공간유지용물질과커플링하기에어려우며, 면역반응, 고비용, 다른장기에대한예상밖의영향등의문제점이있기도하다. 또한, 골형성단백질에대한운반시스템은초기에다량의골형성단백질을방출해버려서국소적으로는치료레벨이하로골형성단백질의농도가떨어지게하기도한다. 골형성단백질을골결손부의재생에활용하기위해서는이를적절하게방출하기위한운반체가필요하며, 이운반체는새로운조직의 template로서의기능도하게된다. 이를위해서단백질펩타이드유사체 (mimicry) 개발에주목하게되었다. 14 성장인자 (growth factor) 중하나인골형성유도단백질 (BMP) 을골이식재와같이사용하는것이골이식재의골형성능력을향상시키는가장효율적인방법중하나로여겨지고있다. 골형성유도단백질 (BMP) 중가장효과적인형태인 BMP-2 와 BMP-7이생체재료 ( 콜라겐, 인산칼슘cement, 중합체, 세라믹 ) 와함께정형외과영역에서적용되어왔다. 30,31 골형성유도단백질 (BMP) 과다공성의세라믹을같이사용할때는단순한방법으로결합하고건조하여적용하나그결합방법과골형성단백질 (BMP) 이유리되는비율에대해서는아직결정되어있지는않다. 32 대부분의연구에서는골형성단백질 (BMP) 을병용하였을때치유가빠르게일어나고골형성능이향상되었음을보고하였다. 반면몇몇연구에서는골형성유도단백질 (BMP) 이파골세포 (o steoclast) 를활성화시켜골흡수가진행된다고도보고하고있다. 33 최근의연구에의하면골형성단백질 (rhbmp-2) 이인산칼슘제재에흡착되는특성이언급되었는데, 한실험에서는흡착등온선에대해조사하였고, 칼슘의농도, 포스페이트의농도, 염화나트륨의농도및산도 (ph) 등과같은흡착에영향을주는요소들을연구한결과 rhbmp-2가하이드록시아파타이트 (HA) 에흡착되는양은초기 4시간이내에최대에도달하고칼슘이온은흡착을촉진하고인산이온은흡착을억제하는것으로보고되었다. 34 다른실험에서는골형성단백질-2(BMP-2) 가다른단백질에서보다인산칼슘제의하이드록시아파타이트표면에강한친화력을보였음을발견하였고 35, 또다른연구에서는하이드록시아파타이트표면들이 BMP-2의기능그룹들과상호작용하는이론적인모델을근거로하여카르

47 복실기능그룹들과하이드록시아파타이트표면으로부터기인한칼슘이온사이의선택적인상호작용에대해보고하였다. 36 이중인산칼슘골이식재의내부의미세공극은재료표면에순환하는성장인자가재료표면에잘결합하는데중요한역할을한다고주장되기도하였다. 37,38 본실험에서는토끼를실험동물로선택하였는데, 토끼는큰동물에비해상악동크기와형태의변이가적고상악동측방벽의두께도얇아서대체로일관되게결손부를형성할수있는장점이있다. 토끼의신진대사는사람보다 3~4배빠른것으로알려져있는데 39, 따라서 4주의치유기간은사람의 3~4 개월, 8주의치유기간은사람의 6~8개월에해당한다. 토끼에서 8주이후에는치유에별다른변화는없을것으로보여 8주는충분한치유기간으로보여진다. 토끼상악동에대한수술은구강내로접근하지않고구강외로접근하여시행하였는데, 구강외접근법이수술시야의확보, 수술부위로의접근성확보에유리하다. 또한, 이러한구강외접근법으로골이식재의노출, 감염,wou nd dehiscence, 저작시가해질수있는과도한부하등의위험요인들을예방할수있다. 40 본연구과정에서수술중이나수술후특이한치유과정을보인개체는없었다. 상악동모델의특성상호흡과정중에 sheneiderian membrane이들어올려지는압력이골생성을방해하는역할을했을것으로추측되지만본실험에서그렇게큰영향을미치지않은것으로고려되므로이실험모델이골이식재의성능을비교하는데사용되기에적합한모델이라고생각되어진다. 이중인산칼슘골이식재인 OSTEON TM 의표면에 oligopeptide, gallate 및 Erh BMP-2 를결합시키는과정은앞서실험방법에서상세히기술하였다. 처음단계가골이식재를속슬렛장치에넣고에탄올을용매로사용하여 100 에서 2 4시간순환시키는과정이었는데, 이는 air pollutant로일컫는 H,C,O,N 등이골이식재의표면에달라붙어재료를소수성, 비활성화상태로만들어표면처리과정이방해받는것을막기위함이었다. 단, OSTEON TM 같은제품화된골이식재는이미멸균처리되어포장된것이므로이과정을생략해도무방하리라생각된다. 골이식재의표면코팅이잘되었는지확인하기위한기초실험 (XPS 분석, MTT assay,fda 염색 ) 은 oligopeptide에대하여만시행하였는데이는 E rhbmp-2의경우구조식에 SH- 기가있어상대적으로 HA 와결합이용이할것으로판단했기때문이다. 반면, oligopeptide와 gallate는 SH-기를포함하지

48 않아별도로 thiolation 과정을수행하여야했으므로 oligopeptide에대한기초실험을통해 thioaltion 과정의성공여부도동시에파악할수있었던것이다. 신생골의형성을비교하기위해서 3차원적으로신생골형성량을분석하여군간의차이를비교한다면더좋은결과를얻을수있을것이다. 그러나본실험에서는신생골형성을파악하기위해 2차원적으로조직시편을만들어서비교하는방법을선택하였는데, 이러한실험상의한계를보상하기위해신생골의절대량을비교하는방법대신전체결손부에서신생골이차지하는비율을계산하는방법을사용하였다. micro CT를이용하여최대로증강된골높이 (MAH), 결손부최고깊이 (DDD) 및증강된골부피 (CTvolume) 을계측하였다. MAH 는특정위치의단면에서골이식으로인해증강된높이이므로전반적인증강된양상은 CTvolume 이더객관적데이터라고할수있다. CTvolume 수치는 4주군, 8주군모두군간에유의성은없었으나, 4주,8주희생군모두에서는 gallate군에서가장큰 CTvolume 을보이는경향을나타냈다. 4주, 8주희생군모두 oligopeptide군에서 DDD 가가장작다. 각군간에 DDD 수치사이에통계적인유의차는없었지만, oligopeptid e의역할에의해골이식부위에결손이적게생기도록하였다고생각해볼수있다. 동물실험상의한계로인해 4주, 8주희생군은각각다른개체여서시간에따른영향을확실히보여주지는못하지만 Erh BMP-2군에서는 4주보다는 8 주에서 MAH 와 CTvolume이모두커지고 DDD 는작아지므로방사선분석결과에국한하여생각하면가장좋은결과를보였다고추측할수있다. 조직학적관찰에서비교적이른시기인 4주에주변결손부경계에서자라나온골이아니라골이식재주변에서신생된골이형성되는것을볼수있었다 (Fig.18). 3차원적으로보면연결되어있을지도모르지만결손부변연에서상당부분거리가있는부위임을미루어짐작할때골이식재표면코팅의영향으로신생골이형성되었다고생각해볼수있다. Fig.23에서는 osteoclast가관찰되고있는데, 다른개체에서는이러한흡수양상을거의찾아볼수없었다. 이는이중인산칼슘골이식재가흡수되면서나오는 Ca 2+ 이온이 osteoclast를억제하기때문으로보인다. 이중인산칼슘골이식재가흡수되면서나타나는이러한양상으로 osteoclast 가억제되는것이신생골형성에도움이되는것으로추측할수있다

49 조직계측학적분석결과 4주희생군의신생골면적비 (NB%) 값은 HE 염색표본에서 oligopeptide, ErhBMP-2, gallate, OSTEON TM 군의순으로나타났고, 8주희생군에서는 gallate, oligopeptide, ErhBMP-2, OSTEON TM 군의순으로나타났다. 이중 4주군에서는 ErhBMP-2군과 OSTEON TM 군간에, 8주군에서는 oligopepti de군과 OSTEON TM 군, gallate군과 OSTEON TM 군간에통계학적유의성이있었다. 비록통계학적인유의성이없는데이터도있었으나전반적으로 oligopeptide, ErhBMP-2, gallate 로표면처리한골이식재를적용했을때 OSTEON TM 만을적용한경우보다골형성량이증가했다고생각할수있다. 통계적으로유의차는없으나 4주희생군에서는 oligopeptide군에서신생골형성이가장많았는데, 이는 MTT assay 결과에서나타나듯이 oligopeptide가초기세포부착을향상시키는데영향을준결과로생각해볼수있다. 본연구결과를보면신생골면적비 (NB%) 값이 4주희생군에서는 oligopepti de군과 ErhBMP-2군,8주희생군에서는 gallate 군에서크게나타났다. 초기에는 oligopeptide와 ErhBMP-2로표면처리한이중인산칼슘골이식재의골형성능력이더우수한것으로보인다. 하지만, 8주까지의충분한치유시간이주어지면 gallate 군에서상대적으로더많은양의신생골을형성하는것으로나타났다. 이는 gallate가 EGCG와유사하게짧은기간에골형성을촉진하는기능보다는파골세포에대한억제효과로골흡수를줄이고조골세포의성숙을도와세포외기질의광화를촉진하여골질을향상시키고유지하는기능이더주가되기때문으로생각된다. 또한, gallate 의파골세포에대한억제효과로인해잔존골이식재면적비 (RG%) 가 gallate 군에서가장크게나타났다고생각된다. 또한조골세포의성숙을도와골기질의광화를촉진하므로서결과적으로증강된골부피 (CTvolume) 값도 gallate에서가장크게나타났다. bone graft를시행하였을때신생골은골이식재에의해유지된공간에생기게된다. 따라서, Remaining graft의양에대한결과가통계학적인유의성은없었지만 8주치유기간이지난뒤에도 gallate군에서더많이남아있으므로향후신생골이생길가능성은더높은것으로예측해볼수있다. 또한, remai ning graft의양의감소와신생골생성양의증가사이의관계를분석하였을때 gallate군과 ErhBMP-2군에서는감소된 graft 양에비해많은신생골이생성되었음을알수있으므로신생골형성에보다효율적으로작용했다고추측할수있다

50 실험에사용된재료들의코팅농도는기존의문헌에서좋은결과를보인농도를채택하였다. 그중특히 ErhBMP-2의농도는기존논문 41 에보고된실험농도인 0.1mg/ml의반에해당하는 0.05mg/ml이었는데, 이는 BMP-2 의임상적용시나타날수있는부작용을고려했을때가능하면낮은농도로최적의효과를낼수있다면그것이더안전성이있는방법이아닌가생각했기때문이다. 척추수술후고농도의골형성단백질 (BMP) 을적용하여골형성을유도하였을때원치않는부위에서골형성이일어나고이로인한신경압박사례가보고되기도하는등 43,44 골형성단백질 (BMP) 사용에는위험성이따르는것으로알려져있다. 특히, 구강악안면영역에서는낮은농도로사용하더라도부작용의위험성을완전히배제하지는못할것으로생각된다. 본실험에서는차단막을사용하지않았는데이로인해골이식부위에연조직이개입할수있는여지가있었다. 결손부를덮는차단막을사용하지않았기때문에, 자라들어온연조직으로인해 healing이저해받았을가능성이있지만이중인산칼슘골이식재는비교적공간유지를하면서연조직이자라들어오는압력에저항할수있는재료라생각되었기때문에차단막을사용하지않았고결과를보면많은영향을받지는않은것으로보인다. 그러나향후실험에서차단막을사용한다면연조직의침범으로인한골생성방해를완전히배제할수있으므로보다가치있을것으로추측된다. 또한, 이중인산칼슘골이식재의표면처리가공중에골이식재입자의크기가변했을가능성이있고, 이것이결과에영향을미칠수도있을것으로사료된다. 앞으로는골이식재에대한표면처리를한가지재료로 1회만시행할것이아니라몇가지재료로여러번시행하여복합적인효과를추구하는것도시도되어야할것이다. 예를들어, BMP와 gallate로표면처리를 2회시행하여먼저 BMP 가초기골형성에작용하고이어서 gallate 가골광화를촉진시키는기능을가지도록한다면더좋은골형성결과를기대해볼수있을것이다. 동시에표면처리에사용한재료들을더적은농도로효율적으로적용할수있는방법도연구되어야하며, 좀더장기간의관찰을통해골이식재가흡수되는양상에대한연구도이루어져야할것으로생각된다. 미래에는더욱실제임상과유사한실험모델로같은이식재에대한실험을진행해보고자한다

51 V. 결론 이중인산칼슘골이식재의표면을 oligopeptide, gallate, ErhBMP-2로코팅하여골이식재의골형성능향상정도를비교한결과다음의결과를얻었다. 1. 4주희생군에서조직계측학적분석으로얻은신생골면적비 (NB%) 를보면대조군인이중인산칼슘골이식재 (OTSEON TM ) 만을적용한군에비해 ErhBMP -2로표면처리한이중인산칼슘골이식재를적용한군에서유의성있게신생골의형성이증가하였다. 2. 8주희생군에서조직계측학적분석으로얻은신생골면적비 (NB%) 를보면대조군인이중인산칼슘골이식재 (OTSEON TM ) 만을적용한군에비해 oligop eptide, gallate 로표면처리한이중인산칼슘골이식재를적용한군에서유의성있게신생골의형성이증가하였다. 3. 4주희생군과 8주희생군간의비교시 gallate 로표면처리한군에서신생골면적비 (NB%) 은유의성있게증가하였다. 이상의결과로보아이중인산칼슘골이식재에대한 gallate 코팅처리가골이식재의골형성능을향상시킨것으로판단되며, 4주이후 8주까지신생골의형성이현저히증가하였다

52 참고문헌 1. Carl E. Misch DDS,MDS, Francine Dietsh DCD,MDS. Bone-grafting materi als in implant dentistry. Implant Dentistry. fall 1993: Jensen SS, Broggini N,Hjørting-hansen E, Schenk R, Buser D. Bone heal ing and graft resorption of autograft, anorganic bovine bone and betatricalcium phosphate. A histologic and histomorphometric study in the mandibles of minipigs. Clin Oral Implants Res Jun;17(3): Daculsi G, Passuti N. Effects of the macroporosity for osseous substi tution of calcium phosphate ceramics. Biomaterials Jul;11: Yamada S, Heymann D, Bouler JM, Daculsi G. Osteoclastic resorption o f calcium phosphate ceramics with different hydroxyapatite/beta-tri calcium phosphate ratios. Biomaterials Aug;18(15): Jensen SS, Bornstein MM, Dard M, Bosshardt DD, Buser D. Comparative study of biphasic calcium phosphates with different ratio in mandibul ar bone defects. A long-term histomorphometric study in minipigs. J B iomed mater Res B Appl Biomater Jul;90(1): Ji Hyun Lee, Ui Won Jung, Chang Sung Kim, Seong Ho Choi, Kyoo Sung C ho. Histologic and clinical evaluation for maxillary sinus augmentat ion using macroporous biphasic calcium phosphate in human. Clin. Oral Impl. Res. 2008;19: Zhu XD, Fan HS, Xiao YM, Li DX, Zhang HJ, Luxbacher T, Zhang XD. Effect s of surface structure on protein adsorption to biphasic calcium phospha te ceramics in vitro and in vivo. Acta Biomater may;5(4):

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59 Abstract Effect of gallate-coated biphasic calcium phosphate bone substitute on osteogenesis No Je Park Department of Dental Science Graduate School, Yonsei University (Directed by Prof. Moon-Kyu Chung,D.D.S.,Ph.D) Biphasic calciumphosphate (BCP) bone substitute is one of the most popular alloplastic material these days. BCP does have osteoconductive characteristic only, not osteoinductive characteristic. To enhance osteo genetic property of BCP, surface modification with various materials ha s been tried. In this study the efficiency of 3 different modification mat erials (gallate, oligopeptide and ErhBMP-2) for bone regeneration were compared. The purpose of this study was to investigate the effects of BCP bone substitute surface modification with gallate on osteogenetic f unction of BCP when compared with Oligopeptide and ErhBMP-2. We compared the efficacy of bone regeneration of these 3 materials in a well-documented animal model. The maxillary sinuses of 36 male white rabbit were prepared bilaterally. The window of 6mm-diameter w ere prepared with trephine bur. Surface modified BCP with oligopeptid e, gallate and ErhBMP-2 was inserted into left maxillary sinuses and B CP alone was inserted right sinuses as control. After a healing period of 4,8 weeks sections of the augmented sinus and surrounding bone w ere made. They were analyzed by micro-ct, with histometrical method and observed histologically

60 According to the histometrical study, 1. In 4 week healing group, BCP coated with ErhBMP-2 showed more new bone formation compared with control group.(p<0.05) 2. In 8 week healing group, BCP coated with oligopeptide, gallate show ed more new bone formation compared with control group.(p<0.05) 3. BCP coated with gallate increased new bone formation between 4 w eek and 8 week healing period.(p<0.05) In conclusion, the surface modification of BCP with gallte was effect ive in enhancing the osteogenetic potential of BCP within the limit of this study. Keywords : biphasic calcium phosphate,gallate,oligopeptide,erhbmp-2,sur face modification