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진건 어금
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1 저작자표시 - 비영리 - 변경금지 2.0 대한민국 이용자는아래의조건을따르는경우에한하여자유롭게 이저작물을복제, 배포, 전송, 전시, 공연및방송할수있습니다. 다음과같은조건을따라야합니다 : 저작자표시. 귀하는원저작자를표시하여야합니다. 비영리. 귀하는이저작물을영리목적으로이용할수없습니다. 변경금지. 귀하는이저작물을개작, 변형또는가공할수없습니다. 귀하는, 이저작물의재이용이나배포의경우, 이저작물에적용된이용허락조건을명확하게나타내어야합니다. 저작권자로부터별도의허가를받으면이러한조건들은적용되지않습니다. 저작권법에따른이용자의권리는위의내용에의하여영향을받지않습니다. 이것은이용허락규약 (Legal Code) 을이해하기쉽게요약한것입니다. Disclaimer

2 의학석사학위논문 유전성유방암 난소암에서 BRCA1/BRCA2 돌연변이검출을위한 차세대염기서열분석법의임상적용 2016 년 2 월 서울대학교대학원 의학과검사의학전공 이승준

3 국문초록 서론 : 국내통계에따르면유방암및난소암은여성에서발생하는암중각각 2번째, 10번째로흔한암이다. BRCA1 및 BRCA2 유전자의돌연변이는유전성유방암및난소암의발병위험도를 5배이상높이는것으로알려져있다. 상기유전자들은각각 5.6 Kb, 10.3 Kb의크기를가지고있으며, 대립유전자의이질성을보일뿐만아니라돌연변이호발부위도없다. 이러한이유로 BRCA1 및 BRCA2 유전자는검사및해석이용이하지않다. 본연구에서는전통적인검사법인 Sanger sequencing 및 multiplex ligationdependent probe amplification (MLPA) 을대체할수있는방법인 next-generation sequencing (NGS) 을이용한유전자패널의임상적적용가능성을검토하고자한다. 방법 : 서울대학교병원분자유전검사실에서시행한 Sanger sequencing 및 MLPA로 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서돌연변이가확인된 50명의환자 (9명의엑손결손및 41명의점돌연변이 ) 를분석대상으로하였다. 평가대상인유전자패널 3종은 TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR Plus 및 Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel이었으며, MiSeq 및 Ion torrent PGM을이용하여염기서열분석을시행하였다. 결과 : 염기서열분석에있어 Sanger sequencing 와비교했을때 TruSeq Custom Amplicon 은 100%, BRCA Tumor MASTR i

4 Plus는 99.6%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 99.2% 의민감도를보였다. 위양성결과는 BRCA Tumor MASTR Plus에서만 133건보고되었다. Copy number variation 분석을이용한엑손결손의여부예측에있어 TruSeq Custom Amplicon은 100%, BRCA Tumor MASTR Plus은 88.9%, Ion AmpliSeq BRCA panel은 40% 의민감도를보였다. 특히 TruSeq Custom Amplicon은 9명의환자중 8명에서엑손결손범위까지정확하게예측하였다. 결론 : 본연구에서는 NGS 기법을이용한유전자패널은우수한분석능을지니고있음을확인하였다. 분석알고리즘을보완한다면 Sanger sequencing 및 MLPA를대체할수있을것으로판단된다. 따라서 NGS 기반의 BRCA1/2 유전자패널은유전성유방암및난소암을진단하는데있어유용한검사전략으로생각된다 주요어 : 유전성유방암 난소암, 차세대염기서열분석법, 유전자 패널, BRCA1, BRCA2 학번 : ii

5 목 차 국문초록...i 목차... iii 표목록... iv 그림목록... v 약어... vi 서론... 1 연구재료및방법 연구대상 DNA 추출 Library Preparation and Targeted Sequencing 데이터분석... 4 결과 Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene Copy number variation analysis of BRCA1 gene 고찰 참고문헌 영문초록 iii

6 표목록 Table 1. Patient list of three gene panel studies... 7 Table 2. Analytic performance of sequence analysis using gene panels Table 3. False negative variant cases in gene panels Table 4. False positive variant cases in gene panels Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel studies Table 6. Analytical performance of exon deletion prediction using gene panel Table 7. Prediction of exon deletion range using gene panel iv

7 그림목록 Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by gene panel Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion by Z-score Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S ,25 Figure 4. Prediction of exon deletion in patient S ,27 Figure 5. Prediction of exon deletion in patient S ,29 Figure 6. Prediction of exon deletion in patient S ,31 v

8 약 어 CNV MLPA NGS PCR Copy number variation Multiplex ligation-dependent probe amplification Next-generation sequencing Polymerase chain reaction vi

9 서 론 중앙암등록본부에서제시한국내통계에따르면유방암및난소암은여성에서발생하는암중에 2번째, 10번째로많은비율을차지한다. 2012년한해동안유방암발생자수는 16,521명이었으며, 난소암발생자수는 2,167명이었다. 유방암및난소암의 5-10% 는유전성인것으로보고되어있다 (1). 유전성유방암, 난소암의원인유전자중가장대표적인것은 BRCA1 (17q21; OMIM *113705) 및 BRCA2 (13q12.3; OMIM *600185) 유전자이다. 이들유전자는유전성케이스중의 15% 정도를설명한다 (2). 이들유전자에서돌연변이가양성인경우, 일생동안의유방암발병확률은 50%-80% 이며난소암발병확률은 20%-40% 이다 (3-5). BRCA1 유전자는 23개엑손으로구성되어있으며크기는 5.6 Kb 이다. 점돌연변이뿐만아니라엑손의결손및중복도발견된다. BRCA2 유전자는 27개엑손으로이루어져있으며크기는 10.3 Kb로 BRCA1 유전자의 2배에해당한다. 그리고 BRCA1 유전자와는달리엑손의결손및중복이거의관찰되지않는다. 두유전자모두돌연변이가호발하는부위는없는것이특징이다. 현재까지알려진바로는 BRCA1 및 BRCA2 유전자에서각각 1706개및 1446개의돌연변이가보고되어있다. BRCA1 및 BRCA2 유전자를분석하기위해전통적으로사용되어온검사방법은 Sanger sequencing이일반적이다. 개별엑손별로 PCR을시행하고각각의증폭산물로직접염기서열분석을시행하는방법이다. 엑손의결손및중복을확인하기 - 1 -

10 위해서는 multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) 또는정량 PCR을사용하고있다. 해당유전자들의크기가큰편이고, 엑손개수도많아상기검사법들은시간및인력이많이소요된다. 이를극복하기위해서최근 next-generation sequencing (NGS) 기법을이용하려는시도가많이이루어지고있다. 본연구에서는염기서열분석을위해사용중인 Sanger sequencing을대체할수있는방법인 NGS 기반의유전자패널을임상적으로적용해보고유용성을평가하고자한다. 그외에엑손의결실및중복을확인하기위해시행중인 MLPA와비교하여유전자패널의임상적적용가능성을검토하고자한다

11 연구재료및방법 1. 연구대상 연구대상은서울대학교병원분자유전검사실로 BRCA1 및 BRCA2 유전자검사가의뢰되었던환자중잔여검체활용에동의한경우만포함하였으며, 돌연변이양성인 50명을선정하였다. 41명은점돌연변이가, 나머지 9명은엑손결손이확인된경우였다. 기본적으로해당검사항목이의뢰되면해당유전자의모든엑손에대해 Sanger sequencing 및 MLPA를시행하였다. 다만 17명은가족내돌연변이가확인된경우라서특정범위에대한분석만시행한사례였다. 본연구는서울대학교병원의의학연구윤리심의위원회 (institutional review board) 에서연구승인 (IRB No. H ) 을받았다. 2. DNA 추출 연구에참여한환자의말초혈액을 EDTA 진공튜브에채혈하였고, 제조사의지침을따라 Puregene DNA purification kit (Gentra Systems, Minneapolis, MN, USA) 를이용하여채혈한말초혈액에서유전체 DNA를추출하였다. NanoDrop 2000c Spectrophotometer (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) 를이용하여 DNA의농도및순도를확인하였다. DNA 순도 - 3 -

12 는 A260/A280 의비율이 1.8 에서 2.0 사이임을확인하고검사를시 행하였다. 3. Library Preparation and Targeted Sequencing 본연구에사용된유전자패널은 3가지종류였으며, 각패널에포함된환자의명단은 Table 1과같다. 첫번째로 TruSeq Custom Amplicon (Illumina, San Diego, CA, USA) 는 50명환자전체를대상으로실험을진행하였으며 MiSeq (Illumina, San Diego, CA, USA) 을이용하여염기서열분석을시행하였다. 두번째로 BRCA Tumor MASTR Plus (Multiplicom, Niel, Belgium) 은 46명의환자 (9명의엑손결손사례포함 ) 를대상으로실험을진행하였으며 MiSeq으로염기서열분석을시행하였다. 세번째로 Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 는 30명의환자 (5명의엑손결손사례포함 ) 를대상으로하였고 Ion torrent PGM (Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) 으로염기서열분석을시행하였다. Libarary preparation 부터 targeted sequencing까지의전과정은제조사지침에따라시행하였다. 4. 데이터분석 4.1. Sequence analysis - 4 -

13 MiSeq에서얻어진기본데이터를 MiSeq Reporter (Illumina) 및 NextGENe software version 2.4 (SoftGenetics, State College, PA) 를이용하여분석하였다. Genome Reference Consortium Human genome build 37 (GRCh37) 을기준으로맵핑을하였다. BRCA1 및 BRCA2 유전자의표준염기서열은각각 NM_ 및 NM_ 을기준으로하였고, 분석범위는엑손 coding region 및그주변 20 bp까지포함하였다 Genome database, dbsnp135 및 Exome Aggregation Consortium의자료를이용하여다형성여부를확인하였다. 이미보고되어있는돌연변이인지를확인하기위해서는 Breast Cancer Information Core Database (BIC database; 및 Human Gene Mutation Database (HGMD; 를이용하였다 Copy number variation analysis BRCA1 유전자의 Copy number variation (CNV) 를파악하기위해서 depth에대한자료를표준정규분포를이용하여분석하였다. 먼저엑손결손이거의없는것으로알려진 BRCA2 유전자에대한평균 depth를이용하여투입된핵산의양을보정하였다. 보정된 BRCA1 유전자의 depth에대한데이터중엑손결손이없는 41명의환자의데이터를표준정규분포화하였고, 이를기반으로하여나머지 9명의환자데이터의표준정규분포내에서의위치를확인하였 - 5 -

14 다. 최종적으로얻어진각엑손에대한 Z-score를분석하여엑손결손의유무및범위를확인하였다. 보완적으로인접한 2개엑손의 Z-score 평균값을활용하여결손범위를예측하는데적용하였다. CNV 분석법에대해서 IBM SPSS Statistics 22 (IBM, Chicago, IL, USA) 를이용하여 ROC 곡선을그려분석능을평가하였다

15 Table 1. Patient list of three gene panel studies Patient TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus Ion AmpliSeq S01 Y Y Y S02 Y Y Y S03 Y Y Y S04 Y Y Y S05 Y Y Y S06 Y Y N S07 Y Y N S08 Y Y N S09 Y Y N S10 Y Y Y S11 Y Y N S12 Y Y N S13 Y Y Y S14 Y Y Y S15 Y Y Y S16 Y Y Y S17 Y Y Y S18 Y Y N S19 Y Y N S20 Y Y Y S21 Y Y Y S22 Y Y Y S23 Y Y N S24 Y Y Y S25 Y Y N S26 Y Y Y S27 Y Y Y S28 Y Y Y S29 Y Y Y S30 Y Y Y S31 Y Y N S32 Y Y N S33 Y Y N S34 Y Y N S35 Y Y Y

16 S36 Y Y N S37 Y Y N S38 Y Y N S39 Y Y Y S40 Y Y Y S41 Y Y N S42 Y Y Y S43 Y Y Y S44 Y Y Y S45 Y Y N S46 Y Y Y S47 Y N Y S48 Y N Y S49 Y N Y S50 Y N N Total number of patient included

17 결 과 1. Sequence analysis of BRCA1 and BRCA2 gene 키트종류및분석파이프라인과는무관하게 Sanger sequencing 결과와달리유전자패널에서추가로보고된 BRCA2 유전자의염기변이가있었다. c.4563a>g (rs206075; Variant allele frequency, 99.96%), c.6513g>c (rs206076; Variant allele frequency, 56.28%) 및 c.7397t>c (rs169547; Variant allele frequency, 99.86%) 가해당염기변이이다. 이는 GRCh37에서의해당위치의표준염기가 BRCA2 유전자의표준염기서열인 NM_ 과달라서위와같이보고된것으로염기변이분석의통계에서는제외하였다. 상기 3종류의염기변이를제외하고 50명의환자에서 Sanger sequencing으로확인된염기변이의개수는 289개였으며, 각유전자패널별로대상이되는환자에대해염기서열분석결과의일치도를비교하였다. 환자 S17의경우 c.922_924delinst를원인돌연변이로가지고있는경우이었다. BIC 데이터베이스에는 c.922_923delag가등재되어있었다. 기존의 Sanger sequencing 결과로는기보고된돌연변이인 c.922_923delag와 c.924c>t가서로반대편대립유전자에존재하는것인지아니면 c.922_924delinst인지를구분할수없었다. 이번연구를통해얻어진유전자패널의결과로 c.922_924delinst가확실함을실제로확인할수있었다 (Fig. 1)

18 1.1. TruSeq Custom Amplicon 대상환자인 50명에서 Sanger sequencing으로확인된염기변이는총 289개였다. 분석파이프라인은 2가지를사용하였으며 Illumina 분석플랫폼인 MiSeq Reporter와 NextGENe이었다. MiSeq Reporter의경우검출한염기변이는 289개로분석민감도는 100% 에해당하며, 위양성사례는없었다 (Table 2). NextGENe의경우 1건의위음성사례가있어분석민감도는 99.7% 에해당하였다. 위음성사례는환자 S20의 BRCA1 유전자에서보고된 c.1511g>a 였다 (Table 3). 해당염기변이의 allele frequency는 20% 미만이었다. 위양성사례는환자 S15에서보고된 c.468_469delta 및환자 S46에서보고된 c.3463dupg였다 (Table 4) BRCA Tumor MASTR Plus 대상환자인 46명에서 Sanger sequencing으로확인된염기변이는총 263개였다. MiSeq Reporter의경우검출한염기변이는 261개로분석민감도는 99.2% 에해당하였다. 위양성사례는 145건이었다 (Table 2). 위음성사례는 2건으로모두틀이동돌연변이였으며, 환자 S33의 BRCA2 유전자돌연변이인 c.3744_3747deltgag 및환자 S40의 BRCA1 유전자돌연변이인 c.5496_5506delinsa였다 (Table 3). 이들모두 20% 미만의 allele frequency를보여검출되지않았다. 위양성사례 145건은모두 8종의염기변이였으며, BRCA2 유전자에만분포하고있었다 (Table 4). NextGENe의경우 263개의염기변이중 262개를검출하여 99.6% 의분석민감도를보였다. 위음성사례 1건은환자

19 S33의 BRCA2 유전자돌연변이인 c.3744_3747deltgag였으며, 20% 미만의 allele frequency로인해검출하지못했다. 위양성사례는모두 133건으로 6종의염기변이였으며, BRCA2 유전자에만분포하고있었다 Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel 대상환자인 30명에서 Sanger sequencing으로확인된염기변이는총 257개였으며, 분석플랫폼은 Ion Reporter를사용하였다. 257개의염기변이중 255개를검출하여 99.2% 의분석민감도를보였다 (Table 2). 위음성사례 2건은환자 S17의 BRCA1 유전자돌연변이인 c.922_924delinst 및환자 S40의 BRCA1 유전자돌연변이인 c.5496_5506delinsa였으며, variant calling의오류로인해검출하지못했다 (Table 3). 위양성사례는존재하지않았다 (Table 4). 2. Copy number variation analysis of BRCA1 gene MLPA에서엑손결손을보인환자는총 9명이었다. BRCA1 유전자의 1번엑손은 non-coding 부위로분석대상에서제외하였으며, 그외의범위인엑손 2-23번에대한유전자패널의엑손단위의결손에대한분석능을평가하기위해 ROC 곡선분석을시행하였고결과는 Fig. 2와같다. 각유전자패널의곡선아래영역은 TruSeq 1.000, Ion AmpliSeq 및 Multiplicom 순이었다 TruSeq Custom Amplicon 50명의환자들에대해 BRCA2 유전자의 depth를분석하였다

20 평균값은 2519X, 표준편차는 573X로나타났으며, 변동계수는 22.7% 이었다. 이를이용하여 BRCA1 유전자의 depth를보정하였으며, 결손이없는환자들의데이터를기반으로하여표준정규분포화를시행한뒤 Z-score를산출하였다. ROC 곡선상에서민감도와특이도의합이가장큰지점은각각 100% 및 99.6% 이었으며, 해당하는 Z-score 범위는 -2.55부터 이었다. 일반적으로많이쓰이는 cut-off인 Z-score -3.0을적용하여결손여부및그범위를예측해보았다. 각환자의엑손결손여부는단하나의엑손에서라도결손을시사하는소견이있는경우를양성으로분류하였다. 분석대상인환자 50명중엑손결손을시사하는소견을보인환자는 12명이었다 (Table 5). 엑손결손여부를예측에있어서의분석능은민감도 100% 및특이도 92.7% 이었다 (Table 6). 9명의환자중 8명에서결손범위를정확하게예측하는분석능을보였다 (Table 7). 각사례별로확인해보면환자 S01의경우엑손 2-23번의결손이정확하게확인되었다 (Fig. 3A). 환자 S02 및 S03의경우각각엑손 10-12번및엑손 17-18번의결손이정확하게확인되었다 (Fig. 4A & 5A). 하지만환자 S04의경우엑손 7번과 9번이 cut-off를약간상회하는소견을보여결손범위의예측에있어일부오차가있었다 (Fig. 6A). 오차를보정하기위해인접한 2개엑손의 Z- score 평균값을산출하여, 해당값이 -3 미만인경우인접엑손이모두결손범위에해당한다고판정하였다. 이결과를결손여부및범위를예측하는데적용하였을때, 9명의환자에서모두정확한결과를도출할수있었다

21 2.2. BRCA Tumor MASTR Plus 46명의환자들에대해 BRCA2 유전자의 depth를분석하였다. 평균값은 6087X, 표준편차는 1288X로나타났으며, 변동계수는 21.2% 이었다. 이를이용하여 BRCA1 유전자의 depth를보정하였으며, 결손이없는환자들의데이터를기반으로하여표준정규분포화를시행한뒤 Z-score를산출하였다. ROC 곡선상에서민감도와특이도의합이가장큰지점은각각 96.1% 및 95.6% 이었으며, 해당하는 Z-score의범위는 -1.83부터 였다. 앞서분석한바와같이 Z-score -3미만을 cut-off를적용하여실제환자의결손여부및그범위를예측해보았다. 분석대상인환자 46명중엑손결손을시사하는소견을보인환자는 10명이었다 (Table 5). 엑손결손여부를예측에있어서의분석능은민감도 88.9% 및특이도 94.6% 이었다 (Table 6). 9명의환자중결손범위를정확하게예측한사례는없었다 (Table 7). 각사례별로확인해보면환자 S01의경우엑손 2, 3, 7, 10, 12, 14-17, 19-22번의결손만을정확하게예측하였다 (Fig. 3B). 환자 S02에서는결손이정확하게예측된엑손이없었다 (Fig. 4B). 환자 S03의경우엑손 17번의결손만이정확하게확인되었으며, 환자 S04의경우엑손 2, 3, 7, 10번의결손만이정확하게확인되어상당한오차가있었다 (Fig. 5B & 6B) Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel 30명의환자들에대해 BRCA2 유전자의 depth를분석하였다. 평균값은 1746X, 표준편차는 126X로나타났으며, 변동계수는 7.2%

22 이었다. 이를이용하여 BRCA1 유전자의 depth를보정하였으며, 결손이없는환자들의데이터를기반으로하여표준정규분포화를시행한뒤 Z-score를산출하였다. ROC 곡선상에서민감도와특이도의합이가장큰지점은각각 98.0% 및 99.4% 이었으며, 해당하는 Z-score의범위는 -1.54부터 -1.68이었다. Z-score - 3미만을 cut-off를적용하여실제환자의결손여부및그범위를예측했을때, 분석대상인환자 30명중엑손결손을시사하는소견을보인환자는 2명이었다 (Table 5). 엑손결손여부를예측에있어서의분석능은민감도 40.0% 및특이도 100% 이었다 (Table 6). 5명의환자중결손범위를정확하게예측한사례는 1건이었다 (Table 7). 각사례별로확인해보면환자 S01의경우엑손 2, 3, 5, 7, 10, 13-23번의결손이정확하게확인되었다 (Fig. 3C). 환자 S02 및 S04의경우정확하게결손이예측된엑손은없었다 (Fig. 4C & 6C). 환자 S03에서는엑손 17-18번의결손이정확하게확인되었다 (Fig. 5C)

23 Table 2. Analytic performance of sequence analysis using gene panels TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus Ion AmpliSeq MiSeq reporter NextGENe MiSeq reporter NextGENe Ion Reporter Total variants reported in Sanger sequencing True positive variants False negative variants False positive variants Analytic sensitivity % PPV % PPV, positive predictive value

24 Table 3. False negative variant cases in gene panels Patient Gene NT change AA change Classification Gene panel (Analysis platform) Cause S17 BRCA1 c.922_924delinst p.ser308* Pathogenic Ion AmpliSeq (Ion Reporter) Variant calling S20 BRCA1 c.1511g>a p.arg504his VUS TruSeq (NextGENe) Low allele frequency S33 BRCA2 c.3744_3747deltgag p.ser1248argfs*10 Pathogenic S40 BRCA1 c.5496_5506delinsa p.val1833serfs*7 Pathogenic NT, nucleotide; AA, amino acid; VUS, variant of uncertain significance Multiplicom (Miseq Reporter) Multiplicom (NextGENe) Multiplicom (Miseq Reporter) Ion AmpliSeq (Ion Reporter) Low allele frequency Low allele frequency Low allele frequency Variant calling

25 Table 4. False positive variant cases in gene panels Total number of the patients Gene NT change Gene panel (Analysis platform) Cause 1 BRCA1 c.3463dupg TruSeq (NextGENe) Amplification error 1 BRCA2 c.468_469delta TruSeq (NextGENe) Amplification error 30 BRCA2 c.1964c>g BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 13 BRCA2 c.3869g>a BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 30 BRCA2 c.68-7delt BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 2 BRCA2 c.7504c>t BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 28 BRCA2 c.8830a>t BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 30 BRCA2 c.10121c>t BRCA Tumor MASTR Plus (NextGENe) Amplification error 29 BRCA2 c.1151c>t BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 29 BRCA2 c.1964c>g BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 27 BRCA2 c.2138a>t BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 5 BRCA2 c.3869g>a BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 21 BRCA2 c.4068g>a BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 26 BRCA2 c.7504c>t BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 5 BRCA2 c.8830a>t BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error 3 BRCA2 c.10121c>t BRCA Tumor MASTR Plus (MiSeq Reporter) Amplification error NT, nucleotide

26 Table 5. Result of exon deletion prediction in gene panel studies Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus S01 Y Y Y Y S02 Y Y N N S03 Y Y Y Y S04 Y Y Y N S05 Y Y Y N S06 Y Y Y N/A S07 Y Y Y N/A S08 Y Y Y N/A S09 Y Y Y N/A S10 N N N N S11 N N N N/A S12 N N N N/A S13 N Y N N S14 N N N N S15 N N N N S16 N N N N S17 N N N N S18 N N Y N/A S19 N N N N/A S20 N N N N S21 N N N N S22 N N N N S23 N N N N/A S24 N N N N S25 N N N N/A S26 N N N N S27 N N N N S28 N N N N S29 N N N N S30 N N N N S31 N N N N/A S32 N N N N/A S33 N Y N N/A S34 N N N N/A S35 N N N N Ion AmpliSeq

27 S36 N N N N/A S37 N N N N/A S38 N N N N/A S39 N N N N S40 N N N N S41 N Y N N/A S42 N N N N S43 N N N N S44 N N N N S45 N N N N/A S46 N N Y N S47 N N N/A N S48 N N N/A N S49 N N N/A N S50 N N N/A N/A MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not applicable

28 Table 6. Analytical performance of exon deletion prediction using gene panel TruSeq Custom Amplicon BRCA Tumor MASTR Plus Ion AmpliSeq Total number of patient included True positive False negative False positive True negative Analytic sensitivity (%) Analytic specificity (%) PPV (%) NPV (%) PPV, positive predictive value; NPV, negative predictive value

29 Table 7. Prediction of exon deletion range using gene panel Patient MLPA TruSeq Custom Amplicon* BRCA Tumor MASTR Plus* Ion AmpliSeq* S , 3, 7, 10, 12, 14-17, , 3, 5, 7, 10, S None None S S , 8, , 3, 7, 10 None S , 3, 10 None S , 3, 7, 10 N/A S , 3, 7, 10, 12 N/A S , 3, 7, 10, 12 N/A S , 3, 10, 11 N/A * Exon 1 was not included in prediction of exon deletion range MLPA, multiplex ligation-dependent probe amplification; N/A, not applicable

30 Figure 1. Frameshift mutation of Patient S17 identified by gene panel

31 Figure 2. ROC curve of estimation of BRCA1 gene deletion by Z-score

32 (A) Z-score Exon (B) 0-2 Z-score Exon Continued

33 (C) Z-score Exon Figure 3. Prediction of exon deletion in patient S01, (A) TruSeq Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel

34 (A) Z-score Exon (B) Z-score Exon Continued

35 (C) Z-score Exon Figure 4. Prediction of exon deletion in patient S02, (A) TruSeq Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel

36 (A) Z-score Exon (B) Z-score Exon Continued

37 (C) Z-score Exon Figure 5. Prediction of exon deletion in patient S03, (A) TruSeq Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel

38 (A) 5 0 Z-score Exon (B) 0-2 Z-score Exon Continued

39 (C) Z-score Exon Figure 6. Prediction of exon deletion in patient S04, (A) TruSeq Custom Amplicon, orange square indicate average Z-score of adjacent two exons (B) BRCA Tumor MASTR Plus, (C) Ion AmpliSeq BRCA1 and BRCA2 panel

40 고 찰 본연구에서는 NGS 기법을이용한유전자패널이 Sanger sequencing 결과에비교했을때유사한분석민감도 (99.2%- 100%) 를가지고있음을확인하였다. TruSeq Custom Amplicon의경우제조자의권장분석플랫폼인 MiSeq Reporter를이용하면정확하게일치하는염기서열분석결과를얻을수있었다. BRCA Tumor MASTR Plus의경우 NextGENe을이용하여분석할경우가장우수한결과를보였으나, 1건의위음성사례및다수의위양성사례를보여분석플랫폼의최적화가더필요하다고생각된다. Ion AmpliSeq BRCA panel은제조사의권장분석플랫폼인 Ion Reporter를사용하였을때, 99.2% 라는분석민감도를보였고이는위음성사례 2건때문이었다. 2건의사례는모두 indel이라는공통점이있었으며, 분석과정중 variant calling에문제가있었던것으로확인되었기에이를보완한다면분석민감도를개선할수있을것으로기대된다. 기타다른연구에서도 BRCA1/2 유전자패널이 Sanger sequencing에비해동등하거나우월한분석능을보였다고보고된바있다 (6-9). 환자 S17의사례에서보았듯이 NGS 기법은대립유전자의분리가필요한경우 raw data를확인하여정확한판독이가능하다. Sanger sequencing의경우대립유전자를분리하여분석하기위해서는별도의실험설계가필요할뿐만아니라판독에도어려움이많다. 하지만 NGS 기법은각각의 amplicon read가하나의대립유전자를반영하기때문에복잡한염기변이를

41 확인하는데유용할수있다. Read length의길이가더길다면 structural variation까지도분석할수있는장점이있다 (10). 본연구에서는 NGS 데이터중 depth를이용하여 CNV를분석하였다. 표준정규분포를이용하여 Z-score를산출하였고, 이를통해엑손단위의결손을예측해보았다. ROC 곡선에서얻어진곡선아래영역은 으로매우우수한분석능을보였다. 다만이를엑손단위의결손예측이아닌환자단위로적용해야하기때문에실제검사법으로서는다소낮아진분석능을보였다. 3가지유전자패널중가장우수한분석능을보인것은 TruSeq Custom Amplicon이었으며엑손결손의여부를예측하는데있어 100% 의민감도를보였다. 이는기존에쓰이는유전자용량검사법인 MLPA를시행하기에앞서선별검사로적용하는데적합한검사법임을의미한다. 선별검사없이 MLPA를시행했을경우 41건의음성사례를모두포함해야겠지만, 선별검사로적용했다고가정하면 41건중위양성사례는단 3건이었기에불필요한 MLPA 시행건수를획기적으로줄일수있을것으로예상된다. 상기기준만을적용했을때 9명의환자중 8명에서정확한결손범위를예측하였고, 나머지 1명에서는결손범위예측에일부오류가있었다. 위에서기술한바와같이 TruSeq Custom Amplicon은엑손결손예측에있어우수하지만일부오류를내포하고있었다. 이를보완하기위해인접한 2개엑손의 Z-score 평균값을산출하여추가로적용하였을때, 결손여부및결손범위예측에있어 100% 의일치도를확보할수있었다. 실제검사실에서 CNV 분석을

42 시행함에있어 (1) 단일엑손의 Z-score 수치로결손여부를판정하고, (2) 2개이상의연속된엑손의결손이있는경우인접한 2개엑손의 Z-score 평균값으로결손범위를예측한다면 MLPA를대체할수있을것으로예상된다. 본연구에서다루어진 2가지유전자이외에도유전성유방암에관련된여러유전자들이알려져있다. p53 및 PTEN의돌연변이는종양증후군과관련되어있으며, 유방암발병위험도를매우높인다. 그외에도 CHEK2, ATM, NBS1, RAD50, BRIP 및 PALB2의돌연변이는유방암위험도를 2배가량높이는것으로보고되어있다 (11). 이런발병위험도에관련된여러유전자들을한꺼번에평가한연구보고가있다 (9, 12). 그밖에도항암화학치료후예후에대해분석하여유전적특성을규명한연구보고도있다 (13, 14). 이와같이 BRCA1 및 BRCA2 유전자이외에도환자의발병위험도및예후와관련된여러유전자들이보고되어있으므로유전자패널의분석범위를확장하여적용하는것도임상적으로중요할것으로생각된다. 본연구에서는유전성유방암및난소암발병의주요유전자인 BRCA1/2에대한유전자패널이기존검사방법인 Sanger sequencing을대체할수있다는가능성을확인하였다. 더불어 CNV 검출에있어서도유용한정보를획득할수있다는사실도확인하였고, MLPA 시행에앞서선별검사로적용할수있는가능성을확인하였다. 앞으로발병및예후와관련된유전자들을포함하여패널로활용한다면임상적으로유용한정보를한꺼번에제공할수있을것이며, 이는유전성유방암및난소암의진단및

43 치료에있어맞춤의학으로나아가는좋은기회가될것으로 생각된다

44 참고문헌 1. Cancer Genome Atlas N. Comprehensive molecular portraits of human breast tumours. Nature. 2012;490(7418): Couch FJ, Nathanson KL, Offit K. Two decades after BRCA: setting paradigms in personalized cancer care and prevention. Science. 2014;343(6178): Chen S, Parmigiani G. Meta-analysis of BRCA1 and BRCA2 penetrance. J Clin Oncol. 2007;25(11): Mavaddat N, Peock S, Frost D, Ellis S, Platte R, Fineberg E, et al. Cancer risks for BRCA1 and BRCA2 mutation carriers: results from prospective analysis of EMBRACE. J Natl Cancer Inst. 2013;105(11): Risch HA, McLaughlin JR, Cole DE, Rosen B, Bradley L, Fan I, et al. Population BRCA1 and BRCA2 mutation frequencies and cancer penetrances: a kin-cohort study in Ontario, Canada. J Natl Cancer Inst. 2006;98(23): Dacheva D, Dodova R, Popov I, Goranova T, Mitkova A, Mitev V, et al. Validation of an NGS Approach for Diagnostic BRCA1/BRCA2 Mutation Testing. Molecular diagnosis & therapy. 2015;19(2): D'Argenio V, Esposito MV, Telese A, Precone V, Starnone F, Nunziato M, et al. The molecular analysis of BRCA1 and BRCA2: Nextgeneration sequencing supersedes conventional approaches. Clinica chimica acta; international journal of clinical chemistry. 2015;446: Kapoor NS, Curcio LD, Blakemore CA, Bremner AK, McFarland RE, West JG, et al. Multigene Panel Testing Detects Equal Rates of Pathogenic BRCA1/2 Mutations and has a Higher Diagnostic Yield Compared

45 to Limited BRCA1/2 Analysis Alone in Patients at Risk for Hereditary Breast Cancer. Ann Surg Oncol. 2015;22(10): Judkins T, Leclair B, Bowles K, Gutin N, Trost J, McCulloch J, et al. Development and analytical validation of a 25-gene next generation sequencing panel that includes the BRCA1 and BRCA2 genes to assess hereditary cancer risk. BMC cancer. 2015;15: Liu B, Conroy JM, Morrison CD, Odunsi AO, Qin M, Wei L, et al. Structural variation discovery in the cancer genome using next generation sequencing: computational solutions and perspectives. Oncotarget. 2015;6(8): Walsh T, King MC. Ten genes for inherited breast cancer. Cancer Cell. 2007;11(2): Easton DF, Pharoah PD, Antoniou AC, Tischkowitz M, Tavtigian SV, Nathanson KL, et al. Gene-panel sequencing and the prediction of breastcancer risk. The New England journal of medicine. 2015;372(23): Lips EH, Michaut M, Hoogstraat M, Mulder L, Besselink NJ, Koudijs MJ, et al. Next generation sequencing of triple negative breast cancer to find predictors for chemotherapy response. Breast Cancer Res. 2015;17(1): Park K, Choi MK, Jung HH, Do IG, Lee KH, Ahn T, et al. Molecular characterization of patients with pathologic complete response or early failure after neoadjuvant chemotherapy for locally advanced breast cancer using next generation sequencing and ncounter assay. Oncotarget. 2015;6(27):

46 Abstract Introduction: According to domestic statistics, breast and ovarian cancer are 2nd and 10th most common cancer in females. Mutations of BRCA1 and BRCA2 gene increase the risk of hereditary breast and/or ovarian cancer in women five times. These genes have 5.6 Kb and 10.3 Kb size respectively, and have allelic heterogeneity without mutation hot spot. Therefore mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 gene have been challenging. The objective of this study is to evaluate clinical usefulness of gene panel using next-generation sequencing for replacement of Sanger sequencing and Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification (MLPA). Methods: This study enrolled 50 BRCA1 and BRCA2 gene mutation positive patients (9 exon deletion cases and 41 point mutation cases), which were confirmed by Sanger sequencing and MLPA in Molecular Diagnostics Laboratory, Seoul National University Hospital. We included 3 gene panels, which were as follows, TruSeq Custom Amplicon, BRCA Tumor MASTR Plus, and Ion AmpliSeq BRCA panel. We performed next-generation sequencing using MiSeq and Ion torrent PGM and compare the results with traditional methods. Results: In comparison to Sanger sequencing, TruSeq Custom Amplicon revealed 100% analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 99.6%, and Ion AmpliSeq BRCA panel 99.2%. False positive variants were reported in only BRCA Tumor MASTR Plus. With regard to prediction of exon deletion using copy number variation analysis, TruSeq Custom Amplicon revealed 100% analytic sensitivity, BRCA Tumor MASTR Plus 88.9%, and Ion AmpliSeq

47 BRCA panel 40%. Especially TruSeq Custom Amplicon estimated precisely exon deletion range 8 of 9 patients. Conclusions: This study suggested gene panel using NGS technology have excellent analytical performance. If analytic algorithm is complemented appropriately, gene panel could replace Sanger sequencing. Furthermore gene panel provide useful information for prediction of CNV analysis. And it was able to support the screening of gene dose analysis. Considering cost and time in addition to analytic performance, BRCA1/BRCA2 gene panel is useful test strategy for diagnosis of hereditary breast and/or ovarian cancer Keywords: Hereditary breast and/or ovarian cancer, Next-generation sequencing, Gene panel, BRCA1, BRCA2 Student number:

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